專利名稱：特異性識別人腦乙酰膽堿酯酶的核酸適配體及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明主要涉及特異結(jié)合人腦乙酰膽堿酯酶的寡核苷酸適配體、含有它的組合物、檢測或鑒別人腦乙酰膽堿酯酶的方法、診斷或治療與人腦乙酰膽堿酯酶相關(guān)的疾病(特別是神經(jīng)管缺陷和神經(jīng)功能紊亂)的方法和診斷試劑和藥物等。
背景技術(shù)：
SELEX技術(shù)是近年來發(fā)展起來的研究核酸結(jié)構(gòu)、功能及進(jìn)化等的一種新的組合化學(xué)技術(shù)，它不僅在基礎(chǔ)研究、生物篩選等方面有很好的應(yīng)用，而且在臨床診斷方面也顯示廣闊的前景(Brody EN &Gold L，J.Biotechnol.，2000，755-13)。篩選出的寡核苷酸適配子(aptamer)可高親和力和高特異性地識別不同的分子。它的親和力和特異性可與抗體相媲美，被認(rèn)為是“挑戰(zhàn)”抗體地位的一種新型試劑，在疾病的診斷和治療中發(fā)揮越來越重要的作用。SELEX技術(shù)一般需要數(shù)輪或數(shù)十輪才能得到其相應(yīng)配基。最近，Santa-Coloma TA等報道了用靶標(biāo)切換技術(shù)制備的高特異性“polyclonal oligobody(多克隆寡核苷酸適配體)”、“monoclonal oligobody(單克隆寡核苷酸適配體)”或“synthetic oligobody(合成寡核苷酸適配體)”(Bianchini M et al，J.Immunol.methods，2001，252191-197)可特異性地識別相應(yīng)的蛋白質(zhì)，應(yīng)用于蛋白質(zhì)印跡、免疫組化、免疫共沉淀等分析實驗中。
蛋白類抗體的產(chǎn)生與應(yīng)用存在以下限制(1)用毒性抗原時，免疫動物承受不了，免疫原性弱的難以產(chǎn)生抗體；(2)雜交瘤產(chǎn)生于鼠，在人體應(yīng)用受限；異源抗體在診斷中還產(chǎn)生非特異性反應(yīng)(假陽性)；(3)成本高、費時費力，稀有抗體需大量篩選才能得到；(4)克隆細(xì)胞株的有效保存不易，有些雜交瘤難以在體內(nèi)生長；(5)批間質(zhì)量不一，診斷時要重新優(yōu)化；(6)體內(nèi)與體外的識別特異性有差別；(7)抗體-靶分子相互作用的動力學(xué)參數(shù)無法依要求改變；(8)壽命有限，對溫度敏感，發(fā)生不可逆變性。而核酸(適配子或適配體)有以下的優(yōu)越性(1)在體外而非體內(nèi)(動物、細(xì)胞)條件下篩選，特性可依要求改變；(2)動力學(xué)參數(shù)可依體外診斷條件的要求而改變；(3)無毒性抗原和免疫原性弱的抗原所受的限制；(4)在體外化學(xué)合成，可以保證時間、質(zhì)量和數(shù)量；(5)特異性和親和性不受組織或樣品中非靶蛋白的干擾；(6)可以在合成時精確、定點、隨意連接其它功能基團(tuán)和分子，如巰基、氨基和熒光素、生物素、酶等；(7)比抗體分子小，更適用于體內(nèi)影像診斷和治療。如接上硫代磷酸，可用于細(xì)胞內(nèi)診斷和治療；(8)變性和復(fù)性可逆，而且速度快，可反復(fù)使用、長期保存和在室溫下運輸(Jayasena SD，Clin.Chem.，1999，451628-1650)。
乙酰膽堿酯酶(Acetylcholinesterase，AChE，EC 3.1.1.7)是神經(jīng)系統(tǒng)的重要水解酶類，它的主要功能是水解突觸后膜的ACh，從而維持神經(jīng)沖動的正常傳遞。AChE具有分子多樣性(Grisaru D，et al.Eur.J.Biochem.，1999；264672-686)。分子克隆揭示，由AChE的mRNA前體的可變剪接導(dǎo)致三種不同AChE亞型。突觸型AChE(AChE-S)主要分布于神經(jīng)系統(tǒng)和肌肉，它有一個含40個氨基酸殘基的親水性C端。紅細(xì)胞型AChE(AChE-E)分布于成熟紅細(xì)胞表面，可能與假性膽堿酯酶(Butyrylcholinesterase，BChE)一起參與清除血液中的一些酯類化合物。近來稀有的通讀型AChE(AChE-R)被發(fā)現(xiàn)，它以可溶性單體形式存在于胚胎及腫瘤細(xì)胞中，在急性生理應(yīng)激、封閉性顱腦損傷或接觸AChE抑制劑時腦中AChE-R含量顯著上升。突觸型和紅細(xì)胞型AchE的序列大部分相同，僅其C-末端氨基酸殘基不同。由于mRNA前體不同的剪接及翻譯后修飾，紅細(xì)胞型AChE(557aa)比腦型AChE(583aa)少26個殘基。
