專利名稱：動(dòng)物細(xì)胞多孔微載體固定化高效培養(yǎng)方法及其培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及動(dòng)物細(xì)胞多孔微載體固定化高效培養(yǎng)方法及其培養(yǎng)基，更具體地說是利用多孔微載體將動(dòng)物細(xì)胞固定化，在生物反應(yīng)器中無血清高密度培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞，高效表達(dá)基因工程產(chǎn)品或其他生物制品的方法以及所使用的培養(yǎng)基，屬于細(xì)胞工程領(lǐng)域和生物制藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
以基因工程和細(xì)胞融合技術(shù)為標(biāo)志的現(xiàn)代生物技術(shù)在醫(yī)藥工業(yè)中形成了一支新的高科技產(chǎn)業(yè)——現(xiàn)代生物技術(shù)制藥工業(yè)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2001年全球現(xiàn)代生物技術(shù)藥品的銷售額超過300億美元，并且每年以15％-20％的速度增長，而常規(guī)藥物的增長率為5％-8％。動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)是生物制藥產(chǎn)業(yè)中的最關(guān)鍵的一個(gè)技術(shù)平臺(tái)，目前一半以上獲得批準(zhǔn)用于臨床治療的生物制品均通過細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)來生產(chǎn)，而且，隨著大分子功能蛋白和人源(化)抗體的開發(fā)，基因治療和細(xì)胞治療的進(jìn)步，以及組織工程和人造生物器官產(chǎn)品的研發(fā)，細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)將在生物制藥產(chǎn)業(yè)化領(lǐng)域中發(fā)揮更大的作用。
用動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)的生物制品包括所有治療性單克隆抗體、病毒疫苗、干擾素、t-PA、EPO、凝血因子、G-CSF、融合蛋白(如Enbrel)、組織工程產(chǎn)品及其他生物制品。美國FDA批準(zhǔn)的很大部分生物制品均是由動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)生產(chǎn)的。目前主要有細(xì)菌(E.coli)、酵母、哺乳動(dòng)物細(xì)胞(如中國倉鼠卵巢細(xì)胞，即CHO細(xì)胞)三種表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)重組蛋白。細(xì)菌等原核表達(dá)系統(tǒng)繁殖快、易于培養(yǎng)，但表達(dá)的蛋白質(zhì)缺乏轉(zhuǎn)錄后的修飾，如缺乏蛋白質(zhì)限制性酶切位點(diǎn)、二硫鍵、特殊的糖基化、磷酸化、酰胺化作用以及形成天然蛋白質(zhì)精確的三維結(jié)構(gòu)的環(huán)境等。而許多蛋白的生物活性與轉(zhuǎn)錄后的修飾有關(guān)，并且原核系統(tǒng)表達(dá)的蛋白一般為胞內(nèi)產(chǎn)物，需要破碎細(xì)胞才能提取產(chǎn)物，給產(chǎn)物的分離純化帶來困難，同時(shí)還容易受到外源毒素的污染。而真核表達(dá)系統(tǒng)如CHO細(xì)胞表達(dá)的蛋白具有轉(zhuǎn)錄后的修飾作用，與人體自身分泌的天然蛋白無論在結(jié)構(gòu)和功能上都非常近似，因而美國FDA傾向在21世紀(jì)采用真核表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)蛋白質(zhì)藥物。幾乎所有用原核細(xì)胞表達(dá)的蛋白均可采用真核表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)，反之則不盡然，用動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的蛋白都是胞外分泌的，產(chǎn)物的分離純化過程非常簡單，但是，由于細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)比較復(fù)雜，目前仍處于發(fā)展完善階段，因而許多重組蛋白仍選用原核表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)。2001年全球銷售額位列前20位的生物制品，用CHO動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的占11種，銷售額占總數(shù)的65％。由此可見動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)品的大規(guī)模高效培養(yǎng)技術(shù)在生物制藥領(lǐng)域中的重要性。
