專利名稱：一種固定化酵母細胞的微膠囊制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微膠囊制備方法，具體地說涉及一種固定化酵母細胞的微膠囊的制備方法。
背景技術(shù)：
酵母細胞固定化技術(shù)最早主要用在釀造工業(yè)，但隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，酵母細胞作為基因重組的宿主細胞優(yōu)勢日益體現(xiàn)，因此，研究酵母細胞的固定化具有新的應(yīng)用價值。目前，應(yīng)用較多的是海藻酸鹽固定化[文獻1L.Kurillova，P.Gemeiner，A.Vikartovska，H.Mikova，M.Rosenbergand M.Ilavsky.Calcium pectate gel beads for cell entrapment.6.morphologyof stabilized and hardened calcium pectate gel beads with cells forimmobilized biotechnology.J.microencapsulation，2000，17(3)279-296]。但仍然存在許多問題，如海藻酸鈣顆粒較大，影響溶質(zhì)在固定化細胞凝膠中的擴散[文獻2Viktor A.Nedovic，Bofana Obradovic，Ida Leskoosek-Cukalovic，Oliivera Trifunovic，Radofica Pesic，Branko Bugarski.Electrostaticgeneration of alginate microbeads loaded with brewing yeast.Processbiochemistry 2001，37(1)17-22]；細胞泄漏[文獻3Yoshimitsu Uemura，NaokiHamakawa，Hidekazu Yoshizawa，Hiroki Ando，Kazuya Ijichi，and Yasuo Hatate.Effect of calcium alginate coating on the performance of immobilized yeastcells in calcium alginate beads.Chem.Eng.Comm.2000，1771-14]等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對上述問題提出在制備出小粒徑海藻酸鈣微膠珠的基礎(chǔ)上，進一步處理制備成一種新型的酵母細胞固定化技術(shù)-海藻酸鈉-聚賴氨酸/殼聚糖微膠囊。與傳統(tǒng)的海藻酸鈣固定化技術(shù)相比，本發(fā)明用大功率微膠囊制備儀[文獻4馬小軍，任吉倫，何洋。大功率高壓脈沖微膠囊制備儀。中國發(fā)明專利00253538.6]制備出粒徑在500μm以下的微膠珠，產(chǎn)量為700ml/h，再在膠珠表面通過離子絡(luò)合反應(yīng)瞬間形成一層聚賴氨酸/殼聚糖微膠囊膜，最后用檸檬酸鈉溶液將微膠囊內(nèi)部海藻酸鈣凝膠液化，使微膠囊內(nèi)成液體環(huán)境。本發(fā)明的制備工藝特點是①條件溫和，制備過程中酵母細胞損失很少，細胞活性保持100％；②由于聚賴氨酸/殼聚糖微膠囊膜的存在，與海藻酸鈣膠珠相比，酵母細胞在培養(yǎng)過程中細胞泄漏明顯減少；③由于微膠囊粒徑小，降低了溶質(zhì)的擴散距離；④微膠囊內(nèi)為液體環(huán)境，有利于溶質(zhì)在固定化細胞中的擴散；⑤選用的成膜材料綜合了聚賴氨酸成膜強度高和殼聚糖價格低廉的優(yōu)勢；⑥用大功率微膠囊制備儀可以實現(xiàn)大規(guī)模制備酵母細胞的固定化載體。