神經(jīng)管缺陷(neural tube defects，NTDs)是我國最常見的先天畸形，平均發(fā)病率為千分之七。NTD是胚胎期神經(jīng)管未閉所致的畸形，主要包括無腦兒、脊柱裂和腦膨出。NTD嬰兒的出生帶來終身災(zāi)難，給家庭和社會帶來沉重負(fù)擔(dān)。NTD是多基因遺傳病，妊娠期缺乏葉酸及環(huán)境因素影響至關(guān)密切。NTD的產(chǎn)前診斷主要有以下幾種方法(1)母血及羊水甲胎蛋白(AFP)檢查；(2)羊水AChE測定人腦AChE由神經(jīng)組織分泌，當(dāng)脊髓和腦組織暴露在羊水中時，羊水中能測出AChE，正常羊水中測不到AChE。羊膜穿刺時可能由于血樣污染而導(dǎo)致假陽性，所以能區(qū)分人腦AChE和人紅細(xì)胞AChE的試劑在NTD產(chǎn)前診斷中十分有用；(3)B超檢查等方法在妊娠早期不適用。(董學(xué)君，中國優(yōu)生與遺傳雜志，1996，4114-115)。
本發(fā)明的目的主要是產(chǎn)生能區(qū)分突觸型和紅細(xì)胞型AChE的寡核苷酸適配體。它們可應(yīng)用于神經(jīng)管缺損和神經(jīng)功能紊亂(e.g.早老性癡呆)的診斷和治療。

發(fā)明內(nèi)容
人腦AChE和人紅細(xì)胞AChE的區(qū)別在于C-末端的不同。我們利用“靶標(biāo)切換”(target switching)法從二者的差異肽段入手，得到特異的針對人腦AChE的多克隆及單克隆寡核苷酸適配體。篩選出的寡核苷酸適配體特異性高，可明確鑒別人紅細(xì)胞AChE及人腦AChE。此外與人BChE也無交叉反應(yīng)。由此完成本發(fā)明。
因此，一方面，本發(fā)明提供特異結(jié)合人腦乙酰膽堿酯酶的寡核苷酸適配體。
具體地，本發(fā)明的寡核苷酸適配體包含如下的核苷酸序列a)包含序列AAACAXnGYCCC的長15-50nt(包括15-50之間的任何整數(shù)，優(yōu)選15-40nt，更優(yōu)選20-30，最優(yōu)選23-28nt，特別是25nt)或更多的核苷酸序列，其中，每個X分別獨立地是A、T、C或G，n為0-20(包括0-20之間的任何整數(shù)，例如0、1、2、3、4…、10、11、12、18、19、20，優(yōu)選0-15，更優(yōu)選1-10，最優(yōu)選2-4，特別是2和4)的整數(shù)或更多，Y為G或C；
b)SEQ ID NO3的序列；c)在嚴(yán)緊條件下與a)或b)的序列雜交的序列；或d)a)或b)或c)的互補序列。
寡核苷酸雜交的嚴(yán)緊條件是本領(lǐng)域公知的，可參見例如J.Sambrook等編著的《分子克隆實驗指南》第二版或Frederick M.Ausubel等編著的《精編分子生物學(xué)實驗指南》。例如，在低于Tm值15-25℃的溫度下雜交，甚至在低于Tm值5-10℃的溫度下雜交。
在一個實施方案中，本發(fā)明的寡核苷酸適配體是DNA。本發(fā)明的寡核苷酸適配體也可以是RNA，還可以是核酸類似物，例如肽核酸(PNA)。
在一個具體實施方案中，所述寡核苷酸適配體具有SEQ ID NO1、SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的序列。
在另一個具體實施方案中，本發(fā)明的寡核苷酸適配體連接或標(biāo)記了其它功能基團(tuán)或分子，例如巰基、氨基、放射性同位素、熒光素、生物素、毒素、或酶等。這些功能基團(tuán)或分子可以用于標(biāo)記目的以便于檢測或診斷，也可以用于治療目的或其它目的。
