專利名稱：降解有機汞污染的轉基因煙草的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于植物學和污染防治領域，具體地說，本發(fā)明涉及對有機汞裂解酶merB基因的改造，用改造的merB基因制備對有機汞污染有高抗性的轉基因植物(尤其是煙草)的方法。本發(fā)明還涉及用所述的轉基因植物降解有機汞污染的方法。
背景技術：
汞廣泛應用于化學工業(yè)，造紙業(yè)，采礦業(yè)和國防工業(yè)，是土壤、水和空氣重金屬污染的主要元素之一。環(huán)境中的汞有單質汞、離子汞和有機汞(如甲基汞)3種形態(tài)。有些微生物可以使毒性低的無機汞轉變成毒性高的甲基汞，甲基汞的生理毒性為單質汞的數千倍。魚類吸收甲基汞的速度很快，通過食物鏈引起生物富集，并不易在生物體內排出。日本的“水俁病”就是由于汞污染魚貝類造成的。
受汞污染的土壤中有一種優(yōu)勢細菌，具有把甲基汞轉變?yōu)殡x子汞，離子汞轉變?yōu)閱钨|汞，并將其排出體內的能力。有人從該細菌中先后分離出merA和merB基因，其中merA基因編碼汞還原酶，催化離子汞轉變?yōu)閱钨|汞的過程；merB基因編碼的酶被稱為有機汞裂解酶(organomercurial lyase)，催化甲基汞轉變?yōu)殡x子汞。兩個基因聯(lián)合作用就會將有機態(tài)的汞轉化為氣態(tài)的單質汞。
一般情況下，無機汞化合物的解毒可以由merA基因的表達產物來實現(xiàn)。然而，有機汞的解毒至少需要兩步轉化，即有機汞降解為無機汞，無機汞汽化為單質汞。
單質汞的毒性小，排到大氣中的汞已稀釋到安全濃度。利用此原理，人們嘗試將merA或merB基因導入植物，采用基因工程方法創(chuàng)造轉基因植物，目的是轉化汞的存在形態(tài)，修復有機汞或無機汞污染的土壤和水體。
Meagher博士領導的研究小組首先在模式植物擬南芥上轉移merA和merB基因，獲得抗汞和揮發(fā)汞的轉基因植物。然而，人們發(fā)現(xiàn)，直接用細菌的merA和merB所獲得的轉基因植物對有機汞的抗性仍然難以令人滿意。
因此，本領域迫切需要開發(fā)對有機汞有高抗性的轉基因植物，以便能夠有效和低廉地降解環(huán)境中的有機汞污染。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的就是提供一種制備對有機汞有很高抗性的轉基因植物的方法，并將該轉基因植物用于降解有機汞污染。
在本發(fā)明的第一方面，提供了本發(fā)明還提供了一種具有有機汞降解功能的多肽，它選自下組(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽；(b)將SEQ ID NO2氨基酸序列經過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有有機汞降解功能的由(a)衍生的多肽。
本發(fā)明還提供了一種編碼上述多肽的多核苷酸。在優(yōu)選例中，提供了一種分離的多核苷酸，它是經過改造的特別適合在植物細胞中表達的merB基因，它包含一核苷酸序列，該核苷酸序列編碼具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽，且所述核苷酸序列中的G+C的百分比含量與SEQ ID NO1中的G+C的百分比含量的差值絕對值小于5％。
在另一優(yōu)選例中，所述核苷酸序列中的G+C的百分比含量與SEQ ID NO1中的G+C的百分比含量的差值小于2％。
更佳地，所述核苷酸序列中的G+C的百分比含量與SEQ ID NO1中的G+C的百分比含量的差值小于1％。
在另一優(yōu)選例中，所述的核苷酸序列具有SEQ ID NO1或3所示的核苷酸序列。
更佳地，在起始密碼子ATG上游的15個核苷酸內含有植物翻譯一致性序列AGAACCAC。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種載體，它含有本發(fā)明所述的改造的merB基因的多核苷酸。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種宿主細胞，它含有本發(fā)明上述的載體，或者所述宿主細胞的染色體中整合有本發(fā)明所述的改造的merB基因的多核苷酸。
在另一優(yōu)選例中，所述的細胞是植物細胞，尤其是煙草、水稻、小麥、玉米等作物。
在本發(fā)明的第四方面，提供了一種改變植物抗有機汞抗性的方法，它包括步驟(1)提供攜帶表達載體的農桿菌，所述的表達載體含有編碼merB的核苷酸序列，核苷酸序列編碼具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽，且所述核苷酸序列中的G+C的百分比含量與SEQ ID NO1中的G+C的百分比含量的差值絕對值小于5％；(2)將植物細胞或組織或器官與步驟(1)中的農桿菌接觸，從而使編碼merB的核苷酸序列轉入植物細胞，并且整合到植物細胞的染色體上；(3)選擇出轉入編碼merB的核苷酸序列的植物細胞或組織或器官；(4)將步驟(3)中的植物細胞或組織或器官再生成植株。
