專利名稱：一種可以快速靈敏檢測sars病毒的新方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域，涉及一種新的人嚴(yán)重急性呼吸綜合癥(severe acute respiratory syndrome SARS)冠狀病毒檢測技術(shù)，具體涉及一種通過多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)技術(shù)快速靈敏檢測SARS冠狀病毒。
背景知識從2002年11月開始于中國廣東的稱為非典型肺炎的嚴(yán)重急性呼吸綜合癥(severe acute respiratory syndrome SARS)在短短的幾個月之內(nèi)迅速流行到全球30多個國家和地區(qū)，造成全球8千多人感染，死亡8百多人。這是21世紀(jì)出現(xiàn)的第一個嚴(yán)重和易于傳播的新疾病，給人類的生命健康帶來巨大的威脅，也造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。面對這個突然出現(xiàn)的人類災(zāi)難，在世界衛(wèi)生組織和包括我國在內(nèi)的全世界各國科學(xué)家的協(xié)調(diào)努力下，在很短的時間內(nèi)確定了此次疾病流行的病因是一種新的冠狀病毒。隨著冠狀病毒的確定和基因測序的完成，開發(fā)靈敏、特異、快速、準(zhǔn)確的實驗室診斷方法成為一個十分重要和緊迫的問題，這對于病人的早期診治、藥物療效的評價、治愈指標(biāo)的確定及傳染源的及時隔斷都有極為重要的意義。現(xiàn)有的幾種檢測方法大致可分為三類1分子檢測方法(PCR檢測)。PCR可以檢測出在各種樣本(血液，糞便，呼吸道分泌物，組織切片)中的SARS病毒的遺傳物質(zhì)。在WHO的官方網(wǎng)站的網(wǎng)絡(luò)實驗室上公布了7對PCR引物序列并且被世界上的許多國家所使用。目前采用的PCR檢測主要分為三種，一是普通RT-PCR，二是Nested-RT-PCR，但是由于在病人血清中病毒含量不是很高，因此這兩種方法有較高的特異度但卻有較差的靈敏度。第三種是實時熒光定量PCR，此法具有靈敏度極高，特異性更強(qiáng)的特點，并且由于熒光定量PCR技術(shù)能夠快速、精確測定患者體內(nèi)的病毒拷貝數(shù)，這對于目前的特效藥物的篩選和評價工作也有直接的意義。但是由于病毒變種很快、引物設(shè)計等原因，分子檢測方法的檢出率還有待進(jìn)一步提高，同時熒光定量PCR所需要的復(fù)雜和昂貴的設(shè)備會制約其在臨床中的應(yīng)用。2免疫學(xué)方法(抗體檢驗)。免疫學(xué)方法目前有免疫熒光和酶聯(lián)免疫兩種手段，它們具有速度快(一般1-2小時)，操作簡單，成本低，能高通量檢測等特點。由于它的檢測原理是基于用病毒蛋白去檢測患者或疑似患者血液中的抗體，而對血清抗體的研究表明，“非典”病人發(fā)病后，最早的抗體IgM出現(xiàn)要在7天左右，10天時達(dá)到高峰，15天左右下降，抗體IgG10天后產(chǎn)生，20天左右達(dá)到高峰。因此利用免疫學(xué)的方法不能做到早期診斷。3細(xì)胞學(xué)方法(細(xì)胞培養(yǎng))。從SARS患者所采集的樣本(如呼吸道分泌物，血液或者糞便)中的病毒，可以通過感染性細(xì)胞培養(yǎng)并產(chǎn)生出病毒，然后在電子顯微鏡下直接觀察病毒顆粒，因而十分準(zhǔn)確。但技術(shù)難度高，操作復(fù)雜，所需時間長，對設(shè)備要求高，不適于大量檢測。
我們的思路得益于我們的SARS病毒cDNA芯片的研究，在實驗過程中我們發(fā)現(xiàn)，在SARS病毒的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中，有一個我們命名為U基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物其表達(dá)量最高，在病人血清的檢測中也發(fā)現(xiàn)同樣的現(xiàn)象，本專利就是利用該基因作為檢測的靶序列用來檢測SARS冠狀病毒。

發(fā)明內(nèi)容
