專(zhuān)利名稱(chēng)：通過(guò)擴(kuò)增巨核祖細(xì)胞和成熟巨核細(xì)胞制備巨核細(xì)胞制劑的方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及制備巨核細(xì)胞制劑的方法，尤其是以造血組織(臍帶血和骨髓等)來(lái)源的干細(xì)胞為種子，以血小板生成素(TPO)，白介素11(IL-11)和肝素組合為巨核細(xì)胞擴(kuò)增刺激因子的擴(kuò)增體系，通過(guò)擴(kuò)增巨核祖細(xì)胞和成熟巨核細(xì)胞制備巨核細(xì)胞制劑的方法及用途。
背景技術(shù)：
血小板是體內(nèi)維持正常血液凝固和血管壁完整性所必須的血細(xì)胞，其數(shù)量的異常會(huì)導(dǎo)致血液和血栓性疾病的發(fā)生。血小板減少的發(fā)生率較高，患者因反復(fù)出血需經(jīng)常性治療，嚴(yán)重危害其身心健康，并給患者帶來(lái)很重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，出血嚴(yán)重時(shí)甚至可危及生命。自體或異體造血干細(xì)胞(HSC)移植是治療白血病、淋巴瘤、實(shí)體腫瘤、代謝性和嚴(yán)重自身免疫疾病等嚴(yán)重危害人類(lèi)健康疾病的最有效的方法之一。但干細(xì)胞移植后的主要并發(fā)癥之一是骨髓抑制期因血小板顯著減少而致出血，導(dǎo)致患者死亡。再生障礙性貧血雖然表現(xiàn)全血減少，但血小板減少的治療最為困難。干細(xì)胞移植后和再生障礙性貧血的血小板減少，治療上血小板輸注是其主要對(duì)癥治療手段，但由于價(jià)格昂貴，反復(fù)輸注可因產(chǎn)生血小板抗體而最終“無(wú)效輸注”。一些血小板生成刺激因子如血小板生成素(TPO)，盡管已進(jìn)入臨床試驗(yàn)，但患者使用TPO后體內(nèi)產(chǎn)生中和抗體，而且可以出現(xiàn)骨髓纖維化和骨髓增生性紊亂等副作用。人們正在著力探尋新的方法，如采集造血干細(xì)胞體外擴(kuò)增的巨核細(xì)胞輸注以加速血小板的恢復(fù)，迄今，巨核細(xì)胞體外擴(kuò)增的I/II期的臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示能幫助病人恢復(fù)血小板，沒(méi)有明顯的副作用，而且可減少自體骨髓抑制的移植物抗宿主病，從而越來(lái)越受到人們關(guān)注。但迄今報(bào)道的擴(kuò)增體系均使用多種細(xì)胞因子的組合，不僅價(jià)格昂貴，而且其中部分因子尚無(wú)獲得臨床許可，因此臨床適用性不強(qiáng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供可以治療血細(xì)胞減少和血小板減少性疾病的巨核細(xì)胞的制備方法及用途，這些巨核細(xì)胞的種子細(xì)胞來(lái)自包括臍帶血在內(nèi)的造血組織，經(jīng)體外誘導(dǎo)分化擴(kuò)增的巨核細(xì)胞直接靜脈內(nèi)注射，在體內(nèi)發(fā)揮很好的作用。本發(fā)明提供的制備方法，可以將干細(xì)胞從自體或異體的造血組織血中分離出來(lái)，制備成巨核細(xì)胞治療產(chǎn)品；所制備的巨核細(xì)胞產(chǎn)品可以通過(guò)靜脈移植治療大劑量放、化療和其他原因引起的血小板減少性癥；制備的細(xì)胞治療產(chǎn)品可以用作基因治療載體，轉(zhuǎn)染促巨核細(xì)胞生成的基因，進(jìn)行基因治療和研究巨核細(xì)胞生成機(jī)制。
為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種通過(guò)擴(kuò)增巨核祖細(xì)胞和成熟巨核細(xì)胞制備巨核細(xì)胞制劑的方法，是以包括臍帶血、骨髓在內(nèi)的造血組織中分離提取的干細(xì)胞為種子細(xì)胞，在包含血小板生成素(TPO)，白介素-11(IL-11)和肝素(Heparin)的無(wú)血清培養(yǎng)基中定向擴(kuò)增。