在另一優(yōu)選例中，所述的植物是煙草、水稻、小麥、或玉米等作物。更佳地，所述的植物是煙草。
在本發(fā)明的五方面，提供了用本發(fā)明上述方法獲得的轉基因植物。
在本發(fā)明第六方面，提供了本發(fā)明轉基因植物的用途，它們被用于降解土壤中的有機汞污染。


圖1A和1B顯示了本發(fā)明改造的merB基因(merBhe基因)的核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列。
圖2顯示了merBhe基因表達載體pJR1∷merBhe的結構示意圖。
圖3顯示了merBhe轉基因煙草的Southern和Northern雜交結果。其中，(a)Southern雜交。第1，3泳道分別為MerBhe-13和MerBhe-14兩個轉基因株系，第2泳道為野生型煙草，第4泳道為merBhe基因的探針。
(b)Northern雜交。第1，3泳道分別為MerBhe-13和MerBhe-14兩個轉基因株系，第2泳道為野生型煙草，第4泳道為merBhe基因的探針圖4顯示了merBhe轉基因煙草在含有0.5μmol/L PMA培養(yǎng)基上的發(fā)芽與生長情況。其中，(a)野生型煙草，(b)轉基因株系MerBhe-14。
具體實施例方式
本發(fā)明人經過研究發(fā)現(xiàn)，將細菌的merA或merB直接導入植物無法獲得對有機汞有高抗性的植株的主要原因是細菌基因的G+C含量太高，在植物體內不表達或表達水平很低。適當降低G+C的含量，獲得改造的merB基因，將改造的merB基因導入煙草，結果獲得了對有機汞的抗性遠高于現(xiàn)有技術的轉基因植物。在此基礎上完成了本發(fā)明。
如本文所用，術語“改造的merB基因”或“本發(fā)明的merB基因”可互換使用，指這樣的核苷酸序列，該核苷酸序列編碼具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽，且所述核苷酸序列中的G+C的百分比含量與SEQ ID NO1中的G+C的百分比含量的差值絕對值小于5％。較佳地，該差值絕對值小于2％，更佳地小于1％，最佳地小于0.5％。
如本文所用，術語“merBhe基因”指具有SEQ ID NO1所示核苷酸序列的核酸分子。其中G+C百分比含量為51.8％。該術語還可包括在起始密碼子上游和終止密碼子下游20個以內的核苷酸，如SEQ ID NO3所示的序列，其中G+C百分比含量為48.6％。
在本發(fā)明中，術語“merB蛋白”或“merB多肽”可互換使用，都指具有merB氨基酸序列(SEQ ID NO2)的蛋白或多肽。它們包括含有或不含起始甲硫氨酸的merB。
如本文所用，“分離的”是指物質從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細胞內的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質中分開，則為分離純化的。
本發(fā)明還包括merB的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術語“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發(fā)明的天然merB相同的生物學功能或活性的多肽。本發(fā)明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個或多個保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個或多個氨基酸殘基中具有取代基團的多肽，或(iii)成熟多肽與另一個化合物融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列)。根據本文的教導，這些片段、衍生物和類似物屬于本領域熟練技術人員公知的范圍。
在本發(fā)明中，術語“merB多肽”指具有merB活性的SEQ ID NO.2序列的多肽。該術語還包括具有與merB的相同功能(降解有機汞功能)的、SEQ ID NO.2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)一個或多個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數個(通常為20個以內，較佳地為10個以內，更佳地為5個以內)氨基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數個氨基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括merB的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴緊度條件下能與merB DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗merB多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含merB多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還包括了merB多肽的片段。通常，該片段具有merB多肽序列的至少約10個連續(xù)氨基酸，通常至少約30個連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個連續(xù)氨基酸。
