專利名稱：一種利用基因工程技術(shù)改良植物營養(yǎng)品質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程和轉(zhuǎn)基因植物領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及一種外源基因(如人乳鐵蛋白基因)在植物種子、果實或其它組織中高效表達(dá)的載體，以及在植物種子、果實或其它組織中高效表達(dá)外源基因的方法。
背景技術(shù)：
植物果實或種子中具有較強(qiáng)的蛋白合成功能，如能利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將外源基因特別是具有重要醫(yī)療價值的基因如人促紅細(xì)胞生成素基因、人生長激素基因轉(zhuǎn)入植物中，就有可能產(chǎn)生出大量的藥用蛋白。人體內(nèi)的許多蛋白的生理活性與翻譯后的修飾有關(guān)，通過原核生物表達(dá)的蛋白通常因為缺少翻譯后修飾而不具有生物活性。以酵母或動物細(xì)胞培養(yǎng)來表達(dá)這些蛋白不僅成本高而且條件要求高，以轉(zhuǎn)基因植物來表達(dá)這些蛋白，其產(chǎn)物接近天然即具有較高的生物活性、表達(dá)量高、成本低而且簡單易行。
利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法技術(shù)轉(zhuǎn)化進(jìn)植物體內(nèi)的基因，其在植物體內(nèi)的基因組的整合及表達(dá)是隨機(jī)的，如果外源基因具有較強(qiáng)的活性，如果隨機(jī)表達(dá)或異位表達(dá)有可能造成對轉(zhuǎn)基因植物的傷害，甚至死亡。
因此本領(lǐng)域迫切需要在植物的種子(如水稻種子)、果實(如番茄果實)及其它可食用組織(如葉片)中特異且高效表達(dá)外源基因的載體和技術(shù)。
乳鐵蛋白是乳汁中主要的鐵結(jié)合蛋白，主要分布在哺乳動物的乳汁、血液、淚液、膽汁、精液、羊水、和小腸液等分泌物中，在哺乳動物中以人乳汁中含量最高。人乳鐵蛋白(Human lactoferrin，hLF)因?qū)σ鹊鞍酌讣邦愃频牡鞍酌妇哂锌菇到饽芰?，特別是結(jié)合鐵離子后抗降解能力增強(qiáng)，因此，在腸道內(nèi)能以完整分子的形式被吸收，有利于嬰兒在發(fā)育中對鐵的攝入，是人體非特異性免疫系統(tǒng)中的重要成員之一，人乳鐵蛋白對某些人體致病菌與病毒有很強(qiáng)的抑制作用(Harmsen等1995)；除此之外，乳鐵蛋白還具有多種生物學(xué)功能。目前，已克隆了多種動物的乳鐵蛋白基因及cDNA序列，并在乳腺、昆蟲、曲霉等系統(tǒng)中表達(dá)了重組的乳鐵蛋白。荷蘭PHP公司20世紀(jì)90年代在牛乳腺中表達(dá)了以牛αs1-酪蛋白基因5’調(diào)控序列為啟動子的人乳鐵蛋白基因，按當(dāng)時的物價，年產(chǎn)值可達(dá)50億美元，由此可以看出人乳鐵蛋白的生產(chǎn)具有巨大的經(jīng)濟(jì)效益。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一目的就是提供一種適合在植物種子、果實或其它組織中高效表達(dá)人乳鐵蛋白的融合基因及載體。
本發(fā)明的第二目的是提供一種利用轉(zhuǎn)基因植物的種子、果實或其它組織高效表達(dá)人乳鐵蛋白的方法，從而在植物種子、果實或其它組織中高效表達(dá)人乳鐵蛋白。
本發(fā)明的第三目的是提供一種利用基因重組技術(shù)生產(chǎn)上述新的人乳鐵蛋白的方法。
本發(fā)明還提供了這種新的人乳鐵蛋白及其編碼序列在植物營養(yǎng)品質(zhì)改良中的應(yīng)用。
本發(fā)明的第一方面，提供了在植物果實、種子或其它組織中高效表達(dá)融合基因hLFSEKDEL的載體，該載體從5’至3’依次包含以下元件胚乳特異表達(dá)啟動子或果實特異表達(dá)啟動子或組成型表達(dá)啟動子、人乳鐵蛋白全長編碼cDNA序列(hLF)、植物內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號肽(SEKDEL)序列、終止子序列。較佳地，在啟動子與人乳鐵蛋白全長編碼cDNA序列有一接頭序列，植物內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號肽的編碼序列的末段還有一接頭序列。
在本發(fā)明的一個實施例中，在啟動子與人乳鐵蛋白全長編碼cDNA序列有一接頭序列帶有一BamHI位點；植物內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號肽的編碼序列的末段還有一接頭序列帶有一SacI位點。
