專利名稱：松材線蟲的微衛(wèi)星擴增引物、檢測方法及檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及一種松材線蟲的微衛(wèi)星擴增引物、檢測方法及檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
自1982年在南京中山陵附近首次發(fā)現(xiàn)松材線蟲病以來，這種松樹的“癌癥”已經(jīng)蔓延到江蘇、安徽、浙江、廣東、湖北、廣西、福建、山東、上海、重慶、江西、湖南、臺灣、香港等14余省市的100多個縣市區(qū)，已有7萬多公頃松林染病，1600萬株松樹死亡，并且發(fā)生范圍正在逐年擴大。不同于其它的森林病蟲害，松樹一旦感染松材線蟲病，長則半年，短則二個月就會死亡。這對于我國南方以馬尾松林為主要組成樹種的森林來說，松材線蟲病造成的危害其嚴(yán)重性不言而喻(白星月，植物病理學(xué)報，16(4)59-62，1993；王喬，中國松材線蟲的流行與治理，69-74，中國林業(yè)出版社，1995)。因此，尋求有效的松材線蟲病控制方法已成為當(dāng)務(wù)之急(楊寶君等，中國松材線蟲的流行與治理，中國林業(yè)出版社，1995；蕭剛?cè)幔袊掷ハx，中國林業(yè)出版社，1992)。
松材線蟲病是一種世界性重大森林疫病，國際檢疫對象，對松林具有毀滅性的破壞。該病防治的關(guān)鍵措施之一是加強病原的檢測，嚴(yán)格控制松材線蟲的擴散與傳播(周建生，森林病蟲通訊，313-25，1997)。然而，松材線蟲的個體非常小，一般的方法難于識別，再加之另一種無毒害性的擬松材線蟲經(jīng)常與松材線蟲同時發(fā)生，嚴(yán)重干擾了對松材線蟲的檢測。因此，有必要建立一套形態(tài)鑒定與分子鑒定相結(jié)合的方法，對松材線蟲進行快速檢測以便于控制松材線蟲病的擴散蔓延。
一旦松材線蟲感染松樹，它們以樹干或樹枝上寄生的有關(guān)真菌和松樹的上皮細(xì)胞為食。但最近的研究表明松材線蟲的取食并非松枯萎病的直接致病原因。真正致命的原因是因為松材線蟲在松樹枝干內(nèi)大量繁殖、堵塞篩管、切斷了水的正常運輸通道而引起松樹缺水枯死(Holdeman Q.The pine woodnematode and the associated pine wilt disease in Japan，Technical Report.1980)。為了防止松材線蟲危害的繼續(xù)擴散，首先需要追蹤松材線蟲的感染源，然后及早切斷其可能的傳播途徑。
松材線蟲并非亞洲本土所產(chǎn)，原產(chǎn)地在北美和歐洲，在20世紀(jì)初因從北美進口木材、木制品以及帶木制包裝箱的貨物而首先被傳入日本(Mamiya Y.In M.J.Wingfield(ed.).pp 59-65.1987；Mamiya Y.J.Nematology20(2)219-226，1988)。在隨后的幾十年內(nèi)，松材線蟲在日本各地肆意流行。僅1979這一年，松材線蟲在日本的危害面積占全國松林的四分之一(LiLiebhold，A.M.，W.L.MacDonald，D.Bergdahl and V.C.Mastro，F(xiàn)or.Sci.Monogr.，301-49.1995)。如今，松材線蟲又?jǐn)U散到中國大陸，臺灣等東南亞地區(qū)，其傳播途徑同樣主要是木材或木制品的進口。通過對日，中，美三地松材線蟲線粒體rRNA的系統(tǒng)進化的分析，證實了在各地采集的樣本是屬于同一種。結(jié)合松材線蟲在各地的發(fā)生史，我們可以斷定松材線蟲正是沿著如上所述的通道傳入中國。沉重的教訓(xùn)告訴我們，嚴(yán)格的木材檢疫和嚴(yán)禁病木的輸入，是防治松材線蟲的第一道防線(楊寶君、高建富，松材萎蔫病防治，中國林業(yè)出版社，1989)。