發(fā)明還提供merB或多肽的類似物。這些類似物與天然merB多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到。
在本發(fā)明中，“merB保守性變異多肽”指與SEQ ID NO2的氨基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個，最佳地至多3個氨基酸被性質相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據表1進行氨基酸替換而產生。
表1

本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與SEQ ID NO1所示的編碼區(qū)序列相同或者是簡并的變異體。如本文所用，“簡并的變異體”在本發(fā)明中是指編碼具有SEQ ID NO2的蛋白質，但與SEQ ID NO1所示的編碼區(qū)序列有差別的核酸序列。
編碼SEQ ID NO2的成熟多肽的多核苷酸包括只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。
術語“編碼多肽的多核苷酸”可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發(fā)明涉及的核苷酸序列還包括G+C的百分比含量與SEQ ID NO1中的G+C的百分比含量的差值絕對值小于5％的核苷酸序列。其中該差值可通過下式計算差值＝某序列的G+C百分比-SEQ ID NO1或3的G+C百分比本發(fā)明的改造的merB的核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂萌斯ず铣?、PCR擴增法、或重組法的方法獲得。例如首先根據SEQ ID NO1的序列進行全序列合成。通常，可先合成多個小片段，然后再進行連接可獲得序列很長的片段。
一旦獲得了有關的序列，就可以用重組來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關序列。還可用PCR法獲得本發(fā)明改造的merB基因。
本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，以及用本發(fā)明的載體或merB編碼序列經基因工程產生的宿主細胞，以及經重組技術產生本發(fā)明所述多肽的方法。
通過常規(guī)的重組DNA技術(Science，1984；2241431)，可利用本發(fā)明的多聚核苷酸序列可用來表達或生產重組的merB多肽。一般來說有以下步驟(1).用本發(fā)明的編碼merB多肽的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達載體轉化或轉導合適的宿主細胞；(2).在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細胞；(3).從培養(yǎng)基或細胞中分離、純化蛋白質。
本發(fā)明中，merB多核苷酸序列可插入到重組表達載體中。術語“重組表達載體”指本領域熟知的細菌質粒、噬菌體、酵母質粒、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒或其他載體。總之，只要能在宿主體內復制和穩(wěn)定，任何質粒和載體都可以用。表達載體的一個重要特征是通常含有復制起點、啟動子、標記基因和翻譯控制元件。
本領域的技術人員熟知的方法能用于構建含merB編碼DNA序列和合適的轉錄/翻譯控制信號的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術、DNA合成技術、體內重組技術等。所述的DNA序列可有效連接到表達載體中的適當啟動子上，以指導mRNA合成。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結合位點和轉錄終止子。
此外，表達載體優(yōu)選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用于選擇轉化的宿主細胞的表型性狀，如真核細胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。
包含上述的適當DNA序列以及適當啟動子或者控制序列的載體，可以用于轉化適當的宿主細胞，以使其能夠表達蛋白質。
宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如植物細胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬、農桿菌；真菌細胞如酵母；植物細胞；昆蟲細胞等。優(yōu)選的宿主細胞是植物細胞。
