專利名稱：一種重組谷氨酸棒桿菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及應(yīng)用微生物和發(fā)酵工程領(lǐng)域中一種重組谷氨酸棒桿菌及其構(gòu)建方法與利用該菌發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酰胺方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
谷氨酰胺是機(jī)體血液中含量最豐富的氨基酸，在生物代謝中起著舉足輕重的作用，它是一種重要的能量中間體、細(xì)胞呼吸的燃料和氨基轉(zhuǎn)移的載體(Labow B I，Souba WW.Abcouwer S F.Mechanisms Governing the Expression of the Enzymes of GlutamineMetabolism-Glutaminase and Glutamine Synthetase，J.Nutr.，2001，1312467S-2474S)；近年來，醫(yī)學(xué)上的發(fā)現(xiàn)還表明谷氨酰胺是一種條件必需性氨基酸，缺乏時將引發(fā)多種疾病(劉利軍，趙瑾.L-谷氨酰胺研究進(jìn)展.天津化工，2003，1717-20)。它可有效治療潰瘍、神經(jīng)衰弱，改善腦后遺癥的記憶性障礙等(王偉平，吳思方，楊金樹，汪世華.谷氨酰胺代謝控制發(fā)酵工藝研究.食品科學(xué)，2002，23(4)82-85)，此外，它還具有增進(jìn)神經(jīng)機(jī)能，促進(jìn)智力不佳兒童的智力發(fā)展，防止癲癇發(fā)作等功能(張軍民.條件性必需氨基酸谷氨酰胺研究進(jìn)展.中國飼料，1999，1722-24)。谷氨酰胺還可以調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的合成，目前大量用于治療運(yùn)動員的運(yùn)動綜合癥及疲勞修復(fù)，重建免疫系統(tǒng)，有利于治療和支持肝臟功能，減少癌癥治療中化療和放射性治療的副作用(劉穎，金宏.谷氨酰胺防治輻射損傷的作用.氨基酸和生物資源，2002，24(2)53-55)?？傊?，藥用谷氨酰胺的需求量很大，有巨大的潛在市場(安秀林，李慶忠，劉海平。產(chǎn)谷氨酰胺菌株的誘變育種.微生物學(xué)雜志，2003，23(1)28-29)。
目前谷氨酰胺的生產(chǎn)方法有三種發(fā)酵法、酶法和化學(xué)法。酶法生產(chǎn)由于底物及產(chǎn)物的抑制作用較強(qiáng)，所以谷氨酰胺產(chǎn)量很低，不具備工業(yè)生產(chǎn)意義(楊春玉，馬崔卿，許平，張兆斌，李金山.酶法轉(zhuǎn)化谷氨酰胺.過程工程學(xué)報，2002，2(6)529-533)?；瘜W(xué)合成法由于原料價格較高，也不利于工業(yè)化推廣。所以目前主要是發(fā)酵法生產(chǎn)谷氨酰胺。日本利用發(fā)酵法生產(chǎn)谷氨酰胺起步早，技術(shù)日臻成熟，并有多項專利(Azumaguchi T，Emoto M，Umesaka C.Glutamine containing oral compositions，useful as foods，and oral pharmaceuticals and quesi drugs，comprise glutamine，oligosaccharide and dietary fiber.Japanese patent，JP 2002226369-A，2001-01-30)。
工業(yè)上用來生產(chǎn)谷氨酰胺的菌種主要是谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)(Schulz A A，Collett H J，Reid S J.Nitrogen and Carbon Regulationof Glutamine Synthetase and Glutamate Synthase in Corynebacterium glutamicumATCC 13032，2001，205361-367)。在谷氨酸棒桿菌C. glutamicum中，催化谷氨酸合成谷氨酰胺的谷氨酰胺合成酶已經(jīng)被分離出來(Nolden L，F(xiàn)arwick M，Krmer R，Burkovski A.Glutamine synthetases of Corynebacterium glutamicumTranscriptional Control and Regulation of Activity.FEMS Microbiology Letters，2001，20191-98)，其編碼基因為glnA(Jakoby，M.