該技術(shù)來源于在對SARS病毒基因芯片研究的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)在SARS病毒的生命周期中，有一個我們命名為U的基因在病毒的生命周期中最先表達(dá)并且表達(dá)量最高?；谝陨习l(fā)現(xiàn)我們設(shè)計了針對該區(qū)域段的多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)多對引物，利用一步PCR技術(shù)對SARS病毒進(jìn)行檢測，在所設(shè)計的50對引物中都能靈敏檢測SARS冠狀病毒。我們選取其中的一對引物進(jìn)行了更為詳細(xì)的研究，通過對不同病人臨床標(biāo)本的處理并且同世界衛(wèi)生組織公布的7對引物進(jìn)行比較，在臨床標(biāo)本的檢測上，我們所設(shè)計的引物具有更高的靈敏度，檢測率明顯優(yōu)于已有的PCR檢測方法。
本專利涉及的主要技術(shù)包括臨床樣品的處理，檢測方法的建立以及檢測結(jié)果的判定。臨床標(biāo)本包括病人血清，病人糞便以及病人咽拭子漱口液，以上病人標(biāo)本通過裂解提取病毒核酸，該病毒核酸作為病毒檢測模板。病毒核酸利用隨機(jī)引物逆轉(zhuǎn)錄方法將病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后通過PCR擴(kuò)增方法進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果通過瓊脂糖凝膠電泳方法進(jìn)行檢測。同時回收PCR產(chǎn)物進(jìn)行核苷酸序列測定，序列測定結(jié)果表明與病毒U基因序列完全一致，表明是特異性的PCR擴(kuò)增，可以作為一種SARS病毒的特異性檢測方法。
具體實施例方式
實施方案1 特異性擴(kuò)增靶基因U基因的確定首先收集SARS病毒細(xì)胞培養(yǎng)物以及不同時相的病毒細(xì)胞培養(yǎng)物，加入TRIZOL裂解液(購自Invitrogen公司)，根據(jù)廠家提供的實驗方法提取病毒RNA。病毒RNA經(jīng)過翻轉(zhuǎn)錄標(biāo)記后與我們所制備的SARS病毒cDNA芯片進(jìn)行雜交，雜交結(jié)果通過Genepix4000B(Axon公司)掃描分析，根據(jù)多次基因芯片的研究結(jié)果，確定我們命名為U基因是一種高轉(zhuǎn)錄拷貝基因，可以作為SARS病毒的檢測靶位。
實施方案2PCR擴(kuò)增檢測引物的確定針對U基因的核苷酸序列，利用生物分析軟件ARRAYDESIGENER分析設(shè)計50對PCR引物，PCR引物涉及不同的位置和不同長度的PCR產(chǎn)物。
實施方案3臨床標(biāo)本的處理一、試劑氯仿；異丙醇；75％乙醇(DEPC處理過的水配制)；無RNA酶水配制0.5％SDS，購自INVITROGEN公司的TRIZOLRNA提取試劑盒。
二、步驟●加入適量的TRIZOL裂解病人臨床標(biāo)本包括病人血清，病人糞便以及病人咽拭子漱口液；●室溫靜置5min，按每1ml TRIZOL加入0.2ml氯仿，用手劇烈震動15sec，室溫靜置2-3min，12000g離心15min，吸取RNA水相；●水相與異丙醇混合，按每1ml TRIZOL加入0.5ml異丙醇，室溫靜置10min，4℃12000g離心10min；●吸取上清，按每1mlTRIZOL加入1ml 75％乙醇，振蕩器震蕩，4℃ 12000g離心10min；●棄上清，干燥，重溶于Rnase-free水配成的0.5％SDS中，55-60℃水浴10min，-70℃保存。
實施方案4 PCR檢測方法
如實施方案3處理臨床標(biāo)本所得到的病毒RNA按照以下技術(shù)路線建立SARS冠狀病毒的PCR檢測技術(shù)平臺。
第一步將濃度為100pmol/ul Random Primer 1ul；RNA模板1-2ul(總量1ng-1ug的total RNA)；濃度為10Mm dNTP 1ul；加水8ul，混勻，離心后95℃反應(yīng)10min。
第二步加入5*first buffer 4ul；濃度為40U/ul Rnasin 1ul?；靹颍x心后25℃反應(yīng)10min。
第三步加入superscript II 1ul，混勻，離心后42℃反應(yīng)1hr。
第四步將前面的反應(yīng)產(chǎn)物取出5ul進(jìn)行電泳檢測。