本發(fā)明的多核苷酸在高等真核細胞中表達時，如果在載體中插入增強子序列時將會使轉錄得到增強。增強子是DNA的順式作用因子，通常大約有10到300個堿基對，作用于啟動子以增強基因的轉錄。
本領域一般技術人員都清楚如何選擇適當的載體、啟動子、增強子和宿主細胞。
用重組DNA轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規(guī)技術進行。當宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態(tài)細胞可在指數生長期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉化也可用電穿孔的方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質體包裝等。轉化植物也可使用農桿菌轉化或基因槍轉化等方法，例如葉盤法。對于轉化的植物細胞、組織或器官可以用常規(guī)方法再生成植株，從而獲得抗有機汞抗性提高的植物。
獲得的轉化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據所用的宿主細胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細胞生長的條件下進行培養(yǎng)。當宿主細胞生長到適當的細胞密度后，用合適的方法(如溫度轉換或化學誘導)誘導選擇的啟動子，將細胞再培養(yǎng)一段時間。
在上面的方法中的重組多肽可在細胞內、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領域技術人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術及這些方法的結合。
另一方面，本發(fā)明還包括對merB DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段、或嵌合抗體。本發(fā)明的抗體可以通過本領域內技術人員已知的各種技術進行制備。
本發(fā)明的主要優(yōu)點在于(a)改造的merB基因特別適合在植物細胞中表達。
(b)獲得的轉基因植物的抗有機汞抗性遠高于現(xiàn)有技術。
因此，本發(fā)明的merB為改變植物的抗有機汞抗性提供了新的途徑，因而具有巨大的應用前景?？梢酝ㄟ^將merB的編碼基因導入，改變現(xiàn)有優(yōu)良農作物品種的抗有機汞抗性，可獲得抗有機汞的小麥、水稻或其它農作物品種，從而降解環(huán)境中的有機汞污染。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例11材料與方法(i)植物材料。試驗植物為煙草(Nicotiana tabacum)。采用常規(guī)方法消毒煙草種子，在MS培養(yǎng)基上播種，并獲得無菌苗，取25～30d苗齡的葉片作為遺傳轉化的受體材料。
(ii)菌種、質粒、工具酶。菌種包括大腸桿菌DH5α，農桿菌LBA4404(美國專利5659121和美國專利5808034)，實驗所用的克隆載體為T-easy(Promega公司產品)，pBluescript KS(+)；植物基因表達載體為pJR1(美國專利5659121和美國專利5808034)，上述質粒和細菌都是本領域常用的，在眾多專利文獻中公開過或者可通過商業(yè)渠道購得。限制性內切酶、修飾酶購自華美生物工程公司。
(iii)對merB序列的改造設計、人工全合成和載體構建。本發(fā)明設計的改造的merB基因被稱為merBhe，具體序列如圖1和SEQ ID NO3所示，其中編碼區(qū)序列示于SEQ ID NO1。將設計的序列用常規(guī)方法進行全基因合成。將合成的merBhe序列(SEQ ID NO3)克隆在T-easy載體中，隨后亞克隆在pBluescriptKS(+)質粒中。將merBhe片段插入pJR1載體中，構建成merBhe基因的表達載體pJR1∷merB。采用凍融法轉入根癌農桿菌LBA4404。
(iv)遺傳轉化。煙草的轉化用常規(guī)的葉盤法進行，方法如下將過夜培養(yǎng)的農桿菌離心，菌體用MS液體培養(yǎng)基10倍懸浮。將煙草葉片切成0.5cm×0.5cm的小塊，放入菌液中浸泡10min，吸干多余的菌液后平放在MS+6-BA 3mg/L的培養(yǎng)基預培養(yǎng)2d。然后轉接到分化和篩選培養(yǎng)基(MS+6-BA 3mg/L+Km 50mg/L+羧芐青霉素Cb 500mg/L)上，在25℃下共培養(yǎng)。等芽長到2cm高時，切下芽并轉入生根培養(yǎng)基(1/2MS+NAA 1mg/L+Cb 300mg/L)上進行生根。待根長出后移栽到盆缽內，溫室內培養(yǎng)至開花。每個轉基因植株標記為一個轉基因株系，按每個果實分別收獲種子并編號。
(v)轉基因種子的卡那霉素抗性篩選。從轉化植株上收獲的種子經表面消毒后播種在含有45mg/L卡那霉素(Km)的1/2MS固體培養(yǎng)基上篩選，21d后挑出綠苗移栽于蛭石和珍珠巖的人工土中，使其在人工氣候室中生長。
