專利名稱：來自膠束酪蛋白的酸溶性蛋白質(zhì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及獲得膠束酪蛋白(micellar casein)的酸溶性蛋白質(zhì)的方法，涉及該蛋白質(zhì)的級分，涉及該蛋白質(zhì)作為藥物的用途，還涉及該蛋白質(zhì)在生產(chǎn)藥物或消費品中的用途。
背景糖尿病是世界上最普遍的疾病之一。糖尿病主要有兩種類型I型和II型。I型糖尿病患者的特征在于分泌胰島素的胰腺β細胞的自身免疫破壞。II型糖尿病患者占所有糖尿病患者的90-95％，他們的特征在于在外周組織(主要是肝臟和肌肉)中形成胰島素抗性，以及不恰當(dāng)?shù)囊葝u素分泌能力。
患II型糖尿病的人具有嚴重的長期并發(fā)癥的高度危險。這些并發(fā)癥基本上是心血管病，以及視網(wǎng)膜病，腎病和神經(jīng)病。
當(dāng)前對II型糖尿病的治療包括幾類藥物，它們能單獨或結(jié)合胰島素使用，這依賴于仍然產(chǎn)生的胰島素的量(如磺酰脲，噻唑烷二酮類化合物)。最終，當(dāng)不再產(chǎn)生胰島素時，藥物治療將由單獨注射胰島素取代。
胰島素生物合成和胰島素原基因表達受胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)的刺激，幾乎僅在內(nèi)分泌腸細胞中表達。該促分泌激素的重要作用很好地概括在“″Glucagone-like peptide-1a major regulator of pancreatic b-cellfunction，R.Perfetti和P.Merkel，European Journal of Endocrinology(2000)，143，717-725”，此處引用該文獻作為參考。
已表明，例如，當(dāng)靜脈內(nèi)GLP-1施用后，II型糖尿病的胰島素分泌反應(yīng)將恢復(fù)到正?；颊郀顟B(tài)。
而且，GLP-1抑制胃能動性、胃酸分泌、胃排空和延緩酶分解及營養(yǎng)的吸收。這些影響幾乎在I型和II型糖尿病患者中都保存。
此外，證明GLP-1影響飽滿感并可能與降低食物的攝取有關(guān)。
因而認為GLP-1是治療糖尿病的理想選擇。
此外，無論何時釋放一分子的GLP-1，也將釋放一分子的胰高血糖素樣肽-2(GLP-2)。哺乳動物胰高血糖素原的轉(zhuǎn)錄物來源于一個mRNA。因而GLP-1和GLP-2在消化道中是共分泌的。
GLP-2抑制胃分泌和胃能動性。用GLP-2的長期治療對腸具有有益的營養(yǎng)效果，例如提高組織質(zhì)量和粘膜厚度，降低腸細胞程序性細胞死亡速率等等。關(guān)于GLP-1合成、分泌和生物活性的綜述可以見Glucagon-LikePeptide 2，D.J.Drucker，The Journal of Clinical Endocrinology andMetabolism，2001，86，1759-64。
在WO 01/37850(Societe des Produits Nestle)中第一次描述用體外細胞模型測量胰高血糖素原基因表達和GLP-1分泌。該細胞系稱為NCI-H716并例如以ATCC號CCL-250保存。因此，某些牛奶蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物促進GLP-1分泌。
WO 98/31239描述了在至少一種另外的蛋白質(zhì)級分存在下選擇性水解酪蛋白的方法。該方法提到如此獲得的制品對糖尿病有益。
本發(fā)明的目的是刺激來自胰高血糖素原的激素的分泌的一種或幾種分子。
另一的目的是發(fā)現(xiàn)生物活性分子，例如，因為它們是在特定的食物原料中自然產(chǎn)生的，所以認為它們是營養(yǎng)安全的。
本發(fā)明的其他目的是預(yù)防或治療II型糖尿病，調(diào)節(jié)血清中葡萄糖濃度，治療或預(yù)防以傷害腸黏膜上皮和/或腸黏膜上皮功能異常為特征的腸紊亂，增加腸粘膜的厚度和表面積，和/或降低食欲和食物攝取。
本發(fā)明的另一目的是改善人和哺乳動物中GLP-1和GLP-2的遞送。
