專(zhuān)利名稱(chēng)：成人骨髓間充質(zhì)干細(xì)體外定向誘導(dǎo)分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞的一種方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及成人骨髓間充質(zhì)干細(xì)體外定向誘導(dǎo)分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞的一種方法。
目前國(guó)際上及國(guó)內(nèi)均單純的采用分離CD34+細(xì)胞作為誘導(dǎo)分化內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，未見(jiàn)有利用成人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外定向誘導(dǎo)分化為內(nèi)皮細(xì)胞。
近年來(lái)，干細(xì)胞特有的生物學(xué)特性及潛在的應(yīng)用價(jià)值受到各國(guó)學(xué)者的高度關(guān)注。骨髓、血液和其它組織來(lái)源的造血干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、成血-血管細(xì)胞、血管干細(xì)胞以及其它組織干細(xì)胞為組織工程的種植細(xì)胞來(lái)源提供了可能性。外周血、骨髓來(lái)源的CD34+造血干細(xì)胞在體外誘導(dǎo)條件下，15～20天后可形成“鵝卵石”樣(cobblestone)內(nèi)皮細(xì)胞層。目前對(duì)CD34+細(xì)胞的提取、體外擴(kuò)增，以及向內(nèi)皮細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化已具有一套完備的方法。
骨髓是由非粘附的造血干細(xì)胞和粘附性基質(zhì)細(xì)胞組成，這些粘附的基質(zhì)細(xì)胞中含有豐富的間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)。MSCs是中胚層發(fā)育的早期細(xì)胞，具有多向分化潛能的組織干細(xì)胞。不僅能分化為造血基質(zhì)，支持造血，還可分化為多種造血以外的組織細(xì)胞，特別是中胚層和神經(jīng)外胚層來(lái)源的組織細(xì)胞。在合適的環(huán)境和誘導(dǎo)因子存在下，成人骨髓MSCs能分化成多種人體組織細(xì)胞，包括骨髓基質(zhì)、骨骼、軟骨、肌肉、腱、脂肪、成纖維細(xì)胞和心肌細(xì)胞等；此外，從理論上講，MSCs還可向臟器中胚層分化，如向血管內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cells，ECs)和平滑肌細(xì)胞分化，但目前國(guó)內(nèi)外還未進(jìn)行將MSCs體外定向分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)。
背景技術(shù)：
決定MSCs分化為ECs的關(guān)鍵是誘導(dǎo)分化的條件。在體內(nèi)，組織干細(xì)胞的發(fā)生及功能獲得與組織中基因編碼的轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞外信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)。但在體外，組織干細(xì)胞的定向分化機(jī)理尚不十分清楚?；A(chǔ)營(yíng)養(yǎng)、細(xì)胞密度、空間組織、機(jī)械力、生長(zhǎng)因子等對(duì)MSCs的分化都有很大的影響。Tremain指出，MSCs克隆的mRNA可表達(dá)出具有內(nèi)皮細(xì)胞、表皮細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞的特點(diǎn)。Lodie指出，在合適條件下，MSCs能分化為內(nèi)皮細(xì)胞。研究表明，VEGF是誘導(dǎo)MSCs分化為ECs的關(guān)鍵所在。VEGF是一種酪氨酸激酶受體Flk-1/KDR和Flt-1的配基，它能特異性促內(nèi)皮細(xì)胞分裂，對(duì)人骨髓髓系祖細(xì)胞有調(diào)節(jié)作用。經(jīng)含人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子培養(yǎng)大約2周后，可分化出ECs。MSCs在向ECs誘導(dǎo)分化過(guò)程中，并不直接分化產(chǎn)生ECs，而是先分化而短暫擴(kuò)增細(xì)胞(transient amplifying cell)，再經(jīng)過(guò)幾次到十幾次不等的分裂后定向分化為內(nèi)皮祖/前體細(xì)胞(committedprogenitors/precursor)，進(jìn)而可分化為有絲分裂后細(xì)胞(post-mitotic cells)及終未分化細(xì)胞(terminally-differentiated cells)，即內(nèi)皮細(xì)胞。