專利名稱：一種木聚糖酶及其生產(chǎn)方法與專用生產(chǎn)菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種木聚糖酶，它的生產(chǎn)方法及其專用生產(chǎn)菌株。
背景技術(shù)：
木聚糖酶系主要包括兩種酶，一種是β-1，4-木聚糖酶，另一種是β-木糖苷酶，二者共同作用可將自然界中的木聚糖降解成單糖，在造紙、飼料、食品工業(yè)中具有重要作用。產(chǎn)生木聚糖酶的微生物有很多種包括絲狀真菌、細(xì)菌、放線菌等。根據(jù)國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道，產(chǎn)生木聚糖酶的細(xì)菌主要有Bacillus subtilis、Clostridium sp.、Pseudomonas fluorescens等；產(chǎn)生木聚糖酶的放線菌主要有Streptomyces lividans、Streotomyces thermoviolaceus等；產(chǎn)木聚糖酶的絲狀真菌主要有Aspergillusniger、Aspergillus nidulans、Aspergillus phoenicis、Trichoderma reesei、Trichoderma koningii等。國(guó)內(nèi)的研究主要集中在絲狀真菌。
微生物產(chǎn)生的木聚糖酶理化性質(zhì)和分子量各不相同。分子量從9500到72000道爾頓，絕大多數(shù)為20000-30000道爾頓，等電點(diǎn)從3.6-10.3都有分布。催化反應(yīng)的最適溫度一般在50℃左右。最適pH根據(jù)微生物來源的不同而有差異，多數(shù)在pH4.0-6.0。
不同微生物產(chǎn)木聚糖酶的能力差異很大。以分批液體發(fā)酵(不補(bǔ)充養(yǎng)分)中每毫升培養(yǎng)液所產(chǎn)生的木聚糖酶酶活作比較。國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道中，Samain E等人報(bào)道的Bacillus sp.XE產(chǎn)木聚糖酶最高活力為380IU/ml(1997年)；Dhillon A等人報(bào)道的Bacillus circulans AB 16最高產(chǎn)酶活力為55IU/ml(2000年)；Kohli U等人報(bào)道的Thermoactinomyces thalophilus subgroup C.的最高酶活為42IU/ml(1997年)；Antonopoulos VT等報(bào)道的StreptomycesalbusATCC 3005的最高酶活為11.97IU/ml(2001年)；Costa-Ferreira M等人報(bào)道的Aspergillus niger CCMI 850的最高產(chǎn)酶活力為65IU/ml(1994年)；de Souza CG報(bào)道的Aspergillus flavus的最高產(chǎn)酶活力為190IU/ml(1999年)。國(guó)內(nèi)的研究報(bào)道中，曲音波等人報(bào)道的Bacilluspumilus A30產(chǎn)木聚糖酶最高活力為431IU/ml(1999年)；陳紅歌等人報(bào)道的Aspergillus niger E149的最高酶活力為375.2IU/ml(1998年)；蔡敬民等人報(bào)道的Aspergillus nigerA3的最高酶活力為340IU/ml(1996年)；丁少軍等人報(bào)道的Pseudomonas fluorescens O1的最高酶活力為164IU/ml(1998年)；楊革等人報(bào)道的Pseudomonas pseudoflava SQ153最高酶活為400IU/ml(2000年)。
發(fā)明創(chuàng)造內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種能夠產(chǎn)生具有較強(qiáng)酶活力的木聚糖酶的菌株。
一種生產(chǎn)木聚糖酶的巴氏畢赤酵母，是基因組中包含有與序列表中序列1的DNA序列至少90％同源性或相同性的DNA序列的巴氏畢赤酵母。其中優(yōu)選的是基因組中包含有序列表中序列1的DNA序列的巴氏畢赤酵母。
巴氏畢赤酵母(Pichia Pastoris)PGX722是基因組中包含有序列表中序列1的DNA序列的巴氏畢赤酵母，已于2002年11月19日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC)，保藏號(hào)為CGMCC № 0836。
巴氏畢赤酵母(Pichia Pastoris)PGX722由以下步驟獲得(1)從黒曲霉(Aspergillus.niger)149菌株(陳紅歌，朱靜，梁改琴，嚴(yán)自正，張樹政，1999，酸性木聚糖酶產(chǎn)生菌的篩選及產(chǎn)酶條件。微生物學(xué)報(bào)，39(4)89-93；陳紅歌，朱靜，梁改琴，嚴(yán)自正，賈新成，張樹政，2000，黑曲霉木聚糖酶的純化與性質(zhì)，菌物系統(tǒng)19(1)111-116)中獲得xylanase B基因的cDNA序列；(2)將該cDNA序列連接到巴氏畢赤酵母pPIC9K的表達(dá)載體，構(gòu)建成重組表達(dá)載體pPICH6(其物理圖譜如圖4所示)；(3)將重組表達(dá)載體pPICH6轉(zhuǎn)化巴氏畢赤酵母GS115受體菌，獲得重組PGX722菌株。