發(fā)明概述令人驚奇地，通常與膠束酪蛋白結(jié)合或與之緊密地交互作用的奶的蛋白質(zhì)級分能刺激GLP-1的分泌?？梢酝ㄟ^將完整或酶處理的酪蛋白暴露于酸性條件釋放該蛋白質(zhì)級分。迄今為止還沒有表征包含在該級分中的一些蛋白質(zhì)。
因此，第一方面，本發(fā)明提供了獲取膠束酪蛋白酸溶性蛋白質(zhì)級分的方法，其包括以下步驟-分離膠束或酶處理的酪蛋白和乳清蛋白質(zhì)，-酸化膠束酪蛋白或酶處理的酪蛋白到pH低于6，-從酪蛋白中分離酸溶性蛋白質(zhì)，和-分離酸溶性蛋白質(zhì)的不同級分。
第二方面，本發(fā)明提供了來自膠束酪蛋白的酸溶性蛋白質(zhì)的亞級分，其特征在于它可以通過疏水作用層析獲得，并且通過包含26.4-36體積％乙腈的流動相從疏水固定相洗脫該級分。
第三方面，本發(fā)明提供了來自膠束酪蛋白的酸溶性蛋白質(zhì)的亞級分，其特征在于該級分可以通過疏水作用層析獲得，并且通過包含43.2-46.4體積％乙腈的流動相從疏水固定相洗脫該級分。
第四方面，本發(fā)明提供了來自膠束酪蛋白的酸溶性蛋白質(zhì)的用途，用作藥物或預(yù)防性或治療性治療人體或動物體。
第五方面，本發(fā)明提供了來自膠束酪蛋白的酸溶性蛋白質(zhì)的用途，用于制備用于增強胰島素分泌和/或胰島素原基因的表達的消費品或藥物。
第六方面，本發(fā)明提供了來自膠束酪蛋白的酸溶性蛋白質(zhì)的用途，用于制備用于預(yù)防或治療I型和/或II型糖尿病的消費品或藥物。
第七方面，本發(fā)明提供了來自膠束酪蛋白的酸溶性蛋白質(zhì)的用途，用于制備用于增加GLP-1和/或GLP-2的分泌和/或調(diào)節(jié)血液中葡萄糖濃度的消費品或藥物。
另一方面，本發(fā)明提供了來自膠束酪蛋白的酸溶性蛋白質(zhì)的用途，用于制備用于降低胃排空和酸分泌的消費品或藥物。
在另一方面，本發(fā)明提供了來自膠束酪蛋白的酸溶性蛋白質(zhì)的用途，用于制備用于調(diào)節(jié)食欲，降低食物攝取和/或增加飽滿感的消費品或藥物。
另一方面，本發(fā)明提供了包含根據(jù)本發(fā)明的任一蛋白質(zhì)級分或亞級分的消費品。
另一方面，本發(fā)明提供了來自膠束酪蛋白的酸溶性蛋白質(zhì)的用途，用于制備消費品或藥物，所述消費品或藥物用于治療以受傷或功能異常為特征的腸疾病和/或增加腸粘膜的厚度和/或表面積。
本發(fā)明的一個優(yōu)點是它提供了能刺激GLP-1分泌的自然產(chǎn)生的有效成分。
本發(fā)明的另一個優(yōu)點是所討論的蛋白質(zhì)級分能容易地分離并以足夠量提供給任何食品。
本發(fā)明的另一優(yōu)點是它提供了營養(yǎng)安全成分，其可以用于治療或預(yù)防I型和/或II型糖尿病、節(jié)段性回腸炎(Crohn’s disease)、短腸綜合征、調(diào)節(jié)血液中葡萄糖水平，和/或增加飽腹感及降低食物攝取。
在附圖中，

圖1比較牛奶的不同蛋白質(zhì)級分體外刺激的GLP-1釋放。以0.5mG/ml(灰色條線)和5mg/ml(黑色條線)施用蛋白質(zhì)，只是根據(jù)本發(fā)明的膠束酪蛋白的酸溶性蛋白質(zhì)除外，所述酸溶性蛋白質(zhì)即使在低濃度下也顯示出對GLP-1釋放的最高影響(灰色條線)。用包含0.2％BSA，pH7.4的Krebs-Ringer平衡緩沖液(KRBB)制備奶提取物。對照僅由緩沖液(KRBB)和BSA(0.2％)組成。
圖2比較膠束酪蛋白酸溶性蛋白質(zhì)的不同亞級分體外刺激的GLP-1釋放。不同的亞級分以相同濃度(30μg/ml)施用，發(fā)現(xiàn)特別地，亞級分5、7、8、10和11對GLP-1分泌顯示出明顯影響。將包含所有14種級分的最初混合物的全部以更高的濃度(5μg/ml)施用。
圖3顯示來自膠束酪蛋白的酸溶性蛋白質(zhì)的14個級分的HI-HPLC(疏水相互作用高效液相層析)層析圖。水平軸闡明來自膠束酪蛋白的不同酸溶性蛋白質(zhì)疏水性的增加，所述蛋白質(zhì)分為所述14種不同亞級分。垂直軸指出從柱子上洗脫的蛋白質(zhì)的量，其通過UV在214nm下檢測。