技術(shù)的發(fā)展要求用動(dòng)物細(xì)胞真核表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的生物制品的比重越來越大。原核表達(dá)系統(tǒng)一般用于小分子、結(jié)構(gòu)簡單的蛋白生產(chǎn)，蛋白轉(zhuǎn)錄后無需修飾，如胰島素。而真核表達(dá)系統(tǒng)主要用于生產(chǎn)大分子、結(jié)構(gòu)復(fù)雜的蛋白，并且轉(zhuǎn)錄后的修飾對蛋白的生物活性具有重要影響，如組織型纖溶酶原激活劑(tPA)、促紅細(xì)胞生成素等(EPO)。生物制品的一個(gè)發(fā)展趨勢是開發(fā)分子量較大的功能蛋白和人源抗體、基因治療產(chǎn)品、治療用疫苗以及組織工程產(chǎn)品，這些產(chǎn)品一般都是通過動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)來生產(chǎn)的。尤其是治療用抗體藥物的開發(fā)是最近5年生物制品研發(fā)的重要領(lǐng)域。目前幾乎所有的嵌合抗體和人源化抗體都是用CHO細(xì)胞表達(dá)的，而且檢測用鼠源單克隆抗體的生產(chǎn)也可經(jīng)培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞獲得。因此，隨著生物制藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，通過動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)的生物制品比重將越來越大。
動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)品生產(chǎn)能力不能滿足市場需求。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)復(fù)雜，至今還沒有一種公認(rèn)的比較標(biāo)準(zhǔn)的高效培養(yǎng)技術(shù)。由于各制藥公司技術(shù)保密的需要，在公開發(fā)表的論文中很難看到真正應(yīng)用于生產(chǎn)的工藝和技術(shù)。一般來講，幾乎所有的制藥公司都采用與細(xì)菌發(fā)酵相似的批式培養(yǎng)工藝，這種培養(yǎng)工藝技術(shù)難度相對較低，但反應(yīng)器的生產(chǎn)能力也很低，大大限制了動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)品的生產(chǎn)和供應(yīng)。劑量在幾百毫克～幾克/人/年的藥物如Enbrel，生產(chǎn)商已經(jīng)應(yīng)用6個(gè)12,500L的生物反應(yīng)器生產(chǎn)，年產(chǎn)量低于10公斤，可見其反應(yīng)器的生產(chǎn)效率并不高。據(jù)Bains&Company預(yù)計(jì)，今后十年，用哺乳動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)的生物制品遠(yuǎn)不能滿足市場的需求。
為了提高反應(yīng)器的生產(chǎn)效率，降低運(yùn)行成本，理想的商業(yè)用工業(yè)化的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)工藝應(yīng)具有以下特點(diǎn)“大規(guī)模、高密度、長時(shí)間、高表達(dá)”。用較小規(guī)模的反應(yīng)器高效率生產(chǎn)生物制品一直是動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)研究的重點(diǎn)，自1980年代以來，動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)成為生化工程領(lǐng)域最為重要的研究內(nèi)容之一，但是由于存在以下難點(diǎn)，至今仍沒有一種成熟的細(xì)胞高效培養(yǎng)技術(shù)，這些難點(diǎn)包括(1)動(dòng)物細(xì)胞非常脆弱，如何解決供氧與細(xì)胞損傷的矛盾。這是細(xì)胞高密度培養(yǎng)的主要限制因素。提高氧傳遞速率一般會(huì)增加混合強(qiáng)度，從而可能對細(xì)胞造成損傷。引起細(xì)胞機(jī)械損傷的因素主要包括機(jī)械碰撞、流體剪切、氣泡凝聚破裂等，解決的主要方法是添加保護(hù)劑如Pluronic F68、血清等；膜包埋培養(yǎng)如中空纖維膜反應(yīng)器；采用多孔細(xì)胞支持物培養(yǎng)，如多孔微載體、燒結(jié)陶瓷等；改進(jìn)反應(yīng)器結(jié)構(gòu)，使攪拌溫和，氣泡與細(xì)胞隔離，如籠式曝氣反應(yīng)器、無泡通氣反應(yīng)器，氣液雙升反應(yīng)器等。
(2)如何解決傳質(zhì)混合與過程放大的矛盾。這是實(shí)現(xiàn)動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的關(guān)鍵。反應(yīng)器放大培養(yǎng)后應(yīng)保證具有良好的傳質(zhì)混合性能和溫和的細(xì)胞生長環(huán)境。許多類型反應(yīng)器如固定床反應(yīng)器和中空纖維膜反應(yīng)器在小規(guī)模實(shí)驗(yàn)中具有很好的細(xì)胞培養(yǎng)效果，但都難以用于商業(yè)化、大規(guī)模生產(chǎn)，主要原因是不能放大培養(yǎng)。目前能夠做到放大培養(yǎng)的一般是采用細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)。在過去一度認(rèn)為多孔微載體培養(yǎng)難以逐級放大。
