專利名稱：非抗性篩選dna疫苗載體及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種DNA疫苗載體以及構(gòu)建的方法。
背景技術(shù)：
DNA疫苗自1990年被發(fā)現(xiàn)以來在人類醫(yī)學(xué)和動物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域已取得很大的進展，作為第三代疫苗，它可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生細胞免疫和體液免疫，具有制備相對簡單，運輸保存容易，可方便構(gòu)建多價疫苗和加入多種免疫佐劑分子等優(yōu)點。但限制其應(yīng)用的一個主要問題是“安全性問題”。目前商品化的DNA疫苗載體中均含有抗生素抗性基因作為選擇性標記，而細菌的抗生素耐藥性問題日益嚴重，已成為全球性共同關(guān)注的問題，因此DNA疫苗上抗生素抗性基因成為阻礙DNA疫苗發(fā)展和大規(guī)模應(yīng)用的一大障礙。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于發(fā)明一種無選擇性的DNA疫苗載體。
本發(fā)明具有以下特征載體全長3114bp，其序列為gactcttcgc gatgtacggg ccagatatac gcgttgacat tgattattga ctagttatta 60atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata 120acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat 180aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga 240ctatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc 300ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt 360atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat 420gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag 480tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc 540aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga 600ggtctatata agcagagctc tctggctaac tagagaaccc actgcttact ggcttatcga 660aattaatacg actcactata gggagaccca agctggctag cgtttaaact taagcttggt 720accgagctcg gatccactag tccagtgtgg tggaattctg cagatatcca gcacagtggc 780ggccgctcga gtctagaggg cccgtttaaa cccgctgatc agcctcgact gtgccttcta 840gttgccagcc atctgttgtt tgcccctccc ccgtgccttc cttgaccctg gaaggtgcca 900ctcccactgt cctttcctaa taaaatgagg aaattgcatc gcattgtctg agtaggtgtc 960
attctattct ggggggtggg gtggggcagg acagcaaggg ggaggattgg gaagacaata 1020gcaggcatgc tggggatgcg gtgggctcta tggcttctac tgggcggttt tatggacagc 1080aagcgaaccg gaattgccag ctggcacatc tctttgcagg aaaaaaacgc tatgaaaaat 1140gttggtttta tcggctggcg cggaatggtc ggctctgttc tcatgcaacg catggtagag 1200gagcgcgatt tcgacgctat tcgccctgtt ttcttttcta cctcccagtt tggacaggcg 1260gcgcccacct tcggcgacac ctccaccggc acgctacagg acgcttttga tctggatgcg 1320ctaaaagcgc tcgatatcat cgtgacctgc cagggcggcg attataccaa cgaaatttat 1380ccaaagctgc gcgaaagcgg atggcagggt tactggattg atgcggcttc tacgctgcgc 1440atgaaagatg atgccattat tattctcgac ccggtcaacc aggacgtgat taccgacggc 1500ctgaacaatg gcgtgaagac ctttgtgggc ggtaactgta ccgttagcct gatgttgatg 1560tcgctgggcg gtctctttgc ccataatctc gttgactggg tatccgtcgc gacctatcag 1620gccgcctccg gcggcggcgc gcgccatatg cgcgagctgt taacccagat gggtcagttg 1680tatggccatg tcgccgatga actggcgacg ccgtcttccg caattcttga tattgaacgc 1740aaagttacgg cattgacccg cagcggcgag ctgccggttg ataactttgg cgtaccgctg 1800gcgggaagcc tgatcccctg gatcgacaaa cagctcgata acggccagag ccgcgaagag 1860tggaaaggcc aggcggaaac caacaagatt ctcaatactg cctctgtgat tccggttgat 1920ggtttgtgtg tgcgcgtcgg cgcgctgcgc tgtcacagcc aggcgttcac catcaagctg 1980aaaaaagagg tatccattcc gacggtggaa