附圖的進一步詳細說明可以從實施例獲得。
發(fā)明詳述在該說明書上下文中，詞語“包含”是指“其中，包括”。不意在將其理解成“僅由...組成”。
在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語消費品意在包括任何營養(yǎng)完全的或補充性可消費的產(chǎn)品。因此，該組合物可由人、寵物，如貓和狗，和/或其他動物消費。它可以是營養(yǎng)巴(bar)、小吃、營養(yǎng)配方，例如液態(tài)或粉末狀和可重構(gòu)的配方、嬰兒或幼兒配方、冰淇淋、奶制品、糖制品、或它可以輔助物或藥物，其可以任選加入到另一食品中，如加入到上述食品中。它也可以是液態(tài)產(chǎn)品。
例如，如果食品是營養(yǎng)配方，它可以是確限配方或補充配方。確限配方通常由成人每天消耗1.8到2.2L的量，嬰兒每天0.6到1.4L。
如果配方作為補充使用，則每天的量為例如確限配方的約1/8到約1/2。
但是，根據(jù)本發(fā)明的消費品不限于任何產(chǎn)品。它可以是食品本身或是任意食品的成分或組分。
關(guān)于膠束酪蛋白的酸溶性蛋白質(zhì)的方法，天然的或從乳清蛋白質(zhì)來源的膠束酪蛋白，或從乳清蛋白質(zhì)得到的酶處理的酪蛋白的分離可以用多種方法處理，如超速離心，或微量過濾。乳清蛋白質(zhì)也可通過根據(jù)它們的疏水性選擇性除去特定乳清蛋白質(zhì)而將其與酪蛋白分離。
調(diào)節(jié)pH到低于6，優(yōu)選低于5，更優(yōu)選低于4.8，例如，4.6，進行膠束或酶處理的酪蛋白的酸化。任何酸都是適宜的，只要它是食品級，如HCl、乙酸等。
從膠束酪蛋白中分離酸溶性酪蛋白可再次通過任何合適的方法獲得，所述方法為例如超速離心、過濾、傾析以及其它方法。
分離酸溶性蛋白質(zhì)不同的亞級分可根據(jù)疏水性質(zhì)進行，如用疏水作用層析(HIC)、疏水相互作用液相層析(HI-HPLC)，以及基于相似原理的方法。其它方法也是適宜的，如可利用不同級分的大小或電荷性質(zhì)分離。
根據(jù)本發(fā)明的酸溶性蛋白質(zhì)的亞級分可根據(jù)表1給出的洗脫特征來定義。表1顯示在乙腈濃度為26.4-36體積％-范圍內(nèi)洗脫的級分相應(yīng)于表1下面定義的在緩沖液A和B組成的混合物中緩沖液B的33-45體積％范圍。
上面的緩沖液B和緩沖液A的濃度范圍足夠表征所洗脫的蛋白質(zhì)級分(表1)。對于上面的洗脫范圍，聚苯乙烯-二乙烯基苯顆粒優(yōu)選用作固定相。來自Amersham的產(chǎn)品目錄號為No.15 RPC TN 17-0727-02的產(chǎn)品優(yōu)選用作固定相。
具體地，根據(jù)上面特征的洗脫pH通常為1.8-2.2范圍，優(yōu)選約2。該pH主要由三氟乙酸(TFA)的量決定。
除了可能未知的物質(zhì)以外，亞級分6、7和8可能包含PP8(蛋白胨)，級分8和9包含PP8和PP5(蛋白胨)，級分10包含乳鐵蛋白(lactoferrin)，級分11包含β-乳球蛋白。
從而，在根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選方案中，根據(jù)本發(fā)明的亞級分是亞級分5、6、7、8、10和11，它們在表1中通過在特定緩沖液或乙腈濃度范圍洗脫來表征。特別可以重新測試亞級分5，因為懷疑具有某種細胞毒性性質(zhì)。
進行本發(fā)明的一中可能的方法首先分離此處報導(dǎo)的特定奶蛋白質(zhì)級分。這可用任何足夠方法完成并至少有一些步驟是合適的。
例如，來自膠束酪蛋白的酸溶性蛋白質(zhì)可通過超速離心從奶或脫脂乳(或衍生物)中分離酪蛋白而獲得。因此，如脫脂乳在30,000到90,000或最高110,000g超速離心45-90分鐘。可以回收組成膠束酪蛋白的沉淀物(或不溶蛋白質(zhì))。
可以通過將膠束酪蛋白分散在CaCl22mM/NaCl 0.9％，并如上超離心洗滌該膠束酪蛋白。
