專利名稱：一種高表達(dá)重組蛋白與高產(chǎn)桿狀病毒的基因工程細(xì)胞系的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬基因工程、細(xì)胞工程和生物防治技術(shù)領(lǐng)域。
二、本發(fā)明的研究背景桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)(The baculovirus-insect cell expressionsystem)是目前廣泛應(yīng)用于真核蛋白表達(dá)最有效的系統(tǒng)之一(Summers，M.D.等，1987，Texas Agricultural Experiment Station Bulletin，1555；O’Reilly，D.R.等，1992，Baculovirus Expression VectorA Laboratory Manual，W.H.Freeman and Company，New York，NY，USA)。該系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)是桿狀病毒載體能誘導(dǎo)大量的重組蛋白產(chǎn)生，而昆蟲細(xì)胞又有加工蛋白的能力。但是由于蛋白產(chǎn)生是病毒侵染以后在寄主細(xì)胞內(nèi)持續(xù)進(jìn)行，所以寄主細(xì)胞的生理狀態(tài)(如翻譯水平、分泌能力和加工質(zhì)量等)就可直接影響蛋白的生產(chǎn)。目前人們已利用sf-9，sf-21，Tn5B1-4(High Five)等多種細(xì)胞系成功地表達(dá)和生產(chǎn)重組蛋白(Summers，M.D.等，1987，TexasAgricultural Experiment Station Bulletin，1555；O’Reilly，D.R.等，1992，BaculovirusExpression VectorALaboratory Manual，W.H.Freeman and Company，New York，NY，USA；Granados，R.R.等，1994，J.Invert.Pathol.，64260-266；Altmann，F(xiàn).等，1999，Glycoconj J.，16109-123；Jarvis，D.L.，1997，In L.K.Miller等.TheBaculoviruses，389-431，Plenum Press，NY，USA)。
但這一系統(tǒng)還存在如下的一些缺點(diǎn)，因而就限制了它的廣泛應(yīng)用首先，由于昆蟲細(xì)胞產(chǎn)生糖基轉(zhuǎn)移酶的能力較弱，影響表達(dá)水平(Altmann，E.等，1999，Glycoconj J.，16109-123；Jarvis，D.L.，1997，In L.K.Miller等.The Baculoviruses，389-431，Plenum Press，NY，USA；Jarvis，D.L.等，1998，Curt.Opin.Biotechnol.，9528-533；Marchal，I.等，2001，Biol.Chem.，382151-159)；其次，病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡也是產(chǎn)量降低的重要因素(Hershberger，P.A.等，1994，J.Virol.，683467-3477；Clem，R.J.等，1991，Science，2541388-1390；Rabizadeh，S.等，1993，J.Neurochem.，612318-2321；Beidler，D.R.等，1995，J.Biol.Chem.，27016，526-528；Robertson，N.M.等，1997，Cancer Res.，5743-47)。
這些因素都直接影響和限制該系統(tǒng)在表達(dá)重組蛋白和生產(chǎn)病毒方面的應(yīng)用。因此，利用基因工程手段構(gòu)建新的病毒-細(xì)胞表達(dá)體系，就是解決重組蛋白高表達(dá)和病毒高產(chǎn)問題的良好途徑。更重要的是，它能夠?yàn)楦哔|(zhì)量重組蛋白的大量生產(chǎn)和生物防治藥物的開發(fā)提供有效的途徑，因此具有廣泛的實(shí)用性。