更佳地，人乳鐵蛋白融合基因hLFSEKDEL具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；以及由SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列；植物內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號肽的編碼序列具有SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列，以及其它相應(yīng)的編碼的核苷酸序列(見表1)。
乳鐵蛋白是一種多功能的糖蛋白，具有抗菌和抗病毒等作用，是一種具有重要價值的藥用蛋白。在本發(fā)明的一個實施例中，選用人的乳鐵蛋白作為研究的外源基因。
本發(fā)明首先提供了一種調(diào)控外源基因在植物種子、果實和其它組織中特異高效表達(dá)的載體，為使外源基因(人乳鐵蛋白)在植物種子、果實及其它組織中高效表達(dá)，本發(fā)明利用了植物種子或果實特異表達(dá)調(diào)控元件，或植物組成型表達(dá)調(diào)控元件構(gòu)建了植物果實、種子或其它組織如葉片中高效表達(dá)的載體。
在本發(fā)明的一個實施例中，所構(gòu)建的載體包括如下序列元件胚乳特異表達(dá)啟動子或果實特異表達(dá)啟動子或植物組成型表達(dá)啟動子、終止子序列。
在本發(fā)明的一個實施例中，為了使人乳鐵蛋白在植物的特定組織中積累，在人乳鐵蛋白的全長編碼序列后加上了植物內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號肽的編碼序列，從而構(gòu)建了融合基因hLFSEKDEL。
本發(fā)明還提出了通過在植物中表達(dá)所述融合基因從而實現(xiàn)提高植物營養(yǎng)品質(zhì)的方法。其步驟如下上述方法中所說的植物為高等植物，在后面的實施例中使用番茄、水稻。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步的闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明，而不是用于限制本發(fā)明的范圍。下面具體實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)的條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或者按照制造廠商所建議的條件。
實施例1 在植物種子或果實或其它組織中高效表達(dá)融合基因hLFSEKDEL的載體的構(gòu)建該實施例的載體構(gòu)建過程如下所示，該基因構(gòu)建物即為在果實或胚乳或其它組織如葉片中表達(dá)的融合基因(hLFSEKDEL)的載體。其中在果實中特異表達(dá)的調(diào)控序列來源于番茄果實特異表達(dá)啟動子PG、在胚乳中特異表達(dá)的調(diào)控序列來源于玉米醇溶蛋白啟動子19Z、在植物其它組織中高效表達(dá)的啟動子來源于花椰菜病毒的35S啟動子CaMV35S，編碼序列來源于人乳鐵蛋白cDNA基因序列。
含融合蛋白hLFSEKDEL的載體的構(gòu)建過程1)融合基因hLFSEKDEL的序列根據(jù)hLF的編碼序列設(shè)計并合成如下引物hLFFPCGGATCCATGAAACTTGTCTTCCTCG(SEQ ID NO.1)hLFRPTTTGAGCTC GGACTTCCTGAGGAATTCACAG(SEQ ID NO.2)其中hLFFP引物序列有BamHI酶切位點(下畫橫線)、hLFRP有SacI酶切位點(下畫橫線)和SEKDEL編碼序列的互補(bǔ)序列(加框序列)。
以人血細(xì)胞總RNA為模板，采用如上所述的引物通過RT-PCR獲得hLFSEKDEL融合基因全長序列(SEQ ID NO.3)，該融合基因全長長度為2189bp，編碼717個氨基酸殘基，分子量為79,073道爾頓，等電點(pI)為8.43。
2)酶切將含有克隆出的序列的質(zhì)粒載體用BamHI及SacI雙酶切，切下融合基因hLFSEKDEL。
3)連接將切下的基因連入已經(jīng)用BamHI及SacI酶切好的經(jīng)過改造的含有植物果實、種子特異啟動子的基因質(zhì)粒pCAMBIA2300植物表達(dá)載體大片段中，用藍(lán)白斑篩選檢測轉(zhuǎn)化的大腸桿菌陽性克隆。
實施例2獲得含融合基因hLFSEKDEL的農(nóng)桿菌及轉(zhuǎn)基因水稻和番茄植株的獲得該實施例的轉(zhuǎn)化過程如下所述，該步驟的結(jié)果是獲得帶有目的基因的轉(zhuǎn)基因水稻和番茄植株。