(vi)有機汞抗性的測定。以醋酸苯汞(PMA)代表有機汞。在MS培養(yǎng)基中加入PMA，配制成不同PMA濃度處理的培養(yǎng)基，使其處理濃度分別為0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35μmol/L。取轉化植株的種子，經表面消毒后播種在含有不同PMA的MS固體培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)室內培養(yǎng)。能夠發(fā)芽且長出綠色真葉的種子認定為抗PMA的種子，不能萌發(fā)或發(fā)芽后心葉變白的種子視為不抗PMA。另外，在培養(yǎng)基中同時加入Km和PMA，觀察轉基因植株對Km和PMA的抗性是否同步。
為了確認轉基因植株在苗期對PMA的抗性，在種有煙草轉基因苗的土壤中加入PMA，根據幼苗的生長狀況判斷其抗性。
(vii)Southern和Northern雜交。用常規(guī)的CTAB法提取煙草轉化植株總DNA，用EcoRI消化3h后，在0.7％瓊脂糖凝膠上電泳。將DNA轉移到尼龍膜(amersham)上。用XbaI/SalI雙酶切pJR1∷merBhe載體，得到以32P-dCTP為標記物的合成探針，在42℃預雜交4h，預雜交緩沖液含有25％甲酰胺，100μg/mL變性的鮭精DNA，10μg/mL酵母RNA，5×Denhardt’s試劑，50mmol/L磷酸鈉(pH 6.5)，5×SSC和0.2％SDS。向預雜交緩沖液中加入經過變性的探針，在同樣的溫度下溫育24h。在室溫下用漂洗緩沖液(0.05mol/L NaH2PO4，0.05mol/L Na2HPO4，5×SSC和25％甲酰胺)漂洗雜交膜，然后在42℃下用2×SSC/0.02％SDS繼續(xù)漂洗。濾膜烘干后加增感屏對X射線片曝光。從轉基因煙草和野生型煙草的葉片中分別提取總RNA，以32P-dCTP為標記的merBhe基因片段為探針進行Northern雜交，雜交溫度為58℃。
2結果2.1merB基因序列改造和植物表達載體構建改造后的merBhe基因(圖1)中增加了A和T的含量，但沒有改變氨基酸序列，仍然編碼SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。此外，merBhe序列起始密碼子ATG上游還包括了植物翻譯一致性序列AGAACCAC，使之更符合真核生物的序列特征。
將該全合成的產物克隆在T-easy載體上，經測序得到與預測序列相同的merBhe基因，其中編碼區(qū)為639bp。由于合成的merBhe序列中G+C的含量明顯降低(由55.3％降為48.6％)，因此，所獲得的merBhe基因的編碼區(qū)更加符合真核生物的序列特征。
用XbaI/SalI酶切pBluescript載體，得到merBhe基因的編碼序列，以同樣的酶切位點插入到pJR1雙元載體中，構建成pJR1∷merBhe植物基因表達載體(圖2)。用凍融法將該載體轉化到農桿菌LBA4404中。
2.2煙草轉化和抗有機汞篩選采用葉盤法轉化，不定芽誘導培養(yǎng)基為MS+6-BA 3mg/L+Km 50mg/L+Cb 500mg/L，生根培養(yǎng)基為1/2MS+NAA 1mg/L+Cb 300mg/L在Km篩選培養(yǎng)基上，轉接14d后煙草葉片開始膨脹，增厚，葉緣開始產生皺褶，并有白色的愈傷組織生成。22d后可見芽的分化。此后，一部分再生芽變白而淘汰。培養(yǎng)綠色再生芽至2cm左右后，進行生根培養(yǎng)，1個月左右根系生長健壯，移栽到溫室的盆缽中。本次實驗得到120株再生苗，移栽成活86株。每個轉基因植株單獨收種、編號。
分別從轉基因植株的葉片中提取總DNA，以merBhe基因的DNA片段為探針進行雜交，結果在4個DNA樣品中有3個轉基因植株的DNA樣品顯示雜交信號(圖3a)。其中MerBhe-13和MerBhe-14兩個轉基因植株中merBhe基因為單拷貝插入。從上述2個轉基因株系和野生型煙草的葉片中分別提取總RNA，以32P-dCTP標記的merBhe基因片段為探針進行Northern雜交，結果在MerBhe-13和MerBhe-14兩個轉基因株系中均出現(xiàn)了雜交帶(圖3b)。說明merBhe基因在該株系上得到了表達。
表1為用不同汞濃度篩選T1代轉基因煙草種子的篩選情況。
表1T1代轉基因煙草種子在含有PMA的篩選培養(yǎng)基上的出苗率a)

a)在播種后35d測定表1結果表明，對照種子在PMA的濃度為0.5μmol/L時，即不能出苗，轉基因種子的發(fā)芽情況很好。但是，有些發(fā)芽的種子后來死掉了。因此那些長出綠色真葉的幼苗才算出苗。出苗率隨PMA的濃度增大而降低，其中MerBhe-13株系在2.5μmol/L時出苗率為13％，3.0μmol/L時仍有5％的出苗率，MerBhe-14株系在2.5μmol/L時出苗率為6％，3.0μmol/L時不能出苗。