(3)如何解決細(xì)胞長期連續(xù)培養(yǎng)的細(xì)胞凋亡問題。這是保持細(xì)胞長期高密度培養(yǎng)的關(guān)鍵。細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)，誘發(fā)細(xì)胞凋亡的主要原因是細(xì)胞生長的環(huán)境條件較惡劣，如營養(yǎng)缺乏，代謝產(chǎn)物的累積，pH和溶氧控制不當(dāng)，機(jī)械攪拌剪切力較大等，尤其在無血清培養(yǎng)基中更易發(fā)生。細(xì)胞凋亡大大影響了細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間，從而嚴(yán)重降低反應(yīng)器的生產(chǎn)能力和利用效率，增加了運(yùn)行成本和勞動(dòng)強(qiáng)度。正因如此，近幾年來對細(xì)胞培養(yǎng)中細(xì)胞凋亡的研究正成為細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)中的一個(gè)熱門課題。為解決這一問題，許多學(xué)者嘗試?yán)没蚬こ碳夹g(shù)改造細(xì)胞株，將抑制細(xì)胞凋亡的基因bcl-2轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中，或在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入昂貴的抑制細(xì)胞凋亡的因子，期望抑制或延緩細(xì)胞凋亡，延長單個(gè)細(xì)胞的壽命以延長培養(yǎng)時(shí)間，但目前效果并不明顯，存在效果不穩(wěn)定，成本較昂貴，延長時(shí)間不長(延長2-3天)等不足，在大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)中并未見有應(yīng)用。
(4)如何解決細(xì)胞在高密度條件下，由于存在密度效應(yīng)，單個(gè)細(xì)胞的表達(dá)水平下降問題。如何保持或提高細(xì)胞在高密度生長條件下的表達(dá)水平，關(guān)系到產(chǎn)物的濃度和產(chǎn)量以及培養(yǎng)基的利用率。細(xì)胞生命活動(dòng)賴依存在的內(nèi)部結(jié)構(gòu)是自然界最復(fù)雜的非線性系統(tǒng)之一，簡單用傳統(tǒng)的化學(xué)反應(yīng)工程原理來設(shè)計(jì)和運(yùn)行生物反應(yīng)器是遠(yuǎn)不夠的，尤其是培養(yǎng)結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜的動(dòng)物細(xì)胞(細(xì)胞表面具有與細(xì)胞通訊有關(guān)的受體，信息在細(xì)胞與環(huán)境之間、細(xì)胞與細(xì)胞之間以及細(xì)胞內(nèi)部的傳遞直接影響細(xì)胞的生長、增殖、代謝及產(chǎn)物表達(dá))。不少文獻(xiàn)嘗試?yán)脺囟鹊淖兓?、培養(yǎng)液滲透壓的變化及其他外部刺激，提高細(xì)胞的表達(dá)水平。
(5)無血清培養(yǎng)基的研究與開發(fā)。用含血清培養(yǎng)基生產(chǎn)生物制品有許多不利，如增加培養(yǎng)成本和污染機(jī)會(huì)，增加純化難度和成本，增加產(chǎn)品質(zhì)控指標(biāo)，因此，大規(guī)模生產(chǎn)臨床使用的生物制品應(yīng)盡可能使用無血清培養(yǎng)基。
(6)細(xì)胞截留技術(shù)的研究。由于單個(gè)細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物的水平是一定的，提高細(xì)胞密度就能夠提高上清中產(chǎn)物濃度，從而提高反應(yīng)器的生產(chǎn)能力。而要獲得較高的細(xì)胞培養(yǎng)密度，前提是要將細(xì)胞截留在反應(yīng)器中。截留細(xì)胞的方法主要有三類(A)分離法，如在位離心、旋轉(zhuǎn)濾器、循環(huán)反應(yīng)器、超聲波隔離等；(B)包埋法(封閉式)，如中空纖維膜反應(yīng)器、微囊化、膜反應(yīng)器；(C)裹夾法(開放式)，如多孔陶瓷、無紡布培養(yǎng)、海綿/泡沫基質(zhì)、多孔微載體等。
(7)動(dòng)物細(xì)胞批式培養(yǎng)與連續(xù)培養(yǎng)的選擇及細(xì)胞生長動(dòng)力學(xué)模型的建立。選擇培養(yǎng)方式應(yīng)根據(jù)細(xì)胞和產(chǎn)物的具體特點(diǎn)來確定。從培養(yǎng)效果講，連續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞密度高，一般截留細(xì)胞的連續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞密度均在107/ml，比批式培養(yǎng)高10倍左右，因而反應(yīng)器生產(chǎn)能力也比批式培養(yǎng)高10倍以上，并且連續(xù)培養(yǎng)的勞動(dòng)強(qiáng)度小，生產(chǎn)成本低，但是前提是整個(gè)連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)，包括反應(yīng)器控制系統(tǒng)、細(xì)胞截留系統(tǒng)等必須保證長時(shí)間運(yùn)行正?？煽?。但是絕大多數(shù)生物制藥公司都還采用批式培養(yǎng)模式，因?yàn)閯?dòng)物細(xì)胞批式懸浮培養(yǎng)運(yùn)行比較簡單可靠，易實(shí)現(xiàn)過程放大，不涉及細(xì)胞凋亡和高密度培養(yǎng)表達(dá)水平下降的問題，懸浮細(xì)胞個(gè)體較小，受流體剪切力的影響相對較小，比較容易借鑒細(xì)菌發(fā)酵的技術(shù)。這也說明目前還沒有一種理想的連續(xù)培養(yǎng)技術(shù)可供制藥公司選擇。但是，動(dòng)物細(xì)胞批式懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)能力低，設(shè)備和廠房投資高，生產(chǎn)成本也比較高。以生產(chǎn)t-PA為例，動(dòng)物細(xì)胞反應(yīng)器的規(guī)模達(dá)到6×6000L，相應(yīng)的純化設(shè)備也很龐大，即要求純化設(shè)備能夠一次性處理細(xì)胞培養(yǎng)上清幾萬升。用這種工藝生產(chǎn)1g基因工程蛋白的成本約10,000美元，而年產(chǎn)量只有10公斤級水平，并且批式培養(yǎng)方式不適合不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)的生產(chǎn)，如尿激酶原的生產(chǎn)。動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的產(chǎn)品如各種人源化抗體、Enbrel、t-PA等，劑量一般都在毫克級甚至克級(EPO除外)，因此，要滿足市場需求，采用批式培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞反應(yīng)器的規(guī)模都很大，如生產(chǎn)Enbrel的反應(yīng)器規(guī)模已達(dá)12,500L，但產(chǎn)量仍不能滿足市場需求。
