專利名稱：雞大腸桿菌異型外膜蛋白細(xì)胞工程菌株的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于菌種的制備技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種大腸桿菌異型外膜蛋白融合菌株的制備方法，尤其適用于雞源。
背景技術(shù)：
菌苗的免疫預(yù)防是目前控制大腸桿菌病的重要手段?，F(xiàn)行雞大腸桿菌菌苗的研制是建立在血清學(xué)分型基礎(chǔ)上的，單價(jià)血清型滅活菌苗僅對(duì)同型致病菌有抵抗力，多價(jià)滅活菌苗為不同血清型的代表株相加而成，在抗原含量與保護(hù)力上難以兩全。我國(guó)自80年代至今從家禽中分離出致病性大腸桿菌血清型多達(dá)60余種，且不同省區(qū)血清型差異很大。地方菌株制備的大腸桿菌滅活苗雖然有預(yù)防效果，但有其明顯的地域局限性，從而限制了該苗的推廣，同時(shí)由于該苗含菌量大，雞應(yīng)用后多出現(xiàn)站立不起，減食等反應(yīng)。
據(jù)統(tǒng)計(jì)天津地區(qū)年存欄蛋雞1800萬(wàn)羽，肉雞6000萬(wàn)羽，全國(guó)每年肉、蛋雞存欄高達(dá)百億，由于沒(méi)有各地區(qū)和全國(guó)可統(tǒng)一應(yīng)用的疫苗，雞大腸桿菌病發(fā)病日趨嚴(yán)重，而且越來(lái)越難以控制，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，外膜蛋白(OMP)與禽大腸桿菌的致病機(jī)理和免疫保護(hù)機(jī)理相關(guān)。最近，業(yè)界對(duì)禽大腸桿菌外膜蛋白(OMP)和脂多糖抗原的免疫保護(hù)作用進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果表明OMPs是禽大腸桿菌病的主要免疫保護(hù)性抗原。這說(shuō)明在O血清型相同的情況下，由于OMP型不同而造成菌株間的遺傳關(guān)系相差較遠(yuǎn)，致病性差異很大，可能是導(dǎo)致菌株免疫原性的差異和菌苗的免疫保護(hù)力不足的原因之一。
研究表明，外膜蛋白(OMP)與禽大腸桿菌病的致病機(jī)理與免疫保護(hù)機(jī)理密切相關(guān)，因此業(yè)界對(duì)外膜蛋白(OMP)加強(qiáng)研究，亟待以不同外膜蛋白型結(jié)合不同血清型菌株為親本構(gòu)建大腸桿菌融合菌株，以求突破現(xiàn)有雞大腸桿菌疫苗血清學(xué)分型的局限性，向制備出可在全市或全國(guó)應(yīng)用的免疫力強(qiáng)的雞大腸桿菌疫苗趨近，解決目前雞大腸桿菌免疫預(yù)防難的局面。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的問(wèn)題在于克服前述技術(shù)存在的上述缺陷，而提供一種表達(dá)多種“O”抗原和多種外膜蛋白型的E.coli融合菌株——大腸桿菌異型外膜蛋白細(xì)胞工程菌株的制備方法。
本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題是采取以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的，依據(jù)本發(fā)明提供的一種大腸桿菌異型外膜蛋白細(xì)胞工程菌株的制備方法，具有如下步驟首先進(jìn)行細(xì)菌分離，將病料接種、培養(yǎng)，分離出的細(xì)菌凍存?zhèn)溆?；第二步是?duì)分離出的細(xì)菌進(jìn)行鑒定，選出優(yōu)勢(shì)血清型O78、O88、O2、O45、O53、O145；第三步提取優(yōu)勢(shì)血清型菌株外膜蛋白(OMPs)，找出同一血清型的菌株屬于完全不同的OMP型，而血清型不同的菌株也為同一OMP型的分離株；第四步是制備原生質(zhì)體融合出親本菌株，即選取兩對(duì)相互之間的血清型和OMP型都不相同的菌株，將它們選作進(jìn)行原生質(zhì)體融合的親本菌株；篩選融合子選擇標(biāo)記并確定親本菌株選擇兩對(duì)相互之間的血清型和OMP型都不相同，而對(duì)卡那霉素(K+)和氨芐西林(Amp+)交叉耐藥的菌株，作為融合子的篩選標(biāo)記，將它們選作進(jìn)行原生質(zhì)體融合的親本菌株。
