專利名稱：利用固定化分枝桿菌細胞脫除汽油中有機硫的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用嗜熱菌固定化細胞脫除化石燃料中有機硫的方法，具體地說涉及利用一株固定化的嗜熱分枝桿菌細胞脫除汽油中有機硫的方法。
背景技術(shù)：
化石燃料的燃燒，產(chǎn)生大量的有毒氣體SO2進入大氣，造成嚴(yán)重的空氣污染，同時也是產(chǎn)生酸雨的主要原因。據(jù)聯(lián)合國環(huán)境署數(shù)據(jù)表明，中國在1995年SO2排放量為34544.14千噸，占世界排放總量的1/4。為了保護環(huán)境，要求使用低硫含量的化石燃料。目前世界上低硫含量的化石燃料儲備正在急劇減少，需要對含硫高的化石燃料進行脫硫處理。隨著汽車排放控制新技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，以及對燃油質(zhì)量的深入研究，國際上對燃料油的硫含量要求越來越嚴(yán)格。隨著汽車工業(yè)的發(fā)展和環(huán)保要求日益嚴(yán)格，國產(chǎn)燃油質(zhì)量問題越來越引起社會的關(guān)注。我國政府把控制汽車尾氣排放分三個階段，第一階段從1999年到2003年，新車要達到歐1排放標(biāo)準(zhǔn)，第二階段從2004年開始，新車要達到歐2排放標(biāo)準(zhǔn)，第三階段2010年將和國際同步。1993年歐洲標(biāo)準(zhǔn)的汽油硫含量要求不大于0.1％，我國新標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定不大于0.08％。因此要使我國燃油質(zhì)量與國際接軌，還要做大量的工作。
化學(xué)脫硫方法—加氫脫硫(Hydrodesulfurization，HDS)通過催化過程，將有機硫轉(zhuǎn)化成H2S氣體，反應(yīng)是在1～20Mpa的壓力和290～450℃的溫度下進行的。目前可以使用的進行汽油脫硫的技術(shù)，最主要的是就是加氫脫硫技術(shù)。使用加氫脫硫技術(shù)，可以將大多數(shù)汽油中的硫含量降低到30ng/μL以下。但是使用加氫脫硫處理汽油進行深度脫硫，往往會導(dǎo)致催化裂化汽油(Fluid catalytic cracking，F(xiàn)CC)中的石腦油中的烯烴飽和，從而顯著降低汽油的辛烷值，同時加氫脫硫技術(shù)需要消耗大量的氫氣，其副產(chǎn)品為H2S氣體，對于環(huán)境又是再次的污染。
由于對化石燃料中的硫含量有嚴(yán)格規(guī)定，再加上HDS方法耗費比較高，而且難以脫去化石燃料中的有機硫，而生物催化法脫硫(Biodesufurization，BDS)成本低，在常溫下即可進行，并且具有高專一性，因此發(fā)展一種化石燃料的生物脫硫方法已是十分必要。這使得BDS方法成為一種可供選擇的方法，和HDS方法一起或者直接代替該方法進行石油的脫硫。
化石燃料中的有機硫主要是二苯并噻吩(Dibenzothiophene，DBT)、苯并噻吩(Benzothiophene，BTH)、噻吩(Thiophene，T)等，于是生物脫有機硫的研究也就以DBT，BTH和T為模式化合物進行?，F(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多微生物，沿著烴降解途徑(Hydrocarbon degradative pathway)降解DBT，在脫去有機硫的同時，往往也破壞碳-碳鍵，從而導(dǎo)致燃料熱值減少而不可取。同時，也發(fā)現(xiàn)一些微生物如紅球菌屬(Rhodococcus)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、棒桿菌屬(Corynebacterium)和節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)等，能夠沿著硫?qū)Ｒ煌緩?Sulfur-specific pathway)降解DBT，它們不打開環(huán)，從而保留了燃料的熱值，成為近年來研究的熱點。最近幾年，發(fā)現(xiàn)能夠?qū)Ｒ恍越到釨TH的菌株，主要包括戈登氏菌株(Gordonia sp.)213E，類芽孢桿菌(Paenibacillussp.)A11-2，紅球菌(Rhodococcus sp.)T09，中華根瘤菌(Sinorhizobium sp.)KT55以及紅球菌KT462。這些菌株的BTH降解途徑已分析較清楚(圖1)。其中類芽孢桿菌(Paenibacillus sp.)A11-2，中華根瘤菌(Sinorhizobium sp.)KT55和紅球菌(Rhodococcus sp.)KT462的BTH降解途徑是苯并噻吩→苯并噻吩亞砜→苯并噻吩砜→2-(2’-羥苯基)乙醛→氧-羥基苯乙烯。
而戈登氏菌(Gordonia sp.)213E和紅球菌(Rhodococcus sp.)T09菌株的BTH降解途徑和上面的類似，只不過降解BTH的終產(chǎn)物不是氧-羥基苯乙烯，而是2-(2’-羥苯基)乙醛。
