專利名稱：一種固定化酵母細(xì)胞的微膠囊制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微膠囊制備方法，具體地說涉及一種固定化酵母細(xì)胞的微膠囊的制備方法。
背景技術(shù)：
細(xì)胞固定化技術(shù)是早在20世紀(jì)70年代發(fā)展起來的一門新興的生物技術(shù)[文獻(xiàn)1Kierstan M，Bucke C.The immobilization of microbial cells，subcellular organelles，and enzymes in calcium alginate gels.BiotechnolBioeng 1977 Mar；19(3)387-97]，是現(xiàn)代生物工程領(lǐng)域的重要內(nèi)容之一。其實質(zhì)就是利用物理或化學(xué)方法將游離細(xì)胞固定在一定的空間內(nèi)，作為生物催化劑而連續(xù)使用。細(xì)胞固定化技術(shù)優(yōu)于游離細(xì)胞主要體現(xiàn)在(1)可提高反應(yīng)器中的細(xì)胞濃度，使反應(yīng)速度加快，容積生產(chǎn)效率提高；(2)細(xì)胞可連續(xù)使用；(3)抗污染能力強；(4)可連續(xù)發(fā)酵，產(chǎn)物分離方便；(5)便于放大和實現(xiàn)自動化。因此，細(xì)胞固定化技術(shù)目前愈來愈廣泛地應(yīng)用于食品與發(fā)酵工業(yè)中。
酵母細(xì)胞是釀造工業(yè)及基因工程技術(shù)中使用最廣泛的一類微生物，因此，研究酵母細(xì)胞的固定化具有很好的應(yīng)用價值和前景。酵母細(xì)胞固定化方法主要有共價偶聯(lián)法、吸附法和包埋法。其中，包埋法以其簡便、易于放大、細(xì)胞活性保持好等優(yōu)勢而被廣泛采用。常用的包埋載體可以是天然材料，如海藻酸鹽、明膠、褐藻膠，K-角叉菜，或合成高分子材料，如聚丙烯酰胺，聚乙烯醇等。其中，褐藻膠，K-卡拉膠、明膠存在強度差、使用壽命短等缺點；聚丙烯酰胺單體有神經(jīng)毒性，不利于微生物活細(xì)胞生長；聚乙烯醇制備過程中需要高無機鹽濃度對微生物生長不利。目前，應(yīng)用較多的是海藻酸鹽固定化酵母細(xì)胞[文獻(xiàn)2L.Kurillova，P.Gemeiner，A.Vikartovska，H.Mikova，M.Rosenberg and M.Ilavsky.Calciumpectate gel beads for cell entrapment.6.morphology of stabilized andhardened calcium pectate gel beads with cells for immobilized biotechnology.J.microencapsulation，2000，17(3)279-296]，但存在著海藻酸鈣顆粒較大(mm級)[文獻(xiàn)3Viktor A.Nedovic，Bofana Obradovic，Ida Leskoosek-Cukalovic，Oliivera Trifunovic，Radofica Pesic，Branko Bugarski.Electrostatic generationof alginate microbeads loaded with brewing yeast.Process biochemistry 2001，37(1)17-22]，影響溶質(zhì)在固定化細(xì)胞凝膠中的擴散；易發(fā)生細(xì)胞泄漏[文獻(xiàn)4Yoshimitsu Uemura，Naoki Hamakawa，Hidekazu Yoshizawa，HirokiAndo，Kazuya Ijichi，and Yasuo Hatate.Effect of calcium alginate coating onthe performance of immobilized yeast cells in calcium alginate beads.Chem.Eng.Comm.2000，1771-14]，和培養(yǎng)過程中細(xì)胞損失較大等問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對上述問題提出在制備出小粒徑海藻酸鈣微膠珠的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步處理制備成一種新型的酵母細(xì)胞固定化技術(shù)-海藻酸鈉/聚賴氨酸微膠囊。