專利名稱：吡蟲啉羥基化的微生物轉(zhuǎn)化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種吡蟲啉羥基化的微生物轉(zhuǎn)化方法。
背景技術(shù)：
吡蟲啉(Imidacloprid，IMI)是一種高效安全、高選擇性的新型殺蟲劑，其作用于昆蟲煙堿乙酰膽堿受體，具有觸殺、胃毒和內(nèi)吸活性。吡蟲啉已廣泛用于刺吸式口器害蟲如蚜蟲和葉蟬及鞘翅目害蟲防治，種子和土壤處理，另外還用于建筑防治白蟻和防治貓和狗等寵物身上的跳蚤等。目前，吡蟲啉已在全球一百多個國家登記，在140多種作物上使用。
目前，國內(nèi)外對于吡蟲啉的研究主要集中在三個方面，一是吡蟲啉的作有機制和特點，包括藥效、抗性和受體研究；二是吡蟲啉的合成方法研究；三是吡蟲啉的環(huán)境行為研究，包括土壤的吸附性、移動性、揮發(fā)性和環(huán)境降解性(光解、水解和土壤降解)研究，在作物中吡蟲啉的代謝及活性研究。國內(nèi)外對于吡蟲啉的研究均是在動植物和土壤方面的，未見有微生物轉(zhuǎn)化吡蟲啉的研究。
Robin sur報道，IMI被植物吸收后，轉(zhuǎn)變?yōu)榱u基吡蟲啉(hydroxy IMI)，hydroxy IMI進一步轉(zhuǎn)變成olefin IMI。Ralf Nauen等研究發(fā)現(xiàn)，olefin IMI對桃蚜與棉蚜的殺蟲效果是IMI的16倍。他們推論經(jīng)種子處理或土壤施藥后，吡蟲啉產(chǎn)生的一些具有生物活性的化合物與殘留的吡蟲啉一起作用，從而更有效地防治了刺吸式口器害蟲。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種吡蟲啉羥基化的微生物轉(zhuǎn)化方法篩選獲得可催化IMI為hydroxy IMI的微生物菌株，以便采用微生物轉(zhuǎn)化的方法，獲得hydroxyIMI產(chǎn)品。hydorxy IMI可作為先導(dǎo)化合物，經(jīng)脫水后得到olefin IMI，或者將hydroxy IMI的羥基經(jīng)過鹵素置換后獲得鹵代吡蟲啉。
本發(fā)明采用分離保藏的具有吡蟲啉羥基化酶活力的微生物菌種，接種到培養(yǎng)液中進行發(fā)酵培養(yǎng)；或接種到含有濃度大于0.001％(質(zhì)量比，以下同)吡蟲啉結(jié)構(gòu)類似物的培養(yǎng)液中，進行誘導(dǎo)發(fā)酵培養(yǎng)；或者直接加入吡蟲啉到培養(yǎng)液中，誘導(dǎo)微生物產(chǎn)生羥基化酶活力的同時，進行吡蟲啉羥基化轉(zhuǎn)化發(fā)酵培養(yǎng)。發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液與菌體分離。若是吡蟲啉的轉(zhuǎn)化發(fā)酵液，保留待與后面的轉(zhuǎn)化液一并處理。所獲菌體沉淀作為靜息細胞，加入到含有吡蟲啉的轉(zhuǎn)化液中，使吡蟲啉轉(zhuǎn)化為羥基吡蟲啉。轉(zhuǎn)化結(jié)束后，去除菌體細胞，轉(zhuǎn)化發(fā)酵液與轉(zhuǎn)化液用有機溶劑萃取去除未轉(zhuǎn)化的吡蟲啉后，含有羥基吡蟲啉的溶液可經(jīng)低溫或濃縮處理，使羥基吡蟲啉晶體析出。
上述具有吡蟲啉羥基化酶活力的微生物菌種，可以是Alcaligenes spp.，Stenotrophomonas spp.，Serratia spp.，Pseudomonas spp.，proteus Spp.，Erwiniaspp.，Bacillus spp.，Escherichia spp.，Staphylococcus spp.，Xanthomonas spp.，Saccharomyces spp.，Rhodotorula spp.，Aspergillus spp.Rhizopus spp.，Saprolegniaspp.，Beauveria.spp，streptomyces.spp等，也可以是任何可羥基化吡蟲啉的微生物或混合微生物。