本發(fā)明還提供包含所述寡核苷酸適配體的載體和包含本發(fā)明載體的細(xì)胞。載體可以是用于克隆或表達(dá)或其它目的的任何載體，包括但不限于質(zhì)粒、病毒載體。寡核苷酸適配體可以采用適當(dāng)?shù)某Ｒ?guī)方法克隆到載體中。包含本發(fā)明載體的細(xì)胞不受限制，可以是真核細(xì)胞或原核細(xì)胞，例如大腸桿菌細(xì)胞、真菌細(xì)胞如酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞或哺乳動物細(xì)胞或細(xì)胞系。轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染細(xì)胞的方法取決于載體和細(xì)胞的種類等本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的因素，可以采用任何適當(dāng)?shù)姆椒ㄞD(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
另一方面，還提供檢測或鑒別人腦乙酰膽堿酯酶的方法，包括使可能含有人腦乙酰膽堿酯酶的樣品與本發(fā)明的寡核苷酸適配體接觸，并檢測人腦乙酰膽堿酯酶與所述寡核苷酸適配體的結(jié)合。
另一方面，還提供抑制人腦乙酰膽堿酯酶活性或減少人腦乙酰膽堿酯酶的方法，包括給予有效量的本發(fā)明寡核苷酸適配體。該方法可以在體內(nèi)或體外使用。體內(nèi)使用時，使用對象可以是有此需要的任何動物，優(yōu)選哺乳動物，例如人。
本發(fā)明還提供包含本發(fā)明寡核苷酸適配體的診斷試劑或藥物。所述診斷試劑或藥物優(yōu)選用于診斷或治療與人腦乙酰膽堿酯酶相關(guān)的疾病，特別是神經(jīng)管缺陷和神經(jīng)功能紊亂。所述診斷試劑或藥物還可以包含其他適當(dāng)輔助試劑，例如適當(dāng)溶劑、賦形劑。所述藥物也可以聯(lián)合其他活性成分一起使用。藥物的劑型、劑量、給藥方式、頻率可以結(jié)合本發(fā)明的實施例由本領(lǐng)域技術(shù)人員通過常規(guī)方法確定。
再一方面，還提供所述寡核苷酸適配體在制備本發(fā)明診斷試劑或藥物中的用途。
以下通過實施例結(jié)合附圖對本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的說明。所述實施例僅用于舉例說明，而不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。


圖1是放射標(biāo)記的次級文庫與人腦十肽點雜交的結(jié)果。
圖2顯示本發(fā)明得到的多克隆寡核苷酸適配體和人腦勻漿免疫共沉淀的結(jié)果。A)人腦勻漿與生物素化多克隆適配體作用；B)陽性對照人腦勻漿與抗人腦AChE抗體作用。
圖3顯示本發(fā)明得到的單克隆寡核苷酸適配體和以下成分蛋白質(zhì)印跡的結(jié)果A)純化人紅細(xì)胞AChE；B)人腦勻漿；C)人全血；D)陽性對照(人腦勻漿與抗人腦AChE抗體作用)。
圖4顯示本發(fā)明得到的單克隆寡核苷酸適配體和不同膽堿酯酶的酶蛋白結(jié)合測定。(■)，人腦AChE；(▲)，電鰩AChE；(●)，人紅細(xì)胞AChE；()，人BChE.n＝3，Mean±SD。
圖5顯示本發(fā)明得到的單克隆寡核苷酸適配體的可能二級結(jié)構(gòu)。
實施例實施例1 ssDNA擴增文庫的構(gòu)建在PCR體系(10XPCR反應(yīng)緩沖液10ul，dNTPs(25mM)8ul，5’引物(25pmol/ul)2ul，3’引物(25pmol/ul)2ul，模板0.25ug，Pfu DNA聚合酶1ul)中，下游引物的5’端標(biāo)記有生物素。以原始ssDNA庫(由上海博亞公司合成并純化)為模板進(jìn)行PCR擴增，可得到3’端帶有生物素的dsDNA庫。