gaactgctgg cggcacataa tccgtgggcg 2040aaagtggtgc cgaacgatcg tgatatcact atgcgcgaat taaccccggc ggcggtgacc 2100ggcacgttga ctacgccggt tggtcgtctg cgtaagctga acatggggcc agagttcttg 2160tcggcgttta ccgtaggcga ccagttgtta tggggcgccg ccgagccgct gcgtcgaatg 2220ctgcgccagt tggcgtagtg gctattgcag cgcttatcgg gcctgcgtgt ggttctgtag 2280gccggataag gcgcgtcagc gccgccatcc ggcggggaaa tttgtgttaa accaggggtg 2340catcgtcacc ctttttttgc gtaatacagg agtaaacgca gatgtcatga ccaaaatccc 2400ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta gaaaagatca aaggatcttc 2460ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc 2520agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt tttccgaagg taactggctt 2580cagcagagcg cagataccaa atactgtcct tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt 2640caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc 2700tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca agacgatagt taccggataa 2760ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac 2820ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc ttcccgaagg 2880gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga 2940gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact 3000tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa 3060cgcggccttt ttacggttcc tgggcttttg ctggcctttt gctcacatgt tctt
另外，本發(fā)明還對具有上述特征的DNA疫苗載體提供構(gòu)建方法，即將擴增的鼠傷寒沙門氏菌asd用pVUII和PagI雙酶切；用pVUII和PagI雙酶切質(zhì)粒pVAX1，去除卡那霉素抗性基因，然后將asd基因與去除卡那霉素抗性基因的載體進行連接。
本發(fā)明采用染色體-質(zhì)粒平衡致死系統(tǒng)代替抗生素抗性基因來作為DNA疫苗擴增的選擇性標記，構(gòu)建新型非抗性篩選DNA疫苗載體，與質(zhì)粒pVAX1相比，缺失其中的卡那霉素抗性基因，取而代之的是長度為1281bp的鼠傷寒沙門氏菌asd基因，從而避免了抗生素抗性基因的潛在性危險問題。
具體實施例1、鼠傷寒沙門氏菌asd基因的擴增鼠傷寒沙門氏菌YZ1392(本室分離)用1mL磷酸鹽緩沖液(PBS)懸浮，濃度為109CFU/mL，100℃加熱10分鐘，12000rpm離心5分鐘，取上清液5μL進行PCR擴增反應(yīng)，采用引物如下正義5’aaacag ctggca cat crc ttt gca gga a 3’反義5’gcctca tgacat ctg cgt tta crc ctg t 3’正義和反義引物分別含pVU II和Pag I酶切位點(下劃線標出)。PCR反應(yīng)體系為50μL細菌裂解上清5μL10×緩沖液5μL上游引物(50μmol/L)0.5μL下游引物(50μmol/L)0.5μLTaq酶(3U/μL)0.5μL4種dNTP混合物(2.5mmol/L)4μL超純水35.5μLPCR反應(yīng)條件為94℃ 40S，57℃ 40S，72℃ 60S，共30個循環(huán)，結(jié)束后用濃度為0.8％瓊脂糖電泳分離，回收長1281bp的asd基因。
2、新DNA疫苗載體的構(gòu)建回收的asd基因用pVU II和Pag I雙酶切，同時用pVU II和Pag I雙酶切質(zhì)粒pVAX1，去除卡那霉素抗性基因，然后將asd基因與載體進行連接反應(yīng)，體系如下asd基因(pVU II-Pag I)3μLpVAX1(pVU II-Pag I)1μL連接緩沖液1μLT4 DNA連接酶(1U/μL)1μL超純水4μL
4℃連接16小時，然后轉(zhuǎn)化asd基因缺失型大腸桿菌X6212，涂布LB平板，37℃培養(yǎng)24小時后，挑取生長菌落LB液體培養(yǎng)，提質(zhì)粒鑒定。
新質(zhì)粒先采用酶切鑒定。采用pVU II和Pag I雙酶切，0.8％瓊脂糖電泳觀察到長約1.3kb的目的條帶，然后將新質(zhì)粒的插入序列進行測序，測序引物分別是5’aaacag ctggca cat ctc ttt gca gga a 3’5’caggcatgctggggatgog 3’5’tcgccgatgaactggcgac 3’測序證實原來質(zhì)粒中的卡那霉素基因已被刪除，長1281bp的asd基因成功連入，形成長3114bp的非抗性篩選DNA疫苗載體(以下簡稱pYZU)。
應(yīng)用實驗1、攜帶紅色熒光蛋白(DsRed)基因的pYZU-DsRed體外轉(zhuǎn)染COS-7細胞結(jié)果從攜帶紅色熒光蛋白基因的質(zhì)粒pDsRed-Express(BD Biosciences Clontech公司)上切下DsRed基因，裝入pYZU和pVAX1的相應(yīng)位點得pYZU-DsRed和pVAX-DsRed(BamH I-EcoR I)，然后進行體外轉(zhuǎn)染實驗，每個質(zhì)粒轉(zhuǎn)染三個孔的細胞。
