專(zhuān)利名稱(chēng)：元江黑孢菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種其發(fā)酵物具有藥用功能的微生物。
背景技術(shù)：
蘆薈內(nèi)脂Synonym5-hydroxy-6-octen-4-olide，Aloelactone 5-(1-羥基-2-丁烯基)-二氫呋喃-2-酮為一已知化合物，1969年，Evans Jr，RH，Ellested GAand Kunstann MP在《Tetrahedron Lett.》雜志上首次報(bào)導(dǎo)從一株未鑒定的黑孢霉菌培養(yǎng)液分離得到5-(1-羥基-2-丁烯基)-二氫呋喃-2-酮化合物。在國(guó)際通用的hdsch軟件化合物庫(kù)中檢索，顯示如下名稱(chēng)5-羥基-6辛烯基-4-脂(5-(1-羥基-2-丁烯基)-二氫呋喃-2-酮)，化合物注冊(cè)編號(hào)23790-99-0，分子式C8H12O3，分子量156.08。但公開(kāi)文獻(xiàn)中并未報(bào)道蘆薈內(nèi)脂的用途。1996年，Zeeck，A.及Burkhardt，K.等人，在抗生物活性雜志《J.Antibiot.》上，報(bào)導(dǎo)了上述化合物對(duì)部分病原細(xì)菌有抗性作用，1998年，F(xiàn)ukushima，T.等人，植物化學(xué)《Phytochemistry》上，報(bào)導(dǎo)了在含有上述化合物與其他2種內(nèi)脂化合物的培養(yǎng)液對(duì)溫室植物病害有預(yù)防作用。進(jìn)一步認(rèn)識(shí)蘆薈內(nèi)脂并增加其獲得途徑是需研究的課題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種其發(fā)酵物能夠獲得蘆薈內(nèi)脂的微生物----元江黑孢菌。
本發(fā)明所述的元江黑孢菌命名為元江黑孢菌Nigrospora yuanjiangensissp.nov.，Chen et Yin Ym38279，現(xiàn)保藏在國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局指定的保藏單位，保藏編號(hào)為CCTCC NOM203079。
本發(fā)明所述的元江黑孢菌系從中國(guó)云南省元江地區(qū)蘆薈(Aloeyuanjiangensis)植物體中分離獲得的?，F(xiàn)保藏在國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局專(zhuān)利局保藏單位保藏，保藏單位名稱(chēng)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期為2003年11月18日，保藏編號(hào)為M203079。
上述元江黑孢菌(Nigrospora yuanjiangensis sp.nov.，Chen et Yin)的微生物分類(lèi)學(xué)地位，屬于真菌門(mén)半知菌類(lèi)(Fungi imperfecti)暗梗孢科(Dematiaceae)黑孢霉屬(Nigrospora Zim)中的一個(gè)新種。經(jīng)微生物分類(lèi)學(xué)及分子生物學(xué)鑒定，它的基內(nèi)菌絲為褐色顆粒狀；分生孢子梗長(zhǎng)，單生不分枝，暗色；分生孢子與孢子梗連接處有表面粗糙的暗色泡囊，該菌18S RNA堿基系列由1718bp組成，明顯區(qū)別于已知黑孢霉菌，確認(rèn)為黑孢霉屬中的一個(gè)新種，定名為元江黑孢菌(Nigrospora yuanjiangensis sp.nov.，Chen et Yin)。
本發(fā)明所述菌株的培養(yǎng)特征如下一、PDA培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)4天，菌落直徑28cm，基內(nèi)菌絲發(fā)達(dá)，中央絮狀白色隆起，背面白色；7天菌落直徑34cm，基內(nèi)菌絲發(fā)達(dá)，中央絮狀白色隆起，背面黃白色；11天菌落蔓延，菌絲白色，絮狀隆起，背面乳黃色。