，Tesch，M.，Sahm H，Krmer，R.，Burkovski，A.Isolation of the Corynebacterium glutamicum glnA geneencoding glutamine synthetase.FEMS Microbiol.Lett.，15481-88(1997))。谷氨酰胺合成酶/谷氨酸合酶(GS/GOGAT)體系是由銨離子濃度調(diào)節(jié)的，在低銨離子濃度下發(fā)揮作用，在高銨離子濃度條件下受抑制。谷氨酰胺合成酶的調(diào)節(jié)開關(guān)是在其肽鏈405位置的酪氨酸被腺苷酸化，而其突變glnA’基因編碼的蛋白就是在405位置的酪氨酸被定點突變?yōu)楸奖彼?，從而失去了這種調(diào)節(jié)機(jī)制，使得谷氨酰胺合成酶可以在高銨離子條件下發(fā)揮催化功能，將谷氨酸轉(zhuǎn)化為谷氨酰胺(Jakoby，M.，Krmer，R.Burkovski A.Nitrogen regulation in Corynebacterium glutamicumIsolation ofgenes involved and biochemical characterization of corresponding proteins.FEMS Microbiol.Lett.，173303-310(1999))。因此在谷氨酸棒桿菌C.glutamjcumATCC 14067中過表達(dá)glnA’基因可以提高谷氨酰胺產(chǎn)量。
據(jù)文獻(xiàn)報導(dǎo)的發(fā)酵溶氧濃度(D.O.)及培養(yǎng)基還原力(culture reducing power，CRP)與氨基酸產(chǎn)量之間的關(guān)系，在合成氨基酸階段，需要有較高的供氧速率才能得到較高的氨基酸產(chǎn)量(Kwong S C，Rao G.Utility of culture redox potential foridentifying metabolic state changes in amino acid fermentation，Biotechnologyand Bioengineering，1991.381034-1040)。而由谷氨酸和銨離子合成谷氨酰胺是一個需能反應(yīng)，需要ATP的參與(Merrick M J，Edwards R A.Nitrogen Control inBacteria，Microbiological Reviews，1995，59604-622)。因此，生產(chǎn)谷氨酰胺比生產(chǎn)谷氨酸需要在更高的供氧條件下，強(qiáng)化三羧酸循環(huán)，增加ATP的生成量，使得谷氨酰胺合成酶的活性增加，加快谷氨酰胺的生成(Jetten M S M，Sinskey A J.RecentAdvances in the Physiology and Genetics of Amino Acid-Producing Bacteria，Critieal Reviews in Biotechnology，1995，15(1)73-103)。通常谷氨酰胺發(fā)酵所需要的高D.O.控制條件，是限制大規(guī)模生產(chǎn)谷氨酰胺的一個重要因素。
細(xì)菌Vitreoscilla是嚴(yán)格好氧的，但多生長在貧氧環(huán)境中，它能合成一種可溶性的血紅素蛋白(Vitreoscilla Hemoglobin，VHb)以適應(yīng)貧氧環(huán)境，編碼該蛋白的基因即為透明顫菌血紅蛋白基因(Vitreoscilla hemoglobin gene，vgb)(Fish P A，Webster D A，Stark B C.Vitreoscilla hemoglobin enhances the first step in2，4-dinitroluene degradation in vitro and at low aeration in vivo，Journal ofMolecular Catalysis BEnzymatic，2000，975-82)。VHb是以氧合態(tài)參與和氧有關(guān)的代謝，通過將氧傳遞給呼吸鏈，而調(diào)節(jié)末端氧化酶的活性，改變氧化磷酸化的效率，進(jìn)而改變低氧條件下的代謝途徑，以至影響到某些基因的表達(dá)。