屬于Alcaligenes屬的微生物有Alcaligenes eutrophus 1.1841；屬于Stenotrophomonas屬的微生物有Stenotrophomonas maltophilia；屬于Serratia屬的微生物有Serratia marcescens；屬于Pseudomonas屬的微生物有Pseudomonasputida；屬于proteus屬的微生物有proteus vulgaris；屬于Erwinia屬的微生物有Erwinia stewartii；屬于Bacillus屬的微生物有Bacillus thuringiensis，Bacillusmucilaginosus，屬于Escherichia屬的微生物有Escherichia coli，屬于Staphylococcus屬的微生物有Staphylococcus aureus；屬于Saccharomyces的微生物有Saccharomyces cerevisia。屬于Rhodotorula屬的微生物有Rhodotorulaminuta；屬于Aspergillus屬的微生物有Aspergillus niger；屬于Rhizopus屬的微生物有Rhizopus stolonifer；屬于Saprolegnia屬的微生物有Saprolegnia ferax；屬于Streptomyces屬有streptomyces jingyangensis。這些微生物的轉(zhuǎn)化率見下表


上述用于發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)液的營養(yǎng)物質(zhì)沒有特別的限制，可以是任何一種適合于微生物生長的營養(yǎng)介質(zhì)。
上述誘導(dǎo)劑可以是煙酸、3-甲基吡啶、3-氰基吡啶等任何含有吡啶環(huán)結(jié)構(gòu)的化合物，也可以是2-硝基亞胺基咪唑烷等任何含有咪唑烷或咪唑結(jié)構(gòu)的化合物，也可以是吡蟲啉或吡蟲啉的其他結(jié)構(gòu)類似物。誘導(dǎo)劑的濃度大于0.001％。誘導(dǎo)劑可預(yù)先溶解在培養(yǎng)基中。
上述吡蟲啉羥基化微生物發(fā)酵培養(yǎng)條件是10-60℃，1-300rpm搖瓶振蕩通氣、或攪拌通氣或管道通氣供氧，發(fā)酵5-96小時。
上述的發(fā)酵液與菌體分離，可采用＞1000rpm的離心分離方法、或過濾分離方法獲得菌體沉淀。
上述若是吡蟲啉的轉(zhuǎn)化發(fā)酵液，與菌體分離后，不含菌的轉(zhuǎn)化發(fā)酵液為IMI和hydroxy IMI的混合物。轉(zhuǎn)化發(fā)酵液可保留與后面的轉(zhuǎn)化液一并處理。
上述的吡蟲啉羥基化靜息細胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)可在水相、有機相或水-有機相雙相中進行，水相轉(zhuǎn)化條件為，底物濃度大于0.01g/L，在任意一種PH7-8的中性、偏堿性，含有濃度大于0.01％碳源的緩沖溶液中。有機相為二氯甲烷、N-甲基吡咯烷酮、二甲基亞砜，或其他對細胞毒性較小的有機溶劑。水-有機相為上述水相和有機相的混合物。轉(zhuǎn)化溫度范圍在10-60℃，1-300rpm搖瓶振蕩通氣、或攪拌通氣或管道通氣供氧，反應(yīng)時間5-192小時，轉(zhuǎn)化結(jié)束后，將轉(zhuǎn)化液與菌體通過離心或過濾分開，可獲得含有hydroxy IMI的轉(zhuǎn)化液。
上述轉(zhuǎn)化液中需要加入濃度大于0.01％的碳源物質(zhì)，以維持菌體基礎(chǔ)代謝活力。碳源可以是蔗糖、葡萄糖、果糖、可溶性淀粉或任何其他糖質(zhì)，也可以是蘋果酸、檸檬酸，或任何其他有機酸，也可以是乙酸鈉、酒石酸鈉等有機酸鹽。