應(yīng)用生長細胞或者休止細胞處理柴油，輕瓦斯油有一些報道，但是使用生物催化劑懸液進行燃油處理有一些局限性，如油相與催化劑所在的水相的比例低，生物催化劑重復(fù)利用困難。因此，使用固定化生物催化劑是一種很好的替代方法。使用固定化細胞有很多優(yōu)點從反應(yīng)體系中容易分離獲得生物催化劑，反應(yīng)體系有相對較高的油相與水相比例，造成的污染可能性比較低。利用固定化生物催化劑處理輕瓦斯油已經(jīng)有報道，但是利用生物催化劑脫除汽油中硫的專利和文獻，至今未見報道。
由于大多石油化合物的處理是在高溫高壓下進行，那么把原料冷卻下來再進行生物過程處理就不太經(jīng)濟，而且不利于后續(xù)處理。因此，圍繞篩選一些較有價值的、可在較高溫度下專一性地脫除DBT和其他噻吩類化合物中有機硫的菌株，并進一步應(yīng)用固定化細胞于汽油脫硫的工作，也是目前本領(lǐng)域急需研究和解決的課題。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是針對上述不足，提供一種利用固定化的兼性嗜熱分枝桿菌細胞脫除汽油中有機硫的方法。
本發(fā)明的利用固定化分枝桿菌細胞脫除汽油中有機硫的方法，其步驟順序如下(1)菌種選擇選用分枝桿菌屬古地分枝桿菌(Mycobacterium goodii)DSM 44492，〖該菌株保藏于德國典型微生物收藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismenund Zellkulturen GmbH，Braunschweig，Germany)〗，草分枝桿菌(Mycobacterium phlei)ATCC 11728〖該菌株保藏于美國典型微生物收藏中心(12301 Park Lawn Drive，Rockville，Md.20852)〗之一；(2)斜面培養(yǎng)將上述菌株接種于含有質(zhì)量百分比為1.5～2.0％的瓊脂糖并加有0.1～1.0mmol/L DBT的MAM固體斜面培養(yǎng)基上，30～50℃培養(yǎng)菌體20～26小時；(3)一級種子培養(yǎng)將步驟(2)培養(yǎng)的菌體，無菌條件下用接種環(huán)接1～4環(huán)于20～100mL含有0.1～1.0mmol/L DBT的MAM液體培養(yǎng)基中，30～50℃條件下，在搖床上振蕩培養(yǎng)20～26小時，制得一級種子；(4)擴大培養(yǎng)以體積比為5％的接種量，接一級種子于300～1000mL含有0.1～1.0mmol/L DBT的MAM液體培養(yǎng)基中，30～50℃條件下，在搖床上振蕩培養(yǎng)20～26小時，制得二級種子；(5)發(fā)酵罐培養(yǎng)以體積比為5％的接種量，接二級種子于1.8～8L含有0.1～1.0mmol/L DBT的MAM液體培養(yǎng)基中，30～50℃條件下，培養(yǎng)20～26小時；
(6)收集菌體在5000g條件下離心5～8分鐘，收集步驟(5)制得的菌體，并用生理鹽水洗滌2～3次；之后用生理鹽水懸浮并加入表面活性劑，使表面活性劑的質(zhì)量百分比濃度為0.05～5％，得菌體細胞；(7)溶解海藻酸鈉用生理鹽水配制質(zhì)量百分比濃度為0.5～3％的海藻酸鈉溶液，配制時，劇烈攪拌或在60℃下水浴加熱以保證充分溶解；(8)向步驟(7)所得的海藻酸鈉溶液中加入質(zhì)量百分比為0.05～5％的表面活性劑；(9)向步驟(8)所得的溶液中加入步驟(6)所得的菌體細胞，使菌體濃度達到10～30克干細胞/升；(10)用生理鹽水配制質(zhì)量百分比濃度為0.5～5％的CaCl2溶液，并在所得的CaCl2溶液中加入質(zhì)量百分比為0.05～5％的表面活性劑；(11)將步驟(9)所得的菌體細胞懸浮液，以直徑0.2～2mm的液滴滴入步驟(10)所得的溶液中；充分交聯(lián)0.5～6小時，形成固定化細胞體系；(12)處理樣品在100～1000毫升的反應(yīng)體系中，以每升25～500克的量加入步驟(11)所得的固定化細胞，作為生物催化劑；加入水相和汽油，使水相和汽油的比例為3～10∶1，在30～45℃條件下，180轉(zhuǎn)/分鐘振蕩16～28小時，進行樣品處理；(13)分離樣品以10,000g離心5～10分鐘分離步驟(12)中處理后的樣品，得到油相樣品；(14)樣品檢測取1～5μL步驟(13)中的油相樣品，進樣，測定汽油中殘留的硫含量，得出脫除率。
在上述利用固定化分枝桿菌細胞脫除汽油中有機硫的方法中，步驟(1)中所述的菌種，選擇古地分枝桿菌(Mycobac terium goodii)DSM 44492。
步驟(2)、(3)、(4)、(5)中所述的菌體培養(yǎng)溫度是37～45℃。
步驟(2)、(3)、(4)、(5)中所述的菌體培養(yǎng)時間是20～24小時。
步驟(2)、(3)、(4)、(5)中所述的DBT濃度為0.2～0.5mmol/L。
步驟(6)、(8)、(10)中所述的表面活性劑是指Tween20、Tween80、TritonX-114之一。
步驟(12)中所述的生物催化劑的加入量是每升100～400克固定化細胞。
步驟(12)中所述的汽油是直餾汽油、催化裂化汽油或調(diào)和汽油之一。
步驟(12)中所述的水相與汽油的比例為5～9∶1。
步驟(12)中處理樣品的溫度為37～45℃，樣品振蕩時間為20～24小時。