轉(zhuǎn)染前一天接種4×105的COS-7細胞至直徑35mm的培養(yǎng)皿中，轉(zhuǎn)染當(dāng)天先用100微升無血清，無抗生素DMEM(由GIBCOBRL公司生產(chǎn)的一種細胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基，英文全稱為Dulbecco’s Modified)培養(yǎng)基稀釋1.5微克的質(zhì)粒，然后加入10微升PolyFect(由QIAGEN公司生產(chǎn)的一種轉(zhuǎn)染試劑，英文全稱為PolyFect&reg；Transfection)轉(zhuǎn)染試劑，混勻，室溫放置5-10分鐘，再加入600微升完全DMEM培養(yǎng)基，混勻，直接轉(zhuǎn)至經(jīng)PBS洗滌過含1.5毫升完全DMEM培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，37℃5％CO2培養(yǎng)24小時，胰酶消化后進行流式細胞儀檢測，發(fā)紅色熒光細胞占總細胞的比例判為轉(zhuǎn)染效率。
實驗結(jié)果顯示pYZU-DsRed轉(zhuǎn)染COS-7細胞的轉(zhuǎn)染效率為54.1±4.5％，對照組pVAX-DsRed轉(zhuǎn)染效率為52.3±3.2％，兩者轉(zhuǎn)染效率類似。
2、攜帶乙肝病毒表面抗原(HBsAg)基因的pYZU-HBsAg肌肉注射途徑免疫小鼠實驗結(jié)果從質(zhì)粒pRc/CMV-HBs(S)(Dr.Robert Whalen贈送)上用Kpn I和Not I切下HBsAg基因裝入pYZU和pVAX1的相應(yīng)位點得pYZU-HBsAg和pVAX-HBsAg。8周齡BALB/c小鼠在第0，4周分別在雙側(cè)股四頭肌注射100微升PBS溶解的100微克的質(zhì)粒(每側(cè)50微升)。分別于第在首免后的第0，4，8周小鼠眼眶靜脈竇采血，分離的血清用間接ELISA法(廈門新創(chuàng)公司試劑盒)測定HBsAb抗體。結(jié)果顯示以pYZU為載體的DNA疫苗可誘生比pVAX1為載體的DNA疫苗稍強的抗體免疫應(yīng)答。
附表pYZU-HBsAg質(zhì)粒免疫小鼠后血清抗體滴度水平免疫組 編號零周 第四周第八周pYZU-HBsAg 1 ＜1∶51∶3201∶12802 ＜1∶51∶20 1∶1603 ＜1∶51∶3201∶6404 ＜1∶51∶80 1∶3205 ＜1∶51∶10 1∶806 ＜1∶51∶3201∶12807 ＜1∶51∶1601∶6408 ＜1∶51∶80 1∶320pVAX-HBsAg 1 ＜1∶51∶80 1∶6402 ＜1∶51∶20 1∶803 ＜1∶51∶20 1∶3204 ＜1∶51∶80 1∶3205 ＜1∶51∶10 1∶806 ＜1∶51∶1601∶6407 ＜1∶5＜1∶5＜1∶58 ＜1∶51∶20 1∶160空載體組pYZU1-6＜1∶5＜1∶5＜1∶5由上述實驗得出1、DNA疫苗載體中用天冬氨酸-β-半醛脫氫酶(Asd)基因代替了抗生素抗性基因，新型非抗性篩選DNA疫苗載體質(zhì)粒避免了抗生素抗性基因的潛在性危險。
2、體外和體內(nèi)實驗表明pYZU具有與原載體pVAX1相似或稍強表達外源基因和激發(fā)機體免疫應(yīng)答的能力，為該載體推廣使用奠定了堅實的基礎(chǔ)。
權(quán)利要求
1.非抗性篩選DNA疫苗載體，其特征在于該載體全長3114bp，其序列為gactcttcgc gatgtacggg ccagatatac gcgttgacat tgattattga ctagttatta 60atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata 120acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat 180aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga 240ctatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc 300ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt 360atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat 420gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag 480tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc 540aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga 600ggtctatata agcagagctc tctggctaac tagagaaccc actgcttact ggcttatcga 660aattaatacg actcactata gggagaccca agctggctag cgtttaaact taagcttggt 720accgagctcg gatccactag tccagtgtgg tggaattctg cagatatcca gcacagtggc 780ggccgctcga gtctagaggg cccgtttaaa cccgctgatc agcctcgact gtgccttcta 840gttgccagcc atctgttgtt tgcccctccc ccgtgccttc cttgaccctg gaaggtgcca 900ctcccactgt cctttcctaa taaaatgagg aaattgcatc gcattgtctg agtaggtgtc 960attctattct ggggggtggg gtggggcagg acagcaaggg ggaggattgg gaagacaata 1020gcaggcatgc tggggatgcg gtgggctcta tggcttctac tgggcggttt tatggacagc 1080aagcgaaccg gaattgccag ctggcacatc tctttgcagg aaaaaaacgc tatgaaaaat 1140gttggtttta tcggctggcg cggaatggtc ggctctgttc tcatgcaacg catggtagag 1200gagcgcgatt