與傳統(tǒng)的海藻酸鈣固定化技術(shù)相比，本發(fā)明用大功率微膠囊制備儀[文獻(xiàn)5馬小軍，任吉倫，何洋。大功率高壓脈沖微膠囊制備儀。中國發(fā)明專利00253538.6]制備出粒徑在500μm以下的微膠珠，產(chǎn)量為700ml/h，再在膠珠表面通過離子絡(luò)合反應(yīng)瞬間形成一層聚賴氨酸微膠囊膜，最后用檸檬酸鈉溶液將微膠囊內(nèi)部海藻酸鈣凝膠液化，使微膠囊內(nèi)成液體環(huán)境[文獻(xiàn)6馬小軍，解玉冰，周麗，虞星炬，袁權(quán)，李昌臣，郝莉，賀欣，孫綿方。APA生物微膠囊的制備條件與膜強度的關(guān)系。中華器官移植雜志，1995，16(4)156-157]。本發(fā)明的制備工藝特點是1)條件溫和，制備過程中酵母細(xì)胞損失很少，細(xì)胞活性保持100％；2)由于聚賴氨酸微膠囊膜的存在，與海藻酸鈣膠珠相比，酵母細(xì)胞在培養(yǎng)過程中細(xì)胞泄漏明顯減少；3)由于微膠囊粒徑小，降低了溶質(zhì)的擴散距離；4)微膠囊內(nèi)為液體環(huán)境，消除凝膠部分的死區(qū)，改善通透性，有利于溶質(zhì)在固定化細(xì)胞中的擴散；5)用大功率微膠囊制備儀可以實現(xiàn)大規(guī)模制備酵母細(xì)胞的固定化載體本發(fā)明的原理是在原有海藻酸鹽固定化細(xì)胞的基礎(chǔ)上，通過大功率微膠囊制備儀，使均勻混合有酵母細(xì)胞的海藻酸鈉溶液在高壓靜電場作用下，形成粒徑在100-500μm可控，分布均勻的液滴，與鈣溶液固化形成微膠珠。并在微膠珠表面通過離子絡(luò)合反應(yīng)瞬間形成一層聚賴氨酸微膠囊膜。再用檸檬酸鈉溶液置換出海藻酸鈣凝膠中的鈣，使微膠囊內(nèi)液化成液體環(huán)境。
本發(fā)明的制備方法中，其主要制備步驟為1)通過大功率微膠囊制備儀，將均勻混合有酵母細(xì)胞的海藻酸鈉溶液在高壓靜電場作用下，形成液滴；本發(fā)明所采用的酵母細(xì)胞包括啤酒酵母、熱帶假絲酵母、畢氏酵母等各種用于食品加工業(yè)的酵母細(xì)胞及各種能夠表達(dá)外源基因的基因工程酵母細(xì)胞。
本發(fā)明所采用的海藻酸鈉濃度在8-30g/L；本發(fā)明所述的液滴其粒徑在100-500μm可控，分布均勻，且具有良好的單分散性。
2)步驟1的液滴與鈣溶液固化形成海藻酸鈣微膠珠，并與聚賴氨酸溶液反應(yīng)成膜，在微膠珠表面形成一層聚賴氨酸微膠囊膜；本發(fā)明所采用的氯化鈣濃度在0.05-0.3mol/L；本發(fā)明反應(yīng)成膜時間在5-60分鐘，膜厚在5-50μm范圍內(nèi)可控；本發(fā)明所采用的聚賴氨酸分子量在1-10萬，聚賴氨酸溶液濃度在0.1-10g/L，pH在7.0-7.4。
3)用檸檬酸鈉溶液將步驟2制得的微膠囊內(nèi)部海藻酸鈣凝膠液化，使微膠囊內(nèi)成液體環(huán)境；本發(fā)明所采用的檸檬酸鈉溶液濃度在0.01-0.10mol/L。
本發(fā)明提供的方法是在全生理條件下制備，其制備過程條件溫和pH7.0-7.4；4-30℃；無剪切及振蕩。制備過程中酵母細(xì)胞活性100％保持。
本發(fā)明系統(tǒng)中制備的固定化酵母細(xì)胞的聚賴氨酸微膠囊在培養(yǎng)過程中細(xì)胞的泄漏率低于10％。
本發(fā)明制備的微膠囊粒徑小于通常的固定化載體，且微膠囊內(nèi)部為液體環(huán)境，極大改善了固定化載體的傳質(zhì)問題，使培養(yǎng)過程中囊中心區(qū)的酵母細(xì)胞仍然存活，保證酵母細(xì)胞的有效利用率。而且，由于微膠囊在原有海藻酸鈣膠珠的基礎(chǔ)上覆蓋一層聚賴氨酸微膠囊膜，減少了培養(yǎng)過程中酵母細(xì)胞泄漏現(xiàn)象的發(fā)生，提高酵母細(xì)胞固定化發(fā)酵的產(chǎn)率。另外，本發(fā)明提供的制備方法其產(chǎn)率高達(dá)700ml/h，初步實現(xiàn)規(guī)?；?。


圖1為本發(fā)明的制備過程示意圖。
圖2為不同分子量蛋白質(zhì)在本發(fā)明制備的海藻酸鈉-聚賴氨酸微膠囊中的擴散曲線具體實施方式
例1有關(guān)本發(fā)明的制備過程請參照圖1。將懸浮培養(yǎng)處于對數(shù)生長期的酵母菌GS115離心收集菌體，與15g/L的海藻酸鈉溶液均勻混合。在大功率微膠囊制備儀的高壓電場作用下滴入100mmol/L的氯化鈣溶液中進(jìn)行凝膠化反應(yīng)30分鐘，制備出粒徑在300μm海藻酸鈣凝膠珠，然后與0.5g/L的聚賴氨酸溶液成膜反應(yīng)10分鐘，生理鹽水清洗3遍后55mmol/L檸檬酸鈉溶液液化10分鐘，生理鹽水清洗3遍后制備出聚賴氨酸微囊化酵母菌，囊膜厚度25μm。整個制備過程均在生理條件下完成，制備過程中酵母細(xì)胞存活率100％保持。