第五步制備原生質(zhì)體，用溶菌酶濃度為6g/L，作用時(shí)間為25min；原生質(zhì)體融合后，培養(yǎng)2-3天形成中等大小菌落，得到雞大腸桿菌異型外膜蛋白細(xì)胞工程菌株，R1OMP-1+OMP-3，O78+O2；R2OMP-1+OMP-2，O78+O88。
本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題還可以采取以下技術(shù)方案進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)前述的雞大腸桿菌異型外膜蛋白細(xì)胞工程菌株的制備方法，其中，所述的細(xì)菌分離是無(wú)菌采取疑似大腸桿菌病新鮮病、死雞肝臟、肺臟、心血病料，劃線接種于麥康凱瓊脂平板上培養(yǎng)，環(huán)境溫度為37℃，培養(yǎng)時(shí)間為18-24小時(shí)；觀察涂片，進(jìn)行革蘭氏染色和鏡檢，選出生長(zhǎng)呈粉紅色、革蘭氏染色為陰性的菌落；對(duì)被選出的陰性菌落接種營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)，環(huán)境溫度為37℃，培養(yǎng)時(shí)間為18-24小時(shí)，完成細(xì)菌分離；將分離出的細(xì)菌加入20％甘油凍存于-30℃?zhèn)溆谩?br> 前述的雞大腸桿菌異型外膜蛋白細(xì)胞工程菌株的制備方法，其中，所述的對(duì)分離出的細(xì)菌進(jìn)行鑒定是經(jīng)致病性試驗(yàn)和生化特性測(cè)定，分離到45株為致病性菌株，該致病性試驗(yàn)和生化特性測(cè)定的方法是已知技術(shù)不予贅述；對(duì)45株致病性大腸桿菌進(jìn)行血清型鑒定，定型出31株，分屬O1、O2、O5、O6、O45、O53、O74、O75、O78、O88、O92、O107、O111、O145等14個(gè)血清型，選其中優(yōu)勢(shì)血清型O78、O88、O2、O45、O53、O145。
前述的雞大腸桿菌異型外膜蛋白細(xì)胞工程菌株的制備方法，其中，所述的在優(yōu)勢(shì)血清型菌株中提取外膜蛋白，是將6個(gè)優(yōu)勢(shì)血清型的18個(gè)菌株，即血清型O78，菌株為J19、H7、Se2、T1、Ww1、S1；血清型O88，菌株為Zh1、Tj2、XQ1；血清型O2，菌株為W、WD2、X1；血清型O45，菌株為G1、G2；血清型O53，菌株為G3、G4；血清型O145，菌株為BJ1、BJ2，應(yīng)用N-十二烷酰肌氨酸鈉(Sarkosyl)方法提取外膜蛋白(OMPs)，進(jìn)行SDS-PAGE分析，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色、脫色后測(cè)定出6個(gè)O78分離株的3個(gè)外膜蛋白型，3個(gè)O88分離株、3個(gè)O2分離株和2個(gè)O145分離株分別出現(xiàn)了2個(gè)外膜蛋白型，但2個(gè)O45分離株和2個(gè)O53分離株均僅發(fā)現(xiàn)1個(gè)外膜蛋白型。其中OMP-1型為O78、O88、O2、O53、O145這5個(gè)血清型分離株所共有，OMP-2型為O78、O88、O2這3個(gè)血清型分離株所共有，OMP-3型為O78、O45、O145分離株所共有，得到同一血清型的菌株屬于完全不同的OMP型，而血清型不同的菌株也為同一OMP型的分離株。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有顯著的優(yōu)點(diǎn)和有益效果。
由以上技術(shù)方案可知，本發(fā)明在優(yōu)異的結(jié)構(gòu)配置下，至少有如下的優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明通過(guò)對(duì)分離到的45株致病性雞大腸桿菌，進(jìn)行分離菌株的生化鑒定和血清型鑒定，確定了天津地區(qū)當(dāng)前流行的致病性雞大腸桿菌血清型，即O78、O88、O2、O45、O53、O145為流行的優(yōu)勢(shì)血清型；本發(fā)明應(yīng)用原生質(zhì)體融合技術(shù)構(gòu)建了兩株表達(dá)不同“O”抗原(O78+O2或O78+O88)和不同外膜蛋白型(OMP-1+OMP-2或OMP-1+OMP-3)的異型外膜蛋白融合菌株，其穩(wěn)定性達(dá)100％。