松材線蟲在森林中是借助松褐天牛的活動，從病樹傳播至健康木(Linit M.J.，J.Nematology 20(2)227-235，1988；Heisuke S.J.Jpn.For.Soc.69492-496，1987)。對松材線蟲和松褐天牛生活史的調(diào)查已揭示了它們在各個發(fā)育階段時的相互關(guān)系。一般，從五月中旬起，病樹中的松材線蟲四齡擴散型幼蟲就會涌向剛羽化出來的松褐天牛成蟲的氣門腔內(nèi)。隨著松褐天牛成蟲脫離病樹，通過取食或產(chǎn)卵傳入健康木上，引起新一輪的松枯萎病。研究證明在日本一條松褐天牛成蟲所攜帶松材線蟲的數(shù)量高達幾十萬條。而在松材線蟲不引起松枯萎病的美國，一條天牛成蟲所攜帶松材線蟲的數(shù)量及攜帶松材線蟲的松褐天牛成蟲的比率，都要低得多。可見，監(jiān)測某地區(qū)天牛成蟲所攜帶松材線蟲的數(shù)量及攜帶松材線蟲的松褐天牛成蟲的比率，可以預(yù)測該地區(qū)松枯萎病的發(fā)生規(guī)模。
對松材線蟲的早期診斷，有著特別重要的意義。有如人的疾病，越是在早期得以診斷，越有希望得到治療。而對那些珍貴的園林松樹林以及有重要文物價值的古松的保護，更需要準(zhǔn)確的早期診斷。只要在松枯萎病的初期檢測到松材線蟲的存在，就能及時采取切實可行的措施，搶救那些面臨絕境的樹木。但是，松枯萎病的發(fā)病缺乏早期癥狀，通常是在松材線蟲的數(shù)量大量增加以至將樹的篩管和樹脂管堵塞后才能發(fā)現(xiàn)初步癥狀。因此，早期診斷急需建立一套快速、精確的檢測技術(shù)，以便在發(fā)病初期就能確診到松材線蟲的存在。
事實上，一些研究人員也進行了這樣的嘗試(王揚、汪來發(fā)等，松材線蟲RAPD規(guī)范化反應(yīng)體系的構(gòu)建第14卷(增刊)，云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1999；張立海、廖金鈴、馮志新，植物病理學(xué)報。31(1)84-89，2001)。但是，他們所建立的方法仍然存在著諸多的問題，特別是靈敏度不高，需要對基因組DNA進行抽提，也不能對一頭線蟲進行鑒定。
綜上所述，建立一套松材線蟲的快速檢測技術(shù)，用于木材的檢疫，災(zāi)情的預(yù)測和早期診斷，是對松材線蟲進行檢疫和防治的關(guān)鍵。目前對松材線蟲的檢測主要根據(jù)外部形態(tài)特征，通常是從感病的樹體中或蟲體中分離線蟲，然后，根據(jù)記載的形態(tài)特征確認(rèn)是否是松材線蟲。除了分類專家外，一般人常常會將鑒定結(jié)果模糊化。而且，在自然界松材線蟲常常與其他線蟲，例如，擬松材線蟲共存。擬松材線蟲無論在形態(tài)，還是在生活環(huán)境都與松材線蟲極為相似，兩者的形態(tài)在幼蟲和雄成蟲時期更是難以區(qū)分。但是擬松材線蟲不會引起松樹的松枯萎病。因此，一種能簡便、快速的區(qū)分松材線蟲與其他非發(fā)病性線蟲是非常必要的。
微衛(wèi)星(Simple Sequence Repeats，簡稱為SSR)DNA多態(tài)性的研究是繼限制性片斷長度多態(tài)型(Restriction Fragment Length Polymorphism，簡稱為RFLP)、隨機擴增DNA多態(tài)型(Random Amplified polymorphic DNA，簡稱為RAPD)之后，近年來發(fā)展起來的第二代分子遺傳標(biāo)記技術(shù)，是指一類由1-6個核苷酸組成的短序列首尾相連重復(fù)多次構(gòu)成的一段DNA，廣泛分布于真核生物基因組中。SSR標(biāo)記信息含量高，覆蓋整個基因組，呈共顯性遺傳；可利用PCR進行分析；與其它DNA分子標(biāo)記相比，SSR標(biāo)記重復(fù)性好，特異性強，而且SSR分析對DNA數(shù)量及純度要求不高；操作方法簡單，即以基因組中SSR兩側(cè)特定短核苷酸序列設(shè)計引物，對基因組DNA進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物進行電泳檢測其多態(tài)性。目前，SSR標(biāo)記技術(shù)已廣泛應(yīng)用于品種鑒定與檢測、群體結(jié)構(gòu)及遺傳多樣性、種質(zhì)資源及育種、基因組作圖等研究中(Lane L，Bargelloni L，and Patranello T.Molecular Ecology111-16，2002)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就在于利用松材線蟲特異的SSR標(biāo)記分析方法，從而提供松材線蟲的特異性微衛(wèi)星擴增引物。
