專利名稱：包含共生菌物質(zhì)的營養(yǎng)性配方制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及包含共生菌的營養(yǎng)性配方制劑和這種制劑在促進(jìn)患者胃腸道中有益微生物生長并且抑制和消滅致病生物中的用途。更具體地說，本發(fā)明涉及包含與益生細(xì)菌的特定菌株組合的低聚果糖和唾液酸乳糖的營養(yǎng)性制劑。
背景技術(shù)：
共生菌是″通過改善宿主胃腸道中活的微生物營養(yǎng)補充物的存活和植入而有利地影響宿主的益生菌和益生元的混合物″(Andersson etal.″Health effects of probiotics and prebioticsAliteraturereview on human studies.″Scand.J.Nutr.4558-75(2001))。
益生元是通過有選擇地刺激已經(jīng)在結(jié)腸中建立的有限數(shù)目的細(xì)菌種屬的生長和/或活性而有利地影響宿主，并因此有效地改善宿主健康的不會被消化的食品成分。(Gibson et al.，″Dietary modulation ofthe human colonic microbiotaIntroducing the concept ofprebiotics.J.Nutrition 125167-176(1995))。
低聚果糖是眾所周知的益生元。低聚果糖經(jīng)過小腸而沒有被消化，再到達(dá)大腸。在大腸中，只通過有限范圍的微生物來發(fā)酵低聚果糖，其中包括大多數(shù)種屬的雙歧桿菌，即對人體健康有益的細(xì)菌種屬。(參見例如，Bouhnik et al，Bouhnik et al，″ShortChain Fructo-Oligosaccharide Administration Dose-DependentlyIncreases Fecal Bifidobacteria in Healthy Humans，″J.Nutrition，129113-116(1999))。已知低聚果糖是雙歧桿菌的特異性底物。(參見例如，Mitsuoka et al，″Effect of Fructo-oligosaccharides on Intestinal Microflora″，Die Nahrung，3，5-6427-436(1987))。雙歧桿菌產(chǎn)生作為其代謝副產(chǎn)物的短鏈脂肪酸，導(dǎo)致消化道pH的降低。
美國專利號5,849,324公開了通過腸內(nèi)施用有效量的難消化的無氮低聚糖而減少中耳炎發(fā)生的方法。援引的特異性的低聚糖是果糖、木糖和半乳糖的低聚糖。
美國專利號5,827,526公開了通過腸內(nèi)施用以預(yù)防為基礎(chǔ)的有效量的難消化的無氮低聚糖而減少腹瀉持續(xù)時間的方法。
美國專利號5,688,777公開了通過腸內(nèi)施用有效量的難消化的無氮低聚糖而抑制艱難梭菌(Clostridium difficile)感染的方法。在感染的小鼠中，通過測量糞便集落形成單位(cfu)，施用特異性的果糖低聚糖來減少或消滅艱難梭菌。
唾液酸乳糖是包括唾液酸和二糖乳糖的低聚糖。唾液酸是包含9個以上碳原子的氨基糖家族，其為神經(jīng)氨酸的N-和O-取代的衍生物。最常見的唾液酸種類是N-乙酰神經(jīng)氨酸。
唾液酸乳糖天然地存在于人乳以及其他哺乳動物的乳中。然而，與其他的哺乳動物種屬相比，唾液酸乳糖以顯著的高濃度存在于人乳中。乳中唾液酸乳糖的2個主要種類是3′-唾液酸乳糖和6′-唾液酸乳糖。這些種類天然地存在于人乳中，其相對比率為1∶3(3′∶6′)。
已知唾液酸乳糖具有針對特定致病細(xì)菌的抗-粘附特性。例如，唾液酸乳糖發(fā)揮體外抑制霍亂毒素的作用(Idota et al.，″Inhibitionof Cholera Toxin by Human Milk Fractions andSialvllactose，″Biosci.Biotech.Biochem.59417-419)和幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)(Simonet al.，″Inhibition ofHelicobacter pylori Binding to Gastrointestinal EpithelialCells by Sialic Acid-Containing Oligosaccharides，″Infectionand Immunity，750-757，(1997))。