1.含目的基因(融合基因hLFSEKDEL)表達(dá)載體的農(nóng)桿菌菌株的獲得在成功地構(gòu)建了含hLFSEKDEL融合基因的植物表達(dá)載體p2300-hLF-SEKDEL的基礎(chǔ)上，通過凍融法將p2300-hLF-SEKDEL導(dǎo)入農(nóng)桿菌(如EHA105或LBA4404)中，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法技術(shù)轉(zhuǎn)化模式植物水稻或番茄。
2.轉(zhuǎn)基因水稻植株的獲得1)愈傷組織的誘導(dǎo)與繼代在無菌器皿中，將去殼的水稻(如品種1826)種子成熟胚或幼胚經(jīng)過以下洗滌75％酒精浸1-2分鐘，再用無菌水洗2次后，25％的次氯酸鈉浸30分鐘(期間要搖動幾次，或放在搖床上搖動)，用無菌水洗4-5次，將種子移到無菌濾紙上，吸干水分，接到MS2(MS0+2，4-D 2ppm)上，每皿25粒，然后在25℃暗培養(yǎng)。3-4周后，將水稻長出的黃色愈傷轉(zhuǎn)到新鮮的MS2上繼續(xù)培養(yǎng)，以后每2周繼代一次。經(jīng)2-4次繼代后即可選擇嫩黃、顆粒狀的胚性愈傷準(zhǔn)備與菌共培養(yǎng)。
2)菌的活化取用甘油保存于-20℃的農(nóng)桿菌50-100μl于2ml的LB液體培養(yǎng)基中(酵母粉5g；蛋白胨10g；NaCl10g；PH7.0；總體積1升。需要高壓滅菌)，并加入相應(yīng)的抗生素[如利福平20-50ppm；鏈霉素50-100ppm；卡那霉素50ppm；壯觀霉素50-100ppm；氯霉素20-50ppm]，在搖床上以250rpm左右、25℃搖菌24-36小時至OD600＝1.0。再取新?lián)u菌100-200μl于30ml的LB液體培養(yǎng)基中，并加入相應(yīng)的抗生素(濃度、條件同上)，經(jīng)12小時左右，菌液達(dá)到OD600＝0.8-1.0時，即可用來轉(zhuǎn)化。
3)共培養(yǎng)菌液在無菌的50ml的離心管中以5000rpm×5min離心，去上清，再用30ml的MSCO(MS2+乙酰丁香酮AS 100μmol/l)液體培養(yǎng)基重懸。將預(yù)先挑好的愈傷浸在菌液中15-30分鐘后，再用無菌濾紙或吸水紙吸去多余的菌液(無須進(jìn)一步吸干)，置于MSCO固體培養(yǎng)基(可覆蓋一層無菌濾紙)上，25℃暗培養(yǎng)2-3天。
4)洗菌與篩選共培養(yǎng)的愈傷先用無菌水沖洗3次，再浸于含頭孢霉素(250mg/l)的MSCO液體培養(yǎng)基中20-30分鐘，將愈傷組織用無菌濾紙或吸水紙吸干后，接種于選擇培養(yǎng)基S1(MS2+卡那霉素50ppm+Cef(頭孢霉素)250ppm)上篩選2-3周。然后挑選新長出的愈傷接種于新鮮的選擇培養(yǎng)基S1上篩選2-3周。
5)植株再生與生根將經(jīng)過2次選擇得到的抗性愈傷接種到預(yù)分化培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)10天左右，再轉(zhuǎn)到分化培養(yǎng)基上進(jìn)行光照培養(yǎng)。約1-2個月，將2cm左右高的幼苗轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基(1/2MS0+卡那霉素50ppm+NAA 0.2ppm+植物凝膠phytagel 2.5g/l+蔗糖15g/l)上生根。當(dāng)苗長至10cm高且根系發(fā)達(dá)后，將植株取出，用無菌水洗凈附著的固體培養(yǎng)基，移入土壤中，剛開始用玻璃罩罩幾天，待植株健壯后再取下玻璃罩，溫室中培養(yǎng)。
3.利用葉盤法轉(zhuǎn)化番茄1)番茄種子滅菌后播于1/2MS培養(yǎng)基上，約10天左右長出子葉；2)取用甘油保存于-20℃的農(nóng)桿菌50-100μl于2ml的LB液體培養(yǎng)基中(酵母粉5g；蛋白胨10g；NaCl 10g；PH7.0；總體積1升。需要高壓滅菌)，并加入相應(yīng)的抗生素[如利福平20-50ppm；鏈霉素50-100ppm；卡那霉素50ppm；壯觀霉素50-10ppm；氯霉素20-50ppm]，在搖床上以250rpm左右、25℃搖菌24-36小時至OD600＝1.0。再取新?lián)u菌100-200μl于30ml的LB液體培養(yǎng)基中，并加入相應(yīng)的抗生素(濃度、條件同上)，經(jīng)12小時左右，菌液達(dá)到OD600＝0.8-1.0時，即可用來轉(zhuǎn)化。