在上述利用固定化分枝桿菌細胞脫除汽油中有機硫的方法中，菌株培養(yǎng)使用改良A培養(yǎng)基(Modification of A Medium，MAM)，配方為10克葡萄糖，0.5克KH2PO4，4克K2HPO4，1克NH4Cl，2mL質(zhì)量百分比為1％的CaCl2，2mL質(zhì)量百分比為10％的MgCl2·6H2O，200μL質(zhì)量百分比為1％的FeCl3，200μL質(zhì)量百分比為5％的NaCl，5mL質(zhì)量百分比為1％的酵母膏，200μL的維生素混合液，5mL的金屬離子混合液，加蒸餾水到1升。115℃條件下滅菌20分鐘。金屬離子混合液的配方為，每升蒸餾水含有ZnCl20.5g；FeCl20.5g；MnCl2·4H2O 0.5g；Na2MoO4·2H2O 0.1g；CuCl2·2H2O 0.05g；Na2WO4·2H2O 0.05g；HCl 120mmol/L。維生素混合物的配方為，每升蒸餾水含有400mg泛酸鈣(Calcium pantothenate)；200mg肌醇(Inositol)；400mg尼克酸/煙酸(Niacin)；400mg VB6(Pyridoxine hydrochloride)；200mg對氨基苯甲酸(p-aminobenzoic acid)；0.5mg VB12(Cyanocobalamin)。以0.5mmol/L的DBT或者二甲基亞砜作為硫源。
由于大多石油化合物的處理是在高溫高壓下進行，那么把原料冷卻下來再進行生物過程處理就不太經(jīng)濟。本發(fā)明涉及的分枝桿菌，能夠在45℃左右，生長、脫硫，達到了較高的脫除率。
經(jīng)過堿洗處理之后的汽油，其中大部分含硫化合物如硫醇、硫醚都已經(jīng)通過加氫處理除去，硫含量為175.4ng/μL，剩余的主要是難以處理的噻吩型含硫有機化合物。本發(fā)明采用固定化古地分枝桿菌細胞作為生物催化劑，能夠有效地脫除汽油中的含硫有機化合物。在40℃條件下，使用固定化細胞將硫含量為175.4ng/μL的汽油中的硫，降低到54.2ng/μL，脫除率達到了69.1％，能夠在脫硫后直接應(yīng)用，完全達到了嚴(yán)格的環(huán)保要求。如圖2所示，使用GC-AED(氣相色譜—原子發(fā)射檢測器)測定固定化細胞處理之前的汽油中的含硫化合物的分布，其中含有硫醇，烷烴代硫醇，硫醚，噻吩，烷烴代噻吩，苯并噻吩等含硫化合物，其總硫含量使用WK-2D微機綜合動態(tài)微庫侖分析儀(江蘇電分析儀器廠)進行分析測定為175.4ng/μL。圖3所示的是經(jīng)過固定化細胞處理之后，汽油中的含硫化合物的分布情況，此時總硫含量為54.2ng/μL。經(jīng)過圖2，圖3比較，可以明顯看出經(jīng)過固定化細胞處理之后，汽油中的大部分含硫化合物，如硫醇類，噻吩類都基本脫除，起到了很好的脫硫效果。使用GC-FID(氣相色譜—氫火焰檢測器)檢測了固定化細胞處理前后汽油中的烴類物質(zhì)變化，結(jié)果表明，固定化細胞處理沒有對汽油烴類造成任何影響(圖4)。
進一步使用硫含量為204.1ng/μL的汽油為樣品，進行固定化細胞處理。增大反應(yīng)體積至500mL，24小時后，汽油有機硫含量為151.4ng/μL，脫除率為25.8％；48小時后汽油的硫含量為98.7ng/μL，脫除率為51.6％。此時更換新鮮的固定化細胞進行第二遍處理，處理后的硫含量為39.8ng/μL，脫除率為80.5％。同時還試驗了固定化細胞的重復(fù)利用情況，結(jié)果表明，處理過一次的固定化細胞，進行再次汽油脫硫，活力為第一次的80％左右。
根據(jù)文獻和專利檢索，目前還沒有關(guān)于汽油的生物脫硫的報道和相關(guān)的專利。


圖1推斷的BTH降解途徑。A是苯并噻吩，B是苯并噻吩亞砜，C，D是苯并噻吩砜，E是苯并氧硫己二烯砜，F(xiàn)是氧-羥基苯乙烯。
圖2進行固定化細胞處理之前，使用GC-AED檢測汽油中的含硫化合物的分布情況。圖中T代表噻吩，BT代表苯并噻吩。
圖3進行固定化細胞處理之后，使用GC-AED檢測汽油中的含硫化合物的分布情況。圖中T代表噻吩。
圖4使用GC-FID檢測固定化細胞處理前后，汽油中的烴類物質(zhì)的變化。其中圖A是處理之前的汽油烴類的色譜圖，圖B是處理之后的汽油烴類的色譜圖。
具體實施方式
實施例1利用固定化分枝桿菌細胞脫除汽油中有機硫的方法，其中加入的水相與汽油的比例為5∶1，處理溫度為37℃
(1)菌種選擇選用分枝桿菌中古地分枝桿菌(Mycobacterium goodii)DSM 44492；(2)斜面培養(yǎng)將上述菌株接種于含有質(zhì)量百分比為1.8％的瓊脂糖并加有0.5mmol/L DBT的MAM固體斜面培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)菌體20小時；(3)一級種子培養(yǎng)將步驟(2)培養(yǎng)的菌體，無菌條件下用接種環(huán)接2環(huán)于50mL含有0.5mmol/L DBT的MAM液體培養(yǎng)基中(使用300mL三角搖瓶)，37℃條件下，在搖床上振蕩培養(yǎng)20小時，制得一級種子；(4)擴大培養(yǎng)以體積比為5％的接種量，接一級種子于300mL含有0.5mmol/L