本發(fā)明的另一個目的在于提供一種松材線蟲的分子快速檢測方法。
本發(fā)明的另一個目的在于建立一種松材線蟲的分子快速檢測試劑盒。
為達到上述目的，本發(fā)明根據(jù)以下幾個原則(1)DNA擴增的效率；(2)易于與二聚體區(qū)分；(3)三個不同的擴增長度和(4)相近的Tm溫度，設(shè)計了下列三對松材線蟲的特異性微衛(wèi)星擴增引物，擴增片段長度在110-190bp之間。
(1)正向引物 5’-TTT CTT CTG GCA TGG CAA AG-3’反向引物 5’-AAG ATA TTG AAC GAT CTT TGT GGC-3’(2)正向引物 5’-CTC AAG ACA TTC CGA ATA CC-3’反向引物 5’-TCT GGT ACC ACG CAC GTT TTC-3’
(3)正向引物 5’-AAC GGA AAA GAG TCC TCA CG-3’反向引物 5’-TAG GCC CTC CTT GAC AAA AGC-3’；本發(fā)明的松材線蟲分子快速檢測方法包括以下步驟1)利用以下三對松材線蟲特異性微衛(wèi)星擴增引物對待測樣品進行擴增(1)正向引物 5’-TTT CTT CTG GCA TGG CAA AG-3’反向引物 5’-AAG ATA TTG AAC GAT CTT TGT GGC-3’(2)正向引物 5’-CTC AAG ACA TTC CGA ATA CC-3’反向引物 5’-TCT GGT ACC ACG CAC GTT TTC-3’(3)正向引物 5’-AAC GGA AAA GAG TCC TCA CG-3’反向引物 5’-TAG GCC CTC CTT GAC AAA AGC-3’；2)擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳，根據(jù)110-190bp之間擴增條帶的有無判斷是否為松材線蟲。
本發(fā)明還根據(jù)上述設(shè)計的松材線蟲特異性擴增引物制備了松材線蟲分子的快速檢測試劑盒，其中含有三對特異性微衛(wèi)星擴增引物。
本發(fā)明的松材線蟲快速檢測試劑盒能夠在2.5小時之內(nèi)完成松材線蟲的快速準(zhǔn)確鑒定，精確度在99％以上。同時，本發(fā)明也將對其他外來物種的快速檢測起到積極的作用。
本發(fā)明的松材線蟲的分子快速檢測技術(shù)具有以下優(yōu)點第一、能夠利用微衛(wèi)星引物對松材線蟲進行擴增并克服了其他方法如RAPD和AFLP等穩(wěn)定性差的缺陷；在此之前尚沒有微衛(wèi)星標(biāo)記用于檢測的報道；第二、篩選出的引物是松材線蟲的特異性引物，對擬松材線蟲沒有擴增條帶，對兩種線蟲同時鑒定只需要判斷條帶的有無；第三，無須對模板進行DNA抽提，大大節(jié)省了檢測所需的時間，因此能夠在2.5個小時之內(nèi)完成檢測，而在此之前的所有方法至少需要10小時以上的時間；第四，三對引物對一條線蟲同時擴增能夠保證檢測的準(zhǔn)確性。這樣克服了傳統(tǒng)方法中對多條線蟲進行DNA抽提，可能混入其他線蟲的不足。


圖1為三種微衛(wèi)星引物D、e和f對單頭松材線蟲的PCR擴增圖譜；其中M為Marker，泳道1、4為引物D對單頭松材線蟲的擴增產(chǎn)物，2、5為引物e對單頭松材線蟲的擴增產(chǎn)物，3、6為引物f對單頭松材線蟲的擴增產(chǎn)物。每一個引物對兩頭線蟲擴增顯示重復(fù)的結(jié)果。
圖2為e引物對松材線蟲與擬松材線蟲的特異性PCR擴增圖譜；其中M為Marker；第一到第四泳道為松材線蟲；第五到第八泳道為擬松材線蟲；第九到第十二泳道為松材線蟲；第十三到第十六泳道為松材線蟲；第十七泳道為松材線蟲T4(日本株系)的基因池DNA的PCR產(chǎn)物用于對照。
具體實施例方式