三、本發(fā)明的目的利用已建立的細(xì)胞系構(gòu)建基因工程細(xì)胞，改變其遺傳特性，提高其利用率，提高其表達(dá)重組蛋白的水平和生產(chǎn)有關(guān)病毒的能力，為病毒的工廠化生產(chǎn)和重組蛋白的大量生產(chǎn)提供技術(shù)解決方案，并有利于害蟲的生物防治和其他領(lǐng)域的應(yīng)用。
四、本發(fā)明的技術(shù)方案1.粘蟲細(xì)胞系的建立按照Guoxun Li的方法(1998，Entomologia Sinica，5(1)89-94)，取室內(nèi)飼養(yǎng)粘蟲種群的受精卵，在TC-100培養(yǎng)基中研磨，然后將此組織液稀釋成不同濃度，轉(zhuǎn)移到25cm2的培養(yǎng)瓶中，置28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。連續(xù)觀察其發(fā)育情況，定期更換培養(yǎng)基。半年后產(chǎn)生大量纖維狀組織，8個(gè)月后有少許細(xì)胞形成，約一年左右，細(xì)胞開始分裂并大量增殖，可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。待其生長(zhǎng)穩(wěn)定后，每周傳代兩次。
2.抗細(xì)胞凋亡基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建按Guangyun Lin和Guoxun Li等的方法(2001，In Vitro Cell.Dev.Biol.，37293-302)利用載體質(zhì)粒PIZ/V5-His構(gòu)建抗細(xì)胞凋亡基因重組質(zhì)粒。將載體質(zhì)粒PIZ/V5-His進(jìn)行BamHI和XhoI酶切，將AcMNPV-P35基因(來自于Blissard Gary，Boyce Thompson Institute，ComellUniversity，Ithaca，NY，USA)克隆到該質(zhì)粒中獲得P35重組質(zhì)粒PIZ/V5-His/P35。
3.抗細(xì)胞凋亡基因細(xì)胞系的構(gòu)建利用脂質(zhì)體Cell Fectin(Invitrogen，CarIsbad，CA，USA)介導(dǎo)的方法，按公司的產(chǎn)品說明，將細(xì)胞和抗細(xì)胞凋亡基因重組質(zhì)粒如重組質(zhì)粒PIZ/V5-His/P35混合于一定濃度的反應(yīng)液中，處理6小時(shí)后，棄去處理液，換成TNM-FH生長(zhǎng)培養(yǎng)基，培養(yǎng)48小時(shí)，然后加入Zeocin選擇培養(yǎng)基，培養(yǎng)一周。如此反復(fù)處理三次，即可獲得抗Zeocin的細(xì)胞(即帶P35基因的工程細(xì)胞)。最后，按照Robert R.Granados和Guoxun Li的方法(1994，J.Invert.Pathol.，64260-266)將抗Zeocin的細(xì)胞進(jìn)行克隆，獲得的克隆株再進(jìn)行抗細(xì)胞凋亡基因如P35基因的測(cè)定，即可得到轉(zhuǎn)抗細(xì)胞凋亡基因如轉(zhuǎn)P35基因的細(xì)胞株。
正如在下面的一個(gè)實(shí)施例中所顯示的那樣，測(cè)定P35基因的方法為利用Easy-DNAKit(Invitrogen，CarIsbad，CA，USA)提取克隆株中的DNA，選擇的引物為P35PCR-upCGT GTC CCA GAC GAT TAT TCG AGA TTG TCA；P35PCR-dnCCC CAG CTC GAT TCT GTA GTA AAC TCT AAA。
利用PCR技術(shù)分析P35的存在。
4.轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的生物學(xué)特性的觀察和測(cè)定(1)細(xì)胞形態(tài)在TNM-FH培養(yǎng)基中，28℃下培養(yǎng)3天，在倒置相差顯微鏡下觀察，大部分細(xì)胞為長(zhǎng)梭狀，少部分為圓形，貼壁較強(qiáng)。