DBT的MAM液體培養(yǎng)基中(使用1L三角搖瓶)，37℃條件下，在搖床上振蕩培養(yǎng)20小時，制得二級種子；(5)發(fā)酵罐培養(yǎng)以體積比為5％的接種量，接二級種子于1.8L含有0.5mmol/LDBT的MAM液體培養(yǎng)基中(使用2L德國貝朗全自動發(fā)酵罐)，37℃條件下，培養(yǎng)20小時；(6)收集菌體在5000g條件下離心5分鐘，收集步驟(5)制得的菌體，并用生理鹽水洗滌2次；之后所得細胞用生理鹽水懸浮后加入表面活性劑Tween80，使表面活性劑的質(zhì)量百分比濃度為0.3％，得到菌體細胞；(7)溶解海藻酸鈉用生理鹽水配制質(zhì)量百分比濃度為1％的海藻酸鈉溶液，配制時，劇烈攪拌或在60℃下水浴加熱以保證充分溶解；(8)向步驟(7)所得的海藻酸鈉溶液中加入質(zhì)量百分比為0.3％的表面活性劑Tween80；(9)向步驟(8)所得的溶液中加入步驟(6)所得的菌體細胞，使菌體濃度達到13克干細胞/升；(10)用生理鹽水配制質(zhì)量百分比濃度為5％的CaCl2溶液，并在所得的CaCl2溶液中加入質(zhì)量百分比為0.3％的表面活性劑Tween80；(11)將步驟(9)所得的菌體細胞懸浮液以直徑1mm的液滴滴入步驟(10)所得的溶液中；充分交聯(lián)4小時形成固定化細胞體系生物催化劑；(12)處理樣品在120mL體系中加入30g步驟(11)所得的生物催化劑，以5∶1的水相與汽油的比例(Water-to-oil ratio，WOR)，加入20mL含有181ng/μL的硫的汽油，在37℃條件下，180轉(zhuǎn)/分鐘振蕩24小時；(13)分離樣品以10,000g離心5分鐘分離步驟(12)中處理的樣品，得到油相樣品；(14)樣品檢測待步驟(13)中的樣品分離完之后，取3μL樣品進樣(WK-2D微機綜合動態(tài)微庫侖分析儀，江蘇電分析儀器廠)，測定汽油中殘留的硫含量，得出脫除率為39％。
菌株使用改良A培養(yǎng)基(Modification of A Medium，MAM)，配方為10克葡萄糖，0.5克KH2PO4，4克K2HPO4，1克NH4Cl，2mL質(zhì)量百分比為1％的CaCl2，2mL質(zhì)量百分比為10％的MgCl2·6H2O，200μL質(zhì)量百分比為1％的FeCl3，200μL質(zhì)量百分比為5％的NaCl，5mL質(zhì)量百分比為1％的酵母膏，200μL的維生素混合液，5mL的金屬離子混合液，加蒸餾水到1升。115℃條件下滅菌20分鐘。金屬離子混合液的配方為，每升蒸餾水含有ZnCl20.5g；FeCl20.5g；MnCl2·4H2O 0.5g；Na2MoO4·2H2O 0.1g；CuCl2·2H2O 0.05g；Na2WO4·2H2O 0.05g；HCl 120mmol/L。維生素混合物的配方為，每升蒸餾水含有400mg泛酸鈣(Calcium pantothenate)；200mg肌醇(Inositol)；400mg尼克酸/煙酸(Niacin)；400mg VB6(Pyridoxine hydrochloride)；200mg對氨基苯甲酸(p-aminobenzoic acid)；0.5mg VB12(Cyanocobalamin)。以0.5mmol/L的DBT或者二甲基亞砜作為硫源。
實施例2利用固定化分枝桿菌細胞脫除汽油中有機硫的方法，其中加入的水相與汽油的比例為9∶1，處理溫度為45℃(1)菌種選擇選用分枝桿菌中古地分枝桿菌(Mycobacterium goodii)DSM 44492；(2)斜面培養(yǎng)將上述菌株接種于含有質(zhì)量百分比為1.8％的瓊脂糖并加有0.5mmol/L DBT的MAM固體斜面培養(yǎng)基上，45℃培養(yǎng)菌體24小時；(3)一級種子培養(yǎng)將步驟(2)培養(yǎng)的菌體，無菌條件下用接種環(huán)接2環(huán)于50mL含有0.2mmol/L DBT的MAM液體培養(yǎng)基中(使用300mL三角搖瓶)，45℃條件下，在搖床上振蕩培養(yǎng)24小時，制得一級種子；(4)擴大培養(yǎng)以體積比為5％的接種量，接一級種子于300mL含有0.2mmol/L DBT的MAM液體培養(yǎng)基中(使用1L三角搖瓶)，45℃條件下，在搖床上振蕩培養(yǎng)24小時，制得二級種子；(5)發(fā)酵罐培養(yǎng)以體積比為5％的接種量，接二級種子于1.8L含有0.2mmol/LDBT的MAM液體培養(yǎng)基中(使用2L德國貝朗全自動發(fā)酵罐)，45℃條件下，培養(yǎng)24小時；(6)收集菌體在5000g條件下離心5分鐘，收集步驟(5)制得的菌體，并用生理鹽水洗滌2次；之后所得細胞用生理鹽水懸浮后加入表面活性劑Tween80，使表面活性劑的質(zhì)量百分比濃度為0.3％，得到菌體細胞；(7)溶解海藻酸鈉用生理鹽水配制質(zhì)量百分比濃度為2％的海藻酸鈉溶液，配置時，劇烈攪拌或在60℃下水浴加熱以保證充分溶解；(8)向步驟(7)所得的海藻酸鈉溶液中加入質(zhì)量百分比為0.3％的表面活性劑Tween80；(9)向步驟(8)所得的溶液中加入步驟(6)所得的菌體細胞，使菌體濃度達到13克干細胞/升；(10)用生理鹽水配制質(zhì)量百分比濃度為5％的CaCl2溶液，并在所得的CaCl2溶液中加入質(zhì)量百分比為0.3％的表面活性劑Tween80；(11)將步驟(9)所得的菌體細胞懸浮液以直徑1mm的液滴滴入步驟(10)所得的溶液中；充分交聯(lián)4小時形成固定化細胞體系生物催化劑；(12)處理樣品在100mL體系中加入50g步驟(11)所得的生物催化劑，以9∶1的水相與汽油的比例(Water-to-oil