專利名稱：胸腺肽α1乳酸桿菌構(gòu)建及酸奶制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種胸腺肽α1乳酸桿菌構(gòu)建及酸奶制備方法，屬于食品生物學(xué)領(lǐng)域，特別涉及到基因工程技術(shù)。
背景技術(shù)：
胸腺是人體的重要免疫器官，可以分泌多種胸腺激素，參與機(jī)體的免疫功能。在胚胎時(shí)期，胸腺比心臟，甚至比肺還要大，在青春時(shí)期達(dá)到最大，以后開始逐漸退化，到中年時(shí)減小到10克左右。胸腺組織逐漸由脂肪代替，到50歲之后，胸腺激素的分泌就完全停止。由于胸腺的萎縮和退化或者一些疾病的影響，使得胸腺激素的分泌減少，導(dǎo)致機(jī)體免疫力降低。在治療肝炎、腫瘤、免疫力低下等疾病的過程中，還必須人為的應(yīng)用胸腺激素治療。因此，市場(chǎng)上銷售胸腺肽藥品比較廣泛，其中注射凍干粉針劑是一種比較常見的制劑。
市售胸腺肽藥品的制造主要是靠從動(dòng)物的胸腺中提取，由于存在純化工藝的局限，其成分比較復(fù)雜，純度比較低。雖然有化學(xué)合成的上市產(chǎn)品，但是價(jià)格昂貴，人們難以接受?？傮w上說，胸腺肽藥品的生產(chǎn)使用大量的設(shè)備和技術(shù)，投入的成本比較高，應(yīng)用一般都采用注射方法，給應(yīng)用帶來不便。
胸腺肽是一類多肽和蛋白質(zhì)激素的總稱，用反相HPLC分離出60多種組分，根據(jù)等電點(diǎn)的不同，分為α、β、γ3組，其中α1、β4活性最強(qiáng)，功能也最清楚。
胸腺肽α1的功能是誘導(dǎo)增加MIF、IFN和淋巴毒素的產(chǎn)生，調(diào)節(jié)修飾TDT活性，增加抗病毒、真菌和腫瘤的免疫性，人體中擴(kuò)增T細(xì)胞免疫等。
胸腺肽α1在臨床上主要用于提高機(jī)體免疫力以及用其免疫調(diào)節(jié)作用治療慢性乙型肝炎、腫瘤、艾滋病等感染性疾病，胸腺肽α1可以明顯降低血漿中的脂質(zhì)，增加紅細(xì)胞膜ATP酶活性，對(duì)防止動(dòng)脈粥樣硬化有較強(qiáng)的效能。同時(shí)，胸腺肽α1由于有多種生物學(xué)功能，因此對(duì)重癥肌無力、血友病、創(chuàng)傷愈合以及放射治療后的免疫恢復(fù)等多種病癥都有嘗試和使用。
酸奶是一種廣泛食用的保健食品，通常都是將牛奶接種乳酸菌發(fā)酵而成。發(fā)酵過程使奶中糖、蛋白質(zhì)有20％左右被分解成為小的分子(如半乳糖和乳酸、小的肽鏈和氨基酸等)，使酸奶更易消化和吸收，各種營(yíng)養(yǎng)素的利用率得以提高。酸奶由純牛奶發(fā)酵而成，除保留了鮮牛奶的全部營(yíng)養(yǎng)成分外，在發(fā)酵過程中乳酸菌還可產(chǎn)生人體營(yíng)養(yǎng)所必須的多種維生素，如VB1、VB2、VB6、VB12等。
一般來說，無論是手術(shù)后，還是急性、慢性病愈后的病人，為了治療疾病或防止感染都曾服用或注射了大量抗生素，使腸道茵叢發(fā)生很大改變，甚至一些有益的腸道菌也統(tǒng)統(tǒng)被抑制或殺死，造成菌群失調(diào)。酸奶中含有大量的乳酸菌，每天喝0.25-0.5千克，可以維持腸道正常菌叢平衡，調(diào)節(jié)腸道有益菌群到正常水平。所以大病初愈者多喝酸奶，對(duì)身體恢復(fù)有著其他食物不能替代的作用。因此，對(duì)于久病初愈的人來說也是最需要的。
現(xiàn)有的基因工程技術(shù)可以將胸腺肽基因轉(zhuǎn)入乳酸桿菌，而使得兩者接合，共同發(fā)揮作用。