該菌株具有以下特點(diǎn)(1)巴氏畢赤酵母PGX722，基因工程酵母，菌體呈球狀，菌落光滑，呈乳白色。生長(zhǎng)溫度為28℃-30℃，代謝表型為Muts。
(2)此菌株的基因組中有序列表中的特征性序列。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種新的酶活性較強(qiáng)的木聚糖酶及其生產(chǎn)方法。
本發(fā)明所提供的木聚糖酶，是發(fā)酵巴氏畢赤酵母(Pichia Pastoris)PGX722 CGMCC№ 0836得到的。
本發(fā)明的木聚糖酶分子量為21KD，最適pH為5.0(如圖1所示)，最適溫度為50℃(如圖2所示)，在pH值4.0-7.0的范圍內(nèi)保持較高的活性(如圖3所示)，在50℃保溫12小時(shí)，酶活能夠保持。
一種生產(chǎn)木聚糖酶的方法，是發(fā)酵巴氏畢赤酵母(Pichia Pastoris)PGX722 CGMCC№ 0836，并自其發(fā)酵液中獲得木聚糖酶。
所述發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基為BMGY和BMMY培養(yǎng)基，其中BMGY培養(yǎng)基為菌體生長(zhǎng)培養(yǎng)基，含有1％酵母抽提物，2％蛋白胨，100mM磷酸鉀，1.34％YNB，1％甘油，4×10-5生物素，pH6.0；BMMY培養(yǎng)基為誘導(dǎo)產(chǎn)酶培養(yǎng)基，含有1％酵母抽提物，2％蛋白胨，100mM磷酸鉀，1.34％YNB，4×10-5％生物素，0.5％甲醇，pH6.0。
用本發(fā)明方法得到的木聚糖酶活性在700-1200IU。酶活性的測(cè)定方法是取0.1ml稀釋的酶液，加入到0.1ml用0.2mol/L pH4.8磷酸緩沖液配制的1％木聚糖溶液中，50℃反應(yīng)10分鐘，DNS測(cè)定還原糖(以木糖為標(biāo)準(zhǔn))。在上述條件下，每分鐘產(chǎn)生的還原糖相當(dāng)于1μmol木糖的所需酶量定義為1個(gè)酶活力單位(IU)。
本發(fā)明所提供的由巴氏畢赤酵母(Pichia Pastoris)PGX722產(chǎn)生的木聚糖酶為重組木聚糖酶，具有較高的酶活力，用重組木聚糖酶水解木聚糖，木聚糖的水解率達(dá)95％以上，水解產(chǎn)物以木二糖、木三糖、木四糖為主，占90％以上。
本發(fā)明的重組木聚糖酶在造紙、食品、飼料工業(yè)等方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值，在紙漿漂白過程中，通過使用該重組木聚糖酶可降低紙漿漂白過程中40％-50％的用氯率。


圖1為重組木聚糖酶的最適pH曲線圖2為重組木聚糖酶的最適溫度曲線圖3為重組木聚糖酶的pH穩(wěn)定性曲線圖4為重組表達(dá)載體pPICH6的物理圖譜具體實(shí)施方式
實(shí)施例1、發(fā)酵巴氏畢赤酵母(Pichia Pastoris)PGX722獲得木聚糖酶1、配制發(fā)酵培養(yǎng)基BMGY和BMMY；2、取配制的BMGY培養(yǎng)基25毫升置于250毫升的三角瓶中，并從YPD培養(yǎng)基上取本發(fā)明巴氏畢赤酵母(Pichia Pastoris)PGX722 CGMCC №0836用菌環(huán)接種于三角瓶中；3、在轉(zhuǎn)速為220r/min的旋轉(zhuǎn)式搖床上，30℃條件下培養(yǎng)48小時(shí)；4、離心收集菌體，將菌體轉(zhuǎn)入25毫升BMMY培養(yǎng)基中，30℃條件下培養(yǎng)72小時(shí)；5、收集發(fā)酵液并離心得到酶液。
實(shí)施例2、本發(fā)明木聚糖酶用于麥草漿的漂白1、酶處理?xiàng)l件漿濃5％；溫度50℃；處理時(shí)間60分鐘；pH值中性；酶用量20IU/g。
2、次氯酸漂白條件漿濃6％；溫度40℃；漂白時(shí)間2小時(shí)；漂液為次氯酸鈉，濃度為26-25g/L；用氯量為5％-3.5％。
3、紙漿經(jīng)酶處理及次氯酸鹽漂白結(jié)果如表1所示，其中X-0未經(jīng)酶處理、只用次氯酸漂白的紙漿；X-1經(jīng)酶處理、未用次氯酸漂白的紙漿；X-2、X-3經(jīng)酶處理、在漂白機(jī)里用次氯酸鈉漂白的紙漿；X-2、X-0漂白條件完全相同。
表1經(jīng)不同處理后漂白紙漿的結(jié)果

從表1的結(jié)果可以看出未漂漿經(jīng)酶處理，可改善麥草漿的次氯酸鹽漂白性能，當(dāng)漂白用氯量為5％時(shí)，漂白原漿經(jīng)酶處理比未經(jīng)酶處理漂后紙漿白度提高5.6個(gè)百分點(diǎn)，即從65.6％提高到71.2％。當(dāng)漂到白度為65.6％左右時(shí)，原漿漂白用氯為5％，經(jīng)酶處理的紙漿比對(duì)照可節(jié)省用氯30％。
