專利名稱：淡紫灰鏈霉菌海南變種及由該菌種制備農(nóng)用抗生素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及鏈霉菌屬的新菌種及由它制備農(nóng)用抗生素的方法。
背景技術(shù)：
農(nóng)藥是重要的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)資料，在保證農(nóng)作物的高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)中發(fā)揮著十分重要的作用。目前，我國每年使用農(nóng)藥制劑高達(dá)100多萬噸，合原藥30多萬噸(折純)，農(nóng)藥品種200多種。面對著巨大的農(nóng)藥需求和大量的投入，我國農(nóng)藥工業(yè)不得不走仿制國外已過專利保護(hù)期的一些農(nóng)藥品種，這導(dǎo)致了我國農(nóng)藥創(chuàng)制的落后和品種結(jié)構(gòu)的不合理。突出地表現(xiàn)在3個(gè)70％現(xiàn)象殺蟲劑占農(nóng)藥的70％，劇毒和高毒農(nóng)藥占?xì)⑾x劑的70％，其中有機(jī)磷有機(jī)氯農(nóng)藥占高毒劇毒農(nóng)藥的70％。
微生物農(nóng)藥通常指用微生物及其代謝產(chǎn)物制造的農(nóng)藥。由于我國幅員遼闊，氣候條件、土壤類型、植物種類等多種多樣，這就為開發(fā)新型微生物農(nóng)藥提供了良好的條件。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種鏈霉菌屬的新菌種，它能夠產(chǎn)生一類新的N-糖甙類抗生素。該抗生素對農(nóng)作物細(xì)菌性和真菌性病害具有防治作用。
本發(fā)明的另一目的是提供由該新菌種制備該類抗生素的方法。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取以下方案將淡紫灰鏈霉菌海南變種，通過發(fā)酵罐液體深層發(fā)酵，發(fā)酵液內(nèi)含有一類糖甙類化合物，這類化合物稱為中生素菌。中生菌素對農(nóng)作物病害，特別是農(nóng)作物細(xì)菌性病害有明顯的防治作用。
本發(fā)明所述的淡紫灰鏈霉菌海南變種(Streptomyces lavendulae var.hainanensis)已于2003年10月29日在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏號(hào)為CGMCC No.1026。
CGMCC No.1026是由自然分離的野生鏈霉菌，經(jīng)菌種選育后得到。
CGMCC No.1026具有以下微生物特性1.形態(tài)學(xué)特性該菌種在多種分類培養(yǎng)基上，都能形成發(fā)育良好的氣生菌絲體及基內(nèi)菌絲體，菌絲單杈分枝，在氣生菌絲體頂端形成卷曲的螺旋形孢子絲1-4圈。常形成10個(gè)以上的分生孢子鏈，孢子圓形或橢圓形(0.6-0.8×1-1.2μm)，孢子表面光滑。
2.培養(yǎng)學(xué)特性該菌種在通常的分類培養(yǎng)基及國際鏈霉菌規(guī)劃擬定的培養(yǎng)基(簡稱ISP培養(yǎng)基)上，形成粉末狀氣生菌絲體，灰白或微粉的灰色、淡紫灰至暗紫灰，基內(nèi)菌絲體乳脂色或淺黃色至芥黃色，無可溶性色素?？蓞⒁姳?。
表1淡紫灰鏈霉菌海南變種的培養(yǎng)特征

3.生理特性a.類黑色素的形成在蛋白胨-酵母膏-鐵瓊脂(ISP6)上，形成褐色色素，但在酪氨酸瓊脂(ISP7)上，無可溶性色素。
b.明膠液化陽性。
c.牛奶培養(yǎng)牛奶凝固并胨化。