(2)細(xì)胞生長(zhǎng)按Robert R.Granados和Guoxun Li(1994，J.Invert.Pathol.，64260-266)的方法，測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)曲線和群體倍增時(shí)間。將培養(yǎng)3天的細(xì)胞按1.0×106細(xì)胞/5ml培養(yǎng)基的濃度接入25cm2培養(yǎng)瓶中，28℃培養(yǎng)，每24小時(shí)測(cè)定細(xì)胞濃度，根據(jù)結(jié)果繪制生長(zhǎng)曲線，并按公式T＝1/K，(log N＝logN0+K+log 2)計(jì)算群體倍增時(shí)間。
(3)病毒滴度(TCID50)和產(chǎn)量測(cè)定利用AcMNPV-1A(苜蓿丫紋夜蛾核型多角體病毒，Robert R.Granados，Boyce Thompson Institute，ComellUniversity，Ithaca，NY，USA)為毒源，按MOI＝10(MOI為Multiplicity ofInfection)的接毒量，侵染對(duì)數(shù)期細(xì)胞，28℃培養(yǎng)3天，離心獲得樣品，測(cè)定TCID50。如測(cè)定其產(chǎn)量，需28℃培養(yǎng)4天，在倒置顯微鏡中計(jì)算感染率后，將感染細(xì)胞經(jīng)超聲波裂解，釋放出全部多角體，然后記數(shù)，即可得到多角體產(chǎn)量。
(4)抗逆性測(cè)定取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)細(xì)胞，按1.0×105細(xì)胞/孔的濃度，接于24孔培養(yǎng)板中，28℃培養(yǎng)2小時(shí)使其貼壁，棄去培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液(phosphatebuffered saline，PBS)洗一次后，分別加入PBS和不同濃度(0.15，0.31，0.62，1.25，2.5，5.0，10和25μg/ml)的放線菌素D(Actinomycin D)。對(duì)于PBS處理，每24小時(shí)檢查結(jié)果，并記錄4天內(nèi)的成活率；對(duì)于Actinamycin D處理，則需在細(xì)胞處理一小時(shí)后，棄處理液，換新鮮培養(yǎng)基，24小時(shí)后檢查其成活率，然后提取其DNA(EASY-DNA Kit)。然后用1.2％的瓊脂糖電泳，測(cè)定其DNA降解程度。
5.重組蛋白在基因工程細(xì)胞中的表達(dá)(1)SEAP的表達(dá)將對(duì)數(shù)期細(xì)胞按2×105細(xì)胞/孔的濃度接入24孔板中，28℃使其貼壁1小時(shí)，棄去培養(yǎng)基，用新鮮培養(yǎng)基洗2次，按MOI＝10的接毒量接入重組病毒AcMNPV-SEAP(Davis，T.R.等，1992，Bio/Technology，101148-1150)，不同時(shí)間間隔取樣，在OD405下測(cè)定其光密度，根據(jù)公式ΔOD/min×0.2220.56×18.2×0.002(IU/ml),]]>計(jì)算其表達(dá)量。
(2)β-半乳糖苷酶的表達(dá)供試細(xì)胞按上述(1)的方法準(zhǔn)備，接入重組病毒(AcMNPV-β-gal.)(Davis，T.R.等，1992，Bio/Technology，101148-1150)，感染后每24小時(shí)取樣，測(cè)定8天的β-半乳糖苷酶的表達(dá)。按(OD)(1.5ml)0.0045×18.2×0.002(IU/ml)]]>的公式計(jì)算表達(dá)水平。
6.利用該細(xì)胞系為病毒殺蟲劑工廠化生產(chǎn)提供優(yōu)質(zhì)毒源該細(xì)胞系可被苜蓿丫紋夜蛾核型多角體病毒(AcMNPV)、八字地老虎核型多角體病毒(XcNPV)、粘蟲核型多角體病毒(MsNPV)和甘藍(lán)夜蛾核型多角體病毒(MbNPV)等多種病毒感染。所以可作為多種病毒增殖的載體，進(jìn)行多種病毒的復(fù)制和生產(chǎn)。另外，可通過空斑技術(shù)(Plaque)進(jìn)行病毒克隆，從中獲得高毒力的克隆株，為病毒殺蟲劑工廠化生產(chǎn)提供優(yōu)質(zhì)的毒源。主要技術(shù)是空斑測(cè)定→克隆病毒→生測(cè)篩選→感染細(xì)胞→收獲病毒。