考慮到其抗-粘附特性，唾液酸乳糖已經(jīng)被用于處理許多醫(yī)學(xué)狀況。例如，美國專利號5,260,280公開了中和細(xì)菌腸毒素作用的包括含有唾液酸的低聚糖的組合物。美國專利號5,514,660、5,753,630和5,883,079公開了通過施用有效量的包含唾液酸的低聚糖，分別用于治療或預(yù)防胃或十二指腸中的潰瘍，或抑制幽門螺桿菌感染的方法。美國專利號5,620,965涉及通過施用有效量的某些低聚糖，用于抑制細(xì)菌幽門螺桿菌與胃或十二指腸細(xì)胞的結(jié)合的組合物。
美國專利號5,834,423描述了促進(jìn)雙歧桿菌增殖的唾液酸衍生物和利用有效量的某些唾液酸化的低聚糖作為抗腹瀉試劑的用途。唾液酸化的低聚糖包括3′-唾液酸乳糖和6′-唾液酸乳糖。
WO2001060346公開了包括以協(xié)同方式作用來刺激有益的雙歧桿菌生長的益生元物質(zhì)低聚果糖和唾液酸乳糖的營養(yǎng)性組合物。
益生菌是對人體健康具有有益影響的活的微生物食品成分。(Salminen et al.，″Functional food science andgastrointestinal physiology and function.″Brit.J.Nutr.80(suppl.1)S147-S171(1998))。
大多數(shù)益生細(xì)菌通常是″乳酸細(xì)菌″，如此稱呼是因為它們發(fā)酵碳水化合物成為乳酸。最經(jīng)常研究的特異菌株包括乳桿菌屬和雙歧桿菌屬的成員。(Sanders，″Probiotics.″Food Technol.5367-77(1999))。
一些乳酸菌特異地產(chǎn)生乳酸作為其代謝的主要產(chǎn)物。一些乳酸菌主要產(chǎn)生左旋″L″-形式的乳酸[L(+)-乳酸]，其它乳酸菌主要產(chǎn)生右旋″D″-形式的乳酸，而其它乳酸菌同時產(chǎn)生D-乳酸和L-乳酸。L(+)-乳酸是哺乳動物代謝的常見中間物。通過肝、腎和腦快速并且有效地氧化L(+)-乳酸。相比之下，哺乳動物組織不是很好地利用D(-)-乳酸，并且可能在人類嬰兒中導(dǎo)致酸毒癥。
干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)種的菌株GG，一種通常稱為″乳桿菌GG″或″LGG″的益生細(xì)菌，主要產(chǎn)生左旋L-形式的乳酸[L(+)-乳酸]?？诜o藥后，在嬰幼兒的糞便中發(fā)現(xiàn)了LGG。(Sepp etal.，″Effect of administration of Lactobacillus casein strainGG on the gastrointestinal microbiota of newborns.″Microb.Ecol.Health Dis.6309-314(1997)；Sheen etal.，″Short ReportA placebo-controlled study ofLactobacillus GG colonization in one-to-three-year-oldPeruvian children.″Am.J.Trop.Med.Hyg.52389-392(1995))。
包含LGG的乳制品顯著地縮短幼兒腹瀉的持續(xù)時間。(Kaila etal.，″Enhancement of the circulating antibody secreting cellresponse in human diarrhea by a human Lactobacillusstrain.″Pediatr.Res.32141-144(1992)；Isolauri et al.，″Thehuman Lactobacillus strain(Lactobacillus casei sp strainGG)promotes recovery from acute diarrhea in children.Pediatrics.8890-97(1991))。
嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)產(chǎn)生近似相等量的D(-)-乳酸和L(+)-乳酸。含有嗜酸乳桿菌(菌株CRL730)和干酪乳桿菌(菌株CRL431)的發(fā)酵牛奶平均在4天中消除患有腸胃炎后綜合癥的嬰兒的腹瀉疾病。發(fā)酵牛奶使糞便的菌群恢復(fù)至主要的乳酸菌群。(Gonzalez et al.，″Biotherapeutic role of fermented milk.″Biotherapy.8129-134(1995))。
美國專利號5,908,646公開了通過加入有效量的有益微生物，主要產(chǎn)生L(+)-乳酸的鼠李糖乳桿菌(L.rhamnosus)[干酪乳桿菌亞種鼠李糖]而抑制人食品中的梭菌種類的生長或活性的方法。
美國專利號5,902,578涉及包含有助于預(yù)防腹瀉的人類腸道微生物的3種特異微生物的活細(xì)胞的組合物。具體地，3種微生物是路氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)、嗜酸乳桿菌和嬰兒雙歧桿菌(Bifidobacterium infantis)。腹瀉可由抗生素治療或病毒、細(xì)菌(例如大腸桿菌)或寄生蟲的感染而引起。
美國專利號5,716,615涉及包含用于治療胃腸機(jī)能紊亂的幾個不同細(xì)菌的組合物。該微生物可選自凍干的乳桿菌種類，包括嗜酸乳桿菌、凍干的雙歧桿菌種類、包括長雙歧桿菌(B.Longum)、嬰兒雙歧桿菌和雙歧雙歧桿菌(B.bifidum)和嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)。
乳酸雙歧桿菌是產(chǎn)生L(+)-乳酸的細(xì)菌。歷史上，在文獻(xiàn)中鑒定乳酸雙歧桿菌(Bifidobacterium lactis)Bb-12為″雙歧雙歧桿菌″(Fukushima et al.，″Effect of a probiotic formula onintestinal immunoglobulin A production in healthychildren.″Int.J.Food Microb.42-39-44(1998))。
包含雙歧雙歧桿菌和嗜熱鏈球菌的未發(fā)酵的嬰兒配方食品減少急性腹瀉和輪狀病毒腹瀉的發(fā)生。(Saavedra et al.，″Feeding ofBifidobacterium bifidum and Streptococcus thermophilus toinfants in hospital for prevention of diarrhoea and sheddingof rotavirus.″The Lancet.3441046-49(1994))。
包含雙歧雙歧桿菌和嗜熱鏈球菌的發(fā)酵的嬰兒配方食品與未發(fā)酵的對照制劑相比，誘導(dǎo)腸中更普遍的雙歧桿菌集群和更低的糞便pH。(Langhendries et al.，″Effect of a fermented infant formulacontaining viable Bifidobacteria on the fecal floracomposition and pH of healthy full-term infants.″J.Pediatr.Gastroenterol.Nutr.21177-181(1995))。
包含雙歧雙歧桿菌和嗜熱鏈球菌的未發(fā)酵的制劑支持營養(yǎng)不良的幼兒的追趕生長。包含2種細(xì)菌的基于乳品的制劑誘導(dǎo)腸的益生菌集群。(Haschke et al(1998))″臨床試驗證明改進(jìn)型的配制品和成熟型的牛奶中益生菌菌株雙歧桿菌Bb12的安全和效果.″Monatsschr.Kinderheilkd.146S26-30(1998)。
WO2000010582公開了利用一種或多種產(chǎn)生乳酸的細(xì)菌的種屬或菌株，優(yōu)選為凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)的菌株用于控制胃腸道病原體、包括控制抗生素-抗性的胃腸道病原體及其相關(guān)疾病的組合物和方法。