所述的培養(yǎng)基中含有血小板生成素(TPO)50-200ng/ml，白介素-11(IL-11)12.5-200ng/ml，肝素(Heparin)5-100IU/ml。
所述的培養(yǎng)基中最佳濃度是TPO，50ng/ml；IL-11，50ng/ml；肝素，25IU/ml。
通過(guò)擴(kuò)增巨核祖細(xì)胞和成熟巨核細(xì)胞制備巨核細(xì)胞制劑的方法用CD34+分離試劑盒從臍血或骨髓中分離CD34+細(xì)胞，接種于培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)袋中，在添加了包含血小板生成素(TPO)，白介素-11(IL-11)和肝素(Heparin)的培養(yǎng)液的無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天，細(xì)胞總數(shù)擴(kuò)增5.3±3.25倍，其中(40.86±15.02)％CD41a+為巨核祖細(xì)胞和成熟巨核細(xì)胞，還含有(39.98±25.47)％的CD34+干祖細(xì)胞，培養(yǎng)10天后，細(xì)胞數(shù)擴(kuò)增36.1±8.63倍，其中(69.26±16.88)％為巨核祖細(xì)胞和成熟巨核細(xì)胞，還含有(2.835±1.29)％的CD34+干祖細(xì)胞。
上述制備的巨核細(xì)胞制劑在治療放化療后、干細(xì)胞移植及其他原因引起的血小板減少癥的藥物中的用途。
所述的巨核細(xì)胞制劑，經(jīng)靜脈輸入到輻射動(dòng)物體內(nèi)可進(jìn)入骨髓，可顯著增加動(dòng)物生存率，幫助動(dòng)物恢復(fù)血小板及其它血細(xì)胞，應(yīng)用于治療各種原因?qū)е碌难“鍦p少癥。
1、臍帶血CD34陽(yáng)性細(xì)胞的制備a、臍血標(biāo)本的處理收集足月妊娠的新鮮CB標(biāo)本，臍血采集量為50-80ml，通過(guò)重力將盡可能多的臍血收集于含有20ml CPD-A(citrate-phosphate-adeninel)抗凝劑(Baxter HealthCare，Deerfield，IL)的采血袋中。按5∶1比例加入6.0％的羥乙基淀粉(終濃度1.2％)，離心沉淀紅細(xì)胞，收集富含有核細(xì)胞的血漿，再用Ficoll淋巴細(xì)胞分離液分離單個(gè)核細(xì)胞(MNC)。
b、CD34陽(yáng)性細(xì)胞的制備取Ficoll分選出的單個(gè)核細(xì)胞，采用MiniMACS免疫磁性吸附柱分離裝置，應(yīng)用MACS CD34+細(xì)胞單選試劑盒(Miltenyi Biotec Inc，Sunnyvale，CA)按其說(shuō)明進(jìn)行分選CD34+細(xì)胞。首先在單個(gè)核細(xì)胞中加入阻斷劑及免疫磁珠標(biāo)記的CD34抗體，4℃孵育30min，然后將分離柱放在MACS磁場(chǎng)中，CD34+細(xì)胞通過(guò)磁力作用留在分離柱中，將分離柱移出磁場(chǎng)，洗出CD34+細(xì)胞，為提高CD34+細(xì)胞的純度可二次過(guò)柱。取出2×105細(xì)胞標(biāo)記PE-抗人CD34抗體，2×105細(xì)胞標(biāo)記PE-抗人IgG1抗體作為陰性對(duì)照，檢測(cè)CD34+細(xì)胞純度，經(jīng)過(guò)兩次分選后的臍血CD34+細(xì)胞純度可達(dá)95％以上。
2、巨核祖細(xì)胞體外誘導(dǎo)擴(kuò)增a、巨核祖細(xì)胞的體外誘導(dǎo)擴(kuò)增新鮮分離的臍血CD34+細(xì)胞(1×105/ml)接種在終體積為1ml的24孔培養(yǎng)板中，包含TPO，TPO+IL-11，TPO+IL-11+肝素的無(wú)血清培養(yǎng)基(Stem Cell Technologies，Vancouver，Canada)中，細(xì)胞在37℃，5％CO2潮濕環(huán)境的孵箱中培養(yǎng)，每3.5天半量換液，在第7、10、14天取出細(xì)胞做胎盤(pán)蘭計(jì)數(shù)總細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)、細(xì)胞染色、免疫組化、巨核祖細(xì)胞集落形成分析、抗體檢測(cè)及電鏡分析。
