專利名稱：一種高活力木本飼料專用復(fù)合纖維素酶制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及木本飼料特別是高含量粗纖維生產(chǎn)飼料，具體地說是一種高活力木本飼料專用復(fù)合纖維素酶制備方法。
背景技術(shù)：
檸條、沙棘等灌木是內(nèi)蒙古自治區(qū)鄂爾多斯高原常見的綠化樹種，具有耐瘠薄、耐低溫、抗干旱的優(yōu)點。目前，僅檸條的種植面積就達(dá)數(shù)十萬公頃。隨著當(dāng)?shù)亟琳叩膶嵤?，牲畜圈養(yǎng)已勢在必行，但飼草短缺已成為當(dāng)?shù)貙崿F(xiàn)牲畜圈養(yǎng)的限制性因素。木本飼料一直是一種潛在的飼草資源，如檸條有“接濟(jì)草”、“救命草”之稱，但其粗纖維和果膠物質(zhì)含量過高既影響木本飼料的營養(yǎng)價值又影響其適口性，因此并沒有得到有效開發(fā)。
纖維素酶可以將植物體內(nèi)的纖維素、半纖維素轉(zhuǎn)化為糖類，同時通過將植物細(xì)胞壁分解，使細(xì)胞中的可溶性蛋白質(zhì)、非蛋白氮化物、礦物質(zhì)等內(nèi)容物得以釋放，在家畜喂養(yǎng)、食品加工、中草藥有效成分提取中得到了廣泛應(yīng)用。在植物性飼料中，果膠不僅是植物細(xì)胞壁成分，也是細(xì)胞間質(zhì)成分，還是豆科植物種子細(xì)胞壁的主要成分，果膠少量溶解后即在動物消化道中形成凝膠物質(zhì)，從而影響牲畜對多種營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。果膠酶可以將果膠質(zhì)分解，從而解除其對牲畜消化吸收營養(yǎng)物質(zhì)的抑制。復(fù)合纖維素酶一般以高活力纖維素酶為主要成分，還含有半纖維素酶、果膠酶、淀粉酶、蛋白酶等，因此將復(fù)合纖維素酶應(yīng)用于木本飼料進(jìn)行反芻動物的體內(nèi)或體外的酶解發(fā)酵，可將檸條等木本植物有效地開發(fā)為一種飼草來源。
當(dāng)前，我國的復(fù)合纖維素酶的工業(yè)化生產(chǎn)技術(shù)還不成熟，所生產(chǎn)的酶制劑產(chǎn)品的酶活較低，目前市場上國產(chǎn)的纖維素酶制劑商品經(jīng)測定，其活力僅在7.5-23U之間(U＝mg葡萄糖/(gDM·h))，而且許多酶制劑產(chǎn)品還存在酶系不均衡的現(xiàn)象，影響其降解作用的發(fā)揮；另外，不少相關(guān)研究選擇豆粕粉、酵母膏、葡萄糖、CMC-Na、淀粉等高價原料作為氮、碳源，因此酶制劑產(chǎn)品的成本高，超出了現(xiàn)階段農(nóng)牧民的購買能力，因此也限制了它在實際生產(chǎn)中的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述酶制劑產(chǎn)品中酶活低、酶系不均衡、成本高的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種成本低、高活力木本飼料復(fù)合纖維素酶制備方法。
為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為采用木霉，通過雙溫度培養(yǎng)法進(jìn)行固體產(chǎn)酶發(fā)酵，經(jīng)斜面培養(yǎng)、搖瓶擴(kuò)大培養(yǎng)及采用新型固體培養(yǎng)基產(chǎn)酶固體發(fā)酵階段，制得高活力的復(fù)合纖維素酶成品；具體操作步驟如下(1)斜面培養(yǎng)在裝有PDA培養(yǎng)基的試管中接入木霉微生物，25～32℃靜置培養(yǎng)4～9天；(2)搖瓶擴(kuò)大培養(yǎng)在裝有PDY培養(yǎng)基的搖瓶中接入斜面孢子懸浮液，擴(kuò)大培養(yǎng)，在25～32℃、80～150r/min條件下培養(yǎng)3～10天，得搖瓶孢子懸浮液；(3)固體發(fā)酵取固體培養(yǎng)基，經(jīng)高壓滅菌，按以1～10％搖瓶孢子懸浮液的量接種于固體培養(yǎng)基，而后采用雙溫度培養(yǎng)法，同時將環(huán)境濕度控制在30～60％之間，自然通風(fēng)以補(bǔ)充氧氣，即可制得高活力的復(fù)合固體酶制劑；所述木霉微生物為康氏木霉F244；所述木霉孢子懸浮液的制備是將斜面培養(yǎng)基上的木霉孢子用無菌水洗下制得；按重量百分比計，所述固體培養(yǎng)基的配方由5～25％稻草粉，15～35％麥麩，1～15％(NH4)2SO4及40～80％水分，經(jīng)混合均勻制得；所述雙溫度培養(yǎng)法指溫度培養(yǎng)分兩個階段，前一階段20～60小時期間內(nèi)恒溫在30～35℃，后一階段50～120小時期間內(nèi)控制溫度在22～27℃之間，共培養(yǎng)70～180小時；所述雙溫度培養(yǎng)法指溫度培養(yǎng)分兩個階段，前一階段24～48小時期間內(nèi)恒溫在30～35℃，后一階段60～96小時期間內(nèi)控制溫度在22～27℃之間，共培養(yǎng)84～144小時。