二、麥芽汁培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)4天菌落直徑19cm，中央菌絲凹陷，外周絮狀，菌絲白色，菌落較整齊；7天菌落直徑35cm，中央菌絲絮狀凹陷，邊緣長(zhǎng)直立絨毛狀，菌落較整齊白色，背面白色；11天菌落蔓延，中央菌絲絮狀凹陷，邊緣菌絲長(zhǎng)絨毛狀，背面棕褐色。
三、察貝克培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)4天菌落直徑12cm，站立絮狀白色菌絲，疏松，背面乳白色；7天菌落直徑17cm，絮狀菌絲，菌落中央灰色，菌落不規(guī)則，起伏不平，背面灰白色；11天菌落直徑17cm，氣生菌絲絨絮狀，灰白色并隆起，基內(nèi)菌絲為褐色顆粒狀，背面褐色至黑色之間。
本發(fā)明所述菌株的形態(tài)特征一、在顯微鏡下，形態(tài)結(jié)構(gòu)表現(xiàn)為菌絲無(wú)色有隔膜。分生孢子梗長(zhǎng)，暗色，單生不分枝；分生孢子扁球形，頂生，黑色，單細(xì)胞12.5～15×20～25微米，分生孢子與孢子梗連接處有表面粗糙的暗色泡囊。
二、有性世代未發(fā)現(xiàn)。
本發(fā)明所述菌株的發(fā)酵培養(yǎng)特征發(fā)酵培養(yǎng)第1天，菌種有零星的白色菌絲點(diǎn)。第2天，出現(xiàn)直徑小于直徑1cm的白色菌絲球。第3天，菌絲球直徑達(dá)1cm，并出現(xiàn)一些直徑接近2mm的小菌絲球。第4天，有直徑2cm大小的顆粒絨狀菌絲球，小菌絲球的數(shù)量增多。第5-6天，出現(xiàn)大量的菌絲球。
本發(fā)明所述菌株的發(fā)酵及獲得蘆薈內(nèi)脂的工藝流程為菌種→活化培養(yǎng)(28℃±2℃，2-4天)→種子培養(yǎng)(液體PDA)→培養(yǎng)(28℃±2℃，2~4天)→接種(接種量5-10％)→發(fā)酵培養(yǎng)(液體PDA，30℃±2℃，4-6天)→收集發(fā)酵液→發(fā)酵產(chǎn)物→萃取→濃縮提取物→層析分離→層析純化→蘆薈內(nèi)脂。蘆薈內(nèi)脂(Aloelactonoe)的分子式為C8H12O3，化學(xué)結(jié)構(gòu)式為 上述發(fā)酵條件參數(shù)為1.發(fā)酵方式液態(tài)發(fā)酵。
2.菌種斜面試管斜面菌種培養(yǎng)采用馬鈴薯葡萄糖固體培養(yǎng)基(固體PDA)。
3.種子培養(yǎng)種子培養(yǎng)為馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(液體PDA)。
馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA)制備取新鮮馬鈴薯200克，去皮切成小塊，加水1升煮沸30分鐘，過(guò)濾棄馬鈴薯，濾夜加水補(bǔ)足至1升，加入葡萄糖20克，PH自然。
上述馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基中加入瓊脂15克，即為固體PDA培養(yǎng)基。
4.發(fā)酵培養(yǎng)馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(液體PDA)，PH自然。
5.培養(yǎng)時(shí)間試管斜面菌種活化培養(yǎng)48～72小時(shí)，種子搖床培養(yǎng)時(shí)間72～96小時(shí)，發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間4～6天。
6.培養(yǎng)溫度試管斜面菌種培養(yǎng)溫度28℃±2℃，種子搖床培養(yǎng)溫度28℃±2℃，發(fā)酵培養(yǎng)溫度為30℃±2℃。