第五步PCR擴(kuò)增首先將前面的產(chǎn)物(前面最終的RT產(chǎn)物)2ul；上游引物primer-10.5ul；下游引物primer-2 0.5ul；10*PCR buffer 5ul；Taqpolymerase 1ul；濃度為10Mm的dNTP 1ul；加水40ul?；靹颍x心然后，94℃ 5min后按照94℃反應(yīng)30sec，55℃反應(yīng)30sec，72℃反應(yīng)1min的順序重復(fù)進(jìn)行30個循環(huán)。最后，取出5ul PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，目的條帶出現(xiàn)于269bp處。
實施方案5 PCR檢測產(chǎn)物的確定為了進(jìn)一步確定實施方案4種的PCR產(chǎn)物為SARS冠狀病毒所特異的，而不是來源細(xì)胞或組織的污染，上述PCR產(chǎn)物通過QIAGEN公司的PCR產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行回收純化，然后由博亞生物技術(shù)公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果表明為SARS冠狀病毒U基所特異的核苷酸序列。
實施方案6，臨床標(biāo)本的檢測結(jié)果根據(jù)實施方案4和實施方案5所建立的SARS冠狀病毒檢測技術(shù)平臺，對收集于北京宣武醫(yī)院14例SARS病人漱口液臨床標(biāo)本進(jìn)行檢測，14例臨床標(biāo)本全部為陽性，同時我們用WHO公布的套式PCR引物進(jìn)行對比試驗，14例臨床標(biāo)本也全部為陽性。結(jié)果表明該發(fā)明專利所建立的一步PCR檢測技術(shù)同多步的套式PCR方法具有同樣的靈敏度，但本發(fā)明專利所建立的方法更為簡單，同時也避免了多步套式PCR方法容易造成污染的問題。
權(quán)利要求
1.本發(fā)明屬于生物技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域，涉及人嚴(yán)重急性呼吸綜合癥(servere acuterespiratory syndrome SARS)冠狀病毒檢測技術(shù)，具體涉及通過多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)技術(shù)，針對SARS冠狀病毒特異性的靶基因U，快速靈敏檢測SARS冠狀病毒。該特異性基因特征在于位于SARS冠狀病毒Tor2株的29130-28426位，或其它SARS冠狀病毒任何與之同源的基因，該靶基因長297bp，編碼98個氨基酸；
2.根據(jù)權(quán)利要求1，特異性靶基因設(shè)計的PCR擴(kuò)增引物，其特征在于可以擴(kuò)增任何任意長度的靶基因序列；
3.根據(jù)權(quán)利要求2，建立的PCR檢測技術(shù)其特征在于可以建立一步PCR擴(kuò)增技術(shù)，也可以建立基于權(quán)利要求1和權(quán)利要求2的實時熒光PCR擴(kuò)增技術(shù)；
4.根據(jù)權(quán)利要求3，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測，其特征在于可以通過簡單的紫外檢測，也可以通過熒光檢測儀檢測；
5.根據(jù)權(quán)利要求1，2，3，4，本發(fā)明專利可以作為SARS冠狀病毒的檢測方法，其特征在于可以用于臨床病人標(biāo)本的檢測，也可以用于環(huán)境中但不局限于水和空氣中SARS冠狀病毒的檢測。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域，涉及一種新的人嚴(yán)重急性呼吸綜合癥(severe acute respiratory syndrome SARS)冠狀病毒檢測技術(shù)，具體涉及一種通過多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)技術(shù)快速靈敏檢測SARS冠狀病毒。通過定位SARS冠狀病毒敏感靶基因，設(shè)計多對PCR檢測引物，建立了一種快速敏感的一步PCR方法檢測SARS冠狀病毒，可用于臨床標(biāo)本的檢測以及環(huán)境中SARS冠狀病毒的監(jiān)控。
文檔編號C12Q1/68GK1609230SQ20031010199
公開日2005年4月27日 申請日期2003年10月21日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月21日
發(fā)明者舒躍龍, 王征, 孫梅生, 侯云德 申請人:北京金迪克生物技術(shù)研究所