由于植物表達載體含有植物選擇標記基因NPTII(新霉素磷酸轉移酶基因)，利用含Km的培養(yǎng)基篩選種子，可確定基因轉化率和轉基因植株。為了解轉基因植株抗Km和抗汞是否同步，本發(fā)明人用含有Km，汞，Km+汞3種培養(yǎng)基篩選轉基因種子。汞的篩選濃度采用煙草的致死濃度，轉merBhe基因種子用PMA 0.5μmol/L篩選；Km的篩選濃度為50mg/L。MerBhe-13株系的種子群體中，抗Km和抗汞的比例較高，幾乎占所處理種子的2/3(表2)；MerBhe-14株系群體中，抗Km和抗汞的比例較低，還不到所處理種子的1/3。在同時含有Km和PMA的培養(yǎng)基上，MerBhe-13株系中雙抗幼苗的比例接近單抗的比例，而MerBhe-14株系的雙抗比例明顯低于單抗，說明有些抗Km的植株并不抗PMA，而有些抗汞的植株并不抗Km。
表2 T1代merBhe轉基因煙草對Km和PMA的反應a)出苗率/％處理對照 MerBhe-13 MerBhe-14Km+ 05626Hg+ 05923Km+，Hg+05410a)在播種后35d測定。Km+示抗卡那霉素，Hg+示抗有機汞從理論上講，在轉基因植株體內，T-DNA的整合同時導入merBhe和NPTII基因。當Km抗性和汞抗性不一致時，最好的解釋是，有些轉基因植株的merBhe或NPTII基因沒有表達或表達水平很低。
2.3轉基因植株的形態(tài)表現(xiàn)圖4顯示，在含有0.5μmol/L PMA的培養(yǎng)基上，野生型的煙草種子沒有發(fā)芽，而轉基因株系MerBhe-13和MerBhe-14的種子發(fā)芽情況基本正常，并且能夠正常生長。當PMA濃度提高到1.0μmol/L時，轉基因種子雖然能夠發(fā)芽和生長，但下胚軸和葉片的伸展開始出現(xiàn)異?，F(xiàn)象，表現(xiàn)在有些下胚軸短縮和傾斜，葉片變小和扭曲。隨著PMA濃度的升高，幼苗生長的異常程度增加。
經PMA初步篩選的MerBhe-13幼苗，移栽于盆缽土壤中，用含PMA的營養(yǎng)液澆灌。結果顯示，野生型煙草PMA的死亡臨界濃度均為0.1μmol/L，在此濃度下，幼苗培養(yǎng)5d后葉片開始發(fā)黃并逐漸死亡。與此不同，MerBhe-13幼苗在0.1μmol/LPMA的條件下健康生長。隨著PMA濃度的增大，生長開始受到不同程度的抑制，表現(xiàn)在葉片數的減少，株高的降低，葉色變黃，根系變小。其中2.0μmol/L時，植株的下部葉黃化死亡，但上部葉仍為黃綠色，新葉為淡綠色，可維持生長。PMA濃度為2.5μmol/L時，全部葉黃化，但若在黃化時轉入不含PMA的培養(yǎng)基中，經1周后，新葉轉綠，表明傷害可逆轉。3.0μmol/L的傷害出現(xiàn)得早，也不可逆。因此，2.5umol/L PMA是MerBhe-13轉基因株系的致死臨界濃度，相比未轉基因的煙草幼苗，抗汞性提高了25倍。
3討論植物修復技術(phytoremediation)是近年來發(fā)展起來的一種綠色生態(tài)技術，其中利用重金屬超富集植物(hyperaccumulator)進行修復是當前環(huán)境生物學研究的熱點領域，它是經濟、有效的污染治理方法。目前已有Cd，Co，Cr，Cu，Mn，Ni，Pb，Zn和As等超富集植物發(fā)現(xiàn)的報道，但相對而言植物不易富集汞，目前還沒有汞超富集植物的報道。因此，利用汞的天然超富集植物來吸收富集，從而從環(huán)境中排除汞的可能性很小。本發(fā)明通過merBhe的修飾和轉移，創(chuàng)造轉基因植物，結果得到對有機汞表現(xiàn)高抗作用的轉基因系，這些轉基因植物可用來吸收和轉化污染環(huán)境中的有機汞，是汞污染土壤治理的有效途徑。
在轉基因植物體內，merA基因的表達產物具有吸收和揮發(fā)離子汞的解毒作用，這一點在轉基因擬南芥、北美鵝掌楸和煙草上得到了證實，與此同時，在轉基因擬南芥上merB基因將有機汞轉化為無機汞。然而，merB轉基因植物無法使無機汞揮發(fā)。要使植物完成有機態(tài)的汞到氣態(tài)汞的揮發(fā)，可以有兩種選擇一是在該植物中同時導入merA和merB兩個基因，二是將merA轉基因植株和merB轉基因植株雜交，其后代的染色體組同時具有這兩個基因。Bizily等人將merA和merB轉基因擬南芥作為父母本雜交，所獲得的雜交后代同預期的一樣能夠將有機汞直接轉化為氣態(tài)的單質汞。到目前為止，大多數汞解毒的研究集中在轉基因擬南芥上。由于模式植物擬南芥?zhèn)€體很小，不可能用于大規(guī)模的植物修復。要采用植物修復的方法處理土壤和水體中的汞污染，必須采用生物量較大的植物。在這方面，煙草是一種比較理想的植物。
野生型的煙草植株由于缺乏外源merB基因，無法有效地轉化PMA，因此對PMA表現(xiàn)出高度的敏感性，轉基因煙草之所以對PMA表現(xiàn)出抗性，是因為它吸收PMA，并且在merB基因表達產物的作用下將有機態(tài)的PMA(有機汞)轉化為離子態(tài)的汞。其結果是植株體內的離子汞濃度增加，植株本身也成為汞離子的超富集載體。在本發(fā)明的實驗中，當PMA濃度為0.5μmol/L時，merB轉基因煙草的出苗和生長基本上是正常的，而野生型煙草不能發(fā)芽，說明此濃度下轉基因煙草對PMA表現(xiàn)出完全的抗性；隨著PMA濃度的升高，轉基因植株雖然能夠生長，但受到越來越大的抑制。這是因為，轉基因植株體內累積的離子汞不斷增多，對植物組織的危害程度逐漸增強。同時因植株吸收PMA也使苯環(huán)的濃度增加。植物體內的苯環(huán)超過一定量后也有可能對生長造成危害。但是，在此類實驗中，苯環(huán)的危害不是明顯的。Bizily等人用甲基汞和PMA篩選merB轉基因擬南芥，結果發(fā)現(xiàn)兩者的篩選效果是一致的。