來自酪蛋白的酸溶性蛋白質(zhì)可通過酸化洗滌過的膠束酪蛋白獲得，如上述。例如，膠束酪蛋白(不溶性蛋白質(zhì))可分散在20mM pH4.6的乙酸鈉緩沖液中。由于酪蛋白的緩沖行為，通過乙酸(或其它合適的酸)加入可實現(xiàn)約4.6的pH。
該溶液于是離心(如9,000到15,000g，20-50分鐘)，收集上清液，其含有來自膠束酪蛋白的酸溶性蛋白質(zhì)。
另一種從膠束酪蛋白中獲得酸溶性蛋白質(zhì)的方法可以來自Proteincomposition of micellar casein obtrained by cross-flow micro-filtration ofskimmed milk，R.Jost，R.Brandsma，S.Rizvi，International Dairy Journal9(1999)389-90。
因此，天然酪蛋白是通過微量過濾而不是超離心獲得。因此，通過純物理方法可以用孔徑范圍為0.1-0.2μm的微量過濾膜將奶的膠束相與它的血清相分離。
例如，加熱到50℃的脫脂乳經(jīng)1P19-40 Tetra-laval 1.4μmMembralox設(shè)備過濾可減少它的細菌負荷。然后將它加熱到55℃并在配備有CarbosepM14(0.14μm孔徑)膜的Tech-Sep 1S 151微量過濾裝置上分離。該奶從而以濃縮模式工作分級分離成存留物和透過液(permeatestream)。當(dāng)達到濃縮因數(shù)3(cf3)后，添加脫礦質(zhì)水開始滲濾。6初始體積水(cf3/cf6)滲濾后獲得的存留物組成膠束酪蛋白。
可用鹽酸(或其它酸，如乙酸)酸化再稀釋的存留物到pH4.6，并通過離心分離凝乳得到膠束酪蛋白的酸溶性部分。結(jié)果，3-5％的總N可從凝乳中分離為膠束酪蛋白的酸溶性蛋白質(zhì)。
在這種情況下，可以獲得蛋白質(zhì)級分，其包含乳鐵蛋白、血清白蛋白、免疫球蛋白H-和L-鏈、具有與β-乳球蛋白相似的電泳遷移率的蛋白質(zhì)。而且，該級分可能包含蛋白胨組分5(β-酪蛋白1-105/1-107)和蛋白胨組分8fast。
膠束酪蛋白的酸溶性蛋白質(zhì)的其它組分由本發(fā)明定義。
當(dāng)然，上述方法僅作為從膠束酪蛋白中分離或純化酸溶性蛋白質(zhì)的例子。技術(shù)人員可以很容易地設(shè)想出其它方法來獲得它們。
例如，膠束酪蛋白的酸溶性蛋白質(zhì)經(jīng)酶處理后(如，粗制凝乳酶)可能保留至少部分附著到酪蛋白。在該情況下，用酶處理奶，隨之回收由凝結(jié)的酪蛋白形成的凝乳，可以獲得膠束酪蛋白的酸溶性蛋白質(zhì)。通過如上述酸化可以將膠束酪蛋白的酸溶性蛋白質(zhì)至少部分地從凝乳中分離。
該方法可代替用離心或超過濾分離膠束酪蛋白，只要膠束酪蛋白的酸溶性蛋白質(zhì)主要保持與切割的酪蛋白質(zhì)級分結(jié)合。
酸化奶或脫脂乳也可能回收膠束酪蛋白的酸溶性蛋白質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)必須從酸性乳清中分離，后者還包含在酸性乳清中包含的其它可溶性奶組分(主要是α-乳清蛋白、β-乳球蛋白、乳鐵蛋白)。這可以通過適合選擇性除去上述乳清級分的任何合適的分離技術(shù)，如HICl或離子交換層析進行。
本發(fā)明基于令人驚奇地認識到膠束酪蛋白的酸溶性蛋白質(zhì)包含適合促進GLP-1和(與之結(jié)合的)GLP-2釋放的生物活性成分。
然而，來自膠束酪蛋白的酸溶性蛋白質(zhì)的進一步分級分離及篩選顯示膠束酪蛋白的酸溶性蛋白質(zhì)的某些亞級分是優(yōu)選的。
進一步分離更有效的亞級分可通過如疏水作用層析(HIC)，或通過疏水相互作用高效液相層析(HI-HPLC)，反相高效液相層析等實現(xiàn)，所有這些方法都基于相同的分離原理。
HIC的原理為技術(shù)人員已知的。通常地，樣品裝入包含能滯留該樣品的疏水材料的平衡柱(固定相)。疏水材料可以是，如，大孔交聯(lián)的聚苯乙烯，例如商品化的Amberlite Xad 16(XAD 16來自Rohm和Hass)。Amersham的15 RPC TN 17-0727-02(聚苯乙烯-二乙烯基苯)或等同物也可使用。