b、細(xì)胞染色及免疫組化分析取培養(yǎng)7、10、14天的細(xì)胞(2×105cells)離心去培養(yǎng)液，用PBS洗兩次，使細(xì)胞離心到涂有多聚賴(lài)氨酸的載波片表面，風(fēng)干2-3分鐘，加入May-Grunwald(Sigma)染液5min，PBS(PH7.2，0.1M)洗1-5min，1∶20稀釋Giemsa(Sigma)復(fù)染15-20min，雙蒸水沖洗，風(fēng)干，鏡下觀察。
免疫組化分析，細(xì)胞涂片后，在甲醇丙酮(1∶1)固定液固定90s，加入生物素—鼠抗人CD41在37℃孵育40min，TBS緩沖液(50ml 0.5MTris-HCL與50ml 9％NaCL定容在400ml雙蒸水中)洗3-4次，加堿性磷酸酶—鏈霉卵白素，37℃孵育30min，TBS緩沖液洗3-4次，固紅顯色10min，Mayer蘇木素復(fù)染1hr，0.5％氨水返藍(lán)5s，自來(lái)水沖凈晾干，鏡下觀察，細(xì)胞核呈藍(lán)色，胞膜或胞漿呈紅色標(biāo)記的為陽(yáng)性細(xì)胞；無(wú)紅色標(biāo)記的為陰性細(xì)胞。
c、流式細(xì)胞儀檢測(cè)抗體取培養(yǎng)7、10、14天的細(xì)胞(2×105cells)離心去培養(yǎng)液，用PBS洗一次，PE-鼠抗人CD41a，F(xiàn)ITC-CD34，F(xiàn)ITC-CD61單克隆抗體與細(xì)胞在4℃下孵育30min，離心去上清并用PBS洗二次，將細(xì)胞固定在0.5ml 1％多聚甲醛中，流式細(xì)胞儀(Becton Dickinson FACSVantage)測(cè)定CD34+，CD41a+，CD61+，CD34/CD41a+，CD41a/CD61+的表達(dá)，CellQuest3.3軟件分析結(jié)果。
d、巨核細(xì)胞集落形成分析巨核細(xì)胞集落形成分析試劑盒(Mega-Cult-C；Stem CellTechnologies，Vancouver，Canada)用來(lái)鑒定巨核祖細(xì)胞生長(zhǎng)所形成的細(xì)胞集落，按其操作說(shuō)明使用。簡(jiǎn)言之，5×103純化的CD34+及擴(kuò)增7、10天的細(xì)胞種入無(wú)血清(包含TPO 50ng/ml，IL-3 10ng/ml，IL-6 10ng/ml，膠原1.1mg/ml)的雙層培養(yǎng)板中，細(xì)胞在37℃孵箱中孵育10-12天后，細(xì)胞經(jīng)脫水、固定、及免疫組化分析。巨核細(xì)胞集落用抗GP II b/IIIa抗體及堿性磷酸酶檢測(cè)系統(tǒng)(APAAP)檢測(cè)，細(xì)胞核用Evan’s Blue復(fù)染，陽(yáng)性克隆根據(jù)其大小判定，小(3-10細(xì)胞/集落)，中等(11-20細(xì)胞/集落，21-50細(xì)胞/集落)，大(＞50細(xì)胞/克隆)。
e、巨核細(xì)胞透射電鏡及血小板過(guò)氧化物酶(PPO)檢測(cè)將培養(yǎng)7天，10天，14天的細(xì)胞(1×106cells)收集，用PBS(0.1M，PH7.2)洗兩遍，2.5％戊二醛4℃固定2-3hr后，再用1％的鋨酸固定2hr，丙酮梯度脫水，環(huán)氧丙烷，812環(huán)氧樹(shù)脂浸透，60℃聚合，超薄切片，枸櫞酸鉛，醋酸鈾雙染，電鏡觀察。
電鏡PPO檢測(cè)將培養(yǎng)7天，10天，14天的細(xì)胞(2×106cells)收集，用生理鹽水洗兩次，孵育液(DAB，Ring/Tris緩沖液，3％H2O2)孵育90min，離心，2.5％戊二醛4℃固定2hr，常規(guī)包埋，超薄切片，枸櫞酸鉛，醋酸鈾雙染，電鏡觀察。