它能夠從分子水平上提高重組菌對氧氣的利用能力(Jacobsen J R，Khosla C.New directions inmetabolic engineering.Current Opinion in Chemical Biology 1998，2133-137)。一些文獻(xiàn)報導(dǎo)了vgb基因的應(yīng)用實例，表明它促進(jìn)細(xì)胞生長，提高細(xì)胞培養(yǎng)密度和外源基因表達(dá)的作用。如vgb基因在金色鏈霉菌中的表達(dá)可將產(chǎn)物合成提高40％-60％(孟春，葉勤，石賢愛，邱荔，宋思揚(yáng)，郭養(yǎng)浩.透明顫菌血紅蛋白基因在金色鏈霉菌中的克隆與表達(dá).微生物學(xué)報，2002，42(3)305-310)；vgb基因在鏈霉菌(Stretomyces lividans)中的表達(dá)可促進(jìn)菌體生長(朱怡非，朱春寶，朱寶泉.透明顫菌血紅蛋白基因在鏈霉菌中的克隆與表達(dá).中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，1998，29(6)253-258)；vgb基因在生產(chǎn)聚羥基丁酸[poly(β-hydroxybutyrate)，PHB]的重組大腸桿菌E.coli中表達(dá)，有效的提高了細(xì)胞生長密度和PHB的產(chǎn)量(Yu H M，Shi Y，ZhangY P，Yang S L，Shen Z Y.Effect of Vitreoscilla hemoglobin biosynthesis inEscherichia coli on production of poly(β-hydroxybutyrate)and fermentativeparameters.FEMS Microbiology Letters，2002，214223-227)等。
發(fā)明創(chuàng)造內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種可在較低溶氧水平下生產(chǎn)出較高產(chǎn)量的谷氨酰胺的重組谷氨酸棒桿菌及其構(gòu)建方法。
本發(fā)明所提供的重組谷氨酸棒桿菌，是含有透明顫菌血紅蛋白基因vgb的野生谷氨酸棒桿菌C.glutamicum ATCC 14067。
為在較低溶氧水平下生產(chǎn)出更高產(chǎn)量的谷氨酰胺，所述重組谷氨酸棒桿菌中還可含有谷氨酰胺合成酶突變基因glnA’。
一種構(gòu)建重組谷氨酸棒桿菌的方法，是將含有透明顫菌血紅蛋白基因vgb的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入野生谷氨酸棒桿菌C.glutamicum ATCC 14067中，得到含有透明顫菌血紅蛋白基因vgb的野生谷氨酸棒桿菌C.glutamicum ATCC 14067。
所述重組質(zhì)?？蔀閜JC1-vgb，該質(zhì)粒是通過如下方法得到的用PstI和SalI酶切pBR322-vgb，將其2.2kb片段插入E.coli/C.glutamicum的穿梭載體pJC1的PstI/SalI酶切位點處，構(gòu)建出質(zhì)粒pJC1-vgb。
為在較低溶氧水平下生產(chǎn)出更高產(chǎn)量的谷氨酰胺，所述重組質(zhì)粒還可為pJC1-VG1或pJC1-VG2；所述pJC1-VG1或pJC1-VG2是通過如下方法得到的以pJC1-vgb為PCR模版，通過PCR擴(kuò)增，使vgb片段的兩端接上SalI位點，然后插入經(jīng)SalI酶切的pJCY405F，得到質(zhì)粒pJC1-VG1和pJC1-VG2。
在構(gòu)建所述pJC1-VG1或pJC1-VG2的過程中，由于vgb片段和pJCY405F兩端連接位點相同，則vgb片段插入順序有正反兩種，所以得到質(zhì)粒pJC1-VG1和pJC1-VG2，都含有vgb基因和glnA’基因。
所述PCR擴(kuò)增的引物為正義鏈5’-ttagtcgacacaggacgctggggtt-3’；反義鏈5’-acagtcgacatgccaaggcacacct-3’。
所述經(jīng)SalI酶切的pJCY405F在被插入兩端帶有SalI位點的vgb片段之前，還用去磷酸化酶CIAP對其進(jìn)行去磷酸化處理，防止其兩端自連。
