專(zhuān)利名稱(chēng)：人α1-胸腺肽基因多拷貝定向克隆及高效表達(dá)的制作方法
胸腺肽主要由胸腺上皮細(xì)胞分泌，是一種細(xì)胞免疫增強(qiáng)劑，具有促進(jìn)淋巴細(xì)胞成熟和增強(qiáng)人體免疫功能，起著對(duì)機(jī)體抗感染的保護(hù)性作用。
年老、體弱及免疫功能低下者應(yīng)用胸腺肽可增加機(jī)體免疫功能。胸腺肽在臨床主要用于原發(fā)性和繼發(fā)性免疫缺陷癥，如各種肝炎、肝硬化、暴發(fā)性肝衰竭、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、風(fēng)濕、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等，及各種惡性腫瘤前期及化療、放療的輔助用藥。另外，胸腺肽作為一種免疫增強(qiáng)劑，對(duì)非典型性肺炎可能有預(yù)防和治療作用。
目前臨床應(yīng)用的胸腺肽有多種劑型如胸腺肽片劑、顆粒劑和注射針劑等。我國(guó)臨床應(yīng)用的胸腺肽主要是由小牛胸腺和豬胸腺提取精制而成的多肽類(lèi)激素。
α1-胸腺肽(α1-thymosin)是Goldstein等1977年首次在胸腺組織內(nèi)發(fā)現(xiàn)。在體內(nèi)它是由111個(gè)氨基酸組成的前體α1-胸腺肽原(prothymosin)經(jīng)酶解加工產(chǎn)生的。成熟的α1-胸腺肽由28個(gè)氨基酸組成，其序列為Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-ILe-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Glu-Lys-lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn成熟的α1-胸腺肽分子量為3108道爾頓，等電點(diǎn)為4.2。α1-胸腺肽除了存在于胸腺細(xì)胞，T-淋巴細(xì)胞以及胸腺組織外，在肝、腎、心、肺、脾等器官也有分布。α1-胸腺肽作為一種廣譜免疫調(diào)節(jié)劑，臨床結(jié)果已顯示其對(duì)乙型肝炎和丙型肝炎有顯著療效，對(duì)腫瘤和愛(ài)滋病也有一定療效。此外，α1-胸腺肽還可用作疫苗輔助藥劑，以增強(qiáng)免疫機(jī)能衰弱的患者對(duì)疫苗(如流感疫苗及乙肝疫苗)的應(yīng)答能力。
α1-胸腺肽早在1977年就被發(fā)現(xiàn)，其專(zhuān)利保護(hù)期已過(guò)。目前進(jìn)口的α1-胸腺肽采用化學(xué)合成方法制備。目前國(guó)家醫(yī)藥管理局有批文的國(guó)產(chǎn)的-胸腺肽都是從?；蜇i中提取，其成本較高，原料來(lái)源的數(shù)量和質(zhì)量受限制，產(chǎn)品純度低、每批量的效價(jià)多不一致。
本發(fā)明采用基因工程方法生產(chǎn)人α1-胸腺肽基因多拷貝定向克隆及高效表達(dá)的技術(shù)。該技術(shù)將α1-胸腺肽基因在大腸桿菌中高效表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)親和層析，純化。因其在生物體內(nèi)自然合成，可以保持蛋白質(zhì)原有的天然狀態(tài)的空間構(gòu)象，與化學(xué)合成α1-胸腺肽相比效價(jià)極高；另外經(jīng)親和層析純化，樣品純度高。用基因工程方法制備人α1-胸腺肽基因多拷貝定向克隆及高效表達(dá)的工藝流程如

圖1所示。
本產(chǎn)品的特點(diǎn)(1)保證產(chǎn)品的質(zhì)量的一致性，不受原料來(lái)源的限制。
特別是為加強(qiáng)對(duì)防治“非典”藥品的監(jiān)督管理，國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局藥品安全監(jiān)管司于2003年4月29日下發(fā)了《關(guān)于開(kāi)展胸腺肽制劑生產(chǎn)企業(yè)專(zhuān)項(xiàng)檢查的緊急通知》(國(guó)食藥監(jiān)安〔2003〕30號(hào))。其中第一點(diǎn)為加強(qiáng)胸腺肽制劑起始原料(健康豬或小牛胸腺)來(lái)源的監(jiān)督管理。胸腺肽制劑起始原料來(lái)源的質(zhì)量直接影響最終成品的質(zhì)量。各胸腺肽制劑生產(chǎn)企業(yè)必須明確所采購(gòu)的起始原料的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，嚴(yán)格按質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)入，且進(jìn)貨單位應(yīng)保持相對(duì)固定；各胸腺肽制劑生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)加強(qiáng)對(duì)起始原料進(jìn)貨單位的質(zhì)量體系進(jìn)行評(píng)估，確保起始原料的質(zhì)量穩(wěn)定可靠。
而重組人α1-胸腺肽可以保證產(chǎn)品的質(zhì)量的一致性，不受原料來(lái)源的限制。
(2)純化方便，成本低，理論上菌種可以無(wú)限期保存。
(3)避免了化學(xué)合成的副產(chǎn)物毒性的憂(yōu)慮。