用乳酸桿菌表達(dá)胸腺肽α1而制作的酸奶是一種新的嘗試，不僅充分發(fā)揮胸腺肽和酸奶的各自的治療以及保健作用，更重要的是將藥食合二為一，簡(jiǎn)化生產(chǎn)過程，降低成本，價(jià)格低廉，應(yīng)用方便，人們更容易接受。

發(fā)明內(nèi)容
利用基因工程技術(shù)，根據(jù)胸腺肽α1的氨基酸序列，構(gòu)建合成其編碼核苷酸序列，組成2串體，組裝入乳酸桿菌表達(dá)載體，通過在牛奶中接種發(fā)酵獲得乳酸桿菌表達(dá)胸腺肽α1的酸奶。
具體實(shí)施例方式一、構(gòu)建工程菌1、從基因庫中查及人胸腺肽α1的核苷酸序列，針對(duì)胸腺肽α1的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)在基因前依次接上核酸內(nèi)切酶ECORI、蛋氨酸、核酸內(nèi)切酶BamHI、天冬酰胺和甘氨酸對(duì)應(yīng)的核苷酸序列，在其基因后依次加上甘氨酸、核酸內(nèi)切酶BglII、終止密碼子和核酸內(nèi)切酶Pst對(duì)應(yīng)的核苷酸序列，采用BamHI和BglII酶切后實(shí)現(xiàn)胸腺肽α1基因的重復(fù)串連，如下所示EcoRIMelBamHI Asn Gly.........Gly BglII Stop PstIGAATTC ATGGGATCCACC GGC......GGC AGATCTTGACTGCAG2、合成以下4條基因片段f1aattcatgggatccaacggcagcgacgccgccgtggacaccagcaf2gcgagatcaccaccaaggacctgaaggagaagaaggaggtggtggaggaggccgag 2aacggcagatcttgactgcaf3gtcaagatctgccgttctcggcctcctccaccacctccttcttf4ctccttcaggtccttggtggtgatctcgctgctggtgtccacggcggcgtcgctgccgttggatcccatg3、胸腺肽α1(Tα1)基因的形成 溶解f1、f2、f3、f4，使其終濃度為100pmol/μl，混合均勻。各取適量，100℃加熱2min，自然冷卻至室溫，-20℃保存。
4、質(zhì)粒載體的制備 取PGEM-32f質(zhì)粒，用EcoRI和PstI雙酶切，電泳回收所需要的片段并溶于雙蒸水中。
5、片段的連接 取3退火片段4μl，T4核酸連接酶1μl，質(zhì)粒載體1μl，雙蒸水3μl，混合均勻，16℃連接12hr。
6、轉(zhuǎn)化大腸桿菌 取片段連接產(chǎn)物5μl，加入到制備的感受態(tài)大腸桿菌DH5α100μl中，混合均勻，常規(guī)方法轉(zhuǎn)化DH5α。
7、陰性克隆的篩選 經(jīng)鋪板、培養(yǎng)、擴(kuò)增和酶切鑒定后初步篩選出陰性克隆，最后通過測(cè)定序列確定陰性克隆。
8、胸腺肽α1基因重復(fù)序列的構(gòu)建 酶切和測(cè)序正確的克隆經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，分為兩份，一份用BamHI和PstI酶切，回收小片段；另一份用BglII和PstI酶切，回收其大片段。將回收的大小片段用T4核酸連接酶連接，即將2個(gè)重復(fù)的胸腺肽α1基因連接。
9、表達(dá)載體的構(gòu)建 將含胸腺肽α12串體基因的重組質(zhì)粒PGEM-32f經(jīng)EcoRI和PstI雙酶切，回收胸腺肽α1②，克隆入經(jīng)相同酶切的PBV中，構(gòu)成PBV-Tα1②重組體。