本發(fā)明的重組谷氨酸棒桿菌由于含有透明顫菌血紅蛋白基因vgb，進(jìn)行發(fā)酵時，在D.O.低于通常發(fā)酵水平的條件下，細(xì)胞生長及谷氨酰胺合成都不受影響；在較低供氧條件下，該重組菌的細(xì)胞干重及谷氨酰胺產(chǎn)量比野生菌有明顯提高，從而降低了工業(yè)生產(chǎn)中的通氣和攪拌的條件要求；又由于含有谷氨酰胺合成酶的突變基因glnA’，大部分的谷氨酸都被轉(zhuǎn)化為谷氨酰胺，可以得到更高產(chǎn)量的谷氨酰胺，強(qiáng)化了谷氨酰胺的合成，為谷氨酰胺大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)提供了可行性。本發(fā)明的重組谷氨酸棒桿菌可實現(xiàn)在較低D.O.水平、較低成本下，生產(chǎn)較高產(chǎn)量的谷氨酰胺，解決了谷氨酰胺大規(guī)模生產(chǎn)過程中要求高溶氧的問題。


圖1為質(zhì)粒pJC1-vgb酶切驗證電泳圖譜圖2為質(zhì)粒pJC1-vgb的構(gòu)建過程示意3為質(zhì)粒pJC1-VG1和pJC1-VG2的構(gòu)建過程示意圖具體實施方式
實施例1、重組谷氨酸棒桿菌C.glutamicum ATCC 14067(pJC1-vgb)的構(gòu)建及發(fā)酵實驗1、重組谷氨酸棒桿菌C.glutamicum ATCC 14067(pJC1-vgb)的構(gòu)建(1)菌種谷氨酸棒桿菌C.glutamicum ATCC 14067(2)外源基因質(zhì)粒pJC1-vgb(3)載體E.coli/C.glutamicum的穿梭載體pJC1(Cremer J，Eggeling L，SahmH.Cloning of the dapA dapB cluster of the lysine-secreting bacteriumCorynebacterium glutamicum.Mol.Gen.Genet.1990，220478-480)。
(4)質(zhì)粒pJC1-vgb的構(gòu)建質(zhì)粒pBR322-vgb含有來自透明顫菌基因組的vgb基因。
質(zhì)粒pJC1-vgb的構(gòu)建過程如圖2所示，用PstI和SalI酶切pBR322-vgb，將其2.2kb片段插入E.coli/C.glutamicum的穿梭載體pJC1(6.1kb)的PstI/SalI位點處，構(gòu)建出質(zhì)粒pJC1-vgb(8.3kb)。
(5)質(zhì)粒pJC1-vgb轉(zhuǎn)化C.glutamicum ATCC 14067用電轉(zhuǎn)化的方法(M.E.van der Rest，Lange C，Molenaar D.A heat shockfollowing electroporation induces highly efficient transformation ofCorynebacterium glutamicum with xenogeneic plasmid DNA.Appl Microbiol.Biotechnol.，1999，52541-545)將質(zhì)粒pJC1-vgb轉(zhuǎn)化入C.glutamicum ATCC 14067中。由于pJC1帶有卡那霉素抗性基因，所以連接成功的質(zhì)粒pJC1-vgb也具有對卡那霉素的抗性，轉(zhuǎn)化成功的重組菌能夠在含有卡那霉素的LB平板上生長，而質(zhì)粒沒有轉(zhuǎn)化成功的野生菌將不能生長。以此篩選出陽性克隆，得到重組谷氨酸棒桿菌C.glutamicum ATCC 14067(pJC1-vgb)。
(6)重組谷氨酸棒桿菌C.glutamicum ATCC 14067(pJC1-vgb)的鑒定用提取質(zhì)粒的方法(Feliciello I，Chinali G.A modified alkaline lysis methodfor the preparation of highly purified plasmid DNA from Escherichia coli.AnalBiochem，1993，212394-401)對重組谷氨酸棒桿菌C.glutamicum ATCC 14067(pJC1-vgb)進(jìn)行驗證從重組谷氨酸棒桿菌C.glutamicum ATCC 14067(pJC1-vgb)中提取質(zhì)粒并進(jìn)行酶切(SalI單切和EcoRI雙切)驗證，結(jié)果如圖1所示，表明分別得到約8.3kb和5.5kb、2.8kb的特異性片段，與序列圖譜相符，證明為含有質(zhì)粒pJC1-vgb的重組谷氨酸棒桿菌。圖1中，1為EcoRI雙切；2為SalI單切；M為分子量標(biāo)準(zhǔn)。