f、非肥胖性糖尿病/嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷鼠(NOD/SCID)體內(nèi)細(xì)胞移植實(shí)驗(yàn)NOD/SCID小鼠(雄性，8-10周，20-25g，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所)飼養(yǎng)于SPF級(jí)層流架中。經(jīng)Cs源照射(275cGy)后隨機(jī)分為兩組，一組為尾靜脈注射PBS組，另一組為尾靜脈注射擴(kuò)增的巨核祖細(xì)胞組，移植均在放射完4小時(shí)內(nèi)，移植1×107/100ul的巨核祖細(xì)胞(CD34+細(xì)胞經(jīng)TPO+IL-11+Heparin擴(kuò)增7天)，在移植后的第7天，14天，21天，28天分別測(cè)小鼠的外周血象、流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血人的血小板(人CD41a/鼠CD41)及骨髓中人細(xì)胞(人CD41a、人CD45)的含量。
g、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行分析，本發(fā)明結(jié)果均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(％±SD)表示。差異顯著性采用t檢驗(yàn)。
按照本發(fā)明提供的制備技術(shù)，可以將干細(xì)胞從自體或異體的造血組織血中分離出來(lái)，制備成巨核細(xì)胞治療產(chǎn)品；按照本發(fā)明制備技術(shù)制備的巨核細(xì)胞產(chǎn)品可以通過(guò)靜脈移植治療大劑量放、化療和其他原因引起的血小板減少性癥；按照本發(fā)明制備技術(shù)制備的細(xì)胞治療產(chǎn)品可以用作基因治療載體，轉(zhuǎn)染促巨核細(xì)胞生成的基因，進(jìn)行基因治療和研究巨核細(xì)胞生成機(jī)制。


圖1a是不同因子組合巨核細(xì)胞總細(xì)胞及各表面標(biāo)記擴(kuò)增倍數(shù)(擴(kuò)增7天)。
圖1b是不同因子組合巨核細(xì)胞總細(xì)胞及各表面標(biāo)記擴(kuò)增倍數(shù)(擴(kuò)增10天)。
圖2a是不同因子組合擴(kuò)增的巨核細(xì)胞集落分析(擴(kuò)增7天)。
圖2b是不同因子組合擴(kuò)增的巨核細(xì)胞集落分析(擴(kuò)增10天)。
圖3a是巨核細(xì)胞大克隆(＞50個(gè))的巨核祖細(xì)胞集落分析(CFU-MK)。
圖3b是中等大小克隆(11-20個(gè))的巨核祖細(xì)胞集落分析(CFU-MK)。
圖4是巨核細(xì)胞分化過(guò)程中的細(xì)胞表面標(biāo)記的變化(流式細(xì)胞儀分析)。
圖5是May-Grunwald-Giemsa染色的巨核細(xì)胞，左邊為4倍體的巨核細(xì)胞，右邊為多倍體巨核細(xì)胞，箭頭為巨核細(xì)胞。
圖6是巨核細(xì)胞透射電鏡及組化電鏡(培養(yǎng)10天)，左邊為透射電鏡，右邊為組化電鏡(血小板過(guò)氧化物酶檢測(cè))。
具體實(shí)施例方式
下面，結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步地說(shuō)明，但本發(fā)明并不受限于下述實(shí)施例。
實(shí)施例1巨核細(xì)胞的體外誘導(dǎo)擴(kuò)增取新鮮分離的臍血CD34+細(xì)胞(1×105/ml)接種在終體積為含有本發(fā)明的血小板生成素(TPO)+重組人白細(xì)胞介素-11(rhIL-11)+肝素(Heparin)組合的無(wú)血清培養(yǎng)基中，其中含TPO50ng/ml，IL-1150ng/ml，Heparin25IU/ml，在37℃，5％CO2潮濕環(huán)境的孵箱中培養(yǎng)，每3.5天半量換液，在第7、10、14天作各種分析。