merBhe轉基因煙草對PMA的抗性高達3.0μmol/L，由merBhe基因作用所產生汞離子可以進一步轉化為低毒的單質汞，這一過程有賴于merA基因的作用。
在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
序列表<110>中國科學院上海生命科學研究院<120>降解有機汞污染的轉基因煙草<130>036598<160>3<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>639<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(639)<223>merB編碼序列<400>1atgaaacttg ctccatatat tttagaatta ttaacttcag ttaatagaac taatggtact 60gcagatctat tagtacctct acttagagaa ctagctaaag gtagaccagt ttcacgaacg120acacttgcct ggattctcga ctggcccgct gagcgagtgg ccgccgtact cgaacaggcc180accagtaccg aatatgacaa agatgtgaac atcatcggct acggcctcac cttgcgcgag240acttcgtatg tctttgaaat tgacgaccgc cgtctgtatg cctggtgcgc gctggacacc300ttgatatttc cggcgctgat cggacgtaca gctcgcgtct catcacattg cgctgcaacc360ggagcaccgg tttcactcac ggtttcaccc agcgagatac aggctgtcga acctgccgtc420atggcggtgt ccttggtatt gccgcaggaa gcagccgacg ttcgtcagtc cttctgttgc480catgtacatt tctttgcatc tgtcccgacg gcggaagact gggcctcaaa gcatcaagga540ttggaaggat tagcaattgt aagtgttcat gaagctttag gtttaggtca agaatttaat600cgacatctat tacaaacaat gtcatctaga acaccttga 639<210>2<211>212<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>MISC_FEATURE<223>有機汞裂解酶<400>2Met Lys Leu Ala Pro Tyr Ile Leu Glu Leu LeuThr Ser Val Asn Arg1 5 10 15Thr Asn Gly Thr Ala Asp Leu Leu Val Pro Leu Leu Arg Glu Leu Ala20 25 30Lys Gly Arg Pro Val Ser Arg Thr Thr Leu Ala Trp Ile Leu Asp Trp35 40 45Pro Ala Glu Arg Val Ala Ala Val Leu Glu Gln Ala Thr Ser Thr Glu50 55 60Tyr Asp Lys Asp Val Asn Ile Ile Gly Tyr Gly Leu Thr Leu Arg Glu65 70 75 80Thr Ser Tyr Val Phe Glu Ile Asp Asp Arg Arg Leu Tyr Ala Trp Cys85 90 95Ala Leu Asp Thr Leu Ile Phe Pro Ala Leu Ile Gly Arg Thr Ala Arg100 105 110Val Ser Ser His Cys Ala Ala Thr Gly Ala Pro Val Ser Leu Thr Val115 120 125Ser Pro Ser Glu Ile Gln Ala Val Glu Pro Ala Val Met Ala Val Ser130 135 140Leu Val Leu Pro Gln Glu Ala Ala Asp Val Arg Gln Ser Phe Cys Cys145 150 155 160His Val His Phe Phe Ala Ser Val Pro Thr Ala Glu Asp Trp Ala Ser165 170 175Lys His Gln Gly Leu Glu Gly Leu Ala Ile Val Ser Val His Glu Ala180 185 190