本發(fā)明的原理是在原有海藻酸鹽固定化細胞的基礎(chǔ)上，通過大功率微膠囊制備儀，使均勻混合有酵母細胞的海藻酸鈉溶液在高壓靜電場作用下，形成粒徑在100-500μm可控，分布均勻的液滴，與鈣溶液固化形成微膠珠。并在微膠珠表面通過離子絡(luò)合反應(yīng)瞬間形成一層聚賴氨酸/殼聚糖微膠囊膜。再用檸檬酸鈉溶液置換出海藻酸鈣凝膠中的鈣，使微膠囊內(nèi)液化成液體環(huán)境(見圖1)。
本發(fā)明的制備方法中，其主要制步驟為1)通過大功率微膠囊制備儀，將均勻混合有酵母細胞的海藻酸鈉溶液在高壓靜電場作用下，形成液滴；所述的酵母細胞包括啤酒酵母、熱帶假絲酵母、畢氏酵母等各種用于食品加工業(yè)的酵母細胞及各種能夠表達外源基因的基因工程酵母細胞。
所述的海藻酸鈉濃度在8-30g/L；所述的液滴其粒徑在100-500μm可控，分布均勻，且具有良好的單分散性。
2)步驟1的液滴與鈣溶液固化形成海藻酸鈣微膠珠，并與聚賴氨酸/殼聚糖溶液反應(yīng)成膜，在微膠珠表面形成一層聚賴氨酸/殼聚糖微膠囊膜；所述氯化鈣濃度在0.05-0.3mol/L；所述聚賴氨酸/殼聚糖溶液中，聚賴氨酸分子量在1-10萬，聚賴氨酸溶液濃度在0.1-10g/L；殼聚糖的脫乙酰度＞90％，粘均分子量在1-15萬，殼聚糖溶液濃度在1-10g/L，pH在4.5-7.4；所述反應(yīng)成膜時間在5-60分鐘，膜厚在5-80μm范圍內(nèi)可控。
3)用檸檬酸鈉溶液將步驟2制得的微膠囊內(nèi)部海藻酸鈣凝膠液化，使微膠囊內(nèi)成液體環(huán)境；所述檸檬酸鈉溶液濃度在0.01-0.10mol/L。
本發(fā)明提供的方法是在全生理條件下制備，其制備過程條件溫和pH5.0-7.4；4-30℃；無剪切及振蕩。制備過程中酵母細胞活性100％保持。
本發(fā)明系統(tǒng)中制備的固定化酵母細胞的聚賴氨酸/殼聚糖微膠囊在培養(yǎng)過程中細胞的泄漏率低于10％。
本發(fā)明制備的微膠囊粒徑小于通常的固定化載體，且微膠囊內(nèi)部為液體環(huán)境，極大改善了固定化載體的傳質(zhì)問題，使培養(yǎng)過程中囊中心區(qū)的酵母細胞仍然存活，保證酵母細胞的有效利用率。而且，由于微膠囊在原有海藻酸鈣膠珠的基礎(chǔ)上覆蓋一層聚賴氨酸/殼聚糖微膠囊膜，減少了培養(yǎng)過程中酵母細胞泄漏現(xiàn)象的發(fā)生，提高酵母細胞固定化發(fā)酵的產(chǎn)率。另外，本發(fā)明提供的制備方法其產(chǎn)率高達700ml/h，初步實現(xiàn)規(guī)模化。


圖1為本發(fā)明的制備過程示意圖。
圖2a為本發(fā)明制備的包埋有酵母細胞的海藻酸鈉-聚賴氨酸/殼聚糖微膠囊顯微鏡照片。
圖2b為本發(fā)明制備的包埋有酵母細胞的海藻酸鈉-聚賴氨酸/殼聚糖微膠囊培養(yǎng)24小時后的顯微鏡照片。
具體實施例方式
例1請參照圖1，將懸浮培養(yǎng)處于對數(shù)生長期的酵母菌GS115離心收集菌體，與15g/L的海藻酸鈉溶液均勻混合。在大功率微膠囊制備儀的高壓電場作用下滴入100mmol/L的氯化鈣溶液中進行凝膠化反應(yīng)30分鐘，制備出粒徑在300μm海藻酸鈣凝膠珠，然后與0.5g/L的聚賴氨酸和5g/L殼聚糖的混合溶液成膜反應(yīng)10分鐘，生理鹽水清洗3遍后55mmol/L檸檬酸鈉溶液液化10分鐘，生理鹽水清洗3遍后制備出聚賴氨酸/殼聚糖微囊化酵母菌，囊膜厚為65μm。整個制備過程均在生理條件下完成，制備過程中酵母細胞存活率100％保持。
例2將配制的用于制備微膠囊膜的聚賴氨酸及殼聚糖溶液分別與酵母細胞充分接觸30分鐘后，稀釋平板法測定其對酵母細胞活性的影響，結(jié)果表明與對照組相比與聚賴氨酸及殼聚糖接觸后的活酵母細胞數(shù)未減少，證實聚賴氨酸及殼聚糖溶液對酵母細胞活性無影響。