用較小規(guī)模的反應(yīng)器高效率生產(chǎn)生物制品一直是動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)研究的重點(diǎn)，這一方向更符合我國國情，并且還沒有動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模高密度長期連續(xù)培養(yǎng)的成熟技術(shù)的專利。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種連續(xù)培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的多孔微載體固定化高效培養(yǎng)方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種成本低廉、質(zhì)量可控、使用安全的無血清培養(yǎng)基。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案動(dòng)物細(xì)胞多孔微載體固定化高效培養(yǎng)方法，包括如下步驟(1)纖維素多孔微載體預(yù)處理將纖維素多孔微載體用0.1mol/L、pH7.0的磷酸緩沖液(PBS)浸泡4h后，傾去PBS，再用PBS洗滌3次。121℃高壓滅菌30min后，吸出PBS，用DMEM/F12培養(yǎng)基洗滌2次后置4℃?zhèn)溆茫?2)細(xì)胞接種攪拌瓶中加人處理好的多孔微載體和含血清培養(yǎng)基，將細(xì)胞懸液按所需接種密度接種到攪拌瓶中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度37.0℃±0.1℃，pH值7.0±0.05，轉(zhuǎn)速20-100r/min；(3)細(xì)胞馴化將生長在多孔微載體上的細(xì)胞懸液在攪拌瓶中逐級放大培養(yǎng)，并將培養(yǎng)基中的血清含量逐漸降到0％，培養(yǎng)條件為溫度37.0℃±0.1℃，pH值7.0±0.05，轉(zhuǎn)速20-100r/min，至細(xì)胞密度大于5×106細(xì)胞/mL，換液量一般為1/2-1個(gè)培養(yǎng)體積；(4)細(xì)胞培養(yǎng)將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至反應(yīng)器中逐級放大培養(yǎng)，使用無泡通氣供氧系統(tǒng)，采用批式換液連續(xù)培養(yǎng)工藝，定期更新部分微載體，對細(xì)胞進(jìn)行無血清培養(yǎng)。
所述纖維素多孔微載體是Cytopore-2。
所述(2)細(xì)胞接種步驟中多孔微載體的濃度為1-4g/L。
所述(2)細(xì)胞接種步驟中血清培養(yǎng)基的濃度為2％。
所述(2)細(xì)胞接種步驟中細(xì)胞懸液的接種密度為2×105-5×105細(xì)胞/mL。
所述(4)細(xì)胞培養(yǎng)步驟中的轉(zhuǎn)移是指使用管道將長滿細(xì)胞的多孔微載體直接導(dǎo)入下一級反應(yīng)器中。
所述(4)細(xì)胞培養(yǎng)步驟中的反應(yīng)器中預(yù)先加入適量培養(yǎng)基和經(jīng)過處理的多孔微載體。
所述(4)細(xì)胞培養(yǎng)步驟采用批式換液連續(xù)培養(yǎng)是指每天通過細(xì)胞截留系統(tǒng)換液1-1.2個(gè)工作體積，將微載體和細(xì)胞截留在反應(yīng)器中，收獲含產(chǎn)品的上清并加入等量新鮮培養(yǎng)基。
所述(4)細(xì)胞培養(yǎng)步驟的無血清培養(yǎng)是指依次使用無血清生長培養(yǎng)基和無血清表達(dá)培養(yǎng)基對反應(yīng)器內(nèi)的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。
所述動(dòng)物細(xì)胞為貼壁細(xì)胞如CHO細(xì)胞或懸浮細(xì)胞如雜交瘤細(xì)胞。
用于動(dòng)物細(xì)胞多孔微載體固定化高效培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基，該無血清培養(yǎng)基包括生長型無血清培養(yǎng)基和表達(dá)型無血清培養(yǎng)基，每10L培養(yǎng)基的成分及其含量分別見下表生長型無血清培養(yǎng)基成分及其含量(每10L培養(yǎng)基)

表達(dá)型無血清培養(yǎng)基成分及其含量(每10L培養(yǎng)基)