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點1.產(chǎn)酶活力高，酶系均衡。利用本發(fā)明配方進(jìn)行固體發(fā)酵產(chǎn)生的纖維素復(fù)合酶具有很高的纖維素酶和果膠酶活性(其濾紙酶活經(jīng)實測可達(dá)76mg葡萄糖/(gDM·h)，果膠酶活經(jīng)實測可達(dá)102mg葡萄糖/(gDM·h))，而且本發(fā)明通過調(diào)整原料配比和發(fā)酵條件，可使復(fù)合酶制劑中的各種酶保持恰當(dāng)比例(其中C1/Cx，即棉花酶活/羧甲基纖維素酶活，比例達(dá)0.45；β-葡萄糖苷酶活力高達(dá)94.4mg葡萄糖/(gDM·h)，β-葡萄糖苷酶/FPA高達(dá)1.24)，這對于木本植物粗纖維的分解特別有利，同時完全適合其他飼料原料如作物秸桿、木材下腳料等用于飼料生產(chǎn)。另外，采用雙溫度培養(yǎng)法，前期的高溫有利于菌絲體的旺盛生長，后期通過適當(dāng)降低發(fā)酵溫度從而控制菌絲體的生長速度，拉長了菌絲生長時間，使產(chǎn)酶過程延長，以促進(jìn)酶的分泌。
2.成本低。本發(fā)明以木本飼料的飼用開發(fā)為目標(biāo)，在復(fù)合酶發(fā)酵原料的選擇上注重其來源廣泛和價格低廉。如以稻草粉為誘導(dǎo)物，(NH4)2SO4為無機(jī)N源，麥麩為復(fù)合N源、C源，具有來源廣、價格低的優(yōu)點，本發(fā)明方法實現(xiàn)了發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化，降低了產(chǎn)酶成本，增加了投產(chǎn)后的產(chǎn)品競爭力。
3.強(qiáng)調(diào)了對牲畜的安全性。本發(fā)明生產(chǎn)復(fù)合酶制劑所使用的固體發(fā)酵原料對動物無毒無害，具有安全性和營養(yǎng)補(bǔ)充價值，對環(huán)境無直接或間接污染作用。由于本發(fā)明方法生產(chǎn)的復(fù)合纖維素酶具有很高的單項和總體酶活性，可用于木本飼料發(fā)酵生產(chǎn)(體外酶解)或直接拌和木本飼料進(jìn)行飼喂(體內(nèi)酶解)，效果良好。
具體實施例方式
下面通過實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
實施例1(1)斜面培養(yǎng)在裝有PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯20％，葡萄糖2％，瓊脂2％，余為水)的試管中接入康氏木霉F244，28℃靜置培養(yǎng)6天；(2)孢子懸浮液制備將斜面培養(yǎng)基上的康氏木霉孢子用無菌水洗下，制成孢子懸浮液；(3)搖瓶擴(kuò)大培養(yǎng)在裝有100ml的PDY培養(yǎng)基(馬鈴薯20％，葡萄糖2％，酵母膏1％，余為水)500ml搖瓶中接入一個斜面的斜面孢子懸浮液，擴(kuò)大培養(yǎng)，在28℃、130r/min條件下培養(yǎng)3天，得搖瓶孢子懸浮液；(4)產(chǎn)酶固體發(fā)酵取上述固體培養(yǎng)基50g進(jìn)行高壓滅菌后，接種2ml搖瓶孢子懸浮液，而后采用雙溫度培養(yǎng)法，發(fā)酵96小時；前30小時恒溫30℃，后66小時27℃，環(huán)境濕度控制在40％，自然通風(fēng)以補(bǔ)充氧氣，即可制得高活力的復(fù)合固體酶制劑。其中固體培養(yǎng)基配方為稻草粉16.9％，麥麩26.5％，(NH4)2SO49.5％，水分47.1％。
經(jīng)過上述步驟制得的高活力的復(fù)合固體酶制劑，其濾紙酶、棉花酶，羧甲基纖維素酶，β-葡萄糖苷酶活力經(jīng)實測分別達(dá)76.6mg葡萄糖/(gDM·h)，93.1mg葡萄糖/(gDM·h)，208.5mg葡萄糖/(gDM·h)，94.4mg葡萄糖/(gDM·h)，101.4mg葡萄糖/(gDM·h)，其中C1/Cx達(dá)0.446。
本發(fā)明所獲得的復(fù)合酶具有活力高，酶系均衡，成本低廉，原料來源廣泛，本發(fā)明具有操作簡便的特點，符合西部牧區(qū)的實際情況，適用于木本飼料或其他高纖維素原料的飼用開發(fā)。