上述含有hydroxy IMI溶液可加入二氯甲烷、三氯甲烷、四氯甲烷、N-甲基吡咯烷酮等有機溶劑，振蕩、萃取去除未轉(zhuǎn)化的吡蟲啉，靜置或離心分層后，含有hydroxy IMI的溶液可經(jīng)低溫或濃縮結(jié)晶后，可使hydroxy IMI晶體析出。
具體實施例方式
實施例1、將100ml含0.1％吡蟲啉的LB培養(yǎng)基放入500ml三角瓶，121℃高壓蒸汽滅菌后，接入Stenotrophomonas maltophilia菌種，30℃，200rpm振蕩發(fā)酵培養(yǎng)，20小時后，停止發(fā)酵，離心使菌體和發(fā)酵液分離，取62.5ml菌液的菌體加入到含有0.1％吡蟲啉，4％蔗糖的25ml磷酸鹽緩沖液(PH7.0)的250ml三角瓶中，30℃，200rpm振蕩通氣進行吡蟲啉羥基化靜息細胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)，96小時后，停止轉(zhuǎn)化反應(yīng)，離心去除菌體，上清液用5ml二氯甲烷萃取兩次，去除未轉(zhuǎn)化的吡蟲啉，含hydroxy IMI的溶液于4℃冰箱中結(jié)晶，使hydroxy IMI晶體析出，晶體中羥基吡蟲啉的含量大于80％。
實施例2、將200ml含0.1％吡蟲啉的LB培養(yǎng)基放入500ml三角瓶，121℃高壓蒸汽滅菌后，接入Alcaligenes eutrophus 1.1841菌種，30℃，200rpm振蕩發(fā)酵培養(yǎng)，48小時后，停止發(fā)酵，離心使菌體和發(fā)酵液分離，菌體加入到含有0.05％吡蟲啉，1％乙酸鈉的10ml磷酸鹽緩沖液(PH7.0)中，30℃，200rpm振蕩通氣進行吡蟲啉羥基化靜息細胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)，96小時后，停止轉(zhuǎn)化反應(yīng)，離心去除菌體，上清液中含有2％hydroxy IMI。
實施例3、將200ml含0.1％吡蟲啉的LB培養(yǎng)基放入500ml三角瓶，121℃高壓蒸汽滅菌后，接入土壤中分離的混合菌種，30℃，200rpm振蕩發(fā)酵培養(yǎng)，48小時后，停止發(fā)酵，離心使菌體和發(fā)酵液分離，菌體加入到含有0.05％吡蟲啉，1％葡萄糖的10ml磷酸鹽緩沖液(PH7.0)中，30℃，200rpm振蕩通氣進行吡蟲啉羥基化靜息細胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)，96小時后，停止轉(zhuǎn)化反應(yīng)，離心去除菌體，上清液中含有5％hydroxy IMI。
實施例4，與實施例1基本相同，但菌種采用Serratia marcescens，誘導(dǎo)劑采用質(zhì)量比濃度0.001％以上煙酸，碳源采用果糖，有機溶劑采用三氯甲烷。
實施例5，與實施例1基本相同，但菌種采用Pseudomonas putida，誘導(dǎo)劑采用質(zhì)量比濃度0.001％以上3-甲基吡啶，碳源采用蘋果酸，有機溶劑采用四氯甲烷。
實施例6，與實施例1基本相同，但菌種采用proteus vulgaris，誘導(dǎo)劑采用質(zhì)量比濃度0.001％以上3-氰基吡啶，碳源采用檸檬酸，有機溶劑采用N-甲基吡咯烷酮。
實施例7，與實施例1基本相同，但菌種采用Erwinia stewartii，誘導(dǎo)劑采用2-硝基亞胺基咪唑烷，有機溶劑采用二氯甲烷、三氯甲烷混合液。
實施例8，與實施例1基本相同，但菌種采用Bacillus thuringiensis，，誘導(dǎo)劑采用2-硝基亞胺基咪唑烷，有機溶劑采用四氯甲烷、N-甲基吡咯烷酮混合液。
實施例9，與實施例1基本相同，但菌種采用Bacillus mucilaginosus，誘導(dǎo)劑采用吡蟲啉，有機溶劑采用二氯甲烷、三氯甲烷混合液。
實施例10，與實施例1基本相同，但菌種采用Escherichia coli，誘導(dǎo)劑采用吡蟲啉，有機溶劑采用三氯甲烷、四氯甲烷混合液。