ratio，WOR)，加入10mL含有175ng/μL的硫的汽油，在45℃條件下，180轉(zhuǎn)/分鐘振蕩24小時；(13)分離樣品以10,000g離心5分鐘分離步驟(12)中處理的樣品，得到油相樣品；(14)樣品檢測待步驟(13)中的樣品分離完之后，取3μL樣品進樣(WK-2D微機綜合動態(tài)微庫侖分析儀，江蘇電分析儀器廠)，測定汽油中殘留的硫含量，得出脫除率為69％。
菌株使用改良A培養(yǎng)基(Modification of A Medium，MAM)，配方為10克葡萄糖，0.5克KH2PO4，4克K2HPO4，1克NH4Cl，2mL質(zhì)量百分比為1％的CaCl2，2mL質(zhì)量百分比為10％的MgCl2·6H2O，200μL質(zhì)量百分比為1％的FeCl3，200μL質(zhì)量百分比為5％的NaCl，5mL質(zhì)量百分比為1％的酵母膏，200μL的維生素混合液，5mL的金屬離子混合液，加蒸餾水到1升。115℃條件下滅菌20分鐘。金屬離子混合液的配方為，每升蒸餾水含有ZnCl20.5g；FeCl20.5g；MnCl2·4H2O 0.5g；Na2MoO4·2H2O 0.1g；CuCl2·2H2O 0.05g；Na2WO4·2H2O 0.05g；HCl 120mmol/L。維生素混合物的配方為，每升蒸餾水含有400mg泛酸鈣(Calcium pantothenate)；200mg肌醇(Inositol)；400mg尼克酸/煙酸(Niacin)；400mg VB6(Pyridoxine hydrochloride)；200mg對氨基苯甲酸(p-aminobenzoic acid)；0.5mg VB12(Cyanocobalamin)。以0.5mmol/L的DBT或者二甲基亞砜作為硫源。
實施例3利用固定化分枝桿菌細胞脫除汽油中有機硫的方法，總反應(yīng)體系為500ml，反應(yīng)時間為24小時，其中加入的水相與汽油的比例為6∶1，處理溫度為43℃(1)菌種選擇選用分枝桿菌中古地草分枝桿菌(Mycobacterium phlei)ATC℃11728；(2)斜面培養(yǎng)將上述菌株接種于含有質(zhì)量百分比為1.8％的瓊脂糖并加有0.5mmol/L DBT的MAM固體斜面培養(yǎng)基上，45℃培養(yǎng)菌體24小時；(3)一級種子培養(yǎng)將步驟(2)培養(yǎng)的菌體，無菌條件下用接種環(huán)接2環(huán)于50mL含有0.3mmol/L DBT的MAM液體培養(yǎng)基中(使用300mL三角搖瓶)，45℃條件下，在搖床上振蕩培養(yǎng)24小時，制得一級種子；(4)擴大培養(yǎng)以體積比為5％的接種量，接一級種子于300mL含有0.3mmol/L DBT的MAM液體培養(yǎng)基中(使用1L三角搖瓶)，45℃條件下，在搖床上振蕩培養(yǎng)24小時，制得二級種子；(5)發(fā)酵罐培養(yǎng)以體積比為5％的接種量，接二級種子于1.8L含有0.3mmol/LDBT的MAM液體培養(yǎng)基中(使用2L德國貝朗全自動發(fā)酵罐)，45℃條件下，培養(yǎng)24小時；(6)收集菌體在5000g條件下離心5分鐘，收集步驟(5)制得的菌體，并用生理鹽水洗滌2次；之后所得細胞用生理鹽水懸浮后加入表面活性劑Tween20，使表面活性劑的質(zhì)量百分比濃度為0.3％，得到菌體細胞；(7)溶解海藻酸鈉用生理鹽水配制質(zhì)量百分比濃度為2％的海藻酸鈉溶液，配置時，劇烈攪拌或在60℃下水浴加熱以保證充分溶解；(8)向步驟(7)所得的海藻酸鈉溶液中加入質(zhì)量百分比為0.3％的表面活性劑Tween20；(9)向步驟(8)所得的溶液中加入步驟(6)所得的菌體細胞，使菌體濃度達到13克干細胞/升；(10)用生理鹽水配制質(zhì)量百分比濃度為5％的CaCl2溶液，并在所得的CaCl2溶液中加入質(zhì)量百分比為0.3％的表面活性劑Tween20；(11)將步驟(9)所得的菌體細胞懸浮液以直徑1mm的液滴滴入步驟(10)所得的溶液中；充分交聯(lián)4小時形成固定化細胞體系生物催化劑；(12)處理樣品在500mL體系中加入250g步驟(11)所得的生物催化劑，以6∶1的水相與汽油的比例(Water-to-oil ratio，WOR)，加入72mL含有204ng/μL的硫的汽油，在43℃條件下，180轉(zhuǎn)/分鐘振蕩24小時；(13)分離樣品以10,000g離心5分鐘分離步驟(12)中處理的樣品，得到油相樣品；(14)樣品檢測待步驟(13)中的樣品分離完之后，取3μL樣品進樣(WK-2D微機綜合動態(tài)微庫侖分析儀，江蘇電分析儀器廠)，測定汽油中殘留的硫含量，得出脫除率為25.8％。