3)室溫下4000g離心10min；4)棄上清，菌體用1/2MS液體培養(yǎng)基懸浮，加入子葉浸泡10分鐘；5)在無菌濾紙上吸干菌液；將子葉放在MS培養(yǎng)基上，共培養(yǎng)兩天；6)將葉片轉(zhuǎn)到含Kan的愈傷和分化培養(yǎng)基(MS+ZT 1.0mg/L+IAA 1.0mg/L+Kan50mg/L+cb 250mg/L)上，25-28℃光照下培養(yǎng)，7-15天可見抗性愈傷組織的形成和植株再生；7)待芽長大后約1-2厘米的時將幼芽移植在生根培養(yǎng)基中(1/2 MS)上進(jìn)行生根培養(yǎng)，2-7天左右生根；8)根系發(fā)達(dá)后，將植株取出，用無菌水洗凈附著的固體培養(yǎng)基，在珍珠巖中馴化一周，用1％的MS澆灌，移入土中。
實施例3 融合基因hLFSEKDEL在轉(zhuǎn)基因水稻和番茄中的檢測本實驗用于檢測轉(zhuǎn)基因植株中的融合基因。
1.樣品處理非轉(zhuǎn)基因的水稻和番茄，及轉(zhuǎn)基因的水稻和番茄，按常規(guī)操作取葉片，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 2.檢測方法1)基因組DNA的快速抽提將保存的葉片按照改良的CTAB法進(jìn)行總DNA的抽提；2)酶切及電泳取基因組總DNA約10微克采用限制性內(nèi)切酶BamHI和SacI進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物在1％的瓊脂糖凝膠，1-2V/cm，電泳12小時以上；3)變性及中和加入變性液(1.5M NaCl、0.5M NaOH)使膠變性45分鐘(輕搖)，加入中和液(1.5M NaCl、0.5M Tris-HCl(pH8.0))輕搖中和45分鐘。
4)轉(zhuǎn)膜將尼龍膜均勻鋪在膠上，上面鋪3MM Waterman吸水紙三張，再鋪紙塔(5-10厘米)壓上重物18小時；用5×SSC沖洗膜以除去膜表面的凝膠碎片，在室溫下涼干，80℃固定2小時。
5)探針制備用BamHI和SacI酶切質(zhì)粒，回收含融合基因hLFSEDKEL的片段，采用隨機(jī)引物標(biāo)記試劑盒標(biāo)記探針。
6)預(yù)雜交及雜交轉(zhuǎn)運(yùn)膜在預(yù)雜交液(5×SSPE，5×Denhardt’s Solution，0.1％SDS，100ug/ml nonhomologus Salman Sperm blocking DNA，50％Formamide)中42℃預(yù)雜交4小時。將探針加入到預(yù)雜交液中42℃中雜交16小時。
7)洗膜壓片洗片采用Washing Solution(1×SSC，0.1％SDS)65℃洗滌1小時，重復(fù)此步驟后，將洗滌后的雜交膜用保鮮膜固定，暗室中放入X光片，-70℃保存兩天。暗室中取出X光片，顯影5分鐘，定影15分鐘，檢查光片上顯示的結(jié)果。
實施例4 融合基因hLFSEKDEL在轉(zhuǎn)基因水稻和番茄植株中的表達(dá)檢測本實驗用于轉(zhuǎn)基因植株中的人乳鐵蛋白的表達(dá)檢測。
1.蛋白的提取取50mg轉(zhuǎn)基因水稻去殼種子或番茄成熟果實，加入100ul PBS(KH2PO40.2g/l，Na2HPO41.15g/l，KCl 0.2g/l，NaCl 8g/l)緩沖液，于1.5ml離心管中研磨；13000，4℃離心10分鐘；取上清，備用。
2.蛋白質(zhì)的定量參考Bradford法(Bradford，1976)。取2ul蛋白質(zhì)樣品，加入1ml Bradford試劑，混勻后，分光光度計測OD595值。
3.SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)SDS-PAGE的制備參考《分子克隆》(Sambrook等，1989)1)加樣前，將樣品(包括提取的植物蛋白樣品(30ug/樣品)和市售的人乳鐵蛋白50ng)置于含50mmol/L DTT的加樣緩沖液(2×加樣緩沖液甘油2.4g，1M Tris-HCl pH6.81ml；溴酚蘭0.01％，H2O定容至20ml)，煮沸10分鐘；2)室溫，100V電壓下電泳，直到指示劑(溴酚蘭)前沿達(dá)到凝膠底部。
4.蛋白質(zhì)向硝酸纖維膜上轉(zhuǎn)移1)轉(zhuǎn)移之前，用轉(zhuǎn)移緩沖液(39mmol甘氨酸，48mmol Tris Base，0.037％SDS，20％甲醇)平衡凝膠和硝酸纖維膜30分鐘；2)室溫下用半干式電轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)移1小時，凝膠兩側(cè)各墊3層Whatman濾紙；5.硝酸纖維膜上蛋白質(zhì)的檢測1)將硝酸纖維膜浸在封閉液中，37℃緩慢搖動、封閉60分鐘(封閉液取5g脫脂奶粉溶于100ml 1×PBS(含0.5g疊氮鈉))；