同時(shí)采用TPO單獨(dú)(50ng/ml)和TPO(50ng/ml)+IL-11(50ng/ml)組合的二種無(wú)血清培養(yǎng)擴(kuò)增方法作為對(duì)照，以評(píng)估TPO+IL-11+肝素組合的無(wú)血清培養(yǎng)擴(kuò)增體系制備巨核細(xì)胞產(chǎn)品的效果。擴(kuò)增過(guò)程中細(xì)胞總數(shù)、不同階段的祖細(xì)胞及巨核細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)等結(jié)果見(jiàn)表1、表2和圖1a、圖1b、圖2a、圖2b、圖3a、圖3b、和圖4。
表1.TPO單獨(dú)誘導(dǎo)臍血CD34+細(xì)胞時(shí)總細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)及巨核細(xì)胞表面標(biāo)記所占的百分比例(a)擴(kuò)增7天時(shí)

(b)擴(kuò)增10天時(shí)

表2.TPO與IL-11，TPO、IL-11、肝素聯(lián)合時(shí)巨核細(xì)胞各標(biāo)記所占的百分比例
(a)擴(kuò)增7天時(shí)

(b)擴(kuò)增10天時(shí)

TPO(50ng/ml)單獨(dú)作用時(shí)，第7天細(xì)胞總數(shù)分別擴(kuò)增4.6±2.31倍，CD41a/CD34+細(xì)胞擴(kuò)增4.01±1.69倍，CD41a+細(xì)胞擴(kuò)增21.3±3.73倍，CD61+細(xì)胞擴(kuò)增21.4±3.92倍，CD41a/CD61+細(xì)胞擴(kuò)增11.7±2.72倍；TPO(50ng/ml)與IL-11(50ng/ml)聯(lián)合作用時(shí)，7天計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)擴(kuò)增6.74±1.35倍，CD41a/CD34+細(xì)胞擴(kuò)增10.51±4.79倍，比TPO(50ng/ml)單獨(dú)作用時(shí)增加了2.62倍，CD34+細(xì)胞擴(kuò)增1.49±1.04倍，較TPO(50ng/ml)單獨(dú)作用時(shí)增加了1.84倍，CD41a+細(xì)胞擴(kuò)增24.28±15.02倍，CD61+細(xì)胞擴(kuò)增27.69±17.15倍，CD41a/CD61+細(xì)胞擴(kuò)增20.74±15.73倍，沒(méi)有比TPO(50ng/ml)單獨(dú)作用時(shí)增加；在TPO(50ng/ml)和IL-11(50ng/ml)的擴(kuò)增體系中，第0天加入肝素(25Iu/ml)，7天總體細(xì)胞倍數(shù)CD41a+，CD61+，CD41a/CD61+擴(kuò)增沒(méi)有比單因子及雙因子的擴(kuò)增體系增加，CD34+細(xì)胞為無(wú)肝素組的1.24倍，CD41a/CD34+細(xì)胞肝素組為無(wú)肝素組的2.85倍，擴(kuò)增達(dá)到29.93±6.39倍，與雙因子組相比差異顯著(P＝0.002，＜0.01)第3天加入肝素時(shí)，CD34+細(xì)胞為無(wú)肝素組的1.22倍，CD41a+，CD61+，CD41a/CD61+、CD41a/CD34+擴(kuò)增無(wú)明顯變化。
TPO(50ng/ml)單獨(dú)作用第10天時(shí)，細(xì)胞總數(shù)分別擴(kuò)增37.4±13倍，CD41a/CD34+細(xì)胞擴(kuò)增4.6±2.49倍，CD41a+細(xì)胞擴(kuò)增251.4±95.7，CD61+細(xì)胞擴(kuò)增336.2±147.5倍，CD41a/CD61+細(xì)胞擴(kuò)增171.7±68；再加入IL-11(50ng/ml)后，10天細(xì)胞總數(shù)擴(kuò)增47.73±13.45倍，CD34+、CD41a/CD34+細(xì)胞分別擴(kuò)增了2.33±1.64、6.11±0.36倍，較TPO(50ng/ml)單獨(dú)作用時(shí)增加了1