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的內(nèi)容未公開(kāi)發(fā)表，本領(lǐng)域的技術(shù)人員如不花費(fèi)創(chuàng)造性勞動(dòng)根本不能根據(jù)現(xiàn)有的技術(shù)推斷得到本發(fā)明的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外定向誘導(dǎo)分化為內(nèi)皮細(xì)胞的方法。
本發(fā)明的目的是提供一種骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外定向誘導(dǎo)分化為內(nèi)皮細(xì)的方法，為體外構(gòu)建心臟組織工程瓣提供一種經(jīng)濟(jì)、便捷、有效的獲取種植細(xì)胞的新方法，以便應(yīng)用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ秃团R床換瓣手術(shù)。
本發(fā)明利用Percoll(1.073g/ml)從正常成人骨髓中分離出MSCs，10％FBS的LG-DMEM培養(yǎng)基純化和擴(kuò)增、流式細(xì)胞儀鑒定其純度；用血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因(VEGF)誘導(dǎo)MSCs向ECs分化，VIII因子(vWF)和Tie-2免疫組化和透射電鏡(TEM)鑒定細(xì)胞性質(zhì)。結(jié)果顯示5.0×105個(gè)MSCs在體外擴(kuò)增15代后，獲得8.0×1012個(gè)MSCs，擴(kuò)增了約1.6×107倍；MSCs在加入VEGF誘導(dǎo)培養(yǎng)大約14～21天，90％的誘導(dǎo)細(xì)胞對(duì)VIII因子和Tie-2相關(guān)抗原呈陽(yáng)性反應(yīng)；TEM可觀察到胞漿內(nèi)有Weible-palade小體，證實(shí)為ECs。研究結(jié)果說(shuō)明成人骨髓MSCs在體外具有定向誘導(dǎo)分化為ECs的潛能，這為心臟組織工程瓣體外構(gòu)建，尤其是在小兒先天性心臟病組織工程研究中種植細(xì)胞的來(lái)源提供了可能性。
下面用實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。
四

(見(jiàn)說(shuō)明書(shū)附圖頁(yè))五具體實(shí)施方式
實(shí)施例1成人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外分離、純化和擴(kuò)增一方法1.肝素液青霉素瓶準(zhǔn)備在已消毒的青霉素瓶中，加入1ml肝素液(250U/ml)；作為取骨髓時(shí)的盛器。骨髓標(biāo)本每瓶取5ml即可。
肝素液的配制2支肝素(1.25萬(wàn)U/支)+100ml生理鹽水→250U/ml/瓶。
2.Percoll應(yīng)用液的配制Percoll原液(密度為1.13)→貯存液→應(yīng)用液(密度為1.073)即Percoll原液5.04ml+0.56ml 1.5M NaCl+4.4ml生理鹽水＝10ml應(yīng)用液或Percoll原液∶1.5M NaCl＝9∶1(V/V)→貯存液貯存液∶生理鹽水＝5.6ml∶4.4ml→應(yīng)用液3.取骨髓標(biāo)本4～5ml/瓶+肝素液1ml/瓶→5～6ml混合液→肝素液的終濃度為40～50U/ml。
4.Percoll應(yīng)用液瓶中加入骨髓，即骨髓在Percoll應(yīng)用液上兩。一般按2∶1(實(shí)際應(yīng)用時(shí)按1∶1)，其目的是為了節(jié)約Percoll應(yīng)用液。即Percoll應(yīng)用液∶骨髓＝1∶1(v/v)。
5.梯度離心。1800rpm×20min，取中間界面的單個(gè)核細(xì)胞(mononuclear cells，MNCs)層面，制備MNCs懸液。
6.細(xì)胞經(jīng)PBS洗滌兩遍，或用LG-DMEM洗滌兩遍后計(jì)數(shù)。即MNCs+LG-DMEM 10ml→輕輕吹打，混勻→離心，1500rpm，5min洗滌MNCs→再重復(fù)一遍。
7.去除上清后，用LG-DMEM 2ml懸浮MNCs(即稀釋了2倍)。
8.接種培養(yǎng)。接種密度為2×105/cm2(如用25cm2的培養(yǎng)瓶，則乘以25)。
9.原代培養(yǎng)的MSCs，其培養(yǎng)液組成為L(zhǎng)G-DMEM+10％FBS(進(jìn)口)。