將包含益生菌雙歧雙歧桿菌(實際為乳酸雙歧桿菌Bb12)和益生元乳-低聚糖的嬰兒配方食品喂養(yǎng)給正常的嬰兒產(chǎn)生更有利的糞便菌群，具有較少的梭菌和更多的雙歧桿菌。(Fukushima et al.″Effectof follow-up formula containing Bifidobacteria(NAN BF)onfecal flora and fecal metabolites in healthychildren.″Bloscience Microflora.1665-72(1997))。
美國專利號6,241,983公開了包含有益的人腸道微生物和促進(jìn)胃腸道健康的食用纖維來源的組合物。更具體地說，該微生物可以選自乳桿菌和雙歧桿菌種屬。食用纖維的來源包括戊聚糖、β-葡聚糖、果膠和果膠多糖、甘露聚糖、阿拉伯聚糖和半乳聚糖、果糖低聚糖及其混合物。
美國專利號5,744,134要求保護(hù)包含有益的人腸內(nèi)微生物和促進(jìn)胃腸道健康的食用纖維來源的組合物。更具體地說，該微生物可以選自乳桿菌和雙歧桿菌種屬。食用纖維的來源是菊糖、果糖低聚糖、果膠、瓜耳豆膠及其混合物。
WO2001015714公開了用于增加全身免疫的組合物。該組合物包括一種或多種微量營養(yǎng)元素、一種或多種選自益生元、益生菌和共生菌的化合物、和以脂類為基礎(chǔ)或以碳水化合物為基礎(chǔ)的賦形劑。
WO2000033854描述了具有健康促進(jìn)作用的、特別是用于預(yù)防和/或治療消化道紊亂的制劑，其包含一種或多種益生菌和一種或多種不易消化的低聚糖。益生菌優(yōu)選地選自例如乳桿菌或雙歧桿菌種屬的菌株，以及選自例如酵母種屬菌株的酵母菌株。益生元可包括水解的角豆樹膠、菊糖、阿拉伯半乳聚糖、阿糖基木聚糖、β-葡聚糖、L-阿拉伯糖、半乳甘露聚糖和葡糖甘露聚糖。
EP904784公開了具有健康促進(jìn)作用的、特別是涉及預(yù)防和治療胃腸道紊亂的營養(yǎng)性制劑，其包括有效量的下列每一種微生物的活細(xì)胞主要產(chǎn)生左旋的L(+)-乳酸的雙歧桿菌屬、糞腸球菌(Enterococcus faecium)、和乳桿菌菌株。例證性的雙歧桿菌種屬包括嬰兒雙歧桿菌和乳酸雙歧桿菌。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及包括低聚果糖、唾液酸乳糖和益生細(xì)菌的營養(yǎng)性組合物。本發(fā)明進(jìn)一步指向抑制或消滅患者胃腸道中的致病生物的方法，包括對所述的患者腸內(nèi)施用包括低聚果糖、唾液酸乳糖和益生細(xì)菌的組合物。
發(fā)明詳述本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)低聚果糖、唾液酸乳糖和益生細(xì)菌的組合物消除致病細(xì)菌，特別是腸致病性大腸桿菌的腸內(nèi)感染，因此可用于預(yù)防由腸致病性大腸桿菌導(dǎo)致的腹瀉。優(yōu)選用于本制劑的益生細(xì)菌包括嗜酸乳桿菌和乳酸雙歧桿菌。
用于本組合物的唾液酸乳糖包括3′-唾液酸乳糖和6′-唾液酸乳糖。優(yōu)選地，在此使用的唾液酸乳糖是3′-唾液酸乳糖。
可根據(jù)例如美國專利號5,575,916、5,714,075、5,278,299、5,374,541、和5,876,980中所描述的任何方法制備唾液酸乳糖。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可認(rèn)識到任何其他合成和純化唾液酸乳糖的方法都可用于制備本發(fā)明的組合物中所使用的唾液酸乳糖。
可通過任何已知的合成和/或分離方法制備對本發(fā)明有用的低聚果糖。對本發(fā)明有用的可商業(yè)購買形式的低聚果糖是可從Orafti S.A.，Tienen，比利時獲得的Raftilose。
低聚果糖包括一系列天然存在于植物，例如洋蔥和菊苣植物的根中的低聚糖。低聚果糖可從在許多植物，包括洋蔥、韭菜、小麥、菊苣和菊芋中發(fā)現(xiàn)的天然存在的多聚果糖(菊糖)在工業(yè)上制備。菊苣是最通常使用的。可通過本領(lǐng)域已知的方法從這些植物回收足夠數(shù)量的低聚果糖。天然存在的菊糖包括低聚果糖和果糖的高聚物。從例如菊苣的植物的菊糖衍生的低聚果糖包含多聚果糖鏈和具有末端葡萄糖單體的多聚果糖鏈。