本發(fā)明采用多孔微載體固定化細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，保護(hù)細(xì)胞免受機(jī)械損傷，并將貼壁細(xì)胞或懸浮細(xì)胞截留在反應(yīng)器中，提高細(xì)胞培養(yǎng)密度；利用細(xì)胞在多孔微載體間自動(dòng)轉(zhuǎn)移的規(guī)律，建立簡單可靠的細(xì)胞培養(yǎng)過程放大的技術(shù)方法；采用無泡通氣供氧系統(tǒng)，解決在細(xì)胞培養(yǎng)過程中直接通氣供氧帶來的泡沫泛濫及損傷細(xì)胞的問題；研制的無血清培養(yǎng)基，降低細(xì)胞培養(yǎng)成本、污染機(jī)會(huì)及后續(xù)產(chǎn)品純化成本和難度；采用批式換液連續(xù)培養(yǎng)工藝，及時(shí)去除培養(yǎng)過程中的廢物累積，降低批式培養(yǎng)過程中產(chǎn)物降解的比例，并提高反應(yīng)器的生產(chǎn)能力；采用定期更新部分微載體的方法，使動(dòng)物細(xì)胞在微載體之間相互轉(zhuǎn)移，改善細(xì)胞生長的微環(huán)境，解決細(xì)胞長期培養(yǎng)的細(xì)胞凋亡問題。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是采用生化工程技術(shù)，建立了一種簡單、可靠的大規(guī)模高密度動(dòng)物細(xì)胞長期連續(xù)培養(yǎng)和高效表達(dá)的技術(shù)，采用該技術(shù)培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞(1)細(xì)胞培養(yǎng)密度高，一般培養(yǎng)密度＞2×107/ml；(2)可方便放大培養(yǎng)規(guī)模；(3)解決了培養(yǎng)中的細(xì)胞凋亡問題，培養(yǎng)時(shí)間長，一般可達(dá)100天左右，細(xì)胞活力保持在95％以上；(4)無血清培養(yǎng)基價(jià)格低廉，并能很好支持細(xì)胞生長和表達(dá)；(5)反應(yīng)器的生產(chǎn)能力高，表達(dá)水平為5μg/106cells/d的工程細(xì)胞采用本發(fā)明中的技術(shù)培養(yǎng)，年生產(chǎn)能力可達(dá)到10g/L反應(yīng)器/年，較目前的反應(yīng)器生產(chǎn)能力提高100倍左右；(6)既可用于貼壁細(xì)胞如CHO細(xì)胞的培養(yǎng)，又可用于懸浮細(xì)胞如雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)。
下面結(jié)合具體實(shí)施方式
對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，并非對本發(fā)明的限制。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1、Cytopore-2纖維素多孔微載體培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞一、Cytopore-2纖維素多孔微載體的預(yù)處理Cytopore-2纖維素多孔微載體(Pharmacia Biotech AB，瑞典，CatNo.17-1271-02)是一種物化特性非常適合動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的細(xì)胞支持物，其主要物化特性見表1。
用前用0.1mol/L、pH7.0的磷酸緩沖液(PBS)浸泡4h后，傾去PBS，再用PBS洗滌3次。121℃高壓滅菌30min后，吸出PBS，用DMEM/F12培養(yǎng)基洗滌2次后置4℃?zhèn)溆谩?br> 表1 Cytopore-2多孔微載體物化特性

Cytopore多孔微載體機(jī)械強(qiáng)度高，培養(yǎng)細(xì)胞后可回收重復(fù)使用。回收方法如下(1)將約300mL內(nèi)部長有細(xì)胞的多孔微載體置于2000mL瓶中，加1000mL水，用力振蕩2分鐘后，用150目不銹鋼濾網(wǎng)濾除液體，以初步去除脫落的細(xì)胞及細(xì)胞碎片。(2)將微載體重新懸浮于0.2mol/L的檸檬酸溶液中，置于室溫6小時(shí)，并每隔1小時(shí)振蕩2分鐘，使多孔微載體內(nèi)部中的大多數(shù)細(xì)胞裂解并脫落出來，用150目濾網(wǎng)濾除液體。(3)重復(fù)第一步，用水多次清洗多孔微載體，直至待微載體沉降后液體清亮透明為止。如果有必要，可再次用檸檬酸溶液浸泡洗滌。(4)用5％的碳酸氫鈉溶液浸泡洗滌一次，爾后用水洗滌三次。(5)顯微鏡下觀察，如果多孔微載體內(nèi)部還有較多的死細(xì)胞，可用0.2％的粗胰酶溶液浸泡，于37℃孵育3小時(shí)并每隔半小時(shí)搖蕩2分鐘，之后用水清洗至液體清亮透明。(4)用去離子水洗滌三次，再用pH7.0～7.5的0.1M PBS緩沖液洗滌三次后，在121℃下高壓滅菌備用。(5)如有必要，加至含0.02mol/L-0.05mol/L DEAE鹽酸鹽、0.2mol/L NaOH的溶液中，置60℃下不斷攪拌10h，使其交聯(lián)-DEAE弱堿性陰離子交換基團(tuán)，以促進(jìn)細(xì)胞貼壁。交聯(lián)后用1％的檸檬酸溶液洗滌一次，再用蒸餾水洗滌三次，爾后用0.1mol/L磷酸緩沖液(PBS)洗滌3次，于121℃蒸汽滅菌30min后。(6)吸出PBS，用DMEM/F12培養(yǎng)基(美國Hyclone公司生產(chǎn)，CatNo.SH30004.04)洗滌2次，再用DMEM/F12培養(yǎng)基浸泡置4℃?zhèn)溆谩?br> 二、細(xì)胞接種將處理好的多孔微載體按1-1.5g/L的濃度加到攪拌瓶中，并加入含1％血清的培養(yǎng)基。在方瓶和轉(zhuǎn)瓶中培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞如CHO細(xì)胞，經(jīng)0.25％的胰酶消化，用培養(yǎng)基吹打制成細(xì)胞懸液，直接接種到攪拌瓶中，而在方瓶中培養(yǎng)的雜交瘤等懸浮細(xì)胞，可直接用培養(yǎng)基吹打制成細(xì)胞懸液接種到攪拌瓶中培養(yǎng)。一般接種密度需大于2×105細(xì)胞/mL，最好接種密度為5×105細(xì)胞/mL。接種后5h內(nèi)，攪拌轉(zhuǎn)速一般為(20-40)r/min，以讓細(xì)胞較充分接觸多孔微載體，隨后可將轉(zhuǎn)速提高至(50-60)r/min，培養(yǎng)溫度為37.0℃±0.1℃。