10.在48h后鏡下觀察，如有貼壁細(xì)胞，則可全換培養(yǎng)液；如未見(jiàn)貼壁細(xì)胞，半量換液。11.在原代培養(yǎng)第一次傳代后，其培養(yǎng)液的組成如下(25cm2培養(yǎng)瓶)LG-DMEM 4.5mlFBS(國(guó)產(chǎn)) 0.5ml(10％)L-谷氨酰胺50μl(1mmol/l)12.貼壁層細(xì)胞達(dá)到90％以上融合后，經(jīng)0.125％胰蛋白酶消化按6×103cells/cm2的密度接種于傳代培養(yǎng)瓶(T-75)中進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)。
13.原代培養(yǎng)當(dāng)出現(xiàn)典型成纖維細(xì)胞樣形態(tài)和細(xì)胞密度融合達(dá)到80％～90％時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞攝像(見(jiàn)說(shuō)明書(shū)附圖1)。
注以上操作均嚴(yán)格按照無(wú)菌操作規(guī)程二.結(jié)果經(jīng)上述方法可從5.0×105個(gè)原代MSCs在體外擴(kuò)增15代后，獲得8.0×1012個(gè)MSCs，擴(kuò)增了約1.6×107倍。
實(shí)施例2MSCs表面抗原分子檢測(cè)一、方法1.MSCs細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增到第二代時(shí)，用胰蛋白酶消化收獲細(xì)胞，分別取2×105個(gè)細(xì)胞與鼠抗人CD13、CD29、CD34、CD45、CD105和HLA-DR抗體室溫中反應(yīng)30min，用PBS洗滌兩次去除未反應(yīng)的抗體后與FITC標(biāo)記的二抗避光反應(yīng)15min。
2.取2×105個(gè)細(xì)胞與CD166直標(biāo)抗體室溫避光孵育20min，1％BSA-PBS清洗2遍，加入500μl PBS重懸，并設(shè)IgG1-FITC、IgGl-PE、IgG1-PC5為對(duì)照。
3.應(yīng)用流式細(xì)胞儀(COULTER Epics XL-AD 2517，BECKMAN COULTER公司，美國(guó))檢測(cè)至少10,000個(gè)細(xì)胞，用Cofit軟件分析結(jié)果。
二結(jié)果流式細(xì)胞儀檢測(cè)MSCs的表面抗原特性。CD34(造血干/祖細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)志)、CD45(白細(xì)胞共同抗原)和HLA-DR(HLA II類(lèi)分子，抗原呈遞細(xì)胞及激活的T細(xì)胞表面標(biāo)志)等表達(dá)呈現(xiàn)陰性；而CD105(主要表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞和活化單核細(xì)胞)、CD13(主要表達(dá)于單核細(xì)胞和粒細(xì)胞)、CD29(纖連蛋白和透明脂酸鹽的受體，基質(zhì)細(xì)胞表面標(biāo)志)和CD166(間質(zhì)細(xì)胞表面標(biāo)志)表達(dá)呈現(xiàn)陽(yáng)性，均在98％以上。經(jīng)過(guò)2代以上的傳代后(細(xì)胞大約分裂14次)，體外擴(kuò)增的MSC在形態(tài)和細(xì)胞表型上達(dá)到了95％以上的均一(見(jiàn)說(shuō)明書(shū)附圖2)。
實(shí)施例3MSCs向內(nèi)皮細(xì)胞的定向誘導(dǎo)分化一.方法1.選擇第3～10代的MSCs作為實(shí)驗(yàn)材料。
2.其誘導(dǎo)培養(yǎng)體系的組成為DMEM-HG，20％FBS(天津市川頁(yè)生化制品有限公司，批號(hào)030509)、VEGF(10ng/ml，Pepro Tech EC LTD公司，英國(guó))、bFGF(5ng/ml，Pepro Tech EC LTD公司，英國(guó))、L-谷氨酰胺(2mmol/L)、青霉素液(100U/ml)、鏈霉素液(100μg/ml)。
3.每2～3d更換培養(yǎng)液，當(dāng)貼壁層細(xì)胞達(dá)到90％以上融合后，經(jīng)0.125％胰蛋白酶消化傳代；按6×103cells/cm2的密度接種于25cm2培養(yǎng)瓶中。重復(fù)上述細(xì)胞傳代的操作即可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的有效擴(kuò)增。
二.結(jié)果MSCs在加入誘導(dǎo)分化培養(yǎng)體系大約14～21d后，形態(tài)多不固定，貼壁的細(xì)胞表現(xiàn)為較大，呈扁平、大多角形、長(zhǎng)梭形、園形、橢原形或板狀，細(xì)胞有豐富的胞漿和不規(guī)則突起。長(zhǎng)成單層的胞，呈典型的“鵝卵石”樣，為內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征(見(jiàn)說(shuō)明書(shū)附圖3)。