實施例1、PCR擴增采用以下三對松材線蟲特異性微衛(wèi)星擴增引物，在PCR儀(FlexigeneThermal Cycler)上進行擴增引物對PW-f 正向引物 5’-TTT CTT CTG GCA TGG CAA AG-3’反向引物 5’-AAG ATA TTG AAC GAT CTT TGT GGC-3’PW-e 正向引物 5’-CTC AAG ACA TTC CGA ATA CC-3’反向引物 5’-TCT GGT ACC ACG CAC GTT TTC-3’PW-D 正向引物 5’-AAC GGA AAA GAG TCC TCA CG-3’反向引物 5’-TAG GCC CTC CTT GAC AAA AGC-3’按照以下比例配制PCR反應(yīng)體系(10μl)10×緩沖液 1.0μl引物對 0.4μl10mM dNTPs 0.3μldd H2O 2.1μlTaq酶(5U/μl) 0.2μl1頭線蟲DNA稀釋液6.0μl
其中10×PCR反應(yīng)緩沖液的組成如下200mM Tris-HCl；100mM (NH4)2SO4；100mM KCl；1％Triton X-100；20mM MgCl2；pH9.0；PCR反應(yīng)按以下條件進行94℃預(yù)變性5分鐘，然后進入循環(huán)；94℃變性30秒，51℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，共35個循環(huán)；最后72℃再延伸5分鐘。
得到的PCR擴增產(chǎn)物于1.5％Agarose凝膠上電泳檢測。30分鐘后用EB染色，在紫外光下觀察并照相，其結(jié)構(gòu)如圖1所示。
從圖1中可以看出三種引物均能夠?qū)λ刹木€蟲進行檢測。D引物僅擴增出一個條帶，而e引物和f引物的電泳圖片上則顯示出兩個條帶。D引物的擴增結(jié)果是理想的結(jié)果，較易用于結(jié)果的確定。雖然e引物和f引物有兩個條帶，但下面的一個條帶短于110bp，屬于二聚體，不會影響結(jié)果的判斷。這些條帶的長度均在設(shè)計引物的區(qū)間之內(nèi)。在圖1中看到松材線蟲的個體之間擴增條帶深度上會有一些差異，這主要是由于松材線蟲個體極小，在進行模板處理時獲得的模板量會有一些偏差導(dǎo)致。但這些差異也不會影響到對擴增結(jié)果的判斷。此外，由于三對引物均能夠?qū)λ刹木€蟲進行檢測，所以任選其中的一對或兩對也能達到同樣的效果。
實施例2、松材線蟲與擬松材線蟲的對比檢測采用實施例2的PCR擴增體系和反應(yīng)條件分別對松材線蟲和擬松材線蟲進行擴增，擴增產(chǎn)物于1.5％Agarose凝膠上電泳檢測。30分鐘后用EB染色，在紫外光下觀察并照相，其結(jié)果如圖2所示。
由圖2可知，在110bp和147bp之間出現(xiàn)了擴增條帶，這與設(shè)計引物時所考慮的長度一致。擴增產(chǎn)物最下面的條帶是二聚體，它們的長度小于60bp，這對于擴增產(chǎn)物的判斷沒有影響。如圖所示，e引物在單頭松材線蟲的擴增中獲得了預(yù)期的條帶，而擬松材線蟲(5-8泳道)則沒有擴增條帶。其他的多次重復(fù)擴增(9-16泳道)中，雖然條帶深淺存在著差異，但不會影響對擴增結(jié)果的判斷。條帶深淺的差異很可能是由于線蟲體內(nèi)DNA抽提量的差異所引起。
實施例3、檢測試劑盒制備松材線蟲分子的快速檢測試劑盒，其中含有下列松材線蟲特異性擴增引物，可以是任意一對、兩對或全部三對引物對PW-f 正向引物 5’-TTT CTT CTG GCA TGG CAA AG-3’反向引物 5’-AAG ATA TTG AAC GAT CTT TGT GGC-3’PW-e 正向引物 5’-CTC AAG ACA TTC CGA ATA CC-3’反向引物 5’-TCT GGT ACC ACG CAC GTT TTC-3’PW-D 正向引物 5’-AAC GGA AAA GAG TCC TCA CG-3’反向引物 5’-TAG GCC CTC CTT GAC AAA AGC-3’利用試劑盒中的松材線蟲特異性微衛(wèi)星擴增引物對待測樣品進行擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳后，根據(jù)110-190bp之間擴增條帶的有無可以判斷樣品是否為松材線蟲。
權(quán)利要求