五、本發(fā)明的有益效果本發(fā)明將抗細(xì)胞凋亡基因克隆到PIZ/V5-His質(zhì)粒載體，進(jìn)一步利用脂質(zhì)體(CellFectin)介導(dǎo)到Ms7311細(xì)胞株中，構(gòu)建基因工程細(xì)胞TMs7311，獲得了重組蛋白高表達(dá)和病毒產(chǎn)量增加的新細(xì)胞系，其蛋白表達(dá)水平和病毒產(chǎn)量都顯著地高于國(guó)際上廣泛應(yīng)用的Sf-9和Sf-21。說明通過轉(zhuǎn)基因途徑，可以從遺傳上改變細(xì)胞的生化特性，達(dá)到提高產(chǎn)量和表達(dá)水平的目的。本發(fā)明在重組蛋白、病毒和生物殺蟲劑的高效生產(chǎn)方面具有有益效果。
六

圖1原始細(xì)胞株Ms7311的形態(tài)圖2重組質(zhì)粒PIZ/V5-His/P35的基因圖譜圖3轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株TMs7311的形態(tài)圖4利用PCR技術(shù)測(cè)定細(xì)胞中的P35基因圖5細(xì)胞生長(zhǎng)曲線圖6抗PBS分析感染后1-4天的細(xì)胞成活率圖71μg/ml Actinamycin D(AMD)處理后的形態(tài)學(xué)觀察和電泳分析A.Ms7311細(xì)胞經(jīng)AMD處理后產(chǎn)生的凋亡；B.TMs7311經(jīng)AMD處理后的抗細(xì)胞凋亡圖；C.細(xì)胞經(jīng)1μg/ml AMD處理后的DNA瓊脂糖電泳分析。
圖8SEAP表達(dá)分析圖9β-gal.表達(dá)分析七、本發(fā)明的具體實(shí)施方案以下敘述本發(fā)明的實(shí)施例。應(yīng)該說明的是，這些實(shí)施例對(duì)本發(fā)明只有說明作用，沒有限制作用。
需要特別指出的是，盡管在實(shí)施例中詳盡描述了基因工程細(xì)胞TMs7311的構(gòu)建和表達(dá)，然而這并不意味著本發(fā)明的基因工程細(xì)胞只限于對(duì)上述重組蛋白的表達(dá)和病毒的生產(chǎn)。因此，使用本發(fā)明描述構(gòu)建的P35基因的重組DNA(PIZ/V5-His/P35)以提高細(xì)胞的表達(dá)水平，或者，使用本發(fā)明描述的基因工程細(xì)胞或基因工程細(xì)胞系進(jìn)行各種目的的實(shí)驗(yàn)或生產(chǎn)，其中包括對(duì)重組蛋白的生產(chǎn)和對(duì)病毒的增殖，均包括在本發(fā)明所要求的權(quán)利范圍之內(nèi)。
實(shí)施例1.粘蟲細(xì)胞系Ms7311的建立按Guoxun Li等的方法(1998，Entomologia Sinica，5(1)89-94)，取粘蟲受精卵分別用2％次氯酸鈉和75％的酒精進(jìn)行表面消毒，再用TC-100培養(yǎng)基洗3次，將卵放入新鮮培養(yǎng)基中研碎。按不同濃度轉(zhuǎn)入25cm2培養(yǎng)瓶(Coming，USA)中，放置28℃下培養(yǎng)。一周內(nèi)有貼壁組織形成，2個(gè)月可產(chǎn)生纖維狀組織，半月?lián)Q半量培養(yǎng)基，培養(yǎng)約一年，可見少量細(xì)胞形成，14個(gè)月可大量產(chǎn)生細(xì)胞。待細(xì)胞鋪滿瓶底時(shí)，進(jìn)行第一次傳代，50代后細(xì)胞生物學(xué)特性穩(wěn)定后，可進(jìn)行各種特性的鑒定及用于各種蛋白表達(dá)和病毒生產(chǎn)。將該細(xì)胞系定名為NEAU-Ms-7311(簡(jiǎn)稱Ms7311)(圖1)。
實(shí)施例2.重組質(zhì)粒PIZ/V5-His/P35的構(gòu)建利用載體質(zhì)粒PIZ/V5-His構(gòu)建重組質(zhì)粒PIZ/V5-His/P35。載體質(zhì)粒PIZ/V5-His具有多克隆位點(diǎn)、桿狀病毒早期啟動(dòng)子、V5表位和抗Zeocin基因(圖2)。