實(shí)施例4MSCs定向誘導(dǎo)分化的內(nèi)皮細(xì)胞鑒定一.方法1.當(dāng)光鏡下誘導(dǎo)的細(xì)胞長(zhǎng)成單層，呈“鵝卵石”(cobblestone)樣時(shí)制備細(xì)胞懸液，分別用5％戊二醛和1％四氧化鋨固定，制成電鏡標(biāo)本行透射電鏡(TEM，JEM-1010，日本)觀察。
2.VIII因子(vWF)和Tie-2相關(guān)抗原的免疫組化檢測(cè)(ABC酶標(biāo)記法)選擇MSCs經(jīng)誘導(dǎo)分化培養(yǎng)體系14～21天的細(xì)胞，消化后用離心涂片機(jī)涂片于載玻片上，丙酮固定細(xì)胞。采用ABC酶標(biāo)記法進(jìn)行檢測(cè)，并設(shè)陰性對(duì)照組；滴加1∶100的兔抗人VIII因子抗體(一抗)和1∶200的Tie-2鼠抗人單克隆抗體。Nikon倒置相差顯微鏡(Olympus，日本)下觀察，拍照。細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕褐色顆粒為陽(yáng)性反應(yīng)。
二.結(jié)果TEM下胞漿內(nèi)可見(jiàn)Weible-palade小體(簡(jiǎn)稱(chēng)W-P小體)，是ECs特有的顆粒(見(jiàn)說(shuō)明書(shū)附圖5)。VIII(vWF)因子和Tie-2相關(guān)抗原的免疫組化結(jié)果顯示細(xì)胞呈多角型或圓型，胞漿內(nèi)布滿(mǎn)細(xì)密的棕褐色顆粒，細(xì)胞核內(nèi)未見(jiàn)著色，呈一片陰性對(duì)照區(qū)，證明培養(yǎng)的是內(nèi)皮細(xì)胞(見(jiàn)說(shuō)明書(shū)附圖4)。
權(quán)利要求
1.成人骨髓間充質(zhì)干細(xì)體外定向誘導(dǎo)分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cells，ECs)的一種方法。其特征在于利用Percoll(1.073g/ml)從正常成人骨髓中分離出骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)，10％FBS的LG-DMEM培養(yǎng)基純化和擴(kuò)增，流式細(xì)胞儀鑒定其純度；用血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascularendothelial growth factor，VEGF)誘導(dǎo)MSCs向ECs分化，VIII因子(vWF)和Tie-2免疫組化，以及透射電鏡(TEM)鑒定血管內(nèi)皮細(xì)胞性質(zhì)。結(jié)果顯示骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)體外在加入VEGF誘導(dǎo)培養(yǎng)大約14～21天后可分化出血管內(nèi)皮細(xì)胞。證實(shí)了成人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在體外具有定向誘導(dǎo)分化為血管內(nèi)皮細(xì)的潛能。
全文摘要
本發(fā)明包括利用Percoll(1.073g/ml)從正常成人骨髓中分離出骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)，10％FBS的LG－DMEM培養(yǎng)基純化和擴(kuò)增，流式細(xì)胞儀鑒定其純度；用血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)誘導(dǎo)MSCs向內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cells，ECs)分化，VIII因子(vWF)和Tie－2免疫組化，以及透射電鏡(TEM)鑒定血管內(nèi)皮細(xì)胞性質(zhì)。結(jié)果顯示骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)體外在加入VEGF誘導(dǎo)培養(yǎng)大約14～21天后可分化出血管內(nèi)皮細(xì)胞。證實(shí)了成人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在體外具有定向誘導(dǎo)分化為血管內(nèi)皮細(xì)的潛能，開(kāi)創(chuàng)了心血管組織工程學(xué)研究中種植細(xì)胞的新來(lái)源。
文檔編號(hào)C12N5/08GK1546656SQ20031011842
公開(kāi)日2004年11月17日 申請(qǐng)日期2003年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月16日
發(fā)明者馮濱, 劉迎龍, 龔茹, 馮凱, 陳虎, 馮 濱 申請(qǐng)人:馮濱, 劉迎龍, 馮 濱