實施例11，與實施例1基本相同，但菌種采用Staphylococcus aureus，誘導(dǎo)吡蟲啉，有機溶劑采用二氯甲烷、三氯甲烷、四氯甲烷混合液。
實施例12，與實施例1基本相同，但菌種采用Saccharomyces cerevisia。
實施例13，與實施例1基本相同，但菌種采用Rhodotorula minuta。
實施例14，與實施例1基本相同，但菌種采用Aspergillus niger。
實施例15，與實施例1基本相同，但菌種采用Rhizopus stolonifer。
實施例16，與實施例1基本相同，但菌種采用Saprolegnia fera。
實施例17，與實施例1基本相同，但菌種采用Saprolegnia ferax。
實施例18，與實施例1基本相同，但菌種采用streptomyces jingyangensis。
本發(fā)明不限于這些公開的實施方案，本發(fā)明將覆蓋在專利權(quán)利要求書中所描述的范圍，以及權(quán)利要求范圍的各種變型和等效變化。
權(quán)利要求
1.一種吡蟲啉羥基化的微生物轉(zhuǎn)化方法，所述的方法是將具有吡蟲啉羥基化酶活力的微生物菌種接種到培養(yǎng)液中，進行發(fā)酵培養(yǎng)；或接種到含有吡蟲啉結(jié)構(gòu)類似物的培養(yǎng)液中，進行誘導(dǎo)發(fā)酵培養(yǎng)；或者接種到含有吡蟲啉的培養(yǎng)液中，誘導(dǎo)微生物產(chǎn)生羥基化酶活力的同時，進行吡蟲啉羥基化轉(zhuǎn)化發(fā)酵培養(yǎng)。發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液與菌體分離，若是吡蟲啉的轉(zhuǎn)化發(fā)酵液，保留待與后面的轉(zhuǎn)化液一并處理，所獲菌體沉淀作為靜息細胞，加入到含有吡蟲啉的轉(zhuǎn)化液中，使吡蟲啉轉(zhuǎn)化為羥基吡蟲啉。轉(zhuǎn)化結(jié)束后，去除菌體細胞，轉(zhuǎn)化發(fā)酵液與轉(zhuǎn)化液用有機溶劑萃取去除未轉(zhuǎn)化的吡蟲啉后，含有羥基吡蟲啉的溶液經(jīng)低溫或濃縮處理，使羥基吡蟲啉晶體析出。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的吡蟲啉羥基化的微生物轉(zhuǎn)化方法，其特征在于所述的具有吡蟲啉羥基化酶活力的微生物菌種，是Alcaligenes spp.，Stenotrophomonas spp.，Serratia spp.，Pseudomonas spp.，proteus Spp.，Erwiniaspp.，Bacillus spp.，Escherichia spp.，Staphylococcus spp.，Xanthomonas spp.，Saccharomyces spp.，Rhodotorula spp.，Aspergillus spp.Rhizopus spp.，Saprolegniaspp.，Beauveria spp.，streptomyces spp.中的一種或幾種，或其他任何可羥基化吡蟲啉的微生物或混合微生物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的吡蟲啉羥基化的微生物轉(zhuǎn)化方法，其特征在于所述誘導(dǎo)劑采用含有吡啶環(huán)結(jié)構(gòu)的化合物，或是含有咪唑烷或咪唑結(jié)構(gòu)的化合物，或是吡蟲啉，或是吡蟲啉的其他結(jié)構(gòu)類似物，誘導(dǎo)劑預(yù)先溶解在培養(yǎng)基中。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的吡蟲啉羥基化的微生物轉(zhuǎn)化方法，其特征在于所述的含有吡啶環(huán)結(jié)構(gòu)的化合物為質(zhì)量比濃度0.001％以上煙酸、3-甲基吡啶，或3-氰基吡啶；所述的含有咪唑烷或咪唑結(jié)構(gòu)的化合物為2-硝基亞胺基咪唑烷、咪唑。