.42、1.33倍，CD41a+、CD61+、CD41a/CD61+細(xì)胞分別擴(kuò)增了283.32±12.88、408.69±10.9、216.51±11.68倍，較TPO(50ng/ml)單獨(dú)作用時(shí)增加了1.13、1.22、1.26倍；在上述體系中0天加入肝素，第10天CD41a+、CD61+、CD41a/CD61+較沒(méi)有比無(wú)肝素的其它二組增加，3天加入肝素，10天CD34+、CD41a/CD34+、CD41a/CD61+較無(wú)肝素組沒(méi)有增加，CD41a+、CD61+較無(wú)肝素組增加1.11、1.11倍，肝素在第5天，7天加入對(duì)巨核祖細(xì)胞的擴(kuò)增沒(méi)有明顯作用。
擴(kuò)增后進(jìn)行巨核細(xì)胞集落(CFU-MK)分析，發(fā)現(xiàn)TPO(50ng/ml)單獨(dú)作用后7天，巨核祖細(xì)胞集落中的小集落(3-10個(gè))擴(kuò)增了96.44±19.73倍，中等集落中(11-20個(gè))擴(kuò)增了117.72±36.33倍，(20-50個(gè))擴(kuò)增了67.49±29.9倍，大集落(＞50個(gè))擴(kuò)增了32.95±3.56倍；加入IL-11(50ng/ml)后，小集落(3-10個(gè))擴(kuò)增了73.17±18.8倍，中等集落中(11-20個(gè))擴(kuò)增了82.42±24.4倍，(20-50個(gè))擴(kuò)增了99.74±14.21倍，大集落(＞50個(gè))擴(kuò)增了70.92±18.79倍；加入肝素(25Iu/ml)后，7天巨核細(xì)胞集落中，小集落(3-10個(gè))擴(kuò)增了99.11±17.92倍，中等集落中(11-20個(gè))擴(kuò)增了132.74±32.11倍，(20-50個(gè))擴(kuò)增了123.5±39.62倍，大集落(＞50個(gè))擴(kuò)增了84.02±41.8倍。
TPO(50ng/ml)單獨(dú)作用后10天后，巨核細(xì)胞集落中的小集落(3-10個(gè))擴(kuò)增了270.8±23.56倍，中等集落中(11-20個(gè))擴(kuò)增了31.28±10.32倍，(20-50個(gè))擴(kuò)增了9.58±5.63倍，大集落(＞50個(gè))擴(kuò)增了3.68±1.36倍；加入IL-11(50ng/ml)后，小集落(3-10個(gè))擴(kuò)增了326.87±25.64倍，中等集落中(11-20個(gè))擴(kuò)增了32.48±13.26倍，(20-50個(gè))擴(kuò)增了11.38±7.89倍，大集落(＞50個(gè))擴(kuò)增了11.2±5.63倍；加入肝素(25u/ml)后，7天巨核細(xì)胞集落中的小集落(3-10個(gè))擴(kuò)增了369.17±34.16倍，中等集落中(11-20個(gè))擴(kuò)增了134.68±23.6倍，(20-50個(gè))擴(kuò)增了34.71±15.3倍，大集落(＞50個(gè))擴(kuò)增了26.6±10.1倍。
如圖5所示，取TPO+IL11+肝素組合擴(kuò)增后的細(xì)胞作May-Grunwald-Giemsa染色，發(fā)現(xiàn)多倍體的巨核細(xì)胞，其數(shù)量隨培養(yǎng)天數(shù)的增加而增加。免疫組化分析巨核細(xì)胞隨培養(yǎng)天數(shù)的增加而增多，10天為(60-70)％，14天時(shí)達(dá)(80-90)％。透射電鏡及血小板過(guò)氧化物酶(PPO)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)10天，14天的透射電鏡顯示培養(yǎng)的巨核細(xì)胞有正常的巨核細(xì)胞形態(tài)，胞漿出現(xiàn)界膜，血小板過(guò)氧化物酶(PPO)實(shí)驗(yàn)顯示細(xì)胞核膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)為陽(yáng)性，線粒體及顆粒為陰性，細(xì)胞外形不規(guī)則，有偽足、突起，94％以上為巨核細(xì)胞，如圖6。