為今后研制新型雞---(E.coli)菌苗奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)；本發(fā)明應(yīng)用兼具兩種不同血清型和不同外膜蛋白型菌株的免疫原性制備疫苗，可以克服現(xiàn)有雞大腸桿菌多價(jià)滅活苗的地域局限性；還可避免因習(xí)知技術(shù)制備的疫苗含菌量大，造成雞免疫后副反應(yīng)嚴(yán)重的缺點(diǎn)；本發(fā)明突破了現(xiàn)有雞大腸桿菌疫苗血清學(xué)分型的局限性，可制備出了免疫力強(qiáng)、使用范圍大的雞大腸桿菌疫苗，與現(xiàn)有技術(shù)相比具有顯著的技術(shù)進(jìn)步，堪稱具有新穎性、創(chuàng)造性、實(shí)用性的好技術(shù)。
本發(fā)明的具體實(shí)施方式
由以下實(shí)施例及其附圖詳細(xì)給出。


圖1是本發(fā)明O78分離株OMP圖譜；圖2是本發(fā)明O2、O88分離株OMP圖譜；圖3是本發(fā)明O45、O53和O145分離株OMP圖譜；圖4是本發(fā)明4株R1融合菌株OMP圖譜；圖5是本發(fā)明R2融合菌株的OMP圖譜。
其中，圖1中1示蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；2、3、4、5、6、7示O78分離株(依次為Se2、T1、S1、Ww1、J19、H7)。
圖2中7蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1、2、3示O88分離株(依次為ZH1、XQ1、TJ2)；4、5、6示O2分離株(依次為W、WD2、X1)；圖3中1示蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；2、3示O45分離株；4、5示O53分離株；6、7示O145分離株(6為BJ1，7為BJ2)；圖4中7示蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1示W(wǎng)w1；2、3、4、5示R1融合菌株；6示W(wǎng)D2；圖5中1示蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；2示XQ1；3示R2融合菌株；4示S具體實(shí)施方式
以下結(jié)合附圖及較佳實(shí)施例，對(duì)依據(jù)本發(fā)明提供的具體實(shí)施方式
、結(jié)構(gòu)、特征及其功效，詳細(xì)說(shuō)明如后。
一種雞大腸桿菌異型外膜蛋白細(xì)胞工程菌株的制備方法，具有如下步驟首先進(jìn)行細(xì)菌分離，將病料接種、培養(yǎng)，分離出的細(xì)菌凍存?zhèn)溆谩?br> 具體是，無(wú)菌采取疑似大腸桿菌病新鮮病、死雞肝臟、肺臟、心血病料，劃線接種于麥康凱瓊脂平板上培養(yǎng)，環(huán)境溫度為37℃，培養(yǎng)時(shí)間為18-24小時(shí)；觀察涂片，進(jìn)行革蘭氏染色和鏡檢，選出生長(zhǎng)呈粉紅色、革蘭氏染色為陰性的菌落；對(duì)被選出的陰性菌落接種營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)，環(huán)境溫度為37℃，培養(yǎng)時(shí)間為18-24小時(shí)，完成細(xì)菌分離；將分離出的細(xì)菌加入20％甘油凍存于-30℃?zhèn)溆谩?br> 第二步是對(duì)分離出的細(xì)菌進(jìn)行鑒定，選出優(yōu)勢(shì)血清型O78、O88、O2、O45、O53、O145。
具體是經(jīng)致病性試驗(yàn)和生化特性測(cè)定，分離到45株為致病性菌株，該致病性試驗(yàn)和生化特性測(cè)定的方法是已知技術(shù)不予贅述；對(duì)45株致病性大腸桿菌進(jìn)行血清型鑒定，定型出31株，分屬O1、O2、O5、O6、O45、O53、O74、O75、O78、O88、O92、O107、O111、O145等14個(gè)血清型，其中O78、O88、O2、O45、O53、O145為優(yōu)勢(shì)血清型，占定型菌株的58.3％。