d.淀粉水解陽性。
e.硝酸還原陽性。
f.纖維素分解不分解。
淡紫灰鏈霉菌海南變種能很好地利用葡萄糖、甘露糖、木糖、鼠李糖、阿拉伯糖。其次是果糖、肌醇、菊糖、乳糖、半乳糖。不利用酒石酸鈉、甘露醇、棉子糖、醋酸鈉、檸檬酸鈉。對蔗糖的利用可疑。
中生素菌有6個(gè)有效成分，各成分之間依次遞增一個(gè)β-賴氨酸，其結(jié)構(gòu)見式I。這6個(gè)有效成分是一個(gè)同系化合物，紙層析結(jié)果表明它屬于典型的堿性水溶性抗生素類群，混合物的紫外吸收光譜僅顯示末端吸收，各組分有類似的紅外光譜，在3400，1720，1600，1560，1340和1050cm-1有特征吸收峰，皆為左旋化合物。
式I其中n為1-6的正整數(shù)。
CGMCC No.1026經(jīng)發(fā)酵得到中生菌素水劑的步驟如下將CGMCC No.1026置于搖瓶中進(jìn)行種子培養(yǎng)，通常條件是溫度28～30℃，搖床轉(zhuǎn)速為180～200rpm，培養(yǎng)20～25小時(shí)；在種子罐內(nèi)培養(yǎng)24小時(shí)；再轉(zhuǎn)接大罐中發(fā)酵60～65小時(shí)后，將發(fā)酵液進(jìn)行板框或離心過濾；將濾液調(diào)節(jié)PH值至4.0-4.5，最后真空濃縮后制得中生菌素水劑成品。
以下發(fā)明內(nèi)容部分是中生菌素的積極效果A.中生素菌對一些常見農(nóng)作物病原菌的抑菌效果見第7頁的表2。MIC為最小抑制濃度(Minimal Inhibition Concentration)。中生菌素防治農(nóng)作物病害的施用方法及效果還可參見第8頁的表3。
B.中生素菌對動(dòng)物的毒性(1)急性毒性大白鼠口服，工業(yè)品LD50為10000mg/kg，純品LD50雄性為3 16mg/kg，雌性為237mg/kg。大白鼠經(jīng)皮，工業(yè)品LD50＞10000mg/kg。
(2)皮膚和眼睛的刺激性大白兔皮膚試驗(yàn)未見紅斑形成，無水腫形成。大白兔眼睛用藥后1～24h結(jié)膜輕度充血水腫，無分泌物，角膜正常，48h恢復(fù)正常。
(3)蓄積毒性按蓄積系數(shù)等于死亡半數(shù)時(shí)總攝樣品量除半數(shù)致死量，中生菌素蓄積系數(shù)為5.8。
(4)致畸性大鼠妊娠第6天至第15天連續(xù)灌胃10天，劑量為0.766～15.32mg/kg，各劑量每次灌0.5mg/100g體重，對胚胎無影響。經(jīng)卡平方檢驗(yàn)，各劑量級(jí)吸收胎數(shù)和死胎數(shù)、胎鼠骨骼畸形與對照組比較無顯著差異，胎鼠內(nèi)臟未見畸形。
(5)微核試驗(yàn)沒有致染色體損傷的作用，沒有致生殖細(xì)胞畸變的作用。
(6)致突變性用Ames標(biāo)準(zhǔn)平板摻入法測定，各劑量級(jí)均無致突變作用。
C.中生素菌在植物體、土壤中的殘留量(1)樣品制備選擇生長健康的蓮白菜地，設(shè)對照區(qū)與30ppm噴藥區(qū)，噴藥后每天取對照土樣、對照菜樣、噴藥土樣、噴藥菜樣，連續(xù)取樣10天。菜樣放組織搗碎皿中搗碎，加水浸泡24h，用紗布濾去菜渣。濾液用濾紙過濾兩次，再用布氏漏斗真空抽濾。濾液于50℃水浴蒸發(fā)至少量體積，冷凍干燥。土樣加水打散，浸泡24h后，用紗布過濾，再用濾紙、布氏漏斗過濾，濾液濃縮凍干。
(2)樣品測定由于中生菌素屬于N-糖甙類抗生素，紫外光譜為末端吸收，一般紫外范圍無法檢測，只有采用柱前將樣品與鄰苯二甲醛在適當(dāng)條件下進(jìn)行衍生化反應(yīng)，生成具有熒光的產(chǎn)物，再以反相離子對色譜進(jìn)行分離后，用熒光檢測器檢出。本方法靈敏度極高，最小檢出量為6.9×10-2ppb，重復(fù)性好，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差cv值為0.2372％，回收率為97.09％。