實(shí)施例2.臍帶血CD34陽(yáng)性細(xì)胞體外擴(kuò)增的巨核細(xì)胞產(chǎn)品的應(yīng)用1)本實(shí)例取正常分娩的臍帶血，采用磁珠親和柱(MACS)分離法分離CD34+細(xì)胞，加入含TPO+IL-11+Heparin的無(wú)血清培養(yǎng)基中定向擴(kuò)增7天，收集巨核細(xì)胞，制成1×107/100ul備用。
2)非肥胖性糖尿病/嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷小鼠(NOD/SCID)經(jīng)Cs源照射(275cGy)后隨機(jī)分為兩組，一組為尾靜脈注射PBS組，另一組為尾靜脈注射擴(kuò)增的上述巨核細(xì)胞組，注射均在照射后4小時(shí)內(nèi)進(jìn)行，移植1×107/100ul的巨核細(xì)胞，在移植后的第7天，14天，21天分別測(cè)小鼠的外周血象、流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血人的血小板及骨髓中人的細(xì)胞。
3)移植巨核細(xì)胞體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果移植巨核細(xì)胞7、14、21天后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)鼠骨髓中人細(xì)胞的含量及外周血中檢測(cè)人血小板的含量，移植后7天，小鼠骨髓中人CD45、CD41a未檢測(cè)到，外周血中人CD41a陽(yáng)性率為6.88％；14天小鼠骨髓中人CD45陽(yáng)性率為0.69％，CD41a陽(yáng)性率為0.24％，外周血中人CD41a陽(yáng)性率為8.98％，21天小鼠骨髓中人CD45陽(yáng)性率為6.15％，外周血中人CD41a陽(yáng)性率為13.85％。
巨核祖細(xì)胞的移植極大地改善了血小板減少癥的出現(xiàn)。對(duì)照組PBS組中50％小鼠死亡。而移植細(xì)胞組小鼠狀態(tài)明顯好于對(duì)照組，可全部長(zhǎng)期存活。外周血象檢測(cè)，第3天血小板可達(dá)56萬(wàn)，14天為54萬(wàn)，21天為98萬(wàn)，均明顯好于對(duì)照組，14天對(duì)照組為8萬(wàn)，21天為16萬(wàn)，兩組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)；同時(shí)，移植后21天小鼠白細(xì)胞也有明顯恢復(fù)，達(dá)6.2×109/L，明顯好于對(duì)照組1.6×109/L。
本發(fā)明成功地建立了誘導(dǎo)干細(xì)胞定向分化巨核細(xì)胞的擴(kuò)增體系，即以TPO加IL-11在加肝素為刺激因子的體系。使用的IL-11和肝素均為臨床用藥，TPO也在臨床試驗(yàn)之中，因子組合簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)、擴(kuò)增效果顯著、小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)能生成血小板并明顯改善照射小鼠的造血恢復(fù)，特別是血小板減少的狀況，移植后小鼠可全部存活，而對(duì)照組則有50％的小鼠死亡。這種新的巨核細(xì)胞擴(kuò)增體系為促進(jìn)干細(xì)胞移植后病人血小板的恢復(fù)提供了新的細(xì)胞治療制劑。
權(quán)利要求