2)將濾膜浸泡在洗滌緩沖液中，37℃洗滌兩次，每次15分鐘；3)加入第一抗體(抗人乳鐵蛋白的抗體)，37℃溫育30分鐘；同步驟b)，洗滌三次；4)加入第二抗體(親和素-堿性磷酸酶復(fù)合物)，37℃溫育30分鐘；5)同步驟2)，洗滌兩次；6)加入底物顯色觀察到人乳鐵蛋白的蛋白特異條帶；7)通過比較植物樣品中的人乳鐵蛋白的特異條帶同市售的人乳鐵蛋白的特異條帶的強(qiáng)弱，計算出人乳鐵蛋白在轉(zhuǎn)基因水稻種子和番茄果實中的表達(dá)量。在本研究中，我們獲得了在轉(zhuǎn)基因水稻種子和番茄果實中人乳鐵蛋白表達(dá)量占總可溶性蛋白的0.5％的轉(zhuǎn)基因水稻和番茄。這些所培育出的表達(dá)人乳鐵蛋白的轉(zhuǎn)基因水稻和番茄可以作為具特殊營養(yǎng)價值的食品加以利用。
在本發(fā)明所提及到的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了上述所講授的內(nèi)容以后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
本發(fā)明涉及的序列及記號分列如下1.SEQ ID NO.1的信息(1)序列特征(A)長度26bp(B)類型寡核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(2)分子類型寡核苷酸(3)序列描述SEQ ID NO.1CGGATCCATGAAACTTGTCTTCCTCG2.SEQ ID NO.2的信息(1)序列特征(A)長度49bp(B)類型寡核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(2)分子類型寡核苷酸(3)序列描述SEQ ID NO.2TTTGAGCTCTTATAGCTCGTCTTTCTCGGACTTCCTGAGGAATTCACAG3.SEQ ID NO.3的信息(1)序列特征(A)長度2189bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(2)分子類型核苷酸(3)序列描述SEQ ID NO.31 tcct gctgttcctc ggggccctcg gactgtgtct
61 ggctggccgt aggagaagga gtgttcagtg gtgcgccgta tcccaacccg aggccacaaa121 atgcttccaa tggcaaagga atatgagaaa agtgcgtggc cctcctgtca gctgcataaa181 gagagactcc cccatccagt gtatccaggc cattgcggaa aacagggccg atgctgtgac241 ccttgatggt ggtttcatat acgaggcagg cctggccccc tacaaactgc gacctgtagc301 ggcggaagtc tacgggaccg aaagacagcc acgaactcac tattatgccg tggctgtggt361 gaagaagggc ggcagctttc agctgaacga actgcaaggt ctgaagtcct gccacacagg421 ccttcgcagg accgctggat ggaatgtccc tacagggaca cttcgtccat tcttgaattg481 gacgggtcca cctgagccca ttgaggcagc tgtggccagg ttcttctcag ccagctgtgt541 tcccggtgca gataaaggac agttccccaa cctgtgtcgc ctgtgtgcgg ggacagggga601 aaacaaatgt gccttctcct cccaggaacc gtacttcagc tactctggtg ccttcaagtg661 tctgagagac ggggctggag acgtggcttt tatcagagag agcacagtgt ttgaggacct721 gtcagacgag gctgaaaggg acgagtatga gttactctgc ccagacaaca ctcggaagcc781 agtggacaag ttcaaagact gccatctggc ccgggtccct tctcatgccg ttgtggcacg841 aagtgtgaat ggcaaggagg atgccatctg gaatcttctc cgccaggcac aggaaaagtt901 tggaaaggac aagtcaccga aattccagct ctttggctcc cctagtgggc agaaagatct961 gctgttcaag gactctgcca ttgggttttc gagggtgccc ccgaggatag attctgggct1021 gtaccttggc