1.一種松材線蟲的特異性微衛(wèi)星擴增引物，其特征在于，可以選自以下任意一對引物序列(1)正向引物 5’-TTT CTT CTG GCA TGG CAA AG-3’反向引物 5’-AAG ATA TTG AAC GAT CTT TGT GGC-3’(2)正向引物 5’-CTC AAG ACA TTC CGA ATA CC-3’反向引物 5’-TCT GGT ACC ACG CAC GTT TTC-3’(3)正向引物 5’-AAC GGA AAA GAG TCC TCA CG-3’反向引物 5’-TAG GCC CTC CTT GAC AAA AGC-3’
2.一種松材線蟲的分子快速檢測方法，其特征在于包括以下步驟A、利用以下三對松材線蟲特異性微衛(wèi)星擴增引物對待測樣品進行PCR擴增(1)正向引物 5’-TTT CTT CTG GCA TGG CAA AG-3’反向引物 5’-AAG ATA TTG AAC GAT CTT TGT GGC-3’(2)正向引物 5’-CTC AAG ACA TTC CGA ATA CC-3’反向引物 5’-TCT GGT ACC ACG CAC GTT TTC-3’(3)正向引物 5’-AAC GGA AAA GAG TCC TCA CG-3’反向引物 5’-TAG GCC CTC CTT GAC AAA AGC-3’；B、擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳，根據(jù)110-190bp之間擴增條帶的有無判斷是否為松材線蟲。
3.如權(quán)利要求2所述的檢測方法，其特征在于，所述步驟A的PCR擴增的體系為10×緩沖液 1.0μl引物對 0.4μl10mM dNTPs 0.3μldd H2O 2.1μlTaq酶(5U/μl) 0.2μl1頭線蟲DNA稀釋液6.0μl。
4.如權(quán)利要求2所述的檢測方法，其特征在于，所述步驟A的PCR擴增的條件為94℃預(yù)變性5分鐘，然后進入循環(huán)；94℃變性30秒，51℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，共35個循環(huán)；最后72℃再延伸5分鐘。
5.如權(quán)利要求2所述的檢測方法，其特征在于，所述步驟B的凝膠電泳采用1.5％Agarose凝膠電泳。
6.如權(quán)利要求2-5任一項所述的檢測方法，其特征在于，PCR擴增的引物也可以是任選其中的一對或兩對。
7.一種松材線蟲的分子快速檢測試劑盒，其特征在于含有以下三對松材線蟲特異性微衛(wèi)星擴增引物(1)正向引物5’-TTT CTT CTG GCA TGG CAA AG-3’反向引物5’-AAG ATA TTG AAC GAT CTT TGT GGC-3’(2)正向引物5’-CTC AAG ACA TTC CGA ATA CC-3’反向引物5’-TCT GGT ACC ACG CAC GTT TTC-3’(3)正向引物5’-AAC GGA AAA GAG TCC TCA CG-3’反向引物5’-TAG GCC CTC CTT GAC AAA AGC-3’。
8.如權(quán)利要求7所述的檢測試劑盒，其特征在于也可以只含有三對引物中的任意一對或兩對。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種松材線蟲的特異性微衛(wèi)星擴增引物，以及在引物基礎(chǔ)上建立的松材線蟲的分子快速檢測方法，具體地說是利用松材線蟲特異性DNA微衛(wèi)星擴增引物，對待測樣品進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳后，根據(jù)擴增條帶的有無來確認(rèn)是否是松材線蟲。本發(fā)明同時還提供了一種松材線蟲的檢測試劑盒。本發(fā)明的特點是能夠?qū)σ粭l線蟲進行鑒定，無需對線蟲的DNA進行抽提；所用的鑒定試劑形成一個試劑盒。在獲得線蟲之后，鑒定工作能夠在2.5個小時之內(nèi)完成。
文檔編號C12Q1/68GK1546686SQ20031010937
公開日2004年11月17日 申請日期2003年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月12日
發(fā)明者黃勇平, 周志華, 王四寶, 司勝利 申請人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院