(4)由于是生物體內(nèi)產(chǎn)品，在保證該蛋白的天然構(gòu)像和活性方面更具優(yōu)勢(shì)。
根據(jù)世界衛(wèi)生組織1997年的報(bào)告，全球有20億人口曾經(jīng)感染過(guò)乙型肝炎病毒，其中有3.5億患者轉(zhuǎn)化為慢性乙型肝炎。1997年全球感染丙型肝炎病毒的人口達(dá)1.7億，其中約有20％的患者將會(huì)發(fā)展成肝硬化或肝癌。α1-胸腺肽自1998年正式上市以來(lái)，其銷(xiāo)售額突飛猛進(jìn)。
根據(jù)α1-胸腺肽對(duì)乙型和丙型肝炎的臨床療效，可預(yù)期α1-胸腺肽在中國(guó)應(yīng)有較好的市場(chǎng)。中國(guó)乙型肝炎的發(fā)病率高，估計(jì)約有6千萬(wàn)人患有慢性肝炎。若每年有1％的患者需接受臨床治療，且其中有20％的患者使用α1-胸腺肽，則每年需要α1-胸腺肽的量約為10千克(60萬(wàn)人×20％×1.6毫克×2次/周×26周＝9.984千克)，此外，α1-胸腺肽用于治療丙型肝炎以及作為廣譜免疫增強(qiáng)劑(如作免疫佐劑)也有一定市場(chǎng)。估計(jì)每年國(guó)內(nèi)所需α1-胸腺肽的用量應(yīng)達(dá)12千克。
以下是具體方法的詳細(xì)描述1 材料表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-1， Pharmacia公司；菌種BL21(F-，ompT，RB-，mB-)， Pharmacia公司；谷胱甘肽Sepharose 4B親和柱，Pharmacia公司；Sephacryl-S100，Pharmacia公司；限制性?xún)?nèi)切酶Biolab公司；T4連接酶MBI公司；異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)，Sigma公司；凝血酶(thrombin)， Sigma公司；
β-巰基乙醇，Sigma公司；PCR引物 上海生工生物有限公司。
DNA Thermal Cycler 480PCR儀，PE公司；BIOSTATB發(fā)酵系統(tǒng)，B.Braun Biotech Inc.；121B氨基酸自動(dòng)分析儀， Beckman公司。
2 表達(dá)載體的構(gòu)建(1)基因重組操作和PCR擴(kuò)增.
α1-胸腺肽原的序列為CcccactggctgctctgaaaagccatctttgcattgttcctcatccgcctccttgctcgccgcagccgcctccgccgcgcgcctcctccgccgccgcggactccggcagctttatcgccagagtccctgaactctcgctttctttttaatcccctgcatcggatcaccggcgtgccccaccatgtcagacgcagccgtagacaccagctccgaaatcaccaccaaggacttaaaggagaagaaggaagttgtggaagaggcagaaaatggaagagacgcccctgctaacgggaatgctaatgaggaaaatggggagcaggaggctgacaatgaggtagacgaagaagaggaagaaggtggggaggaagaggaggaggaagaagaaggtgatggtgaggaggagggtggagatgaagatgaggaagctgagtcagctacgggcaagcgggcagctgaagatgatgaggatgacgatgtcgataccaagaagcagaagaccgacgaggatgactagacagcaaaaaaggaaaagttaaactaaaaaaaaaaaggccgccgtgacctattcaccctccacttcccgtctcagaatctaaacgtggtcaccttcgagtagagaggcccgcccgcccaccgtgggcagtgccacccgcagatgacacgcgctctccaccacccaacccaaaccatgagaatttgcaacaggggaggaaaaaagaaccaaaacttccaaggccctgctttttttcttaaaagtactttaaaaaggaaatttgtttghThymosin-pGEX-4T-1質(zhì)粒的具體構(gòu)建過(guò)程見(jiàn)圖2。步驟為(a)設(shè)計(jì)引物xxt1和xxt2，序列如下。通過(guò)xxt1和xxt2從人總cDNA中通過(guò)PCR方法克隆到人α1-胸腺肽的cDNA序列，同時(shí)在此序列兩端引Thrombin切割位點(diǎn)和BamHI切割位點(diǎn)。
xxt15’-CG GGATCC GACGCAGCCGTAGACACC-3’xxt25’-CG GGATCC CCGATTTTCTGCCTCTTCCAC-3’(b)用BamHI切割載體pZeroT，與含有Thrombin切割位點(diǎn)的人胸腺肽片段連接。得到含有多基因片段的非定向連接?？赡芎?個(gè)，2個(gè)，3個(gè)，4個(gè)，5個(gè)或更多個(gè)人胸腺肽基因片段。
(c)用酶切割這些質(zhì)粒，由于頭頭相接和尾尾相接的序列含有特定的酶切位點(diǎn)，它們都被切斷，只流下頭尾相連的序列。得到含有多基因片段的定向連接。頭頭相接序列含有Acc III的酶切位點(diǎn)，TCCGGA。尾尾相接的序列含有Eco52 I的酶切位點(diǎn)，CGGCCG。