1.一種通過(guò)擴(kuò)增巨核祖細(xì)胞和成熟巨核細(xì)胞制備巨核細(xì)胞制劑的方法，是以包括臍帶血、骨髓在內(nèi)的造血組織中分離提取的干細(xì)胞為種子細(xì)胞，在包含血小板生成素(TPO)，白介素-11(IL-11)和肝素(Heparin)的無(wú)血清培養(yǎng)基中定向擴(kuò)增。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的通過(guò)擴(kuò)增巨核祖細(xì)胞和成熟巨核細(xì)胞制備巨核細(xì)胞制劑的方法，其特征是所述的無(wú)血清培養(yǎng)基中含有血小板生成素(TPO)50-200ng/ml，白介素-11(IL-11)12.5-200ng/ml，肝素(Heparin)5-100IU/ml。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的通過(guò)擴(kuò)增巨核祖細(xì)胞和成熟巨核細(xì)胞制備巨核細(xì)胞制劑的方法，其特征是所述的培養(yǎng)基中最佳濃度是TPO，50ng/ml；IL-11，50ng/ml；肝素，25IU/ml。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的通過(guò)擴(kuò)增巨核祖細(xì)胞和成熟巨核細(xì)胞制備巨核細(xì)胞制劑的方法，其特征是用CD34+分離試劑盒從臍血或骨髓中分離CD34+細(xì)胞，接種于培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)袋中，在添加了包含血小板生成素(TPO)，白介素-11(IL-11)和肝素(Heparin)的無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天，細(xì)胞總數(shù)擴(kuò)增5.3±3.25倍，其中(40.86±15.02)％為巨核祖細(xì)胞和成熟巨核細(xì)胞，還含有(39.98±25.47)％的CD34+干祖細(xì)胞，培養(yǎng)10天后，細(xì)胞數(shù)擴(kuò)增36.1±8.63倍，其中(69.26±16.88)％為巨核祖細(xì)胞和成熟巨核細(xì)胞，還含有(2.835±1.29)％的CD34+干祖細(xì)胞。
5.權(quán)利要求1制備的巨核細(xì)胞制劑在治療放化療后、干細(xì)胞移植及其他原因引起的血小板減少癥的藥物中的用途。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的巨核細(xì)胞制劑的用途，其特征是所述的巨核細(xì)胞制劑經(jīng)靜脈輸入到輻射動(dòng)物體內(nèi)可進(jìn)入骨髓，可顯著增加動(dòng)物生存率，幫助動(dòng)物恢復(fù)血小板及其它血細(xì)胞，應(yīng)用于治療各種原因?qū)е碌难“鍦p少癥。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了通過(guò)擴(kuò)增巨核祖細(xì)胞和成熟巨核細(xì)胞制備巨核細(xì)胞制劑的方法及用途，主要涉及一種高效培養(yǎng)和定向誘導(dǎo)干細(xì)胞分化成巨核細(xì)胞的培養(yǎng)擴(kuò)增體系。該體系采用臍帶血和骨髓干細(xì)胞作為種子細(xì)胞，以血小板生成素(TPO)，白介素11(IL－11)和肝素組合的無(wú)血清培養(yǎng)基為巨核細(xì)胞擴(kuò)增的主要成分。按照本發(fā)明技術(shù)制備的巨核細(xì)胞制劑，含有大量的巨核祖細(xì)胞和成熟的巨核細(xì)胞以及CD34+細(xì)胞，具有治療血小板減少、改善干細(xì)胞移植后造血功能的作用。本發(fā)明為再生障礙性貧血、腫瘤病人大劑量放化療及自/異體干細(xì)胞移植后以及其它原因引起的血小板減少癥和全血細(xì)胞減少提供全新而有效的細(xì)胞治療制劑。
文檔編號(hào)C12N5/08GK1554748SQ20031012214
公開(kāi)日2004年12月15日 申請(qǐng)日期2003年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月29日
發(fā)明者韓忠朝, 馮義 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所