三、細(xì)胞馴化將生長在多孔微載體上的細(xì)胞懸液在攪拌瓶中逐級放大培養(yǎng)，培養(yǎng)3d后，可根據(jù)培養(yǎng)基中葡萄糖濃度適量換液，培養(yǎng)條件為溫度37.0℃±0.1℃，pH值7.0±0.05，轉(zhuǎn)速50-60r/min，至細(xì)胞密度大于5×106細(xì)胞/mL，換液量一般為1/2-1個(gè)培養(yǎng)體積；并將培養(yǎng)基中的血清含量逐漸降到0％，以馴化細(xì)胞適應(yīng)無血清培養(yǎng)基。
四、細(xì)胞培養(yǎng)將細(xì)胞懸液由攪拌瓶轉(zhuǎn)移至7.5L Biostat CT反應(yīng)器(工作體積為5L，B.Braun公司，德國)，爾后再轉(zhuǎn)移至30L Biostat UC反應(yīng)器(工作體積為20L，B.Braun公司，德國)逐級放大培養(yǎng)反應(yīng)器中逐級放大培養(yǎng)，使用無泡通氣供氧系統(tǒng)，采用批式換液連續(xù)培養(yǎng)工藝，定期更新部分微載體，對細(xì)胞進(jìn)行無血清培養(yǎng)。
由于細(xì)胞能在長滿細(xì)胞的載體和空載體之間自動(dòng)轉(zhuǎn)移，每級放大培養(yǎng)時(shí)，先在更大規(guī)模的反應(yīng)器中預(yù)先加入適量培養(yǎng)基和經(jīng)過處理的多孔微載體，長滿細(xì)胞的多孔微載體通過管道直接進(jìn)入下一級反應(yīng)器中，而無需胰酶的消化來幫助細(xì)胞培養(yǎng)的接種和放大。這種種子細(xì)胞制備方法和反應(yīng)器細(xì)胞接種方法非常簡便，并且可以嚴(yán)格保證無菌，為多孔微載體細(xì)胞培養(yǎng)的規(guī)模放大提供了條件。
五、多孔微載體中生長細(xì)胞的染色與計(jì)數(shù)1.MTT染色法取出樣品后用5mg/ml MTT溶液染色，置37℃下2h-4h后，在顯微鏡下觀察，長有細(xì)胞的多孔微載體為黑色，未長細(xì)胞的多孔微載體仍為本白色。
2.結(jié)晶紫染色法取樣5ml于10ml試管中，待多孔微載體沉降后用吸管盡可能多地吸出上清，爾后加入等量的含0.1％結(jié)晶紫的0.1mol/L檸檬酸溶液，每隔1h用吸管吹打、搖蕩，置于37℃下3小時(shí)后，搖勻待微載體稍沉降后，用吸管緊靠液面吸取適量液體于血球計(jì)數(shù)板上，數(shù)出被染成深紫色的細(xì)胞核數(shù)。
實(shí)施例2、無血清培養(yǎng)基的制備細(xì)胞培養(yǎng)密度大于2×106細(xì)胞/mL后，可以逐漸換用無血清培養(yǎng)基。無血清培養(yǎng)基有兩種一種為生長型無血清培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞密度大于2×106細(xì)胞/mL后，用這種培養(yǎng)基培養(yǎng)CHO細(xì)胞，其比生長速率約為0.22d-1；另一種為表達(dá)型無血清培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞密度大于107細(xì)胞/mL后，用這種培養(yǎng)基培養(yǎng)CHO細(xì)胞，其比生長速率約為0.11d-1，較低的生長速率有利于維持高密度培養(yǎng)條件下的細(xì)胞密度的相對穩(wěn)定，對保持溶氧水平和細(xì)胞表達(dá)水平有利。
1、生長型無血清培養(yǎng)基的制備(1)成分及含量見表2。
表2 配制10L生長型無血清培養(yǎng)基成分一覽表

(2)制備方法按表2稱取各成分于10L無菌無熱源的容器中，加入10L純凈水?dāng)嚢枞芙?，?.22μm濾膜過濾除菌。
2、表達(dá)型無血清培養(yǎng)基的制備(1)成分及含量見表3。
表3 配制10L表達(dá)型無血清培養(yǎng)基成分一覽表

(2)制備方法按表3稱取各成分于10L無菌無熱源的容器中，加入10L純凈水?dāng)嚢枞芙?，?.22μm濾膜過濾除菌。
用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞時(shí)，在細(xì)胞密度大于5×106cells/mL后換用表達(dá)型培養(yǎng)基，可以在表3的基礎(chǔ)上添加5×10-5mol/L巰基乙醇。
實(shí)施例3、生物反應(yīng)器高密度長期培養(yǎng)基因重組CHO細(xì)胞并高效表達(dá)基因重組尿激酶原(rhPro-UK)一、纖維素多孔微載體預(yù)處理，見實(shí)施例1。
二、細(xì)胞接種將處理好的多孔微載體按1-1.5g/L的濃度加到攪拌瓶中，并加入含1％血清的培養(yǎng)基。在方瓶和轉(zhuǎn)瓶中培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞Pro-UK的基因重組CHO細(xì)胞系CL-11G(見中國專利，專利號(hào)為ZL96119836.2，國際專利主分類號(hào)C12N 15/58)，經(jīng)0.25％的胰酶消化，用培養(yǎng)基吹打制成細(xì)胞懸液，直接接種到攪拌瓶中，接種密度需大于2×105細(xì)胞/mL，最好接種密度為5×105細(xì)胞/mL。接種后5h內(nèi)，攪拌轉(zhuǎn)速一般為(20-40)r/min，以讓細(xì)胞較充分接觸多孔微載體，隨后可將轉(zhuǎn)速提高至(50-60)r/min，培養(yǎng)溫度為37.0℃±0.1℃。
三、細(xì)胞馴化將生長在多孔微載體上的細(xì)胞懸液在攪拌瓶中逐級放大培養(yǎng)，培養(yǎng)3d后，可根據(jù)培養(yǎng)基中葡萄糖濃度適量換液，培養(yǎng)條件為溫度37.0℃±0.1℃，pH值7.0±0.05，轉(zhuǎn)速50-60r/min，至細(xì)胞密度大于5×106細(xì)胞/mL，換液量一般為1/2-1個(gè)培養(yǎng)體積；并將培養(yǎng)基中的血清含量逐漸降到0％，以馴化細(xì)胞適應(yīng)無血清培養(yǎng)基。