第三步提取優(yōu)勢(shì)血清型菌株外膜蛋白(OMPs)，找出同一血清型的菌株屬于完全不同的OMP型，而血清型不同的菌株也為同一OMP型的分離株；具體是，將6個(gè)優(yōu)勢(shì)血清型的18個(gè)菌株，即血清型O78，菌株為J19、H7、Se2、T1、Ww1、S1；血清型O88，菌株為Zh1、Tj2、XQ1；血清型O2，菌株為W、WD2、X1；血清型O45，菌株為G1、G2；血清型O53，菌株為G3、G4；血清型O145，菌株為BJ1、BJ2，應(yīng)用N-十二烷酰肌氨酸鈉(Sarkosyl)方法提取外膜蛋白(OMPs)，進(jìn)行SDS-PAGE分析，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色、脫色后測(cè)定出6個(gè)O78分離株的3個(gè)外膜蛋白型，3個(gè)O88分離株、3個(gè)O2分離株和2個(gè)O145分離株分別出現(xiàn)了2個(gè)外膜蛋白型，但2個(gè)O45分離株和2個(gè)O53分離株均僅發(fā)現(xiàn)1個(gè)外膜蛋白型。其中OMP-1型為O78、O88、O2、O53、O145這5個(gè)血清型分離株所共有，OMP-2型為O78、O88、O2這3個(gè)血清型分離株所共有，OMP-3型為O78、O45、O145分離株所共有，得到同一血清型的菌株屬于完全不同的OMP型，而血清型不同的菌株也為同一OMP型的分離株，參見(jiàn)圖1、圖2、圖3。
第四步是制備原生質(zhì)體融合出親本菌株，即選取兩對(duì)相互之間的血清型和OMP型都不相同的菌株，將它們選作進(jìn)行原生質(zhì)體融合的親本菌株。
篩選融合子選擇標(biāo)記并確定親本菌株選擇兩對(duì)相互之間的血清型和OMP型都不相同，而對(duì)卡那霉素(K+)和氨芐西林(Amp+)交叉耐藥的菌株，作為融合子的篩選標(biāo)記，將它們選作進(jìn)行原生質(zhì)體融合的親本菌株。用17種抗生素對(duì)6個(gè)O78、3個(gè)O2和3個(gè)O88分離株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，篩選出兩對(duì)交叉耐藥菌株。參見(jiàn)表1、表2。
表1 R1兩親本株的交叉耐藥性及其血清型、OMP型菌株號(hào)Ww1WD2卡那霉素(K+) + -氨芐西林(Amp+) - +血清型 O78O2OMP型 OMP-3 OMP-1注“+”表示敏感，“-”表示耐藥。
表2 R2兩親本株的交叉耐藥性及其血清型、OMP型菌株號(hào)S1XQ1卡那霉素(K+) + -+氨芐西林(Amp+)- +血清型 O78O88OMP型 OMP-1 OMP-2注“+”表示敏感，“-”表示耐藥。
表3酶濃度和作用時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體制備率和再生率的影響(制備率％/再生率％)說(shuō)明書(shū)第7頁(yè)/共8頁(yè)作用時(shí)間融菌酶濃度(g/L)(min)2 4 6 810 9％/3.4％ 16％/6％ 20％/9％ 25％/13％15 12％/4％20％/12％ 31％/20％ 56％33％20 27％/14％ 36％/18％ 68％/43％ 87％/46％25 36％/19％ 55％/29％ 90％/51％ 92％/41％30 39％/24％ 64％/44％ 94％/44％ 98％/30％
以上兩對(duì)菌株相互之間的血清型和OMP型都不相同，而它們對(duì)卡那霉素(K+)和氨芐西林(Amp+)交叉耐藥則可作為融合子的篩選標(biāo)記，因此將它們選作進(jìn)行原生質(zhì)體融合的親本菌株。為了便于區(qū)分，將Ww1和WD2的融合菌株稱為R1，S1和XQ1的融合菌株稱作R2。
第五步制備原生質(zhì)體，用溶菌酶濃度為6g/L，作用時(shí)間為25min。
在一定范圍內(nèi)溶菌酶的工作濃度越高，原生質(zhì)體制備率就越高，但原生質(zhì)體制備率太高又影響再生率。制備原生質(zhì)體的最佳條件是所用溶菌酶濃度為6g/L，作用時(shí)間為25min。溶菌酶的作用濃度和時(shí)間確定不同酶濃度和作用時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體制備率和再生率的影響見(jiàn)表3。