Leu Gly Leu Gly Gln Glu Phe Asn Arg His Leu Leu Gln Thr Met Ser195 200 205Ser Arg Thr Pro210<210>3<211>658<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>含上游和下游部分序列的merBhe<400>3ctctagaacc acaatgaaac ttgctccata tattttagaa ttattaactt cagttaatag 60aactaatggt actgcagatc tattagtacc tctacttaga gaactagcta aaggtagacc120agtttcacga acgacacttg cctggattct cgactggccc gctgagcgag tggccgccgt180actcgaacag gccaccagta ccgaatatga caaagatgtg aacatcatcg gctacggcct240caccttgcgc gagacttcgt atgtctttga aattgacgac cgccgtctgt atgcctggtg300cgcgctggac accttgatat ttccggcgct gatcggacgt acagctcgcg tctcatcaca360ttgcgctgca accggagcac cggtttcact cacggtttca cccagcgaga tacaggctgt420cgaacctgcc gtcatggcgg tgtccttggt attgccgcag gaagcagccg acgttcgtca480gtccttctgt tgccatgtac atttctttgc atctgtcccg acggcggaag actgggcctc540aaagcatcaa ggattggaag gattagcaat tgtaagtgtt catgaagctt taggtttagg600tcaagaattt aatcgacatc tattacaaac aatgtcatct agaacacctt gaagcttc 658
權利要求
1.一種分離的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，該核苷酸序列編碼具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽，且所述核苷酸序列中的G+C的百分比含量與SEQ ID NO1中的G+C的百分比含量的差值絕對值小于5％。
2.如權利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列中的G+C的百分比含量與SEQ ID NO1中的G+C的百分比含量的差值小于2％。
3.如權利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列中的G+C的百分比含量與SEQ ID NO1中的G+C的百分比含量的差值小于1％。
4.如權利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，所述的核苷酸序列具有SEQID NO1或3所示的核苷酸序列。
5.一種載體，其特征在于，它含有權利要求1所述的多核苷酸。
6.一種宿主細胞，其特征在于，它含有權利要求6所述的載體，或者所述宿主細胞的染色體中整合有權利要求1所述的多核苷酸。
7.如權利要求6所述的細胞，其特征在于，所述的細胞是植物細胞。
8.一種改變植物抗有機汞抗性的方法，其特征在于，它包括步驟(1)提供攜帶表達載體的農桿菌，所述的表達載體含有編碼merB的核苷酸序列，核苷酸序列編碼具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽，且所述核苷酸序列中的G+C的百分比含量與SEQ ID NO1中的G+C的百分比含量的差值絕對值小于5％；(2)將植物細胞或組織或器官與步驟(1)中的農桿菌接觸，從而使編碼merB的核苷酸序列轉入植物細胞，并且整合到植物細胞的染色體上；(3)選擇出轉入編碼merB的核苷酸序列的植物細胞或組織或器官；(4)將步驟(3)中的植物細胞或組織或器官再生成植株。
9.如權利要求8所述的方法，其特征在于，所述的植物是煙草。
10.一種用權利要求8所述方法獲得的轉基因植物的用途，其特征在于，它被用于降解土壤中的有機汞污染。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種適合在植物中表達的有機汞裂解酶merB基因，該基因是對細菌中催化甲基汞轉變?yōu)殡x子汞的merB基因進行序列改造獲得的。該本發(fā)明還涉及將改造的merB基因轉入植物，從而獲得對有機汞有強抗性的轉基因植物。本發(fā)明的轉基因植物可用于降解土壤中的有機汞污染物。
文檔編號C12N15/63GK1614024SQ200310108449
公開日2005年5月11日 申請日期2003年11月6日 優(yōu)先權日2003年11月6日
發(fā)明者何玉科, 沈瑞娟, 王進游 申請人:中國科學院上海生命科學研究院