序列表<160>1<210>1<211>1019<212>DNA<213>巴氏畢赤酵母(Pichia Pastoris)<400>1acagcaatat ataaacagaa ggaagctgcc ctgtcttaaa cctttttttt tatcatcatt 60attagcttac tttcataatt gcgactggtt ccaattgaca agcttttgat tttaacgact120tttaacgaca acttgagaag atcaaaaaac aactaattat tcgaaggatc caaacgatga180gatttccttc aatttttact gcagttttat tcgcagcatc ctccgcatta gctgctccag240tcaacactac aacagaagat gaaacggcac aaattccggc tgaagctgtc atcggttact300cagatttaga aggggatttc gatgttgctg ttttgccatt ttccaacagc acaaataacg360ggttattgtt tataaatact actattgcca gcattgctgc taaagaagaa ggggtatctc420tcgagaaaag agaggctgaa gcttacgtag aattctcgac cccgagctcg accggcgaga480acaacggctt ctactactcc ttctggaccg acggcggtgg agacgtgacc tacaccaacg540gagatgctgg tgcctacact gttgagtggt ccaacgtggg caactttgtc ggtggaaagg600gctggaaccc cggaagtgcg caggacatca cctacagcgg caccttcacc cctagcggca660acggctacct ctccgtctat ggctggacca ctgaccctct gatcgagtac tacatcgtcg720agtcttacgg cgactacaac cccggcagtg gaggcacgta caagggcacc gtcacctcgg780acggatccgt ttacgatatc tacacggcta cccgtaccaa tgctgcttcc attcagggaa840ccgctacctt cactcagtac tggtccgttc gccagaacaa gagagttggc ggaaccgtta900ccacctccaa ccacttcaat gcttgggcta agctgggaat gaacctgggt actcacaact960accagatcgt ggctaccgag ggttaccaga gcagtggatc ttcgtccatc actgttcag1019
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)木聚糖酶的巴氏畢赤酵母，是基因組中包含有與序列表中序列1的DNA序列至少90％同源性或相同性的DNA序列的巴氏畢赤酵母。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的巴氏畢赤酵母，其特征在于所述巴氏畢赤酵母的基因組中包含有序列表中序列1的DNA序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的巴氏畢赤酵母，其特征在于所述巴氏畢赤酵母為巴氏畢赤酵母PGX722 CGMCC №0836。
4.權(quán)利要求3所述的巴氏畢赤酵母(Pichia Pastoris)PGX722 CGMCC No PGX722的制備，包括以下步驟(1)從黑曲霉(Aspergillus.niger)149菌株中獲得xylanase B基因的cDNA序列；(2)將該cDNA序列連接到巴氏畢赤酵母pPIC9K的表達(dá)載體，構(gòu)建成重組表達(dá)載體pPICH6；(3)將重組表達(dá)載體pPICH6轉(zhuǎn)化巴氏畢赤酵母GS115受體菌，獲得重組PGX722菌株。
5.一種重組木聚糖酶，是發(fā)酵巴氏畢赤酵母(Pichia Pastoris)PGX722 CGMCC№0836得到的。
6.巴氏畢赤酵母(Pichia Pastoris)PGX722 CGMCC №0836在生產(chǎn)木聚糖酶中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種木聚糖酶及其生產(chǎn)方法與專用生產(chǎn)菌株，本發(fā)明提供的生產(chǎn)木聚糖酶的巴氏畢赤酵母，是基因組中包含有與序列表中序列1的DNA序列至少90％同源性或相同性的DNA序列的巴氏畢赤酵母。巴氏畢赤酵母(Pichia Pastoris)PGX722是基因組中包含有序列表中序列1的DNA序列的巴氏畢赤酵母，已于2002年11月19日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC)，保藏號(hào)為CGMCC № 0836。本發(fā)明所提供的由巴氏畢赤酵母(Pichia Pastoris)PGX722 CGMCC№0836產(chǎn)生的木聚糖酶具有高的酶活力，在造紙、食品及飼料工業(yè)中將得到廣泛應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N15/31GK1614015SQ20031010324
公開日2005年5月11日 申請(qǐng)日期2003年11月3日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月3日
發(fā)明者董志揚(yáng), 毛愛軍, 祝令香 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院微生物研究所