2、利用重組谷氨酸棒桿菌C.glutamicum ATCC 14067(pJC1-vgb)發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酰胺和谷氨酸(1)發(fā)酵菌種重組谷氨酸棒桿菌C.glutamicum ATCC 14067(pJC1-vgb)(2)培養(yǎng)基a.種子LB培養(yǎng)基酵母粉5.0g/L，蛋白胨10.0g/L，NaCl10.0g/L，卡那霉素20mg/L，pH值中性。
b.搖瓶種子培養(yǎng)基葡萄糖35g/L，硫酸銨7.5g/L，尿素5.0g/L，K2HPO4·3H2O 8.0g/L，KH2PO42.0g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，CaCl2·2H2O 0.1g/L，檸檬酸鈉·2H2O 3.0g/L，NaCl 2.0g/L，微量元素10ml/L，生物素6μg/L，硫胺素1mg/L，卡那霉素20mg/L，pH值中性。
c.發(fā)酵罐培養(yǎng)基葡萄糖80g/L，硫酸銨25g/L，尿素5.0g/L，K2HPO4·3H2O 8.0g/L，KH2PO42.0g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，CaCl2·2H2O 0.1g/L，檸檬酸鈉·2H2O 3.0g/L，NaCl 2.0g/L，微量元素10ml/L，生物素6μg/L，硫胺素1mg/L，卡那霉素20mg/L，pH7.0。
微量元素溶液每升1N HCl含有MnSO4·7H2O 0.4g，Na2B4O7·10H2O 0.04g，(NH4)6MO7O24·4H2O 0.02g，F(xiàn)eCl2·6H2O 0.4g，ZnSO4·7H2O 0.1g，CuSO4·5H2O 0.04g，F(xiàn)eSO4·7H2O 5g。
(3)培養(yǎng)條件a.一級種子從平板上挑取單菌落接入LB培養(yǎng)基(20ml培養(yǎng)基/50ml搖瓶)。30℃培養(yǎng)14hr，搖床轉(zhuǎn)速200r/min。
b.二級種子采用搖瓶種子培養(yǎng)基(100ml培養(yǎng)基/500ml搖瓶)，接種量5％一級種子(v/v)。30℃培養(yǎng)12hr，搖床轉(zhuǎn)速200r/min。
c.三級種子采用搖瓶種子培養(yǎng)基，接種量5％二級種子(v/v)。培養(yǎng)條件與二級種子相同。
d.發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基體積3L，30℃，pH7.0，分別用H2SO4和氨水來調(diào)節(jié)酸堿。將三級種子以10％(v/v)接種量接入發(fā)酵罐。溶氧D.O.通過攪拌自動控制在設(shè)定值。分級(即每隔2-3小時，將D.O.升高10％)升高D.O.至40％后，將溶氧降到較低水平(10％以下)保持一段時間，然后再升高至正常水平(20％-40％)，至發(fā)酵結(jié)束。通氣量也分級提高，由初始的1.0L/min按每次1.0L/min的梯度提高到5～7L/min)。攪拌轉(zhuǎn)速控制范圍為200-950r/min。發(fā)酵過程中監(jiān)測葡萄糖濃度，低于10g/L時補(bǔ)糖，發(fā)酵72小時過程中補(bǔ)加兩次，每次補(bǔ)加50g/L。
培養(yǎng)結(jié)束后，用液相色譜檢測谷氨酸和谷氨酰胺的含量(張嘉麟，孫繼英，徐文安.高效液相色譜-PITC衍生法的血漿游離氨基酸分析.昆明醫(yī)學(xué)院學(xué)報，1994，1528-33)。
發(fā)酵結(jié)果表明，重組菌C.glutamicum ATCC 14067(pJC1-vgb)CDW、谷氨酰胺和谷氨酸產(chǎn)量都明顯高于對比例1中的野生菌C.glutamicum ATCC14067。重組菌CDW最高為54.1g/L，比野生菌提高了1.5倍。重組菌中谷氨酸產(chǎn)量最高達(dá)到9.56g/L比野生菌提高了7.5倍；重組菌中谷氨酰胺最高達(dá)到5.51g/L，比野生菌提高了2.4倍。相對于單位細(xì)胞來說，其生產(chǎn)能力也有明顯提高。重組菌單位細(xì)胞谷氨酸的生產(chǎn)能力為0.177Glu/g干細(xì)胞，比野生菌提高了6.3倍，單位細(xì)胞谷氨酰胺的生產(chǎn)能力為0.102Gln/g干細(xì)胞，比野生菌提高了2.0倍。在本發(fā)明中，在D.O.受限制的條件下，而重組菌仍然有接近10g/L的谷氨酸產(chǎn)量，表明在細(xì)胞內(nèi)部的氧濃度仍維持在相對高的水平，使代謝向谷氨酸合成的方向進(jìn)行。此實驗說明了透明顫菌血紅蛋白基因在重組谷氨酸棒桿菌中發(fā)揮了一定作用，能夠使其適應(yīng)低氧環(huán)境。