經(jīng)PCR擴(kuò)增AcMNPV-P35基因(來自于Blissard Gary，Boyce ThompsonInstitute，Comell University，Ithaca，NY，USA)。其中設(shè)計(jì)的引物為P35upCGT GTC CCA GAC GAT TAT TCG AGATTG TCA；P35dnCCC CAG CTC GAT TCT GTA GTAAAC TCT AAA。
按Guangyun Lin和Guoxun Li等的方法(2001，In Vitro Cell.Dev.Biol.，37293-302)將載體質(zhì)粒PIZ/V5-His進(jìn)行BamHI和XhoI酶切，將AcNPV-P35基因(來自于Blissard Gary，Boyce Thompson Institute，Comell University，Ithaca，NY，USA)克隆到該質(zhì)粒中獲得P35重組質(zhì)粒PIZ/V5-His/P35(圖2)。
實(shí)施例3.轉(zhuǎn)P35基因細(xì)胞的構(gòu)建和克隆通過脂質(zhì)體(Cell Fectin，Invitrogen，Los Angeles，CA，USA)介導(dǎo)，將P35基因轉(zhuǎn)染到Ms7311細(xì)胞中，獲得轉(zhuǎn)P35基因細(xì)胞系。具體步驟如下對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞↓計(jì)數(shù)6孔培養(yǎng)板，濃度為5.0×104cells/well↓28℃條件下培養(yǎng)24小時(shí)↓用無血清培養(yǎng)基洗2次↓
加入轉(zhuǎn)染混合液(3μg DNA/100μl無血清培養(yǎng)基+20μl Cell Fectin/100μl無血清培養(yǎng)基，室溫處理30分鐘，再加入1.8ml無血清培養(yǎng)基)↓轉(zhuǎn)染處理6小時(shí)(28℃)↓棄去轉(zhuǎn)染混合液，換成TNM-FH培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)48小時(shí)，使細(xì)胞恢復(fù)正常狀態(tài)和增殖↓將細(xì)胞按1.0×104cells/well的濃度懸浮后重新接入6孔板，貼壁后換成4.5mg/ml濃度的Zeocin選擇培養(yǎng)基↓28℃培養(yǎng)一周，換新鮮的選擇培養(yǎng)基連續(xù)選擇3次，可獲得抗Zeocin的細(xì)胞(轉(zhuǎn)P35基因的細(xì)胞)抗Zeocin的細(xì)胞用24孔細(xì)胞克隆板完成細(xì)胞克隆，該細(xì)胞克隆板(GreinerLabotechnik，Germany)每個(gè)孔內(nèi)包含16個(gè)2mm2的小格，24孔共含這樣的小格384個(gè)。方法是將細(xì)胞稀釋成每小格有2個(gè)細(xì)胞的濃度(即32細(xì)胞/孔/2ml)，每孔中加入2ml該細(xì)胞懸浮液；28℃下靜置培養(yǎng)2小時(shí)，在倒置相差顯微鏡下觀察并記錄下只含1個(gè)細(xì)胞的小格；28℃下培養(yǎng)一周后，檢查并記錄已增殖的細(xì)胞，待增殖長(zhǎng)滿小格底部后，小心取出，轉(zhuǎn)入96孔板中增殖，在選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)至底部長(zhǎng)滿細(xì)胞后再轉(zhuǎn)入24孔板，最后轉(zhuǎn)入25cm2培養(yǎng)瓶，反復(fù)克隆三次即獲得轉(zhuǎn)P35基因的細(xì)胞克隆株(圖3)。將該克隆株命名為TMs7311。
實(shí)施例4.轉(zhuǎn)P35基因細(xì)胞中P35基因的測(cè)定利用PCR技術(shù)，測(cè)定轉(zhuǎn)P35基因的細(xì)胞克隆株TMs7311中P35和抗ZeocinDNA的存在。DNA提取按Easy-DNAKit(Invitrogen，CarIsbad，CA，USA)的產(chǎn)品說明。用獲得的DNA制備PCR反應(yīng)液基因組DNA 50μg/μl1μl引物 10pmol/μl 1μl×2PIZ/Ac-P35不同濃度7.0×10ng/μl-7.0×1012ng/μl 1μl