所述原始ssDNA庫(單鏈DNA文庫)是一個具有25個隨機序列，全長85個堿基的隨機DNA文庫。此文庫兩端為固定序列，可設(shè)計引物對文庫進(jìn)行PCR擴增。ssDNA的序列為5’-TAATACGACTCACTATAGCAATGGTACGGTACTTCC(25個隨機核苷酸)CAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA-3’dsDNA產(chǎn)物經(jīng)分離純化后，加入鏈親和素磁珠結(jié)合，此時dsDNA通過生物素與磁珠上的鏈親和素結(jié)合，然后用0.15N的NaOH使dsDNA變性解鏈，帶有生物素的一條鏈與鏈親和素結(jié)合留在磁珠上，而不帶生物素的一條鏈解離出來，經(jīng)乙醇沉淀，溶于TE緩沖液中，測定OD值，作為第一次篩選的隨機ssDNA庫。
實施例2 ssDNA次級文庫的構(gòu)建選用人腦AChE的560-569位氨基酸殘基(NH2-WSSYMVHWKN-COOH)作為第一個靶分子。它位于人AChE的C末端的第11個抗原表位中，此十肽具有抗原性。首先將DC膜(0.45μm，0.15cm2)與10mg/ml的靶蛋白4℃孵育過夜，然后把約0.5nmol上述生物素標(biāo)記的隨機ssDNA和NC膜在400μl含1％BSA的結(jié)合TE緩沖液(10mM Tris-HCl，pH7.5，1mM EDTA，1mM CaCl2，1mM MgCl2)中孵育，輕輕振搖，4℃過夜。然后NC膜用1ml TE洗滌15min×3次(室溫)。最后NC膜浸于7M尿素中洗脫結(jié)合的寡核苷酸，94℃，10min。然后再用酚/氯仿/異丙醇(25∶24∶1，pH8)抽提。洗脫液加入10％糖原后用乙醇沉淀，再進(jìn)行PCR(95℃預(yù)變性5min后，擴增5個循環(huán)94℃變性1min，55℃退火2min，72℃延伸1min，最后72℃終延伸5min。取10ul上述PCR產(chǎn)物為模板，再次PCR擴增，每3個循環(huán)取樣，選擇PCR產(chǎn)量大，無雜帶的循環(huán)數(shù)為最佳循環(huán)數(shù)，將剩余90ul產(chǎn)物全部擴增。)。其中一部分以[α-32P]CTP為底物進(jìn)行PCR，得到的產(chǎn)物與不同濃度十肽(1μg/5μg/8μg)的結(jié)合通過在NC膜上進(jìn)行的點雜交(Sorensen K，et al.Biochim Biophys Acta，1987，91256-62.)進(jìn)行驗證。其余部分通過PCR生成生物素化dsDNA，再拆分為生物素化ssDNA。
不同濃度的十肽和放射性標(biāo)記的第一輪篩選后的擴增文庫進(jìn)行點雜交，結(jié)果顯示隨著加入多肽的量的增加，X光片上的斑點也隨著加入肽量的增加而逐漸加深。此結(jié)果表明放射性標(biāo)記文庫和多肽有結(jié)合作用(圖1)。
實施例3 多克隆寡核苷酸適配體采用“靶標(biāo)切換”的方法獲得特異性多克隆寡核苷酸適配體。即將起始靶分子十肽“切換”為人腦勻漿中的人腦AChE。人腦勻漿(80μg)(制備方法取人腦尾狀核和小腦，在高速組織搗碎機中慢速破碎，制成勻漿。加辛酸數(shù)滴去除泡沫后，再加10％Triton X-100至終濃度為1％，4℃攪拌4h，100,000g離心60min，上清即為人腦勻漿)進(jìn)行12％的SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜后用含5％脫脂奶粉的PBS封閉。NC膜與生物素化的ssDNA次級文庫在含1％BSA的3ml TE結(jié)合緩沖液中室溫孵育2h，然后用鏈親和素標(biāo)記的HRP進(jìn)行顯色。切下相對應(yīng)于人腦AChE的66kD條帶(同樣也被抗人腦AChE抗體所驗證)。結(jié)合的寡核苷酸用尿素-酚法洗脫，并進(jìn)行PCR。最后得到的產(chǎn)物即為多克隆寡核苷酸適配體。
免疫共沉淀首先將人腦勻漿(200μg)和上述的生物素化的多克隆寡核苷酸適配體在TE結(jié)合緩沖液中室溫孵育1h。加入25μl鏈親和素磁珠來分離寡核苷酸適配體和人腦AChE的復(fù)合物。用1ml TE緩沖液洗滌4次。將磁珠-寡核苷酸適配體-人腦AChE復(fù)合物進(jìn)行12％SDS-PAGE，轉(zhuǎn)印到NC膜上。然后依次用抗人腦AChE抗體和HRP-IgG二抗顯色。陽性對照用抗人腦AChE抗體對人腦勻漿中的AChE進(jìn)行檢測。