在根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)級分裝載到柱子上之前，應(yīng)該用緩沖液平衡柱子。裝載級分后，緩沖液或緩沖液混合物(移動相)可以流過柱子，其中緩沖液混合物改變并且可以具有根據(jù)疏水性從柱子洗脫的蛋白質(zhì)亞級分，這些亞級分具有不同的性質(zhì)。
根據(jù)該方法分離乳清蛋白質(zhì)描述于″Simultaneous separation andquantitation of the major bovine whey proteins including proteose peptoneand caseinomacropeptide by reversed-phase high performance liquidchromatography on polystyrene-divinylbenzene″，D.F.Elgar等人，Journal of Chromatography A 878(2000)183-196。
從柱子上洗脫的蛋白質(zhì)亞級分可用實現(xiàn)它們從固定相上洗脫的緩沖液混合物的組成或乙腈含量來精確描述。
例如，來自膠束酪蛋白的酸溶性蛋白質(zhì)可以加到裝填聚苯乙烯-二乙烯基苯珠(15 RPC TN 17-0727-02，Amersham)的柱子上，緩沖液A可定義為水中的0.1體積％三氟乙酸(TFA)，緩沖液B可定義為水中的80體積％乙腈和0.85體積％TFA。
然后，緩沖液A和B的混合和傳輸可由特定系統(tǒng)，如FPLC(快速蛋白質(zhì)液相層析)UNICORN工作站(Pharmacia，Amersham)控制，并流過柱子。
洗脫的蛋白質(zhì)亞級分可由上述緩沖液A和B的混合比例的洗脫范圍來限定。利用特定的緩沖液組成，蛋白質(zhì)亞級分的洗脫時間或間隔可簡單地由本發(fā)明的蛋白質(zhì)級分在洗脫時的存在的乙腈的相對量來描述。然而，值得注意的是，洗脫順序是依賴pH值的。
下表1通過緩沖液B的體積百分比范圍或乙腈的范圍定義了根據(jù)發(fā)明的膠束酪蛋白的酸溶性蛋白質(zhì)的14種酸溶性蛋白質(zhì)亞級分，在所述乙腈范圍內(nèi)洗脫根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方案的亞級分。
表1通過疏水作用層析定義的來自膠束酪蛋白的酸溶性蛋白質(zhì)的亞級分
緩沖液A水TFA 0.1％緩沖液B乙腈/水/TFA(80％/19.15％/0.85％；v/v)柱子Source 15 RPC Amersham(基質(zhì)聚苯乙烯/二乙烯基苯)，柱體積(CV＝100ml)梯度從20％B緩沖液開始，1柱體積(CV)后注射樣品，然后以15CV將梯度增加到高達75％B，然后用2CV達到100％B緩沖液。
如果希望，亞級分可通過蒸發(fā)、超濾或透析以除去有機溶劑進行濃縮，然后干燥，例如通過真空干燥、冷凍干燥、噴霧干燥、流化床干燥、烘烤干燥或任何其它適合的干燥方法干燥。
亞級分5、6、7、8、9、10和11在促進GLP-1體外釋放中特別有效并構(gòu)成了本發(fā)明的優(yōu)選實施方案。亞級分5、7、8和11構(gòu)成了更優(yōu)選的實施方案。
已經(jīng)表明亞級分5對體外模型的細胞有毒性作用，因此可證明該級分在人或動物上的適用性較小。
膠束酪蛋白的酸溶性蛋白質(zhì)包含提高體外模型中GLP-1分泌的生物活性成分。
因此，級分或所選亞級分可用于調(diào)節(jié)依賴或由GLP-1、GLP-2或胰島素控制的過程。實例是預(yù)防或治療I或II型糖尿病，調(diào)節(jié)血糖濃度，抑制胃能動性和分泌，減少液體和固體的胃排空速率，減小小腸轉(zhuǎn)運，抑制平滑肌活動，降低膳食引起的葡萄糖偏離，延緩腸中營養(yǎng)物的酶分解和吸收，降低食欲，減少食物攝取，等等。
例如，該級分可用于降低人或動物的總體消化和吸收活性。
蛋白質(zhì)級分可添加到消費品或藥物中。消費品的實例為營養(yǎng)配方、嬰兒配方或臨床配方。其它的實例是飲料，如耐儲存的、冷凍的或即時可飲的飲料。該級分可添加到其它食品，如巧克力、營養(yǎng)巴、谷類、奶制品、冰淇淋、冷凍食品、寵物食品、咖啡、膠囊劑、片劑等。