PCR混合液 12.5μldH2O 調(diào)整到最后量為25.0μl反應(yīng)條件95℃ 2分鐘95℃/45秒，55℃/45秒，72℃/2分鐘30個(gè)循環(huán)72℃ 5分鐘引物P35upCGT GTC CCA GAC GAT TAT TCG AGA TTG TCAP35dnCCC CAG CTC GAT TCT GTA GTA AAC TCT AAA從PCR檢測(cè)結(jié)果獲得轉(zhuǎn)P35基因的細(xì)胞株(圖4)。
實(shí)施例5.轉(zhuǎn)P35基因細(xì)胞系TMs7311的生物學(xué)特性的觀察和測(cè)定(1)形態(tài)特征采用TNM-FH(含10％小牛血清)培養(yǎng)基，按1∶10的比例，將TMs7311每周傳代2次，28℃下培養(yǎng)。三日齡的細(xì)胞在相差顯微鏡下觀察，大部分(80％)細(xì)胞為長(zhǎng)梭狀，少部分為圓形，與原始細(xì)胞比較有較大的差異(圖1和圖3)。
(2)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線取三日齡的細(xì)胞，按1.0×106細(xì)胞/瓶的濃度接入25cm2培養(yǎng)瓶中，放置室溫使細(xì)胞貼壁2小時(shí)，棄去舊培養(yǎng)基，換成新鮮培養(yǎng)基，該時(shí)刻定為零時(shí)間。然后每隔24小時(shí)取樣，測(cè)定細(xì)胞濃度。采用Ping Wang(1992，Journal of Invertebrate Pathology，5946-53)的方法，計(jì)算細(xì)胞的生長(zhǎng)速率并繪制細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線和計(jì)算其群體倍增時(shí)間(圖5)。
(3)營(yíng)養(yǎng)抗性的測(cè)定取對(duì)數(shù)期的TMs7311細(xì)胞，按1.0×105細(xì)胞/孔的濃度接入24孔板中，28℃下培養(yǎng)2小時(shí)，使其貼壁，然后棄去培養(yǎng)基，用PBS洗一次，再加入1ml PBS緩沖液，不同時(shí)間間隔取樣，用臺(tái)盼藍(lán)染色，測(cè)定細(xì)胞的存活率。從結(jié)果可看出，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的抗逆性明顯強(qiáng)于原始細(xì)胞系(圖6)。
(4)抗放線菌素D(Actinamycin D)的測(cè)定取對(duì)數(shù)期的TMs7311細(xì)胞，按1.0×106細(xì)胞/瓶的濃度接入25cm2培養(yǎng)瓶中，28℃下靜置培養(yǎng)使其貼壁2小時(shí)，然后用不同濃度的放線菌素D(0.15，0.31，0.62，1.25，2.5，5.0，10和25μg/ml)處理1.0小時(shí)，然后換成新鮮培養(yǎng)基，28℃下培養(yǎng)24小時(shí)。觀察其產(chǎn)生細(xì)胞凋亡的情況，并按Easy-DNA Kit(Invitrogen，CarIsbad，CA，USA)提供的方法，提取DNA，經(jīng)1.2％的瓊脂糖電泳，觀察其DNA基因組的降解(見附圖7A、B、C)。從結(jié)果可以看出，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞只有少數(shù)產(chǎn)生凋亡，基因組不被降解。
實(shí)施例6.病毒產(chǎn)量(OB和BV)的測(cè)定取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，按每孔5×105細(xì)胞接入24孔板中，28℃下培養(yǎng)2小時(shí)，使其貼壁，棄去上清液后接入0.2ml的病毒懸浮液(MOI＝10)，培養(yǎng)2小時(shí)使病毒吸附，棄去接種物后用新鮮培養(yǎng)基洗2次，最后加入1ml培養(yǎng)基，28℃下培養(yǎng)4天，記錄侵染率。最后將細(xì)胞懸浮并用超聲波裂解，使多角體完全釋放。在顯微鏡下用血球計(jì)數(shù)板測(cè)定每細(xì)胞多角體的產(chǎn)量。