tcgacgctat tcgccctgtt ttcttttcta cctcccagtt tggacaggcg 1260gcgcccacct tcggcgacac ctccaccggc acgctacagg acgcttttga tctggatgcg 1320ctaaaagcgc tcgatatcat cgtgacctgc cagggcggcg attataccaa cgaaatttat 1380ccaaagctgc gcgaaagcgg atggcagggt tactggattg atgcggcttc tacgctgcgc 1440atgaaagatg atgccattat tattctcgac ccggtcaacc aggacgtgat taccgacggc 1500ctgaacaatg gcgtgaagac ctttgtgggc ggtaactgta ccgttagcct gatgttgatg 1560tcgctgggcg gtctctttgc ccataatctc gttgactggg tatccgtcgc gacctatcag 1620gccgcctccg gcggcggcgc gcgccatatg cgcgagctgt taacccagat gggtcagttg 1680tatggccatg tcgccgatga actggcgacg ccgtcttccg caattcttga tattgaacgc 1740aaagttacgg cattgacccg cagcggcgag ctgccggttg ataactttgg cgtaccgctg 1800gcgggaagcc tgatcccctg gatcgacaaa cagctcgata acggccagag ccgcgaagag 1860tggaaaggcc aggcggaaac caacaagatt ctcaatactg cctctgtgat tccggttgat 1920ggtttgtgtg tgcgcgtcgg cgcgctgcgc tgtcacagcc aggcgttcac catcaagctg 1980aaaaaagagg tatccattcc gacggtggaa gaactgctgg cggcacataa tccgtgggcg 2040aaagtggtgc cgaacgatcg tgatatcact atgcgcgaat taaccccggc ggcggtgacc 2100ggcacgttga ctacgccggt tggtcgtctg cgtaagctga acatggggcc agagttcttg 2160tcggcgttta ccgtaggcga ccagttgtta tggggcgccg ccgagccgct gcgtcgaatg 2220ctgcgccagt tggcgtagtg gctattgcag cgcttatcgg gcctgcgtgt ggttctgtag 2280gccggataag gcgcgtcagc gccgccatcc ggcggggaaa tttgtgttaa accaggggtg 2340catcgtcacc ctttttttgc gtaatacagg agtaaacgca gatgtcatga ccaaaatccc 2400ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta gaaaagatca aaggatcttc 2460ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc 2520agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt tttccgaagg taactggctt 2580cagcagagcg cagataccaa atactgtcct tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt 2640caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc 2700tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca agacgatagt taccggataa 2760ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac 2820ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc ttcccgaagg 2880gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga 2940gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact 3000tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa 3060cgcggccttt ttacggttcc tgggcttttg ctggcctttt gctcacatgt tctt。
2.具有權(quán)利要求1所述序列的非抗性篩選DNA疫苗載體的構(gòu)建方法，其特征在于將擴增的鼠傷寒沙門氏菌asd用pVUII和PagI雙酶切；用pVUII和PagI雙酶切質(zhì)粒pVAX1，去除卡那霉素抗性基因；然后將asd基因與去除卡那霉素抗性基因的載體進行連接。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種DNA疫苗載體以及構(gòu)建的方法，將擴增的鼠傷寒沙門氏菌asd用pVUII和PagI雙酶切；用pVUII和PagI雙酶切質(zhì)粒pVAX1，去除卡那霉素抗性基因；然后將asd基因與去除卡那霉素抗性基因的載體進行連接，構(gòu)成長度為3114bp的新型非抗性篩選DNA疫苗載體。本發(fā)明采用染色體－質(zhì)粒平衡致死系統(tǒng)代替抗生素抗性基因來作為DNA疫苗擴增的選擇性標記，構(gòu)建新型非抗性篩選DNA疫苗載體，從而避免了抗生素抗性基因的潛在性危險問題。
文檔編號C12N15/12GK1546669SQ200310112640
公開日2004年11月17日 申請日期2003年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月10日
發(fā)明者焦新安, 張曉明, 潘志明, 張曉榮, 劉秀梵 申請人:揚州大學(xué)