(d)把質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coli BL21中擴(kuò)增。
(e)提取質(zhì)粒。
(f)通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳鑒定分離含有5個(gè)人胸腺肽基因的質(zhì)粒。
(g)通過(guò)PCR引入在含有5個(gè)人胸腺肽基因的目的片段兩端引入EcoRI和Not I酶切位點(diǎn)。
(g)EcoR I和Not I酶切，與同酶切后的pGEX-4T-1質(zhì)粒連接得到hThymosin-pGEX-4T-1質(zhì)粒。
3 發(fā)酵，誘導(dǎo)表達(dá)及分離純化將表達(dá)載體轉(zhuǎn)入E.coli BL21，挑單一陽(yáng)性克隆接種入2xYT培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜；再以1∶100擴(kuò)大培養(yǎng)，當(dāng)菌長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，以此為種子1∶10上發(fā)酵罐.保持合適的溶氧和pH值，當(dāng)通氣量和轉(zhuǎn)速達(dá)到最大，菌發(fā)酵至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，加入IPTG(200μmol/L)誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白；4h后下罐離心。將收獲的菌體懸浮于冰預(yù)冷的PBS，冰浴中超聲波破碎細(xì)胞，而后加入Triton X-100(1％)，柔和攪拌約30min后離心。上清液上Glutathione Sepharose 4B親和柱，20倍柱床體積的PBS洗滌后，加凝血酶酶切液(1.5mg/mL凝血酶，0.05mol/LTris-Hcl，pH8.0)25℃原位酶切16h。下柱液上10mmol/L NH4HCO4預(yù)平衡的Sephacryl-S100柱，紫外280nm吸收檢測(cè)，收集蛋白峰，凍干。
4 氨基酸組成分析蛋白質(zhì)樣品用鹽酸水解，而后上氨基酸自動(dòng)分析儀分析。
5 質(zhì)譜法測(cè)定分子量蛋白樣品溶于0.1％(體積比)的TFA中，上質(zhì)譜儀測(cè)定。
6 蛋白質(zhì)含量測(cè)定蛋白樣品加入到一定體積的DC Protein Assay(BIO-RAD)試劑中，室溫反應(yīng)，60min內(nèi)測(cè)定700nm處光吸收，以牛血清清蛋白(BSA)作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算蛋白含量。
在表達(dá)中，本發(fā)明采用了發(fā)酵的方法，由于比搖瓶有更好的條件控制，使重組蛋白的得率約為搖瓶的8倍多。這為重組人α1-胸腺肽大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)打下了基礎(chǔ)。
權(quán)利要求
1.本發(fā)明涉及一種采用基因工程方法生產(chǎn)人α1-胸腺肽基因多拷貝定向克隆及高效表達(dá)的方法。該技術(shù)將α1-胸腺肽基因在大腸桿菌中高效表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)親和層析，純化。因其在生物體內(nèi)自然合成，可以保持蛋白質(zhì)原有的天然狀態(tài)的空間構(gòu)象，與化學(xué)合成α1-胸腺肽相比效價(jià)極高；另外經(jīng)親和層析純化，樣品純度高。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述，該方法包括以下步驟(1)表達(dá)載體的構(gòu)建(2)生產(chǎn)菌種(3)種子培養(yǎng)(4)發(fā)酵，誘導(dǎo)表達(dá)(5)收集并破碎菌體，取上清液(6)GST親和層析(7)凝血酶切割(8)凝膠過(guò)濾層析(9)凍干
全文摘要
本發(fā)明采用基因工程方法高效生產(chǎn)重組人α1－胸腺肽的技術(shù)。該技術(shù)將α1－胸腺肽基因在大腸桿菌中多拷貝插入并高效表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)親和層析一步純化得到天然純品。因其在生物體內(nèi)自然合成，可以保持蛋白質(zhì)原有的天然狀態(tài)的空間構(gòu)象，與化學(xué)合成α1－胸腺肽相比本產(chǎn)品效價(jià)提高顯著；另外經(jīng)親和層析純化，樣品純度高。本產(chǎn)品的特點(diǎn)(1)保證產(chǎn)品的質(zhì)量的一致性，不受原料來(lái)源差異性的限制。(2)純化方便，成本低，理論上菌種可以無(wú)限期保存。(3)避免了化學(xué)合成中副產(chǎn)物毒性的憂(yōu)慮。(4)由于是生物體內(nèi)產(chǎn)品，在保證該蛋白的天然構(gòu)象和活性方面更具優(yōu)勢(shì)。
文檔編號(hào)C12N15/12GK1528903SQ200310100199
公開(kāi)日2004年9月15日 申請(qǐng)日期2003年10月17日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月17日
發(fā)明者任宏偉, 徐明旭, 韓鐵鋼 申請(qǐng)人:任宏偉, 徐明旭, 韓鐵鋼