下面的實施例僅用于闡明并且決不能解釋為限制本發(fā)明的主題。除非另外指出，百分比和部分是按重量計算的。
實施例1從膠束酪蛋白中分離酸溶性蛋白質(zhì)牛奶從當(dāng)?shù)厥袌霁@得(瑞士，toni lait，2000-02-01)。
通過1000-4500g的離心從全脂奶提取乳酪。通過用固定角轉(zhuǎn)子SorvallGS3將加速度增加到13,600g(30分鐘內(nèi)9000轉(zhuǎn)/分鐘)提高該步的選擇性。從2200ml全脂奶開始，在頂層回收90g乳酪。
然后，將250μl CaCl2200mM添加到250ml脫脂乳中達到2mM終濃度。將奶在固定角轉(zhuǎn)子45TI(Beckman L8-60M超速離心機；32,000轉(zhuǎn)/分鐘，對應(yīng)于管中間100,000g)中超速離心(6管含42.1g脫脂乳)1小時從不溶的膠束酪蛋白分離乳清。
膠束酪蛋白(24g)分散于220ml CaCl22mM/NaCl 0.9％中并如上超速離心。將22g洗滌的經(jīng)回收膠束酪蛋白分散在CaCl22mM/NaCl 0.9％中并將體積調(diào)節(jié)到250ml。將其等分試樣，標上不溶蛋白質(zhì)(膠束酪蛋白)并冷凍。
從190g全脂奶開始，將所洗滌的不溶性蛋白質(zhì)沉淀物(17g)分散在40ml乙酸鈉緩沖液20mM pH4.6中。
由于酪蛋白的緩沖行為，添加乙酸將pH(6.5)調(diào)節(jié)到4.6，通過添加醋酸鹽緩沖液將體積調(diào)整到最初奶體積的一半(90ml)。溶液經(jīng)離心(12,000g，30分鐘)并將上清液(77g)標上來自膠束酪蛋白的酸溶性蛋白質(zhì)。
對于下面的實施例3，將樣品浸于液氮中冷凍，并在-20℃保存。
實施例2不同的牛奶級分促進的GLP-1釋放材料和方法MH(肉水解產(chǎn)物)和EAH(蛋白蛋白水解產(chǎn)物)購于Sigma，基質(zhì)膠(matrigel)購于BD bioscience。CGMP根據(jù)WO 9853702中描述獲得。
獲得脫脂乳、甜乳清、酸性乳清、酸性酪蛋白、可溶性蛋白質(zhì)、不溶性蛋白質(zhì)的分級分離步驟從常規(guī)奶方法(見Alais C.1984 science du lait，Principe des Techniques Laiti ères，4 è me é dition，SEPAIC，Paris，29-35，159-178)改編。在更高的加速率下離心并洗滌不溶級分以增加選擇性和分離效率。
酸性酪蛋白是酸處理脫脂乳后從沉淀物收集的酪蛋白。可溶性蛋白質(zhì)是以100,000g超速離心脫脂乳1h(見實施例1)后在水溶液中回收的蛋白質(zhì)，不溶性蛋白質(zhì)(膠束酪蛋白)是之后在沉淀中回收的部分。
來自膠束酪蛋白的酸溶性蛋白質(zhì)從實施例1獲得，基本上是通過酸化和離心上面段落的所得酸性酪蛋白獲得。
將NCI-H716人腸細胞系(ATCC號CCL-251)在37℃培養(yǎng)在含5％CO2的濕潤培養(yǎng)箱中。為了增殖，細胞懸浮生長在添加了10％FBS、100IU/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素和2mM L-谷氨酰胺的RPMI 1640培養(yǎng)基(Life Technologies Inc)中。對于分泌研究，將細胞接種在基質(zhì)膠涂布的平板上，并在添加了10％FBS、100IU/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素和2mM L-谷氨酰胺的DMEM(低葡萄糖)(Life Technologies Inc)中孵育2天。
在實驗前兩天，細胞以一百萬個細胞/每孔接種在12孔板中。在實驗當(dāng)天，細胞用HBSS(Hank′s Balanced Salt Solution；Life Technologies Inc)洗滌一次，并在不同蛋白質(zhì)溶液存在下37℃孵育2小時。將受試蛋白質(zhì)溶于含0.2％BSA(級分V；Sigma)的pH 7.4的1ml KRBB中(Krebs-Ringer平衡緩沖液)中。在培養(yǎng)期結(jié)束時，用10μl PMSF 200mM回收上清液并在-80℃立即冷凍。