四、細(xì)胞培養(yǎng)將馴化好的種子細(xì)胞接種到30L Biostat UC(工作體積為20L，B.Braun，德國)無泡通氣攪拌式反應(yīng)器中，接種密度一般為106細(xì)胞/mL，先用無血清生長型培養(yǎng)基，控制pH＝7.0±0.05，溶氧(DO)＝20％-40％，溫度＝37.0℃±0.1℃，攪拌轉(zhuǎn)速為70rpm-90rpm，多孔微載體的濃度為2g/L-4g/L培養(yǎng)基。采用批式換液連續(xù)培養(yǎng)方式，在細(xì)胞密度大于107細(xì)胞/mL后，改用無血清表達(dá)型培養(yǎng)基，每天通過細(xì)胞截留系統(tǒng)換液1-1.2個(gè)工作體積，將微載體截留在反應(yīng)器中，收獲含產(chǎn)品的上清并加入等量新鮮培養(yǎng)基。為保持長期培養(yǎng)細(xì)胞的活力，并維持高密度培養(yǎng)條件下細(xì)胞的表達(dá)水平，當(dāng)多孔微載體中長滿細(xì)胞后，在細(xì)胞表達(dá)水平急劇下降前，用新多孔微載體部分更換長滿細(xì)胞的多孔微載體。微載體的更換量和更換頻率視細(xì)胞表達(dá)水平而定。一般地，如果一次更換1/2-2/3的多孔微載體，可以維持細(xì)胞良好生長1個(gè)月以上，而如果每次更新1/4左右的微載體，一般每隔15d左右就需更換部分微載體。采用這種培養(yǎng)模式，細(xì)胞密度可一直維持在(1-2)×107細(xì)胞/mL，活細(xì)胞比例可維持在90％-95％，培養(yǎng)上清中Pro-UK濃度可以維持在50mg/L-100mg/L，每天可收獲上清20L-25L，可獲得產(chǎn)品(1-2.5)g/d，整個(gè)培養(yǎng)時(shí)間可維持在3個(gè)月以上。
實(shí)施例4、生物反應(yīng)器高密度培養(yǎng)鼠-鼠雜交瘤細(xì)胞3G7-anti-Pro-UK生產(chǎn)抗尿激酶原單克隆抗體一、纖維素多孔微載體預(yù)處理，見實(shí)施例1。
二、細(xì)胞接種將處理好的多孔微載體按1-1.5g/L的濃度加到攪拌瓶中，并加入含1％血清的培養(yǎng)基。將分泌抗尿激酶原抗體的鼠-鼠雜交瘤細(xì)胞系3G7-anti-scuPA細(xì)胞懸液(中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保存，北京市海淀區(qū)中關(guān)村北一條13號(hào)，100080，電話010-62542758，保藏日為2003年9月8日，保藏號(hào)為CGMCC No.0999，建議的分類命名為3G7-anti-scuPA鼠-鼠雜交瘤細(xì)胞系)。直接接種到攪拌瓶中，接種密度需大于5×105細(xì)胞/mL。接種后5h內(nèi)，攪拌轉(zhuǎn)速一般為(20-40)r/min，以讓細(xì)胞較充分接觸多孔微載體，隨后可將轉(zhuǎn)速提高至(50-60)r/min，培養(yǎng)溫度為37.0℃±0.1℃。
三、細(xì)胞馴化將生長在多孔微載體上的細(xì)胞懸液在攪拌瓶中逐級放大培養(yǎng)，培養(yǎng)3d后，可根據(jù)培養(yǎng)基中葡萄糖濃度適量換液，培養(yǎng)條件為溫度37.0℃±0.1℃，pH值7.0±0.05，轉(zhuǎn)速50-60r/min，至細(xì)胞密度大于5×106細(xì)胞/mL，換液量一般為1/2-1個(gè)培養(yǎng)體積；并將培養(yǎng)基中的血清含量逐漸降到0％，以馴化細(xì)胞適應(yīng)無血清培養(yǎng)基。
四、細(xì)胞培養(yǎng)將馴化后的細(xì)胞懸液直接接種到5L攪拌式反應(yīng)器(Biostat CT5，B.Braun公司，德國)中培養(yǎng)，接種密度一般為106細(xì)胞/mL，先用無血清生長型培養(yǎng)基，控制pH＝7.0±0.05，溶氧(DO)＝20％-40％，溫度＝37.0℃±0.1℃，攪拌轉(zhuǎn)速為70rpm-90rpm，多孔微載體的濃度為2g/L-4g/L培養(yǎng)基。采用批式換液連續(xù)培養(yǎng)方式，在細(xì)胞密度大于107細(xì)胞/mL后，改用無血清表達(dá)型培養(yǎng)基，每天通過細(xì)胞截留系統(tǒng)換液1-1.2個(gè)工作體積，將微載體截留在反應(yīng)器中，收獲含產(chǎn)品的上清并加入等量新鮮培養(yǎng)基。采用本發(fā)明中的培養(yǎng)模式，細(xì)胞密度可達(dá)1×107細(xì)胞/mL，活細(xì)胞比例可維持在90％-95％，培養(yǎng)上清中抗體滴度一般可達(dá)1∶150000-1∶300000，整個(gè)培養(yǎng)時(shí)間可維持在2個(gè)月以上。
權(quán)利要求
1.動(dòng)物細(xì)胞多孔微載體固定化高效培養(yǎng)方法，包括如下步驟(1)纖維素多孔微載體預(yù)處理將纖維素多孔微載體用0.1mol/L、pH7.0的磷酸緩沖液(PBS)浸泡4h后，傾去PBS，再用PBS洗滌3次；121℃高壓滅菌30min后，吸出PBS，用DMEM/F12培養(yǎng)基洗滌2次后置4℃?zhèn)溆茫?2)細(xì)胞接種攪拌瓶中加入處理好的多孔微載體和含血清培養(yǎng)基，將細(xì)胞懸液按所需接種密度接種到攪拌瓶中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度37.0℃±0.1℃，溶氧20％-40％，pH值7.0±0.05，轉(zhuǎn)速20-100r/min；(3)細(xì)胞馴化將生長在多孔微載體上的細(xì)胞懸液在攪拌瓶中逐級放大培養(yǎng)，并將培養(yǎng)基中的血清含量逐漸降到0％，培養(yǎng)條件為溫度37.0℃±0.1℃，溶氧20％-40％，pH值7.0±0.05，轉(zhuǎn)速20-100r/min，至細(xì)胞密度大于5×106細(xì)胞/mL，換液量一般為1/2-1個(gè)培養(yǎng)體積；(4)細(xì)胞培養(yǎng)將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至反應(yīng)器中逐級放大培養(yǎng)，使用無泡通氣供氧系統(tǒng)，采用批式換液連續(xù)培養(yǎng)工藝，定期更新部分微載體，對細(xì)胞進(jìn)行無血清培養(yǎng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的動(dòng)物細(xì)胞多孔微載體固定化高效培養(yǎng)方法，其特征在于所述纖維素多孔微載體是Cytopore-2。