對(duì)于芽生病毒(Budded Virus或BV)的測(cè)定，參照Granados和李國(guó)勛(1994，J.Invert.Pathol.，64260-266)的方法測(cè)定TCID50/ml。
從測(cè)定結(jié)果可以看出，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞在多角體產(chǎn)量和BV產(chǎn)量都明顯高于原始細(xì)胞株(見表1)。
表1 轉(zhuǎn)基因細(xì)胞(TMs7311)與野生株(Ms7311)病毒產(chǎn)量比較AcMNPV病毒產(chǎn)量細(xì)胞多角體/細(xì)胞(OBs/cell) 芽生病毒(TCID50/ml)Ms7311 86.62.47×107TMs7311110 3.82×107Sf-9 40 1.45×108實(shí)施例7.堿性磷酸酶(SEAP)和β-半乳糖苷酶(β-gal.)的表達(dá)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，按每孔5×105細(xì)胞接入24孔板中，貼壁2小時(shí)后，棄去舊的培養(yǎng)基，并將重組病毒AcMNPV-SEAP和AcMNPV-β-gal.按一定的侵染指數(shù)(MOI＝10)感染細(xì)胞。使其吸附1小時(shí)，棄去接種物后用新鮮培養(yǎng)基洗2次，換新鮮培養(yǎng)基，在28℃下培養(yǎng)，不同時(shí)間間隔取樣，按Davis等(1992，Bio/Technology，101148-1150)的方法，測(cè)定重組病毒的表達(dá)，然后按下列計(jì)算公式求得表達(dá)的量
β-gal.(1u/ml)=OD4200.003×2(min)×0.002(ml)]]>結(jié)果見圖8和圖9。
權(quán)利要求
1.一種轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，其特征是該細(xì)胞系帶有轉(zhuǎn)入的具有抗細(xì)胞凋亡功能的基因。
2.權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，其中所說的具有抗細(xì)胞凋亡功能的基因是P35基因。
3.一種高效生產(chǎn)重組蛋白的方法，其特征是該方法應(yīng)用權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所說的重組蛋白是農(nóng)業(yè)、醫(yī)療及其他領(lǐng)域中所用的蛋白。
5.權(quán)利要求3的方法，其中所說的重組蛋白是β-半乳糖苷酶(β-gal.)。
6.權(quán)利要求3的方法，其中所說的重組蛋白是堿性磷酸酶(SEAP)。
7.一種高效生產(chǎn)病毒的方法，其特征是該方法應(yīng)用權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所說的病毒是苜蓿丫紋夜蛾核型多角體病毒(AcMNPV)。
全文摘要
本發(fā)明為“一種高表達(dá)重組蛋白與高產(chǎn)桿狀病毒的基因工程細(xì)胞系”，屬基因工程、細(xì)胞工程和生物防治技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系的構(gòu)建、篩選、重組蛋白和病毒在該轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中的高效表達(dá)。進(jìn)一步，本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)抗細(xì)胞凋亡基因(P
文檔編號(hào)C12N7/01GK1609201SQ200310101900
公開日2005年4月27日 申請(qǐng)日期2003年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月24日
發(fā)明者李國(guó)勛, 劉大群, 李長(zhǎng)友, 郭巍, 王勤英, 鄭桂玲, 王艷, 陸秀君, 王俊平 申請(qǐng)人:河北農(nóng)業(yè)大學(xué)