本發(fā)明所述的元江黑孢菌是從元江蘆薈植物體中分離篩選得到的、能夠人工發(fā)酵產(chǎn)生與寄主植物類(lèi)似藥用作用有效成分的一種絲狀真菌。為獲得化合物蘆薈內(nèi)脂提供了一種新的途徑。近期研究表明蘆薈內(nèi)脂具有抑制人白血病淋巴細(xì)胞(MolT-4)、人骨髓白血病淋巴細(xì)胞(K-562)、人肝腫瘤細(xì)胞(CA)，以及對(duì)星型石膏樣毛癬菌(Trichophyton gypseum astenides)人皮膚真菌生長(zhǎng)作用具有顯著的高生物活性。


附圖為本發(fā)明所述菌株顯微形態(tài)圖(Olympus顯微鏡，200X)。
具體實(shí)施例方式
取編號(hào)YM-38279菌種，在無(wú)菌條件下(無(wú)菌室或超凈工作臺(tái))，用接種針挑取少許菌種，轉(zhuǎn)接于已滅菌的固體PDA培養(yǎng)基試管(18×180mm)中，置培養(yǎng)箱內(nèi)28℃±2℃活化培48-72小時(shí)。
取出活化48-72小時(shí)的斜面菌種，在無(wú)菌條件下，以同樣方式接入活化好的菌種到已滅菌的種子液體PDA培養(yǎng)基中，在28℃±2℃下?lián)u床培養(yǎng)72-96小時(shí)后，即得YM-38279液體種子。
按發(fā)酵數(shù)量比例，發(fā)酵采用一定容量的發(fā)酵容器，裝入配制好的液體PDA培養(yǎng)基適量(發(fā)酵液/升)，121℃或15磅滅菌30-50分鐘后，待發(fā)酵培養(yǎng)基冷卻至28-32℃，在無(wú)菌條件下，取事先培養(yǎng)的YM-38279種子，接種于裝有一定量的液體PDA發(fā)酵培養(yǎng)基中，種子接種量為5-10％(v/w)，置30℃±2℃通氣或攪拌培養(yǎng)4-6天。在發(fā)酵期間，注意發(fā)酵容器溫度變化，檢查有無(wú)染菌現(xiàn)象。
發(fā)酵完畢，收集發(fā)酵液，裝入一定體積的容器內(nèi)，按常規(guī)化學(xué)分離提取方法，采用乙酸乙酯提取蘆薈內(nèi)脂混合物；再采用200-300目硅膠(Silica G)柱層析方法，經(jīng)柱層析(國(guó)產(chǎn)200-300目硅膠，氯仿-甲醇95∶5)→組分C→柱層析(硅膠，氯仿-甲醇8∶2)→組分F→柱層析(國(guó)產(chǎn)200-300目硅膠，石油醚-乙酸乙酯6∶4)→組分J→反相柱層析(RP-18，甲醇-水8∶2)→蘆薈內(nèi)脂。每升發(fā)酵液可得到蘆薈內(nèi)脂7-9毫克(mg/L)。
本發(fā)明所述菌株的18SRNA堿基組成系列如下(DNA1718bp)AGTNTNCGGCCCTGAGTGGTGCGNTGCCGACCTCTCTGGGCCAGTCCCAAAGCCTCACTGAGCCATTCAATCGGTAGTAGCGACGGGCGGTGTGTACAAAGGGCAGGGACGTAATCAACGCAAGCTGATGACTTGCGCTTACTAGGGATTCCTCGTTGAAGAGCAATAATTGCAATGCTCTATCCCCAGCACGACGGAGTTTAACAAGATTACCCAGGCATCTCTGCCAAGGAGGAACTCGCTGGCTCCGTCAGTGTAACGCGCGTGCGGCCCAGAACATCTAAGGGCATCACAGACCTGTTATTGCCTAAAACTTCCATCCGCTTGAGCGGATAGTCCCTCTAAGAAGCCAGCGTACTGCCAAAGCAATACGGGCTATTTAGTAGGTTAAGGTCTCGTTCGTTATCGCAATTAAGCAGACAAATCACTCCACCAACTAAGAACGGCCATGCACCACCACCCACAAAATCAAGAAAGAGCTCTCAATCTGTCAATCCTCATTGTGTCTGGACCTGGTGAGTTTCCCCGTGTTGAGTCAAATTAAGCCGCAGGCTCCACCCCTGGTGGTGCCCTTCCGTCAATTTCTTTAAGTTTCAGCCTTGCGACCATACTCCCCCCAGAACCCAAAGACTTTGATTTCTCGTAAGGTGCCGAGCGAGTCAAATAATAACATCGCCCGATCCCTAGTCGGCATAGTTTATGGTTAAGACTACGACGGTATCTGATCGTCTTCGATCCCCTAACTTTCGTTCCTGATTAATGAAAACATCCTTGGCGAATGCTTTCGCAGTAGTTAGTCTTCCGTAAATCCAAGAATTTCACCTCTGACAACGGAATACTGACGCCCCCGACTGTCCCTATTAATCATTACGGCGGTCCTAGAAACCAACAAAATAGAACCACACGTCCTATTCTATTATTCCATGCTAATGTATTCGAGCATAGGCCTGCTTTGAACACTCTAATTTTTTCACAGTAAAAGTCCTGGTTCCCCGACACACCCAGTGAAGGGCATGCGGTTCCCCAGAGGGAAAGGCCCGGCCGAACCAGTGCACGCGGTGAGGCGGACCGGCCAGCCAGGCCCAAGGTTCAACTACGAGCTTTTTAACTGCAACAACTTTAATATACGCTATTGGAGCTGGAATTACCGCGGCTGCTGGCACCAGACTTGCCCTCCAATTGTTCCTCGTTAAGGGATTTAAATTGTACTCATTCCAATTACAAGACCCAAAAGAGCCCTGTATCAGTATTTATTGTCACTACCTCCCCGAGTCGGGATTGGGTAATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTTGGATGTAGTAGCCGTTTCTCAGGCTCCTTCTCCGGGGTCGAGCCCTAACCCTCCGTTACCCGTTGTAACCATGGCAGGCCAAGACCCTGCCATCGAAAGTTGATAGGGCAGAAATTTGAATGAACCATCGCCGGCGCAAGGCCATGCGATTCGAGAAGTTATTATGAATCACCAAGAAGCCCCGAAGGGCATTGGTTTTTAATCTAATAAATACACCCCTTCGTGAGTTGGGGTTTTTAGCATGTATTAGCTCTAGAATTACCACGGTTATCCATGTAGTAAGGTACTATCAAATAAACGATAACTGATTTAATGAGCCATTCGCAGTTTCGCGGTATAATTGCTTATACTTAGACATGCATGGCTTAATCTTTGAGACAAGCATATTACTACTGGCAGAACANCCCAG
權(quán)利要求
1.一種元江黑孢菌，其特征是命名為元江黑孢菌Nigrospora yuanjiangensissp.nov.，Chen et Yin Ym38279，現(xiàn)保藏在國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局指定的保藏單位，保藏編號(hào)為CCTCC NOM203079。
2.按照權(quán)利要求1所的元江黑孢菌，其特征是其18SRNA堿基組成系列如下AGTNTNCGGCCCTGAGTGGTGCGNTGCCGACCTCTCTGGGCCAGTCCCAAAGCCTCACTGAGCCATTCAATCGGTAGTAGCGACGGGCGGTGTGTACAAAGGGCAGGGACGTAATCAACGCAAGCTGATGACTTGCGCTTACTAGGGATTCCTCGTTGAAGAGCAATAATTGCAATGCTCTATCCCCAGCACGACGGAGTTTAACAAGATTACCCAGGCATCTCTGCCAAGGAGGAACTCGCTGGCTCCGTCAGTGTAACGCGCGTGCGGCCCAGAACATCTAAGGGCATCACAGACCTGTTATTGCCTAAAACTTCCATCCGCTTGAGCGGATAGTCCCTCTAAGAAGCCAGCGTACTGCCAAAGCAATACGGGCTATTTAGTAGGTTAAGGTCTCGTTCGTTATCGCAATTAAGCAGACAAATCACTCCACCAACTAAGAACGGCCATGCACCACCACCCACAAAATCAAGAAAGAGCTCTCAATCTGTCAATCCTCATTGTGTCTGGACCTGGTGAGTTTCCCCGTGTTGAGTCAAATTAAGCCGCAGGCTCCACCCCTGGTGGTGCCCTTCCGTCAATTTCTTTAAGTTTCAGCCTTGCGACCATACTCCCCCCAGAACCCAAAGACTTTGATTTCTCGTAAGGTGCCGAGCGAGTCAAATAATAACATCGCCCGATCCCTAGTCGGCATAGTTTATGGTTAAGACTACGACGGTATCTGATCGTCTTCGATCCCCTAACTTTCGTTCCTGATTAATGAAAACATCCTTGGCGAATGCTTTCGCAGTAGTTAGTCTTCCGTAAATCCAAGAATTTCACCTCTGACAACGGAATACTGACGCCCCCGACTGTCCCTATTAATCATTACGGCGGTCCTAGAAACCAACAAAATAGAACCACACGTCCTATTCTATTATTCCATGCTAATGTATTCGAGCATAGGCCTGCTTTGAACACTCTAATTTTTTCACAGTAAAAGTCCTGGTTCCCCGACACACCCAGTGAAGGGCATGCGGTTCCCCAGAGGGAAAGGCCCGGCCGAACCAGTGCACGCGGTGAGGCGGACCGGCCAGCCAGGCCCAAGGTTCAACTACGAGCTTTTTAACTGCAACAACTTTAATATACGCTATTGGAGCTGGAATTACCGCGGCTGCTGGCACCAGACTTGCCCTCCAATTGTTCCTCGTTAAGGGATTTAAATTGTACTCATTCCAATTACAAGACCCAAAAGAGCCCTGTATCAGTATTTATTGTCACTACCTCCCCGAGTCGGGATTGGGTAATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTTGGATGTAGTAGCCGTTTCTCAGGCTCCTTCTCCGGGGTCGAGCCCTAACCCTCCGTTACCCGTTGTAACCATGGCAGGCCAAGACCCTGCCATCGAAAGTTGATAGGGCAGAAATTTGAATGAACCATCGCCGGCGCAAGGCCATGCGATTCGAGAAGTTATTATGAATCACCAAGAAGCCCCGAAGGGCATTGGTTTTTAATCTAATAAATACACCCCTTCGTGAGTTGGGGTTTTTAGCATGTATTAGCTCTAGAATTACCACGGTTATCCATGTAGTAAGGTACTATCAAATAAACGATAACTGATTTAATGAGCCATTCGCAGTTTCGCGGTATAATTGCTTATACTTAGACATGCATGGCTTAATCTTTGAGACAAGCATATTACTACTGGCAGAACANCCCAG
全文摘要
本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種其發(fā)酵物具有藥用功能的微生物。本發(fā)明所述的元江黑孢菌系從中國(guó)云南省元江地區(qū)蘆薈(Aloe yuanjiangensis)植物體中分離獲得的?，F(xiàn)保藏在國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局專(zhuān)利局保藏單位保藏，保藏單位名稱(chēng)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期為2003年11月18日，保藏編號(hào)為M203079。本發(fā)明所述的元江黑孢菌是從元江蘆薈植物體中分離篩選得到的、能夠人工發(fā)酵產(chǎn)生與寄主植物類(lèi)似藥用作用有效成分的一種絲狀真菌。為獲得化合物蘆薈內(nèi)脂提供了一種新的途徑。
文檔編號(hào)C12N15/31GK1624102SQ200310119320
公開(kāi)日2005年6月8日 申請(qǐng)日期2003年12月4日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月4日
發(fā)明者陳有為, 尹建雯, 李治瀅, 李紹蘭, 楊麗源, 周斌 申請(qǐng)人:云南省微生物研究所