例2將制備好的含有酵母細(xì)胞的海藻酸鈉-聚賴氨酸微膠囊與海藻酸鈣微膠珠置于YPD培養(yǎng)液中，搖瓶培養(yǎng)，28℃，180rpm，培養(yǎng)24小時后，計算酵母細(xì)胞泄漏率。結(jié)果表明，聚賴氨酸微膠囊組細(xì)胞的泄漏率比海藻酸鈣微膠珠組降低3倍以上。
例3圖2給出了不同分子量蛋白在海藻酸鈉-聚賴氨酸微膠囊的擴散曲線圖，由圖可以判斷，低于1萬Da的分子在海藻酸鈉-聚賴氨酸微膠囊中可以自由擴散，不影響囊內(nèi)酵母菌營養(yǎng)的供應(yīng)和代謝產(chǎn)物的排出。
比較例文獻(xiàn)3采用靜電液滴法制備出粒徑在250-2000μm的固定化酵母細(xì)胞的海藻酸鈣膠珠。雖然解決了小粒徑問題，但產(chǎn)率低(僅25.2ml/h)。本發(fā)明制備的固定化酵母細(xì)胞的海藻酸鈣膠珠粒徑在100-500μm范圍可控，且產(chǎn)率高達(dá)700ml/h。
文獻(xiàn)4通過制備雙層海藻酸鈣凝膠來減少細(xì)胞泄漏，雖然在解決細(xì)胞泄漏問題上有一定的效果，但制備的膠珠粒徑在3mm，大粒徑載體在培養(yǎng)過程中，載體中心部分的酵母細(xì)胞由于受傳質(zhì)阻力影響無法獲得充分的營養(yǎng)供應(yīng)。本發(fā)明制備的固定化酵母細(xì)胞的聚賴氨酸微膠囊既減少了細(xì)胞泄漏，又通過小粒徑(可控制在100-500μm范圍)和內(nèi)部液體環(huán)境解決了傳質(zhì)問題。
權(quán)利要求
1.一種固定化酵母細(xì)胞的微膠囊制備方法，其主要步驟為a)通過大功率微膠囊制備儀，將均勻混合有酵母細(xì)胞的海藻酸鈉溶液在高壓靜電場作用下，形成液滴；b)步驟a的液滴與鈣溶液固化形成海藻酸鈣微膠珠，并與聚賴氨酸溶液反應(yīng)成膜，在微膠珠表面形成一層聚賴氨酸微膠囊膜；c)用檸檬酸鈉溶液將步驟b制得的微膠囊內(nèi)部海藻酸鈣凝膠液化，使微膠囊內(nèi)成液體環(huán)境；所述海藻酸鈉濃度在8-30g/L；所述氯化鈣濃度在0.05-0.3mol/L；所述聚賴氨酸分子量在1-10萬，聚賴氨酸溶液濃度在0.1-10g/L，pH在7.0-7.4；所述檸檬酸鈉溶液濃度在0.01-0.10mol/L。
2.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟a中所述的酵母細(xì)胞包括啤酒酵母、熱帶假絲酵母或畢氏酵母及基因工程酵母菌。
3.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟a中所述的液滴其粒徑在100-500μm。
4.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟b中所述的海藻酸鈣凝膠珠與聚賴氨酸溶液反應(yīng)成膜時間在5-60分鐘。
5.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟b中所述的聚賴氨酸微膠囊膜厚為5-50μm。
全文摘要
一種固定化酵母細(xì)胞的海藻酸鈉－聚賴氨酸微膠囊制備方法，在原有海藻酸鹽固定化細(xì)胞的基礎(chǔ)上，通過大功率微膠囊制備儀，使均勻混合有酵母細(xì)胞的海藻酸鈉溶液在高壓靜電場作用下，形成粒徑在100－500μm可控，分布均勻的液滴，與鈣溶液固化形成微膠珠。并在微膠珠表面通過離子絡(luò)合反應(yīng)瞬間形成一層聚賴氨酸微膠囊膜。再用檸檬酸鈉溶液置換出海藻酸鈣凝膠中的鈣，使微膠囊內(nèi)液化成液體環(huán)境。本發(fā)明是在全生理條件下制備，其制備過程條件溫和pH5.0－7.4；4－30℃；無剪切及振蕩。制備過程中酵母細(xì)胞活性100％保持。在培養(yǎng)過程中細(xì)胞的泄漏率低于10％。
文檔編號C12N11/02GK1616658SQ20031011815
公開日2005年5月18日 申請日期2003年11月10日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月10日
發(fā)明者馬小軍, 于煒婷, 謝威揚 申請人:中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所