10、工程菌的構(gòu)建 將連接好的PBV-Tα1②用電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化乳酸桿菌，在含氨芐青霉素的LB瓊脂平板上挑取單菌落，經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)提取質(zhì)粒，酶切鑒定篩選出目的菌株。
11、胸腺肽α1的表達(dá) 經(jīng)篩選后的PBV-Tα1②的克隆于37℃培養(yǎng)過夜，次日按1％轉(zhuǎn)接于LB中，37℃培養(yǎng)3hr，溫度升至42℃誘導(dǎo)4hr，收集菌體，進(jìn)行15％SDS-PAGE。
二、制備酸奶選用新鮮牛奶，要求脂肪量低于3％，按照鮮牛奶總量6％的比例加入白糖，煮沸5分鐘滅菌，過濾。當(dāng)溫度下降至38-42℃時(shí)，接入電轉(zhuǎn)化PBV-Tα1②構(gòu)建的乳酸桿菌，37℃發(fā)酵培養(yǎng)6-8hr，發(fā)酵后要隨時(shí)抽樣檢查酸度和凝固情況。當(dāng)酸度Ph達(dá)到4.5-4.7、凝固也達(dá)到要求時(shí)，停止發(fā)酵，小心地取出在室溫下冷卻，再移到2℃-6℃冰箱中冷卻。
權(quán)利要求
1.胸腺肽α1乳酸桿菌構(gòu)建及酸奶制備。其特征在于，用于制備酸奶的乳酸桿菌中轉(zhuǎn)入的質(zhì)粒載體包含有抗青霉素和胸腺肽α1的基因。
2.根據(jù)權(quán)力要求1所述的胸腺肽α1以2串體的形式在乳酸桿菌中表達(dá)。其基因片段為f1aattcatgggatccaacggcagcgacgccgccgtggacaccagcaf2gcgagatcaccaccaaggacctgaaggagaagaaggaggtggtggaggaggccgagaacggcagatcttgactgcaf3gtcaagatctgccgttctcggcctcctccaccacctccttcttf4ctccttcaggtccttggtggtgatctcgctgctggtgtccacggcggcgtcgctgccgttggatcccatg
3.權(quán)力1所述的胸腺肽α1乳酸桿菌中的Tα1可以多串體的形式表達(dá)。
4.權(quán)力1所述的酸奶，是接入權(quán)力要求2、權(quán)力要求3所述的胸腺肽α1乳酸桿菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)制作而成。
全文摘要
應(yīng)用基因工程方法，將胸腺肽α1質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)入乳酸桿菌，通過接種、發(fā)酵培養(yǎng)制作酸奶。這種酸奶含有功效最強(qiáng)的胸腺肽α1，耐酸，可以小肽的形式直接被腸完整吸收，更快被機(jī)體利用。因此，這種酸奶可以同時(shí)具有胸腺肽的藥理作用和酸奶的保健功能，藥食合二為一，彌補(bǔ)人胸腺肽分泌的不足。簡(jiǎn)化生產(chǎn)過程，降低成本，應(yīng)用方便，人們?nèi)菀捉邮堋＠眯叵匐摩?乳酸桿菌生產(chǎn)酸奶和用常規(guī)方法生產(chǎn)酸奶的工藝相同。
文檔編號(hào)C12N15/11GK1626650SQ20031011895
公開日2005年6月15日 申請(qǐng)日期2003年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月8日
發(fā)明者石繼紅, 包春杰 申請(qǐng)人:包春杰, 石繼紅