以兩種濃度每ml培養(yǎng)基中0.5mg蛋白質(zhì)和5mg蛋白質(zhì)加入蛋白質(zhì)溶液。
結(jié)果圖1顯示不同濃度(0.5和5mg/ml)的不同奶蛋白質(zhì)級分對體外GLP-1釋放的影響。根據(jù)實施例1獲得的來自膠束酪蛋白的酸溶性蛋白質(zhì)即使在低濃度(0.5mg/ml)下也對GLP-1釋放具有最高影響。
總之，通過根據(jù)實施例1的方法獲得的來自膠束酪蛋白的酸溶性蛋白質(zhì)包含生物活性成分。這些因子可用于人或動物體的疾病預(yù)防或治療。GLP-1的釋放提示這些成分在預(yù)防和治療如糖尿病和肥胖癥中的有用性和工業(yè)應(yīng)用性。
實施例3來自膠束酪蛋白的酸溶性蛋白質(zhì)的亞分級分離如下進行疏水相互作用液相層析用。用100ml Source 15 RPC TN17-0727-02(聚苯乙烯-二乙烯基苯)填充的HR16×50柱連接由UNICORN工作站(Amersham Pharmacia Biotech)控制的FPLC系統(tǒng)。將15ml HCl酸溶性級分(見實施例1)在37℃水浴中解凍20分鐘，通過渦旋混合并在5415Eppendorf離心機中以13000轉(zhuǎn)/分鐘離心1分鐘。在0.45μm Millipore濾器(306/GSWP04700.GS)上過濾后，注射10ml該制備物。
層析條件為A緩沖液水中的0.1％TFA(在0.45μm Millipore系統(tǒng)上過濾的2000ml miliQ水，加入2ml TFA(Sigma 91699，100ml)；B緩沖液乙腈80％，TFA 0.85％(在0.45μm Millipore系統(tǒng)上過濾的400ml miliQ水，加入1600ml乙腈，并在超聲浴中脫氣15分鐘，最后加入1.7ml TFA)。
柱子用20％B緩沖液平衡。一個柱體積(CV)后，將樣品注入，B緩沖液在15個CV內(nèi)增加到75％并在2.5CV內(nèi)增加到100％。最后，梯度在0.4個CV內(nèi)降低到20％。流速固定在3ml/分鐘。
用塑料管收集96個18ml級分。級分保存在-20℃。經(jīng)HPLC分析后，通過HPLC圖的相似性將96個收集管合并成14個級分并蒸發(fā)濃縮后凍干用于隨后檢測。
記錄215nm處的紫外吸收，對應(yīng)的HIC圖在圖3中給出。
用本說明書的表1中描述的它們從柱子上洗脫的時刻和對應(yīng)的乙腈濃度(疏水性)表征來自膠束酪蛋白的14個酸溶性蛋白質(zhì)亞級分。
實施例4實施例3的亞級分促進的GLP-1釋放根據(jù)實施例2中給出的實驗設(shè)計篩選實施例3中獲得的亞級分的GLP-1釋放促進能力。所有亞級分在30μg/ml的培養(yǎng)基中檢測，只有包括所有亞級分的“總級分”在500μg/ml的培養(yǎng)基中檢測。
在本實驗中提到，所檢測的疏水層析庫的濃度為比實施例2中來自膠束酪蛋白的最初酸溶性蛋白質(zhì)的1/16-1/17(30μg/ml相比500μg/ml)。
結(jié)果在圖2中顯示。在體外幾乎所有級分都引起GLP-1釋放增加。用亞級分5、7、8、以及9、10、和11在非常低的蛋白質(zhì)濃度(30μg蛋白質(zhì)/ml培養(yǎng)基)發(fā)現(xiàn)非常強的增加。
然而，發(fā)現(xiàn)亞級分5對細胞系有毒性作用。
總之，亞級分7、8、9、10和11包含生物活性分子或成分。這些可作為藥物，其特別用于治療II型糖尿病，也可能治療I型糖尿病或肥胖癥。在人體或動物體內(nèi)GLP-1的多種其它效果解釋了如權(quán)利要求中給出的亞級分的其他應(yīng)用。
實施例5包含來自膠束酪蛋白的酸溶性蛋白質(zhì)的營養(yǎng)配方根據(jù)推薦值(315KJ/dl)，用根據(jù)實施例1的膠束酪蛋白的酸溶性蛋白質(zhì)完成了按干物質(zhì)重量百分比計包含14％蛋白質(zhì)、62％糖、18％脂肪和3.2％礦物質(zhì)和維生素的營養(yǎng)配方。