例3將制備好的含有酵母細胞的海藻酸鈉-聚賴氨酸/殼聚糖與海藻酸鈣微膠珠置于YPD培養(yǎng)液中，搖瓶培養(yǎng)，28℃，180rpm，培養(yǎng)24小時后(參見圖2a和圖2b)，計算酵母細胞泄漏率。結(jié)果表明，海藻酸鈉-聚賴氨酸/殼聚糖微膠囊組細胞的泄漏率比海藻酸鈣微膠珠組降低3倍以上。
比較例文獻2采用靜電液滴法制備出粒徑在250-2000μm的固定化酵母細胞的海藻酸鈣膠珠。雖然解決了小粒徑問題，但產(chǎn)率低(僅25.2ml/h)。本發(fā)明制備的固定化酵母細胞的海藻酸鈣膠珠粒徑在100-500μm范圍可控，且制備效率高達700ml/h。
文獻3通過制備雙層海藻酸鈣凝膠來減少細胞泄漏，雖然在解決細胞泄漏問題上有一定的效果，但制備的膠珠粒徑在3mm，大粒徑載體在培養(yǎng)過程中，載體中心部分的酵母細胞由于受傳質(zhì)阻力的影響無法獲得充分的營養(yǎng)供應(yīng)。本發(fā)明制備的固定化酵母細胞的海藻酸鈉-聚賴氨酸/殼聚糖微膠囊既減少了細胞泄漏，又通過小粒徑(可控制在100-500μm范圍)和內(nèi)部液體環(huán)境解決了傳質(zhì)問題。
權(quán)利要求
1.一種固定化酵母細胞的微膠囊制備方法，其主要步驟為a)通過大功率微膠囊制備儀，將均勻混合有酵母細胞的海藻酸鈉溶液在高壓靜電場作用下，形成液滴；b)步驟a的液滴與鈣溶液固化形成海藻酸鈣微膠珠，并與聚賴氨酸/殼聚糖溶液反應(yīng)成膜，在微膠珠表面形成一層聚賴氨酸/殼聚糖微膠囊膜；c)用檸檬酸鈉溶液將步驟b制得的微膠囊內(nèi)部海藻酸鈣凝膠液化，使微膠囊內(nèi)成液體環(huán)境；所述海藻酸鈉濃度在8-30g/L；所述氯化鈣濃度在0.05-0.3mol/L；所述聚賴氨酸分子量在1-10萬，聚賴氨酸溶液濃度在0.1-10g/L；所述殼聚糖的脫乙酰度＞90％，粘均分子量在1-15萬，殼聚糖溶液濃度在1-10g/L，pH在4.5-7.4；所述檸檬酸鈉溶液濃度在0.01-0.10mol/L。
2.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟a中所述的酵母細胞包括啤酒酵母、熱帶假絲酵母、畢氏酵母及基因工程酵母菌。
3.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟a中所述的液滴其粒徑在100-500μm。
4.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟b中所述的海藻酸鈣凝膠珠與聚賴氨酸/殼聚糖溶液反應(yīng)成膜時間在5-60分鐘。
5.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟b中所述的聚賴氨酸/殼聚糖微膠囊膜厚為5-80μm。
全文摘要
一種固定化酵母細胞的海藻酸鈉－聚賴氨酸/殼聚糖微膠囊制備方法，在原有海藻酸鹽固定化細胞的基礎(chǔ)上，通過大功率微膠囊制備儀，使均勻混合有酵母細胞的海藻酸鈉溶液在高壓靜電場作用下，形成粒徑在100－500μm可控，分布均勻的液滴，與鈣溶液固化形成微膠珠。并在微膠珠表面通過離子絡(luò)合反應(yīng)瞬間形成一層聚賴氨酸/殼聚糖微膠囊膜。再用檸檬酸鈉溶液置換出海藻酸鈣凝膠中的鈣，使微膠囊內(nèi)液化成液體環(huán)境。本發(fā)明是在全生理條件下制備，其制備過程條件溫和pH5.0－7.4；4－30℃；無剪切及振蕩。制備過程中酵母細胞活性100％保持。在培養(yǎng)過程中細胞的泄漏率低于10％。
文檔編號C12N11/02GK1616657SQ20031011815
公開日2005年5月18日 申請日期2003年11月10日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月10日
發(fā)明者馬小軍, 于煒婷, 雄鷹 申請人:中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所