菌株使用改良A培養(yǎng)基(Modification of A Medium，MAM)，配方為10克葡萄糖，0.5克KH2PO4，4克K2HPO4，1克NH4Cl，2mL質(zhì)量百分比為1％的CaCl2，2mL質(zhì)量百分比為10％的MgCl2·6H2O，200μL質(zhì)量百分比為1％的FeCl3，200μL質(zhì)量百分比為5％的NaCl，5mL質(zhì)量百分比為1％的酵母膏，200μL的維生素混合液，5mL的金屬離子混合液，加蒸餾水到1升。115℃條件下滅菌20分鐘。金屬離子混合液的配方為，每升蒸餾水含有ZnCl20.5g；FeCl20.5g；MnCl2·4H2O 0.5g；Na2MoO4·2H2O 0.1g；CuCl2·2H2O 0.05g；Na2WO4·2H2O 0.05g；HCl 120mmol/L。維生素混合物的配方為，每升蒸餾水含有400mg泛酸鈣(Calcium pantothenate)；200mg肌醇(Inositol)；400mg尼克酸/煙酸(Niacin)；400mg VB6(Pyridoxine hydrochloride)；200mg對氨基苯甲酸(p-aminobenzoic acid)；0.5mg VB12(Cyanocobalamin)。以0.5mmol/L的DBT或者二甲基亞砜作為硫源。
實施例4利用固定化分枝桿菌細胞脫除汽油中有機硫的方法，總反應(yīng)體系為500ml，反應(yīng)時間為48小時，其中加入的水相與汽油的比例為6∶1，處理溫度為43℃(1)菌種選擇選用分枝桿菌中古地分枝桿菌(Mycobacterium goodii)DSM 44492；(2)斜面培養(yǎng)將上述菌株接種于含有質(zhì)量百分比為1.8％的瓊脂糖并加有0.5mmol/L DBT的MAM固體斜面培養(yǎng)基上，45℃培養(yǎng)菌體24小時；(3)一級種子培養(yǎng)將步驟(2)培養(yǎng)的菌體，無菌條件下用接種環(huán)接2環(huán)于50mL含有0.5mmol/L DBT的MAM液體培養(yǎng)基中(使用300mL三角搖瓶)，45℃條件下，在搖床上振蕩培養(yǎng)24小時，制得一級種子；(4)擴大培養(yǎng)以體積比為5％的接種量，接一級種子于300mL含有0.5mmol/L DBT的MAM液體培養(yǎng)基中(使用1L三角搖瓶)，45℃條件下，在搖床上振蕩培養(yǎng)24小時，制得二級種子；(5)發(fā)酵罐培養(yǎng)以體積比為5％的接種量，接二級種子于1.8L含有0.5mmol/LDBT的MAM液體培養(yǎng)基中(使用2L德國貝朗全自動發(fā)酵罐)，45℃條件下，培養(yǎng)24小時；(6)收集菌體在5000g條件下離心5分鐘，收集步驟(5)制得的菌體，并用生理鹽水洗滌2次；之后所得細胞用生理鹽水懸浮后加入表面活性劑Triton X-114，使表面活性劑的質(zhì)量百分比濃度為0.3％，得到菌體細胞；(7)溶解海藻酸鈉用生理鹽水配制質(zhì)量百分比濃度為2％的海藻酸鈉溶液，配制時，劇烈攪拌或在60℃下水浴加熱以保證充分溶解；(8)向步驟(7)所得的海藻酸鈉溶液中加入質(zhì)量百分比為0.3％的表面活性劑TritonX-114；(9)向步驟(8)所得的溶液中加入步驟(6)所得的菌體細胞，使菌體濃度達到13克干細胞/升；
(10)用生理鹽水配制質(zhì)量百分比濃度為5％的CaCl2溶液，并在所得的CaCl2溶液中加入質(zhì)量百分比為0.3％的表面活性劑Triton X-114；(11)將步驟(9)所得的菌體細胞懸浮液以直徑1mm的液滴滴入步驟(10)所得的溶液中；充分交聯(lián)4小時形成固定化細胞體系生物催化劑；(12)處理樣品在500mL體系中加入180g步驟(11)所得的生物催化劑，以6∶1的水相與汽油的比例(Water-to-oil ratio，WOR)，加入72mL含有204ng/μL的硫的汽油，在43℃條件下，180轉(zhuǎn)/分鐘振蕩48小時；(13)分離樣品以10,000g離心5分鐘分離步驟(12)中處理的樣品，得到油相樣品；(14)樣品檢測待步驟(13)中的樣品分離完之后，取3μL樣品進樣(WK-2D微機綜合動態(tài)微庫侖分析儀，江蘇電分析儀器廠)，測定汽油中殘留的硫含量，得出脫除率為51.6％。
菌株使用改良A培養(yǎng)基(Modification of A Medium，MAM)，配方為10克葡萄糖，0.5克KH2PO4，4克K2HPO4，1克NH4Cl，2mL質(zhì)量百分比為1％的CaCl2，2mL質(zhì)量百分比為10％的MgCl2·6H2O，200μL質(zhì)量百分比為1％的FeCl3，200μL質(zhì)量百分比為5％的NaCl，5mL質(zhì)量百分比為1％的酵母膏，200μL的維生素混合液，5mL的金屬離子混合液，加蒸餾水到1升。115℃條件下滅菌20分鐘。金屬離子混合液的配方為，每升蒸餾水含有ZnCl20.5g；FeCl20.5g；MnCl2·4H2O 0.5g；Na2MoO4·2H2O 0.1g；CuCl2·2H2O 0.05g；Na2WO4·2H2O 0.05g；HCl 120mmol/L。維生素混合物的配方為，每升蒸餾水含有400mg泛酸鈣(Calcium pantothenate)；200mg肌醇(Inositol)；400mg尼克酸/煙酸(Niacin)；400mg VB6(Pyridoxine hydrochloride)；200mg對氨基苯甲酸(p-aminobenzoic acid)；0.5mg VB12(Cyanocobalamin)。以0.5mmol/L的DBT或者二甲基亞砜作為硫源。