(3)測定結(jié)果用藥后第1天植物體中檢出量為0.185μg/ml，第7天檢出量為0.001μg/ml，第8天未檢出，這說明中生菌素在自然界中殘存量極微，而且時(shí)間僅有7天，因此，對環(huán)境沒有污染，對人畜沒有毒害。
從以上結(jié)果可知，中生菌素是一種使用安全，易于分解的生物農(nóng)藥。
D.中生素菌的農(nóng)田示范效果a.1991-1996年在河南和北京兩地用中生菌素(15-30ppm)防治水稻白葉枯病做了系統(tǒng)的試驗(yàn)和示范，包括不用藥劑的對比試驗(yàn)，不同發(fā)病程度和防治次數(shù)試驗(yàn)，秧田施藥保護(hù)對大田發(fā)病期和發(fā)病程度的作用，試驗(yàn)示范面積達(dá)2萬畝。結(jié)果表明，中生菌素防水防治水稻白葉枯病的最佳時(shí)期是浸種、再加秧田三葉期和移栽前5天噴霧。如遇嚴(yán)重發(fā)病年份，與大田發(fā)病初期再噴1-2次，能控制了病情的擴(kuò)展蔓延，防治效果高達(dá)86.3-90.1％，優(yōu)于化學(xué)藥劑葉枯凈和稻禾壯。
b.1992-2000年在河南汝州、鄭州、濮陽，山東的沂源、煙臺(tái)等地的果園中以中生菌素取代退菌特等常用化學(xué)殺菌劑，防治蘋果輪紋病(爛果病)和葉斑病，采用15-30ppm中生菌素藥液與波多液交替使用，生長期共噴3次中生菌素，爛果率一般可控制在0.47-5％，相當(dāng)或優(yōu)于常用化學(xué)藥劑，使用中生菌素防治的果園，果實(shí)大、色澤好、果銹少亦是突出特點(diǎn)之一。
c.1992-2000年在鄭州、濮陽、沂源等地果園用中生菌素防治蘋果葉病，葉斑病病葉率控制在22％左右，病情指數(shù)在8％以下，顯著優(yōu)于退菌特、多菌靈等化學(xué)藥劑。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)中生菌素可以防治農(nóng)作物病害，特別是防治農(nóng)作物細(xì)菌性病害，應(yīng)用范圍廣，且具有高效、低毒、低殘留的優(yōu)點(diǎn)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1CGMCC No.1026的選育將自然分離的淡紫灰鏈霉菌海南變種野生菌株，通過自然選育得到一株菌落大而飽滿的菌株，顏色為淡紫色。以此菌株為出發(fā)菌株，其效價(jià)近400μg/ml，經(jīng)溶菌酶酶解獲得該菌原生質(zhì)體，再用紫外誘變15-50秒，取得了較好的誘變效果，得到一株CGMCC No.1026，其效價(jià)高達(dá)6000～7000μg/ml，是出發(fā)菌株的17倍。
實(shí)施例2中生菌素水劑的制備將CGMCC No.1026置于搖瓶中進(jìn)行種子培養(yǎng)，條件是溫度28℃，搖床轉(zhuǎn)速為200rpm，培養(yǎng)24小時(shí)。然后在種子罐培養(yǎng)24小時(shí)，種子罐中采用LM培養(yǎng)基。種子罐轉(zhuǎn)接發(fā)酵罐中發(fā)酵60小時(shí)后，將發(fā)酵液進(jìn)行板框或離心過濾。將濾液調(diào)節(jié)PH值至4.0，最后真空濃縮(真空度0.080MPa)后制得中生菌素水劑成品，有效成份含量為10000μg/ml。
培養(yǎng)種子所用的搖瓶培養(yǎng)基為(wt％)葡萄糖1.0、可溶性淀粉1.5、玉米粉1.0、黃豆餅粉2.0、NH4Cl 0.3、CaCO30.3及通用的微量元素。搖瓶裝量為500ml瓶裝100ml。