免疫共沉淀在66kD處呈現(xiàn)一條主帶(圖2A)，與抗人腦AChE抗體(陽性對照)的單一條帶相當(dāng)(圖2B)。此結(jié)果說明多克隆寡核苷酸適配體與人腦AChE產(chǎn)生特異性結(jié)合(圖2)。
實施例4 單克隆寡核苷酸適配體多克隆寡核苷酸適配體經(jīng)過PCR擴增后，連接于pGEM-T easyvector，然后轉(zhuǎn)染感受態(tài)細(xì)胞，挑取3個克隆進(jìn)行測序。每一個陽性克隆即為一個單克隆寡核苷酸適配體。3個單克隆寡核苷酸適配體的免疫共沉淀、蛋白質(zhì)印跡、點雜交及酶抗原免疫測定結(jié)果相似，下面是1號單克隆寡核苷酸適配體(Ob1)的實驗結(jié)果。
1.蛋白質(zhì)印跡(western blotting)將人腦勻漿、純化的人紅細(xì)胞AChE及人全血樣品進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜后與1號生物素化單克隆寡核苷酸適配體孵育，然后用鏈親和素標(biāo)記的HRP進(jìn)行顯色。
1號單克隆寡核苷酸適配體可與人腦AChE產(chǎn)生特異性結(jié)合，在66kD處呈現(xiàn)一條主帶(圖3B)，而與純化人紅細(xì)胞AChE及人全血無結(jié)合(圖3A、C)說明1號單克隆寡核苷酸適配體可區(qū)分變性的人腦AChE和人紅細(xì)胞AChE。
2.點雜交將0.5U的膽堿酯酶溶于5μl的0.01M PBS(pH7.4)-144mMNaCl-1ml/L Triton X-100中(變性樣品加SDS至1g/L濃度，煮沸5min)，然后點樣于NC膜上。用3％BSA的buffer A(0.05M Tris-HCl，pH7.4，0.14M NaCl)對NC膜封閉2h，然后用不含BSA的buffer A漂洗一次。然后加入生物素化單克隆適配體，再用鏈親和素連接的HRP顯色。
結(jié)果表明1號寡核苷酸適配體和天然及變性的人腦AChE和電鰩AChE顯示特異性結(jié)合，而與人及牛紅細(xì)胞AChE及人BChE無結(jié)合能力(表1)。
表1.單克隆寡核苷酸適配體和不同來源的純化膽堿酯酶的點雜交Source Native enzyme Denatured enzyme人腦AChE + +人紅細(xì)胞AChE - -牛紅細(xì)胞AChE - -人BChE - -電鰩AChE + +3.酶蛋白結(jié)合測定(ECA)酶蛋白結(jié)合測定法仿效酶抗原免疫測定進(jìn)行。將鏈親和素(5g/L，用PBS稀釋)加入微孔板中，100μl/孔，4℃過夜。用PBS洗滌后，用1％BSA封閉，室溫1h。生物素化1號單克隆寡核苷酸適配體用包被緩沖液(0.01M PBS，pH8.0，144mM NaCl)稀釋后加入每孔(0.3μg/孔)，37℃孵育2h。經(jīng)洗滌緩沖液(0.01M PBS，pH7.2，0.05％Tween-20)洗滌2次后，用含1％BSA的包被緩沖液，每孔200μl，37℃封閉1h。洗滌2次后，每孔加酶反應(yīng)緩沖液(0.01 PBS，pH7.4，144mM NaCl，0.01％Triton X-100)稀釋的不同種屬的AChE 100μl，在室溫中緩慢搖動2h，洗滌5次后，加底物反應(yīng)液(1mM ATCh·I，0.025mM DTNB，0.1M PBS，pH7.4，0.1％ Triton X-100)，每孔100μl，在414nm波長處測定消光值。
ECA顯示人腦AChE的1號單克隆寡核苷酸適配體與人腦及電鰩AChE均顯示明顯的特異結(jié)合反應(yīng)性，而與人紅細(xì)胞AChE及人假性膽堿酯酶(BChE)無結(jié)合現(xiàn)象(圖4)。從另一個側(cè)面說明1號單克隆寡核苷酸適配體對人腦AChE有特異性。