實施例2、重組谷氨酸棒桿菌C.glutamicum ATCC 14067(pJC1-VG1)的制備及發(fā)酵實驗1、重組谷氨酸棒桿菌C.glutamicum ATCC 14067(pJC1-VG1)的構(gòu)建(1)菌種谷氨酸棒桿菌C.glutamicum ATCC 14067(2)外源基因質(zhì)粒pJC1-VG1和pJC1-VG2(3)載體E.coli/C.glutamicum的穿梭載體pJC1(4)質(zhì)粒pJC1-VG1和pJC1-VG2的構(gòu)建質(zhì)粒pJC1-VG1(pJC1-VG2)含有來自透明顫菌基因組的vgb基因和谷氨酸棒桿菌的glnA’基因。
質(zhì)粒pJC1-VG1和pJC1-VG2的構(gòu)建過程如圖3所示，用pJC1-vgb做為PCR模版，設(shè)計引物將其vgb片斷兩端接上SalI位點。上述引物為正義鏈5’-ttagtcgacacaggacgctggggtt-3’；反義鏈5’-acagtcgacatgccaaggcacacct-3’。同時用SalI酶切pJCY405F(8.4kb)，并用去磷酸化酶CIAP對其進(jìn)行去磷酸化處理，防止其載體兩端自連。然后將pJCY405F的線性片段與所得vgb基因片段的SalI位點連接，構(gòu)建出質(zhì)粒pJC1-VG1和pJC1-VG2(9.1kb)。由于兩端連接位點相同，則插入順序有正反兩種，分別為質(zhì)粒pJC1-VG1和pJC1-VG2，都含有vgb基因和glnA’基因。
(5)質(zhì)粒pJC1-VG1(pJC1-VG2)轉(zhuǎn)化C.glutamicum ATCC 14067用電轉(zhuǎn)化的方法將質(zhì)粒pJC1-VG1(pJC1-VG2)轉(zhuǎn)化入C.glutamicumATCC 14067中。由于pJC1帶有卡那霉素抗性基因，所以由此構(gòu)建的質(zhì)粒pJC1-VG1(pJC1-VG2)也具有對卡那霉素的抗性，轉(zhuǎn)化成功的重組菌能夠在含有卡那霉素的LB平板上生長，而質(zhì)粒沒有轉(zhuǎn)化成功的野生菌將不能生長。以此篩選出陽性克隆，得到重組谷氨酸棒桿菌C.glutamicum ATCC 14067(pJC1-VG1)和C.glutamicum ATCC 14067(pJC1-VG2)。
(6)重組谷氨酸棒桿菌C.glutamicum ATCC 14067(pJC1-VG1)和C.glutamfcumATCC 14067(pJC1-VG2)的鑒定用提取質(zhì)粒的方法對重組谷氨酸棒桿菌C.glutamfcum ATCC 14067(pJC1-VG1)和C.glutamicum ATCC 14067(pJC1-VG2)進(jìn)行驗證。結(jié)果表明重組谷氨酸棒桿菌C.glutamicum ATCC 14067(pJC1-VG1)和C.glutamfcum ATCC 14067(pJC1-VG2)分別含有質(zhì)粒pJC1-VG1和pJC1-VG2。選擇其中一株C.glutamicum ATCC 14067(pJC1-VG1)進(jìn)行發(fā)酵實驗。
2、利用重組谷氨酸棒桿菌C.glutamicum ATCC 14067(pJC1-VG1)發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酰胺和谷氨酸(1)發(fā)酵菌種谷氨酸棒桿菌C.glutamicum ATCC 14067(pJC1-VG1)。
(2)培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件與實施例1中野生菌發(fā)酵實驗相同(培養(yǎng)基需加入卡那霉素20mg/L)。發(fā)酵結(jié)果表明，重組菌C.glutamicum ATCC 14067(pJC1-VG1)細(xì)胞生長及谷氨酰胺產(chǎn)量都明顯高于下述對比例1中的野生菌C.glutamicum ATCC 14067。重組菌CDW最高達(dá)到40g/L。在D.O.受限制的條件下，重組菌中谷氨酰胺產(chǎn)量達(dá)到50g/L左右；重組菌中谷氨酸為5g/L左右。