種子罐培養(yǎng)基為(wt％)葡萄糖1.5、玉米粉1.0、黃豆餅粉2.0、NH4Cl0.4、CaCO30.3、氯化鈉0.5及通用的微量元素。
發(fā)酵培養(yǎng)基為(wt％)葡萄糖2.5、玉米粉1.0、黃豆餅粉2.0、NH4Cl 0.4、CaCO30.3、氯化鈉0.5及通用的微量元素。
實(shí)施例3將CGMCC No.1026置于搖瓶中進(jìn)行種子培養(yǎng)，條件是溫度30℃，搖床轉(zhuǎn)速為180rpm，培養(yǎng)20小時(shí)。然后在種子罐發(fā)酵24小時(shí)，種子罐中采用與實(shí)施例2相同的LM培養(yǎng)基。種子罐轉(zhuǎn)接發(fā)酵罐中發(fā)酵65小時(shí)后，將發(fā)酵液進(jìn)行板框或離心過濾。將濾液調(diào)節(jié)PH值至4.5，最后真空濃縮(真空度0.080MPa)后制得中生菌素水劑成品，有效成份含量為9900μg/ml。
表2中生菌素不同組分的抗菌譜(MIC，單位μg/ml)

表3中生菌素防治農(nóng)作物病害及效果

權(quán)利要求
1.淡紫灰鏈霉菌海南變種，保藏號(hào)為CGMCC No.1026。
2.一類化合物，其特征在于具有式I的結(jié)構(gòu)， 式I其中n為1-6的正整數(shù)。
3.一種抗生素，其特征在于，由權(quán)利要求2所述的化合物中的一種或幾種組成。
4.一種權(quán)利要求3所述的抗生素的水劑的制備方法，其特征在于，使用CGMCC No.1026進(jìn)行液體深層發(fā)酵。
5.一種權(quán)利要求4所述的抗生素的水劑的制備方法，其特征在于，將CGMCC No.1026置于搖瓶中進(jìn)行種子培養(yǎng)，條件是溫度28～30℃，搖床轉(zhuǎn)速為180～200rpm，培養(yǎng)20～25小時(shí)；在種子罐內(nèi)培養(yǎng)24小時(shí)；再轉(zhuǎn)接大罐中發(fā)酵60～65小時(shí)后，將發(fā)酵液進(jìn)行板框或離心過濾；將濾液調(diào)節(jié)PH值至4.0-4.5，最后真空濃縮后制得中生菌素水劑成品。
6.權(quán)利要求2所述的化合物在農(nóng)作物病害防治中的用途。
7.權(quán)利要求2所述的化合物在農(nóng)作物細(xì)菌性病害防治中的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了淡紫灰鏈霉菌海南變種CGMCC No.1026。由CGMCC No.1026發(fā)酵后得到一類化合物，如式I所示，其中n為1－6的正整數(shù)。以CGMCCNo.1026經(jīng)發(fā)酵后的發(fā)酵液，即中生菌素，含有式I類化合物中的一種或幾種純化合物，可以防治農(nóng)作物病害，特別是防治農(nóng)作物細(xì)菌性病害，且具有高效、低毒、低殘留的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12N1/20GK1539957SQ200310103250
公開日2004年10月27日 申請日期2003年11月4日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月4日
發(fā)明者朱昌雄, 蔣細(xì)良, 謝德齡, 倪楚芳, 許鴻章, 孫東園, 姬軍紅, 趙立平, 田云龍 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物防治研究所, 蘇州凱立生物制品有限公司