以生理有效量加入酸溶性蛋白質(zhì)。在完整的、確限營養(yǎng)配方中(預(yù)計消費為每天2升)將最終濃度調(diào)節(jié)為0.1-0.5mg/ml配方。在作為其它營養(yǎng)物補充的配方中(預(yù)計消費為每天2升)中，調(diào)節(jié)濃度到1-5mg/ml配方。根據(jù)情況和個人需要使用更高的劑量。
實施例6包含來自膠束酪蛋白的酸溶性蛋白質(zhì)亞級分的營養(yǎng)配方實施例5的配方富含在實施例3中獲得的亞級分7和8的蛋白質(zhì)，而不是實施例1所得到的蛋白質(zhì)。
對于完整配方(見實施例5)，將營養(yǎng)配方中亞級分干物質(zhì)的量調(diào)節(jié)到5-25μg/ml液態(tài)配方，對于2dl的日劑量調(diào)節(jié)到50-250μg/ml(補充品)。
還制備了包含亞級分的高劑量配方(對于上述2dl補充物濃縮10倍)。根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)濃度在2dl中為0.5-2.5mg/ml。
權(quán)利要求
1.得到膠束酪蛋白的酸溶性蛋白質(zhì)級分的方法，其包括步驟分離膠束酪蛋白或酶處理的酪蛋白和乳清蛋白質(zhì)，酸化膠束酪蛋白或酶處理的酪蛋白到低于6的pH，從酪蛋白分離酸溶性蛋白質(zhì)，和分離酸溶性蛋白質(zhì)的不同亞級分。
2.來自膠束酪蛋白的酸溶性蛋白質(zhì)的亞級分，其特征在于它可以通過疏水作用層析獲得并且通過包含26.4到36體積％乙腈的流動相從疏水固定相洗脫該級分。
3.來自膠束酪蛋白的酸溶性蛋白質(zhì)的亞級分，其特征在于該級分可以通過疏水作用層析獲得并且通過包含43.2到46.4體積％乙腈的流動相從疏水固定相洗脫該級分。
4.來自膠束酪蛋白的酸溶性蛋白質(zhì)的用途，用作藥物或預(yù)防性或治療性治療人體或動物體。
5.根據(jù)權(quán)利要求2-4的酸溶性蛋白質(zhì)，其中該酸溶性蛋白質(zhì)包含選自根據(jù)權(quán)利要求2、權(quán)利要求3的蛋白質(zhì)、 蛋白胨5、 蛋白胨8、β-乳球蛋白、乳鐵蛋白、血清白蛋白、免疫球蛋白和其混合物的蛋白質(zhì)。
6.來自膠束酪蛋白的酸溶性蛋白質(zhì)的用途，用于制備用于增強胰島素分泌和/或胰島素原基因表達的消費品或藥物。
7.來自膠束酪蛋白的酸溶性蛋白質(zhì)的用途，用于制備用于預(yù)防或治療I型和/或II型糖尿病的消費品或藥物。
8.來自膠束酪蛋白的酸溶性蛋白質(zhì)的用途，用于制備用于增加GLP-1和/或GLP-2分泌和/或調(diào)節(jié)血液中葡萄糖濃度的消費品或藥物。
9.來自膠束酪蛋白的酸溶性蛋白質(zhì)的用途，用于制備用于降低胃排空和酸分泌的消費品或藥物。
10.來自膠束酪蛋白的酸溶性蛋白質(zhì)的用途，用于制備用于調(diào)節(jié)食欲，降低食物攝取和/或增加飽滿感的消費品或藥物。
11.來自膠束酪蛋白的酸溶性蛋白質(zhì)的用途，用于制備消費品或藥物，所述消費品或藥物用于治療以受傷或功能異常為特征的腸疾病和/或用于增加腸粘膜的厚度和/或表面積。
12.消費品，其包含根據(jù)權(quán)利要求2-5任一項的任一種蛋白質(zhì)級分或亞級分。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過酸化膠束酪蛋白并將沉淀的酪蛋白即酸溶性蛋白質(zhì)從膠束酪蛋白中分離可以獲得的奶級分。發(fā)現(xiàn)奶級分，特別是其某些亞級分具生物活性并且在體外促進GLP－1釋放?；谶@些結(jié)果，來自膠束酪蛋白的酸溶性蛋白質(zhì)可用于治療和預(yù)防II型糖尿病、肥胖癥并可進一步添加到針對處理胃腸道的其它目的的配方中。
文檔編號A23J3/32GK1860131SQ03827177
公開日2006年11月8日 申請日期2003年8月30日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月30日
發(fā)明者S·格萊姆里希, L·博韋托, C·梅斯 申請人:雀巢技術(shù)公司