對比例1、利用野生谷氨酸棒桿菌C.glutamicum ATCC 14067發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酰胺和谷氨酸菌種谷氨酸棒桿菌C.glutamicum ATCC 14067(從ATCC購買)培養(yǎng)基及發(fā)酵條件同實施例1，但培養(yǎng)基中不含卡那霉素。發(fā)酵結(jié)果表明，野生菌C.glutamicum ATCC 14067細(xì)胞干重(cell dried weight，CDW)最高達(dá)到40g/L。野生菌中谷氨酸產(chǎn)量最高為1.27g/L；野生菌中谷氨酰胺最高為2.27g/L。相對于單位細(xì)胞來說，野生菌生產(chǎn)能力為0.028Glu/g干細(xì)胞，0.050Gln/g干細(xì)胞。此實驗說明了在D.O.受限制的條件下，野生菌的代謝明顯受到了低氧條件的影響，使得谷氨酸的生成路徑不能順利進(jìn)行，導(dǎo)致谷氨酸的產(chǎn)量偏低。
權(quán)利要求
1.一種重組谷氨酸棒桿菌，是含有透明顫菌血紅蛋白基因vgb的野生谷氨酸棒桿菌C.glutamicum ATCC 14067。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組谷氨酸棒桿菌，其特征在于所述重組谷氨酸棒桿菌中還含有谷氨酰胺合成酶突變基因glnA’。
3.一種構(gòu)建重組谷氨酸棒桿菌的方法，是將含有透明顫菌血紅蛋白基因vgb和谷氨酰胺合成酶突變基因glnA’的重組質(zhì)粒pJC1-VG1或pJC1-VG2轉(zhuǎn)入野生谷氨酸棒桿菌C.glutamicum ATCC 14067中，得到含有透明顫菌血紅蛋白基因vgb和谷氨酰胺合成酶突變基因glnA’的野生谷氨酸棒桿菌C.glutamicum ATCC 14067。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述重組質(zhì)粒為pJC1-vgb，所述質(zhì)粒pJC1-vgb是通過如下方法得到的用PstI和SalI酶切pBR322-vgb，將其2.2kb片段插入E.coli/C.glutamicum的穿梭載體pJC1的PstI/SalI酶切位點處，構(gòu)建出質(zhì)粒pJC1-vgb。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述重組質(zhì)粒為pJC1-VG1或pJC1-VG2；所述pJC1-VG1或pJC1-VG2是通過如下方法得到的以pJC1-vgb為PCR模版，通過PCR擴(kuò)增，使vgb片段的兩端接上Sal I位點，然后插入經(jīng)Sal I酶切的pJCY405F，得到質(zhì)粒pJC1-VG1和pJC1-VG2；所述質(zhì)粒pJC1-vgb是通過如下方法得到的用PstI和SalI酶切pBR322-vgb，將其2.2kb片段插入E.coli/C.glutamicum的穿梭載體pJC1的PstI/SalI酶切位點處，構(gòu)建出質(zhì)粒pJC1-vgb。
6.權(quán)利要求1和2所述重組谷氨酸棒桿菌在谷氨酰胺生產(chǎn)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種重組谷氨酸棒桿菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用，目的是提供一種可在較低溶氧水平下生產(chǎn)出較高產(chǎn)量的谷氨酰胺的重組谷氨酸棒桿菌及其構(gòu)建方法。本發(fā)明所提供的重組谷氨酸棒桿菌，是含有透明顫菌血紅蛋白基因vgb和谷氨酰胺合成酶突變基因glnA’的野生谷氨酸棒桿菌C.glutamicum ATCC 14067。本發(fā)明的重組谷氨酸棒桿菌可實現(xiàn)在較低D.O.水平、較低成本下，生產(chǎn)較高產(chǎn)量的谷氨酰胺，解決了谷氨酰胺大規(guī)模生產(chǎn)過程中要求高溶氧的問題，為谷氨酰胺大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)提供了可行性。
文檔編號C12P13/00GK1614008SQ200310103230
公開日2005年5月11日 申請日期2003年11月3日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月3日
發(fā)明者陳國強(qiáng), 梁楠, 孫智杰 申請人:北京理工大學(xué), 清華大學(xué)