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的動(dòng)物細(xì)胞多孔微載體固定化高效培養(yǎng)方法，其特征在于所述(2)細(xì)胞接種步驟中多孔微載體的濃度為1-4g/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的動(dòng)物細(xì)胞多孔微載體固定化高效培養(yǎng)方法，其特征在于所述(2)細(xì)胞接種步驟中血清培養(yǎng)基的濃度為2％。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的動(dòng)物細(xì)胞多孔微載體固定化高效培養(yǎng)方法，其特征在于所述(2)細(xì)胞接種步驟中細(xì)胞懸液的接種密度為2×105-5×105細(xì)胞/mL。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的動(dòng)物細(xì)胞多孔微載體固定化高效培養(yǎng)方法，其特征在于所述(4)細(xì)胞培養(yǎng)步驟中的轉(zhuǎn)移是指使用管道將長滿細(xì)胞的多孔微載體直接導(dǎo)入下一級反應(yīng)器中。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的動(dòng)物細(xì)胞多孔微載體固定化高效培養(yǎng)方法，其特征在于所述(4)細(xì)胞培養(yǎng)步驟中的反應(yīng)器中預(yù)先加入適量培養(yǎng)基和經(jīng)過處理的多孔微載體。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的動(dòng)物細(xì)胞多孔微載體固定化高效培養(yǎng)方法，其特征在于所述(4)細(xì)胞培養(yǎng)步驟采用批式換液連續(xù)培養(yǎng)是指每天通過細(xì)胞截留系統(tǒng)換液1-1.2個(gè)工作體積，將微載體和細(xì)胞截留在反應(yīng)器中，收獲含產(chǎn)品的上清并加入等量新鮮培養(yǎng)基。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的動(dòng)物細(xì)胞多孔微載體固定化高效培養(yǎng)方法，其特征在于所述(4)細(xì)胞培養(yǎng)步驟的無血清培養(yǎng)是指依次使用無血清生長培養(yǎng)基和無血清表達(dá)培養(yǎng)基對反應(yīng)器內(nèi)的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任何一項(xiàng)所述的動(dòng)物細(xì)胞多孔微載體固定化高效培養(yǎng)方法，其特征在于所述動(dòng)物細(xì)胞為貼壁細(xì)胞或懸浮細(xì)胞。
11.用于動(dòng)物細(xì)胞多孔微載體固定化高效培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基，其特征在于該無血清培養(yǎng)基包括生長型無血清培養(yǎng)基和表達(dá)型無血清培養(yǎng)基，每10L培養(yǎng)基的成分及其含量分別見下表生長型無血清培養(yǎng)基成分及其含量
表達(dá)型無血清培養(yǎng)基成分及其含量
全文摘要
本發(fā)明公開了一種動(dòng)物細(xì)胞多孔微載體固定化高效培養(yǎng)方法，包括如下步驟(1)纖維素多孔微載體預(yù)處理；(2)細(xì)胞接種攪拌瓶中加入處理好的多孔微載體和含血清培養(yǎng)基，將細(xì)胞懸液按所需接種密度接種到攪拌瓶中培養(yǎng)；(3)細(xì)胞馴化將生長在多孔微載體上的細(xì)胞懸液在攪拌瓶中逐級放大培養(yǎng)，并將培養(yǎng)基中的血清含量逐漸降到0％；(4)細(xì)胞培養(yǎng)將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至反應(yīng)器中逐級放大培養(yǎng)，定期更新部分微載體，對細(xì)胞進(jìn)行無血清培養(yǎng)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是(1)細(xì)胞培養(yǎng)密度高；(2)可方便放大培養(yǎng)規(guī)模；(3)細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間長，一般可達(dá)100天左右；(4)無血清培養(yǎng)基價(jià)格低廉；(5)反應(yīng)器的生產(chǎn)能力高；(6)適用于貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)。
文檔編號(hào)C12N11/00GK1556203SQ20031012425
公開日2004年12月22日 申請日期2003年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月31日
發(fā)明者胡顯文, 肖成祖, 高麗華, 李佐虎, 陳照烈, 劉紅, 胥照平, 張正光, 李世崇, 王菲 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所, 中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工