tccggctact tcactgccat ccagaacttg aggaaaagtg aggaggaagt1081 ggctgcccgg cgtgcgcggg tcgtgtggtg tgcggtgggc gagcaggagc tgcgcaagtg1141 taaccagtgg agtggcttga gcgaaggcag cgtgacctgc tcctcggcct ccaccacaga1201 ggactgcatc gccctggtgc tgaaaggaga agctgatgcc atgagtttgg atggaggata1261 tgtgtacact gcatgcaaat gtggtttggt gcctgtcctg gcagagaact acaaatccca1321 acaaagcagt gaccctgatc ctaactgtgt ggatagacct gtggaaggat atcttgctgt1381 ggcggtggtt aggagatcag acactagcct tacctggaac tctgtgaaag gcaagaagtc
1441 ctgccacacc gccgtggaca ggactgcagg ctggaatatc cccatgggcc tgctcttcaa1501 ccagacgggc tcctgcaaat ttgatgaata tttcagtcaa agctgtgccc ctgggtctga1561 cccgagatct aatctctgtg ctctgtgtat tggcgacgag cagggtgaga ataagtgcgt1621 gcccaacagc aacgagagat actacggcta cactggggct ttccggtgcc tggctgagaa1681 tgctggagac gttgcatttg tgaaagatgt cactgtcttg cagaacactg atggaaataa1741 caatgaggca tgggctaagg atttgaagct ggcagacttt gcgctgctgt gcctcgatgg1801 caaacggaag cctgtgactg aggctagaag ctgccatctt gccatggccc cgaatcatgc1861 cgtggtgtct cggatggata aggtggaacg cctgaaacag gtgctgctcc accaacaggc1921 taaatttggg agaaatggat ctgactgccc ggacaagttt tgcttattcc agtctgaaac1981 caaaaacctt ctgttcaatg acaacactga gtgtctggcc agactccatg gcaaaacaac2041 atatgaaaaa tatttgggac cacagtatgt cgcaggcatt actaatctga aaaagtgctc2101 aacctccccc ctcctggaag c 2161 注框內(nèi)的序列為設(shè)計的引物序列或其互補(bǔ)序列4.SEQ ID NO.4的信息(1)序列特征(A)長度717個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(2)分子類型多肽(3)序列描述SEQ ID NO.4
MKLVFLVLLF LGALGLCLAG RRRRSVQWCA VSQPEATKCF QWQRNMRKVRGPPVSCIKRD SPIQCIQAIA ENRADAVTLD GGFIYEAGLA PYKLRPVAAEVYGTERQPRT HYYAVAVVKK GGSFQLNELQ GLKSCHTGLR RTAGWNVPTGTLRPFLNWTG PPEPIEAAVA RFFSASCVPG ADKGQFPNLC RLCAGTGENKCAFSSQEPYF SYSGAFKCLR DGAGDVAFIR ESTVFEDLSD EAERDEYELLCPDNTRKPVD KFKDCHLARV PSHAVVARSV NGKEDAIWNL LRQAQEKFGKDKSPKFQLFG SPSGQKDLLF KDSAIGFSRV PPRIDSGLYL GSGYFTAIQNLRKSEEEVAA RRARVVWCAV GEQELRKCNQ WSGLSEGSVT CSSASTTEDCIALVLKGEAD AMSLDGGYVY TACKCGLVPV LAENYKSQQS SDPDPNCVDRPVEGYLAVAV VRRSDTSLTW NSVKGKKSCH TAVDRTAGWN IPMGLLFNQTGSCKFDEYFS QSCAPGSDPR SNLCALCIGD EQGENKCVPN SNERYYGYTGAFRCLAENAG DVAFVKDVTV LQNTDGNNNE AWAKDLKLAD FALLCLDGKRKPVTEARSCH LAMAPNHAVV SRMDKVERLK QVLLHQQAKF GRNGSDCPDKFCLFQSETKN LLFNDNTECL ARLHGKTTYE KYLGPQYVAG ITNLKKCSTSPLLEACEFLR KSEKDEL5.SEQ ID NO.5的信息(1)序列特征(A)長度18bp(B)類型寡核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(2)分子類型寡核苷酸