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的吡蟲啉羥基化的微生物轉(zhuǎn)化方法，其特征在于微生物發(fā)酵培養(yǎng)條件是10-60℃，1-300rpm搖瓶振蕩通氣、或攪拌通氣或管道通氣供氧，發(fā)酵5-192小時。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的吡蟲啉羥基化的微生物轉(zhuǎn)化方法，其特征在于發(fā)酵培養(yǎng)液與菌體分離，采用＞1000rpm的離心分離方法、或過濾分離方法。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的吡蟲啉羥基化的微生物轉(zhuǎn)化方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)后獲得的菌體沉淀，作為靜息細胞用于吡蟲啉羥基化，轉(zhuǎn)化反應(yīng)在水相、有機相或水-有機相雙相中進行水相轉(zhuǎn)化條件為，底物質(zhì)量比濃度大于0.01％，在任意一種PH7-8的中性、偏堿性，含有質(zhì)量比濃度大于0.01％的碳源的緩沖溶液中；有機相為二氯甲烷、N-甲基吡咯烷酮、二甲基亞砜，或其他對細胞毒性較小的有機溶劑；水-有機相為上述水相和有機相的混合物。轉(zhuǎn)化溫度范圍在10-60℃，1-300rpm搖瓶振蕩通氣、或攪拌通氣或管道通氣供氧，反應(yīng)時間5-192小時，轉(zhuǎn)化結(jié)束后，將轉(zhuǎn)化液與菌體通過離心或過濾分開，可獲得含有羥基吡蟲啉的轉(zhuǎn)化液。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的吡蟲啉羥基化的微生物轉(zhuǎn)化方法，其特征在于轉(zhuǎn)化液中需要加入質(zhì)量比濃度大于0.01％的碳源物質(zhì)，碳源是蔗糖、葡萄糖、果糖或其他糖質(zhì)，或是蘋果酸、檸檬酸，或其他有機酸，或是乙酸鈉等有機酸鹽。
9.根據(jù)權(quán)利要求4～8之一所述的吡蟲啉羥基化的微生物轉(zhuǎn)化方法，其特征在于有機溶劑為二氯甲烷、三氯甲烷、四氯甲烷、N-甲基吡咯烷酮中的一種或幾種。
全文摘要
吡蟲啉羥基化的微生物轉(zhuǎn)化方法將具有吡蟲啉羥基化酶活力的微生物菌種接種到培養(yǎng)液中，進行發(fā)酵培養(yǎng)；或接種到含有吡蟲啉結(jié)構(gòu)類似物的培養(yǎng)液中，進行誘導(dǎo)發(fā)酵培養(yǎng)；或接種到含有吡蟲啉的培養(yǎng)液中，誘導(dǎo)微生物產(chǎn)生羥基化酶活力的同時，進行吡蟲啉羥基化轉(zhuǎn)化發(fā)酵培養(yǎng)。發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液與菌體分離，若是吡蟲啉的轉(zhuǎn)化發(fā)酵液，保留待與后面的轉(zhuǎn)化液一并處理，所獲菌體沉淀作為靜息細胞，加入到含有吡蟲啉的轉(zhuǎn)化液中，使吡蟲啉轉(zhuǎn)化為羥基吡蟲啉，轉(zhuǎn)化結(jié)束后，去除菌體細胞，轉(zhuǎn)化發(fā)酵液與轉(zhuǎn)化液用有機溶劑萃取去除未轉(zhuǎn)化的吡蟲啉。含有羥基吡蟲啉的溶液經(jīng)低溫或濃縮處理后，可使羥基吡蟲啉晶體析出。
文檔編號C12P17/16GK1544643SQ20031010628
公開日2004年11月10日 申請日期2003年11月13日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月13日
發(fā)明者戴亦軍, 袁生, 葛峰, 戚銘盛, 徐尚成, 馬海軍, 倪玨萍, 張湘寧 申請人:南京師范大學(xué), 江蘇省農(nóng)藥研究所有限公司