實施例5利用固定化分枝桿菌細胞脫除汽油中有機硫的方法，同一批油樣使用固定化細胞進行兩次處理(1)菌種選擇選用分枝桿菌中古地分枝桿菌(Mycobacterium goodii)DSM 44492；(2)斜面培養(yǎng)將上述菌株接種于含有質(zhì)量百分比為1.8％的瓊脂糖并加有0.5mmol/LDBT的MAM固體斜面培養(yǎng)基上，45℃培養(yǎng)菌體24小時；(3)一級種子培養(yǎng)將步驟(2)培養(yǎng)的菌體，無菌條件下用接種環(huán)接2環(huán)于50mL含有0.5mmol/L DBT的MAM液體培養(yǎng)基中(使用300mL三角搖瓶)，45℃條件下，在搖床上振蕩培養(yǎng)24小時，制得一級種子；(4)擴大培養(yǎng)以體積比為5％的接種量，接一級種子于300mL含有0.5mmol/L DBT的MAM液體培養(yǎng)基中(使用1L三角搖瓶)，45℃條件下，在搖床上振蕩培養(yǎng)24小時，制得二級種子；(5)發(fā)酵罐培養(yǎng)以體積比為5％的接種量，接二級種子于1.8L含有0.5mmol/LDBT的MAM液體培養(yǎng)基中(使用2L德國貝朗全自動發(fā)酵罐)，45℃條件下，培養(yǎng)24小時；(6)收集菌體在5000g條件下離心5分鐘，收集步驟(5)制得的菌體，并用生理鹽水洗滌2次；之后所得細胞用生理鹽水懸浮后加入表面活性劑Tween80，使表面活性劑的質(zhì)量百分比濃度為0.3％，得到菌體細胞；
(7)溶解海藻酸鈉用生理鹽水配制質(zhì)量百分比濃度為2％的海藻酸鈉溶液，配制時，劇烈攪拌或在60℃下水浴加熱以保證充分溶解；(8)向步驟(7)所得的海藻酸鈉溶液中加入質(zhì)量百分比為0.3％的表面活性劑Tween80；(9)向步驟(8)所得的溶液中加入步驟(6)所得的菌體細胞，使菌體濃度達到13克干細胞/升；(10)用生理鹽水配制質(zhì)量百分比濃度為5％的CaCl2溶液，并在所得的CaCl2溶液中加入質(zhì)量百分比為0.3％的表面活性劑Tween80；(11)將步驟(9)所得的菌體細胞懸浮液以直徑1mm的液滴滴入步驟(10)所得的溶液中；充分交聯(lián)4小時形成固定化細胞體系生物催化劑；(12)處理樣品在140mL體系中加入50g步驟(11)所得的生物催化劑，以6∶1的水相與汽油的比例(Water-to-oil ratio，WOR)，加入20mL含有204ng/μL的硫的汽油，在43℃條件下，180轉(zhuǎn)/分鐘振蕩24小時；(13)以10,000g離心5分鐘分離步驟(12)中處理的樣品，得到油相樣品；(14)在140mL體系中加入50g步驟(11)所得的生物催化劑，以6∶1的水相與汽油的比例(Water-to-oil ratio，WOR)，加入步驟(13)所得的油相在43℃條件下，180轉(zhuǎn)/分鐘振蕩24小時；(15)分離樣品以10,000g離心5分鐘分離步驟(12)中處理的樣品，得到油相樣品；(16)樣品檢測待步驟(15)中的樣品分離完之后，取3μL樣品進樣(WK-2D微機綜合動態(tài)微庫侖分析儀，江蘇電分析儀器廠)，測定汽油中殘留的硫含量，得出脫除率為80.5％。
菌株使用改良A培養(yǎng)基(Modification of A Medium，MAM)，配方為10克葡萄糖，0.5克KH2PO4，4克K2HPO4，1克NH4Cl，2mL質(zhì)量百分比為1％的CaCl2，2mL質(zhì)量百分比為10％的MgCl2·6H2O，200μL質(zhì)量百分比為1％的FeCl3，200μL質(zhì)量百分比為5％的NaCl，5mL質(zhì)量百分比為1％的酵母膏，200μL的維生素混合液，5mL的金屬離子混合液，加蒸餾水到1升。115℃條件下滅菌20分鐘。金屬離子混合液的配方為，每升蒸餾水含有ZnCl20.5g；FeCl20.5g；MnCl2·4H2O 0.5g；Na2MoO4·2H2O 0.1g；CuCl2·2H2O 0.05g；Na2WO4·2H2O 0.05g；HCl 120mmol/L。維生素混合物的配方為，每升蒸餾水含有400mg泛酸鈣(Calcium pantothenate)；200mg肌醇(Inositol)；400mg尼克酸/煙酸(Niacin)；400mg VB6(Pyridoxine hydrochloride)；200mg對氨基苯甲酸(p-aminobenzoic acid)；0.5mg VB12(Cyanocobalamin)。以0.5mmol/L的DBT或者二甲基亞砜作為硫源。
權(quán)利要求