(3)序列描述SEQ ID NO.5TCCGAGAAAGACGAGCTA(4)序列SEKDEL所對應(yīng)的編碼序列及其所組成的序列(表1)

權(quán)利要求
1.一種在植物種子、果實或其它組織中高效表達(dá)融合基因的載體，其特征在于該載體以5’至3’依次包含以下元件胚乳特異表達(dá)啟動子或果實特異表達(dá)啟動子或組成型表達(dá)啟動子、人乳鐵蛋白全長編碼cDNA序列和植物內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號肽序列組成的融合基因(hLFSEKDEL)、終止子序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的載體，其特征在于在啟動子側(cè)翼序列和人乳鐵蛋白全長編碼cDNA序列之間有一接頭序列；植物內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號肽的編碼序列與終止子序列之間還有一接頭序列。
3.一種如權(quán)利要求1所述的融合基因，其特征在于融合基因hLFSEKDEL具有SEQ IDNO.3所示的核苷酸序列，以及由SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的融合基因，其特征在于其中的植物內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號肽編碼序列具有SEQ ID NO.5序列及其它相應(yīng)的編碼的核苷酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的融合基因，其特征在于構(gòu)建該融合基因的編碼序列所采用的引物，分別具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
6.一種通過在植物中表達(dá)權(quán)利要求1所述的融合基因從而實現(xiàn)提高植物營養(yǎng)品質(zhì)的方法，其特征在于，它包括步驟(1)將所述的含融合基因hLFSEKDEL的載體利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化植物，獲得基因組中整合有融合基因hLFSEKDEL的愈傷組織；(2)將步驟(1)中所獲得的愈傷組織進(jìn)行分化培養(yǎng)，篩選出表達(dá)該融合基因的轉(zhuǎn)基因植株及其后代，包括植物種子、果實及其它組織如葉；(3)所獲得的轉(zhuǎn)基因植物因其種子、果實及其它組織中含有表達(dá)的人乳鐵蛋白而具有附加的營養(yǎng)價值，可以直接食用或加工成其它營養(yǎng)食品或作為其它食品的添加原料使用。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述植物為高等植物。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述植物為番茄和水稻。
全文摘要
本發(fā)明為人乳鐵蛋白(hLF)全長cDNA編碼序列以及植物內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號肽(SEKDEL)序列組成的融合基因hLFSEKDEL。其中涉及包含所說該融合基因構(gòu)建的利用胚乳特異表達(dá)啟動子或果實特異表達(dá)啟動子或組成型表達(dá)啟動子啟動表達(dá)的植物高效表達(dá)載體。還涉及被所說的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，以及由所說的轉(zhuǎn)化細(xì)胞產(chǎn)生的表達(dá)人乳鐵蛋白的轉(zhuǎn)基因植株及其后代，包括植物種子及植物組織。本發(fā)明還提供了在樣品中檢測人乳鐵蛋白核酸序列和多肽的方法。
文檔編號C12N15/12GK1544641SQ20031010884
公開日2004年11月10日 申請日期2003年11月25日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月25日
發(fā)明者張健, 劉曉軍, 李柱剛, 孫小芬, 龐永珍, 張 健 申請人:復(fù)旦大學(xué)