實施例5 寡核苷酸適配體的一級結(jié)構(gòu)和二級結(jié)構(gòu)分析對所獲的陽性孔中3個克隆進(jìn)行測序，分別命名為Ob1，Ob2，Ob3。使用Clustal W和DNA folding server軟件分別對這3個適配體進(jìn)行一級結(jié)構(gòu)和二級結(jié)構(gòu)分析。一級結(jié)構(gòu)如下。其中Ob1和Ob2有一定的同源性，含保守序列，而Ob3無同源發(fā)現(xiàn)。
Ob1CTCTCGTGCTAAACATAGGCCCGTA(SEQ ID NO1)Ob2CTTCGAAAACACCCTGCCCCTCACA(SEQ ID NO2)保守序列AAACA G(G/C)CCCOb3CATTAGAATCTGTGACAATAACGTT(SEQ ID NO3)二級結(jié)構(gòu)分析3個寡核苷酸適配體分子的二級結(jié)構(gòu)均用DNA Folding Server進(jìn)行最低能量二級結(jié)構(gòu)分析。結(jié)果顯示Ob1-3的二級結(jié)構(gòu)有相似框架，近5’端固定序列形成一個相同的莖環(huán)，隨機序列中部有一個小的莖環(huán)(圖5)。
權(quán)利要求
1.特異結(jié)合人腦乙酰膽堿酯酶的寡核苷酸適配體。
2.權(quán)利要求1的寡核苷酸適配體，包含如下的核苷酸序列a)包含序列AAACAXnGYCCC的長15-50nt(優(yōu)選15-40nt，更優(yōu)選20-30，最優(yōu)選23-28nt，特別是25nt)的核苷酸序列，其中，每個X分別獨立地是A、T、C或G，n為0-20(優(yōu)選0-15，更優(yōu)選1-10，最優(yōu)選2-4，特別是2和4)的整數(shù)，Y為G或C；b)SEQ ID NO3的序列；c)在嚴(yán)緊條件下與a)或b)的序列雜交的序列；或d)a)或b)或c)的互補序列。
3.權(quán)利要求1或2的寡核苷酸適配體，其是DNA。
4.權(quán)利要求3的寡核苷酸適配體，具有SEQ ID NO1、SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的序列。
5.權(quán)利要求1-4任意一項的寡核苷酸適配體，其連接或標(biāo)記了其它功能基團(tuán)或分子，例如巰基、氨基、放射性同位素、熒光素、生物素、或酶等。
6.包含權(quán)利要求1-5任意一項的寡核苷酸適配體的載體。
7.包含權(quán)利要求6的載體的細(xì)胞。
8.檢測或鑒別人腦乙酰膽堿酯酶的方法，包括使可能含有人腦乙酰膽堿酯酶的樣品與權(quán)利要求1-5任意一項的寡核苷酸適配體接觸，并檢測人腦乙酰膽堿酯酶與所述寡核苷酸適配體的結(jié)合。
9.抑制人腦乙酰膽堿酯酶活性或減少人腦乙酰膽堿酯酶的方法，包括給予有效量的權(quán)利要求1-5任意一項的寡核苷酸適配體。
10.包含權(quán)利要求1-5任意一項的寡核苷酸適配體的診斷試劑或藥物。
11.權(quán)利要求10的診斷試劑或藥物，其用于診斷或治療與人腦乙酰膽堿酯酶相關(guān)的疾病，特別是神經(jīng)管缺陷和神經(jīng)功能紊亂。
12.權(quán)利要求1-5任意一項的寡核苷酸適配體在制備權(quán)利要求10或11的診斷試劑或藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供了優(yōu)選具有SEQ ID NO1.SEQ IDNO2或SEQ ID NO3之序列的特異結(jié)合人腦乙酰膽堿酯酶的寡核苷酸適配體、檢測或鑒別人腦乙酰膽堿酯酶的方法、診斷或治療與人腦乙酰膽堿酯酶相關(guān)的疾病(特別是神經(jīng)管缺陷和神經(jīng)功能紊亂)的方法和診斷試劑和藥物等。
文檔編號C12Q1/68GK1611509SQ200310103048
公開日2005年5月4日 申請日期2003年10月31日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月31日
發(fā)明者張興梅, 李前, 孫曼霽 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所