1.一種利用固定化分枝桿菌細胞脫除汽油中有機硫的方法，其步驟順序如下(1)菌種選擇選用分枝桿菌中古的分枝桿菌(Mycobacterium goodii)DSM 44492，草分枝桿菌(Mycobac terium phlei)ATCC 11728之一；(2)斜面培養(yǎng)將上述菌株接種于含有質(zhì)量百分比為1.5～2.0％的瓊脂糖并加有0.1～1.0mmol/L DBT的MAM固體斜面培養(yǎng)基上，30～50℃培養(yǎng)菌體20～26小時；(3)一級種子培養(yǎng)將步驟(2)培養(yǎng)的菌體，無菌條件下用接種環(huán)接1～4環(huán)于20～100mL含有0.1～1.0mmol/LDBT的MAM液體培養(yǎng)基中，30～50℃條件下，在搖床上振蕩培養(yǎng)20～26小時，制得一級種子；(4)擴大培養(yǎng)以體積比為5％的接種量，接一級種子于300～1000mL含有0.1～1.0mmol/LDBT的MAM液體培養(yǎng)基中，30～50℃條件下，在搖床上振蕩培養(yǎng)20～26小時，制得二級種子；(5)發(fā)酵罐培養(yǎng)以體積比為5％的接種量，接二級種子于1.8～8L含有0.1～1.0mmol/L DBT的MAM液體培養(yǎng)基中，30～50℃條件下，培養(yǎng)20～26小時；(6)收集菌體在5000g條件下離心5～8分鐘，收集步驟(5)制得的菌體，并用生理鹽水洗滌2～3次；之后用生理鹽水懸浮并加入表面活性劑，使表面活性劑的質(zhì)量百分比濃度為0.05～5％，得菌體細胞；(7)溶解海藻酸鈉用生理鹽水配制質(zhì)量百分比濃度為0.5～3％的海藻酸鈉溶液，配制時，劇烈攪拌或在60℃下水浴加熱以保證充分溶解；(8)向步驟(7)所得的海藻酸鈉溶液中加入質(zhì)量百分比為0.05～5％的表面活性劑；(9)向步驟(8)所得的溶液中加入步驟(6)所得的菌體細胞，使菌體濃度達到10～30克干細胞/升；(10)用生理鹽水配制質(zhì)量百分比濃度為0.5～5％的CaCl2溶液，并在所得的CaCl2溶液中加入質(zhì)量百分比為0.05～5％的表面活性劑；(11)將步驟(9)所得的菌體細胞懸浮液，以直徑0.2～2mm的液滴滴入步驟(10)所得的溶液中；充分交聯(lián)0.5～6小時，形成固定化細胞體系；(12)處理樣品在100～1000毫升的反應(yīng)體系中，以每升25～500克的量加入步驟(11)所得的固定化細胞，作為生物催化劑；加入水相和汽油，使水相和汽油的比例為3～10∶1，在30～45℃條件下，180轉(zhuǎn)/分鐘振蕩16～28小時，進行樣品處理；(13)分離樣品以10,000g離心5～10分鐘分離步驟(12)中處理后的樣品，得到油相樣品；(14)樣品檢測取1～5μL步驟(13)中的油相樣品，使用WK-2D微機綜合動態(tài)微庫侖分析儀(江蘇電分析儀器廠)進行檢測，測定汽油中殘留的硫含量，得出脫除率。
2.如權(quán)利要求1所述的利用固定化分枝桿菌細胞脫除汽油中有機硫的方法，其特征在于，步驟(1)中所述的菌種，選擇古的分枝桿菌(Mycobacteriumgoodii)DSM 44492。
3.如權(quán)利要求1所述的利用固定化分枝桿菌細胞脫除汽油中有機硫的方法，其特征在于，步驟(2)、(3)、(4)、(5)中所述的菌體培養(yǎng)溫度是37～45℃。
4.如權(quán)利要求1所述的利用固定化分枝桿菌細胞脫除汽油中有機硫的方法，其特征在于，步驟(2)、(3)、(4)、(5)中所述的菌體培養(yǎng)時間是20～24小時。
5.如權(quán)利要求1所述的利用固定化分枝桿菌細胞脫除汽油中有機硫的方法，其特征在于，步驟(2)、(3)、(4)、(5)中所述的DBT濃度為0.2～0.5mmol/L。
6.如權(quán)利要求1所述的利用固定化分枝桿菌細胞脫除汽油中有機硫的方法，其特征在于，步驟(6)、(8)、(10)中所述的表面活性劑是指Tween20、Tween80、Triton X-114之一。
7.如權(quán)利要求1所述的利用固定化分枝桿菌細胞脫除汽油中有機硫的方法，其特征在于，步驟(12)中所述的生物催化劑的加入量是每升100～400克固定化細胞。
8.如權(quán)利要求1所述的利用固定化分枝桿菌細胞脫除汽油中有機硫的方法，其特征在于，步驟(12)中所述的汽油是直餾汽油、催化裂化汽油和調(diào)和汽油之一。
9.如權(quán)利要求1所述的利用固定化分枝桿菌細胞脫除汽油中有機硫的方法，其特征在于，步驟(12)中所述的水相與汽油的比例為5～9∶1。
10.如權(quán)利要求1所述的利用固定化分枝桿菌細胞脫除汽油中有機硫的方法，其特征在于，步驟(12)中處理樣品的溫度為37～45℃，樣品振蕩時間為20～24小時。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用固定化分枝桿菌細胞脫除汽油中有機硫的方法，該方法包括(1)菌種選擇，(2)斜面培養(yǎng)，(3)一級種子培養(yǎng)，(4)擴大培養(yǎng)，(5)發(fā)酵罐培養(yǎng)，(6)收集菌體，(7)固定化細胞，(8)處理樣品，(9)分離樣品，(10)樣品檢測等步驟；具有方法簡便，溫度要求寬泛(30－50℃)，耗能低，脫硫率高等特點，在大氣污染治理方面具有很大的應(yīng)用前景。
文檔編號C12S1/02GK1544581SQ20031010553
公開日2004年11月10日 申請日期2003年11月24日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月24日
發(fā)明者許平, 李福利, 馮進輝, 馬翠卿, 楊春玉, 王霞, 許 平 申請人:山東大學(xué)