第六步原生質(zhì)體融合、再生及融合菌株的檢出、鑒定原生質(zhì)體融合后，在(HNA)上生長(zhǎng)緩慢，2-3d才形成中等大小菌落。隨機(jī)調(diào)選R1、R2兩組融合菌株各4株，移接于麥康凱瓊脂平板上培養(yǎng)，革蘭氏染色鏡檢均為G-菌。
融合子生化鑒定所有8個(gè)融合菌株均符合典型大腸桿菌生化特征。
融合子血清型鑒定①以Ww1和WD2為親本的4個(gè)R1融合子，均同時(shí)具有O2和O78抗原。②以S1和XQ1為親本的4個(gè)R2融合子中，1個(gè)融合子同時(shí)具有O88和O78抗原，另外3個(gè)融合子只含O78抗原。
融合子OMP型測(cè)定R1融合子OMP型測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖4。
R2融合子OMP型測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖5。
提取同時(shí)具有O88和O78抗原R2融合子的OMPs進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果見(jiàn)圖5。融合菌株R2具有3條帶。與2個(gè)親本株S1和XQ1(分別具有2條帶和3條帶)相比，R2融合菌株遷移率居中的OMP條帶表達(dá)量明顯增強(qiáng)，而對(duì)親本株XQ1獨(dú)有的OMP條帶表達(dá)量相對(duì)較弱。
本發(fā)明將每組的2個(gè)親本菌株的原生質(zhì)體混合，以PEG為助溶劑進(jìn)行原生質(zhì)體融合，融合產(chǎn)物涂布于高滲營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)再生細(xì)胞壁，再以氨芐青霉素和卡那霉素為抗性標(biāo)記進(jìn)行融合子的篩選，獲得2株雞大腸桿菌異型外膜蛋白細(xì)胞工程菌株(R1OMP-1+OMP-3，O78+O2；R2OMP-1+OMP-2，O78+O88)。挑選獲得的工程菌株第5、10、15代培養(yǎng)物接種麥康凱瓊脂平板進(jìn)行的培養(yǎng)特性、菌體形態(tài)、革蘭氏染色特性、生化特性和血清型鑒定及OMP型分析，結(jié)果表明新構(gòu)建的細(xì)胞工程菌株符合大腸桿菌的形態(tài)、染色和生化特性，且均可與兩個(gè)親本菌株的陽(yáng)性因子血清發(fā)生凝集反映，SDS-PAGE電泳分析結(jié)果表明融合菌株可同時(shí)表達(dá)兩個(gè)親本菌株的OMP抗原。以上結(jié)果證明本研究所構(gòu)建的兩株雞大腸桿菌異型外膜蛋白細(xì)胞工程菌株均可同時(shí)表達(dá)兩個(gè)親本菌株的O抗原和OMP抗原，具有良好的遺傳穩(wěn)定性，為今后研制新型雞大腸桿菌細(xì)胞工程菌苗奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非對(duì)本發(fā)明作任何形式上的限制，凡是依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所作的任何簡(jiǎn)單修改、等同變化與修飾，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種雞大腸桿菌異型外膜蛋白細(xì)胞工程菌株的制備方法，具有如下步驟首先進(jìn)行細(xì)菌分離，將病料接種、培養(yǎng)，分離出的細(xì)菌凍存?zhèn)溆?；第二步是?duì)分離出的細(xì)菌進(jìn)行鑒定，選出優(yōu)勢(shì)血清型O78、O88、O2、O45、O53、O145；第三步提取優(yōu)勢(shì)血清型菌株外膜蛋白(OMPs)，找出同一血清型的菌株屬于完全不同的OMP型，而血清型不同的菌株也為同一OMP型的分離株；第四步是制備原生質(zhì)體融合出親本菌株，即選取兩對(duì)相互之間的血清型和OMP型都不相同的菌株，將它們選作進(jìn)行原生質(zhì)體融合的親本菌株；篩選融合子選擇標(biāo)記并確定親本菌株選擇兩對(duì)相互之間的血清型和OMP型都不相同，而對(duì)卡那霉素(K+)和氨芐西林(Amp+)交叉耐藥的菌株，作為融合子的篩選標(biāo)記，將它們選作進(jìn)行原生質(zhì)體融合的親本菌株。第五步制備原生質(zhì)體，用溶菌酶濃度為6g/L，作用時(shí)間為25min；原生質(zhì)體融合后，培養(yǎng)2-3天形成中等大小菌落，得到雞大腸桿菌異型外膜蛋白細(xì)胞工程菌株，R1OMP-1+OMP-3，O78+O2；R2OMP-1+OMP-2，O78+O88。