實施例2與實施例1不同之處在于在裝有PDA培養(yǎng)基的試管中接入康氏木霉，32℃靜置培養(yǎng)9天；在裝有PDY培養(yǎng)基中接入斜面孢子懸浮液，擴(kuò)大培養(yǎng)，在25℃、80r/min條件下培養(yǎng)10天，得搖瓶孢子懸浮液；產(chǎn)酶固體發(fā)酵時取上述固體培養(yǎng)基50g進(jìn)行高壓滅菌后，接種4ml搖瓶孢子懸浮液，而后采用雙溫度培養(yǎng)法，發(fā)酵144小時；前48小時恒溫35℃，后96小時22℃，環(huán)境濕度控制在60％，即可制得高活力的復(fù)合固體酶制劑。其中固體培養(yǎng)基配方為稻草粉25％，麥麩15％，(NH4)2SO45％，水分55％。初始pH值自然，約6.4。
發(fā)酵結(jié)束后，濾紙酶活經(jīng)實測為96mg葡萄糖/(gDM·24h)。
權(quán)利要求
1.一種高活力木本飼料復(fù)合纖維素酶制備方法，其特征在于采用木霉，通過雙溫度培養(yǎng)法進(jìn)行固體產(chǎn)酶發(fā)酵，經(jīng)斜面培養(yǎng)、搖瓶擴(kuò)大培養(yǎng)及采用新型固體培養(yǎng)基產(chǎn)酶固體發(fā)酵階段，制得高活力的復(fù)合纖維素酶成品；具體操作步驟如下(1)斜面培養(yǎng)在裝有PDA培養(yǎng)基的試管中接入木霉微生物，25～32℃靜置培養(yǎng)4～9天；(2)搖瓶擴(kuò)大培養(yǎng)在裝有PDY培養(yǎng)基的搖瓶中接入斜面孢子懸浮液，擴(kuò)大培養(yǎng)，在25～32℃、80～150r/min條件下培養(yǎng)3～10天，得搖瓶孢子懸浮液；(3)固體發(fā)酵取固體培養(yǎng)基，經(jīng)高壓滅菌，按以1～10％搖瓶孢子懸浮液的量接種于固體培養(yǎng)基，而后采用雙溫度培養(yǎng)法，同時將環(huán)境濕度控制在30～60％之間，自然通風(fēng)以補(bǔ)充氧氣，即可制得高活力的復(fù)合固體酶制劑。
2.按照權(quán)利要求1所述高活力木本飼料復(fù)合纖維素酶制備方法，其特征在于所述木霉微生物為康氏木霉F244。
3.按照權(quán)利要求1所述高活力木本飼料復(fù)合纖維素酶制備方法，其特征在于所述木霉孢子懸浮液的制備是將斜面培養(yǎng)基上的木霉孢子用無菌水洗下制得。
4.按照權(quán)利要求1所述高活力木本飼料復(fù)合纖維素酶制備方法，其特征在于按重量百分比計，所述固體培養(yǎng)基的配方由5～25％稻草粉，15～35％麥麩，1～15％(NH4)2SO4及40～80％水分，經(jīng)混合均勻制得。
5.按照權(quán)利要求1所述高活力木本飼料復(fù)合纖維素酶制備方法，其特征在于所述雙溫度培養(yǎng)法指溫度培養(yǎng)分兩個階段，前一階段20～60小時期間內(nèi)恒溫在30～35℃，后一階段50～120小時期間內(nèi)控制溫度在22～27℃之間，共培養(yǎng)70～180小時。
6.按照權(quán)利要求1所述高活力木本飼料復(fù)合纖維素酶制備方法，其特征在于所述雙溫度培養(yǎng)法指溫度培養(yǎng)分兩個階段，前一階段24～48小時期間內(nèi)恒溫在30～35℃，后一階段60～96小時期間內(nèi)控制溫度在22～27℃之間，共培養(yǎng)84～144小時。
全文摘要
本發(fā)明涉及木本飼料特別是高含量粗纖維生產(chǎn)飼料，具體地說是一種高活力木本飼料復(fù)合纖維素酶制備方法。以康氏木霉為產(chǎn)酶菌種通過雙溫度培養(yǎng)法進(jìn)行固體產(chǎn)酶發(fā)酵，經(jīng)斜面培養(yǎng)、搖瓶擴(kuò)大培養(yǎng)及采用新型固體培養(yǎng)基產(chǎn)酶固體發(fā)酵階段，制得高活力的復(fù)合纖維素酶成品。所獲得的復(fù)合酶具有活力高，酶系均衡，成本低廉，原料來源廣泛，本發(fā)明具有操作簡便的特點，符合西部牧區(qū)的實際情況，適用于木本飼料或其他高纖維素原料的飼用開發(fā)。
文檔編號C12N9/42GK1607250SQ20031010484
公開日2005年4月20日 申請日期2003年10月15日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月15日
發(fā)明者李培軍, 靖德兵, 張春桂, 許華夏, 寇振武, 丁建國, 李穎梅, 張海榮 申請人:中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所