2.如權(quán)利要求1所述的雞大腸桿菌異型外膜蛋白細(xì)胞工程菌株的制備方法，其特征在于，所述的細(xì)菌分離是無(wú)菌采取疑似大腸桿菌病新鮮病、死雞肝臟、肺臟、心血病料，劃線接種于麥康凱瓊脂平板上培養(yǎng)，環(huán)境溫度為37℃，培養(yǎng)時(shí)間為18-24小時(shí)；觀察涂片，進(jìn)行革蘭氏染色和鏡檢，選出生長(zhǎng)呈粉紅色、革蘭氏染色為陰性的菌落；對(duì)被選出的陰性菌落接種營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)，環(huán)境溫度為37℃，培養(yǎng)時(shí)間為18-24小時(shí)，完成細(xì)菌分離；將分離出的細(xì)菌加入20％甘油凍存于-30℃?zhèn)溆谩?br> 3.如權(quán)利要求1所述的雞大腸桿菌異型外膜蛋白細(xì)胞工程菌株的制備方法，其特征在于，所述的對(duì)分離出的細(xì)菌進(jìn)行鑒定是經(jīng)致病性試驗(yàn)和生化特性測(cè)定，分離到45株為致病性菌株，該致病性試驗(yàn)和生化特性測(cè)定的方法是已知技術(shù)不予贅述；對(duì)45株致病性大腸桿菌進(jìn)行血清型鑒定，定型出31株，分屬O1、O2、O5、O6、O45、O53、O74、O75、O78、O88、O92、O107、O111、O145等14個(gè)血清型，選其中優(yōu)勢(shì)血清型O78、O88、O2、O45、O53、O145。
4.如權(quán)利要求1所述的雞大腸桿菌異型外膜蛋白細(xì)胞工程菌株的制備方法，其特征在于，所述的在優(yōu)勢(shì)血清型菌株中提取外膜蛋白，是將6個(gè)優(yōu)勢(shì)血清型的18個(gè)菌株，即血清型O78，菌株為J19、H7、Se2、T1、Ww1、S1；血清型O88，菌株為Zh1、Tj2、XQ1；血清型O2，菌株為W、WD2、X1；血清型O45，菌株為G1、G2；血清型O53，菌株為G3、G4；血清型O145，菌株為BJ1、BJ2，應(yīng)用N-十二烷酰肌氨酸鈉(Sarkosyl)方法提取外膜蛋白(OMPs)，進(jìn)行SDS-PAGE分析，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色、脫色后測(cè)定出6個(gè)O78分離株的3個(gè)外膜蛋白型，3個(gè)O88分離株、3個(gè)O2分離株和2個(gè)O145分離株分別出現(xiàn)了2個(gè)外膜蛋白型，但2個(gè)O45分離株和2個(gè)O53分離株均僅發(fā)現(xiàn)1個(gè)外膜蛋白型。其中OMP-1型為O78、O88、O2、O53、O145這5個(gè)血清型分離株所共有，OMP-2型為O78、O88、O2這3個(gè)血清型分離株所共有，OMP-3型為O78、O45、O145分離株所共有，得到同一血清型的菌株屬于完全不同的OMP型，而血清型不同的菌株也為同一OMP型的分離株。
全文摘要
一種雞大腸桿菌異型外膜蛋白細(xì)胞工程菌株的制備方法，首先將病料接種、培養(yǎng)，分離出的細(xì)菌凍存?zhèn)溆?；二是選出優(yōu)勢(shì)血清型；三提取優(yōu)勢(shì)血清型菌株外膜蛋白，找出同一血清型的菌株屬于完全不同的外膜蛋白型，血清型不同的菌株也為同一外膜蛋白型的分離株；四是制備原生質(zhì)體融合出親本菌株，選擇兩對(duì)相互之間的血清型和外膜蛋白型都不相同的菌株，作為融合子的篩選標(biāo)記，將它們選作進(jìn)行原生質(zhì)體融合的親本菌株；然后制備原生質(zhì)體，原生質(zhì)體融合后，培養(yǎng)形成中等大小菌落，得到雞大腸桿菌異型外膜蛋白細(xì)胞工程菌株。
文檔編號(hào)C12N15/03GK1528884SQ20031010666
公開(kāi)日2004年9月15日 申請(qǐng)日期2003年10月16日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月16日
發(fā)明者丁伯良, 鄢明華, 王英珍, 黃金海, 李秀麗 申請(qǐng)人:天津市畜牧獸醫(yī)研究所