低聚果糖可通過合成而不是提取方法來制備?？蓮恼崽峭ㄟ^利用一種酶，β-呋喃果糖苷酶進(jìn)行轉(zhuǎn)果糖化的方式而合成低聚果糖，其中所述的酶將附加的果糖單體連接到蔗糖分子上。在這個方式中形成的低聚果糖包含連接至末端葡萄糖單體上的果糖單元。這種果糖低聚糖的實例是蔗果三糖(GF2)、霉菌赤蘚醛糖(GF3)和呋喃果糖化的霉菌赤蘚醛糖(GF4)。通過諸如這些方法制備的包括低聚糖混合物的低聚果糖是例如可從GTC Nutrition Company，Golden，CO，美國獲得的NutraFlora。
對本發(fā)明有用的合適益生菌是雙歧桿菌和乳桿菌。乳酸雙歧桿菌BB1和嗜酸乳桿菌NCFM可從Rhodia公司獲得。
本發(fā)明的營養(yǎng)性組合物可包括(或用水稀釋后能夠包括)0.1g/L至10g/L的低聚果糖、6mg/L至10g/L的唾液酸乳糖、每升106至1014集落形成單位(cfu)的乳桿菌、和106至1014cfu/L的雙歧桿菌。優(yōu)選地，本組合物包括(或用水稀釋后能夠包括)0.3g/L至6g/L的低聚果糖、60mg/L至1g/L的唾液酸乳糖、108至1012cfu/L的乳桿菌和108至1012cfu/L的雙歧桿菌。更優(yōu)選地，本制劑包括(或用水稀釋后能夠包括)1g/L至3g/L的低聚果糖、100mg/L至600g/L的唾液酸乳糖、109至1011cfu/L的乳桿菌、和109至1011cfu/L的雙歧桿菌。以及甚至更優(yōu)選地包括大約3g/L的低聚果糖、大約100mg/L的唾液酸乳糖、大約3×1010cfu/L的乳桿菌和大約3×1010cfu/L的雙歧桿菌。
本發(fā)明的營養(yǎng)性組合物可以以多種營養(yǎng)性產(chǎn)品，例如嬰兒配方食品、改進(jìn)型的配制品、嬰兒飲料、牛奶、酸奶、針對較年長兒童的基于水果的產(chǎn)品(例如果汁)、糖果、口香糖、錠劑、粉劑、片劑等的形式或與之結(jié)合的形式加以使用。優(yōu)選地，該營養(yǎng)性組合物以嬰兒配方食品的形式進(jìn)行使用。當(dāng)用作嬰兒配方食品時，可能以料液或粉末的形式準(zhǔn)備，再與水混合并且喂給嬰兒。最優(yōu)選地，將本制劑以粉末的形式加入嬰兒配方食品中。
適用于本發(fā)明的嬰兒配方食品應(yīng)該包含全部維生素和認(rèn)為在嬰兒的每日飲食中必需的礦物質(zhì)。這些維生素和礦物質(zhì)應(yīng)該以營養(yǎng)性顯著的數(shù)量存在。可包括在將被加入本制劑的嬰兒配方食品內(nèi)的維生素、礦物質(zhì)和其他營養(yǎng)的實例包括維生素A、復(fù)合維生素B、維生素C、維生素D、維生素E、維生素K、鈣、鎂、鈉、鉀、磷、銅、鋅、氯化物、碘、硒、鐵、煙酸、葉酸、泛酸、生物素、膽堿、肌醇和錳。
嬰兒配方食品可包含本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠認(rèn)識到的一種或多種脂類來源。嬰兒配方食品可進(jìn)一步地包含已知具有有益效果的其他物質(zhì)。這種物質(zhì)的實例包括核苷酸、免疫球蛋白、多聚不飽和脂肪酸等。進(jìn)一步參考下列非限制性的實施例對本發(fā)明加以說明。
實施例1當(dāng)用水稀釋127.3克的所述嬰兒配方食品至1升體積時，根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的嬰兒配方食品提供下列營養(yǎng)營養(yǎng)單位每升能量 Kcal 672蛋白質(zhì)g 15乳清∶酪蛋白比率 60-40脂肪 g 36碳水化合物，包括 g 72低聚果糖 g 3.0唾液酸乳糖mg 100嗜酸乳桿菌NCFMcfu3×1010乳酸雙歧桿菌BB1 cfu3×1010維生素A RE 750混合的天然類胡蘿卜素 IU 400維生素D mcg10.6維生素E IU 7.4維生素K mcg67.0維生素B1(硫胺素) mcg1000維生素B2(核黃素) mcg1500維生素B6(吡哆醇) mcg600維生素B12(氰鈷胺素) mcg2.0煙酸 mcg9.0葉酸 mcg80
泛酸mcg 3000生物素 mcg 90維生素C(抗壞血酸) mg20膽堿mg100肌醇mg33鈣 mg460磷 mg333鎂 mg64鐵 mg8.0鋅 mg6.0錳 mcg 50銅 mcg 560碘 mcg 100鈉 mg160鉀 mg650氯化物 mg433硒 mcg 14下列實驗說明嗜酸乳桿菌和乳酸雙歧桿菌消除腸致病性大腸桿菌的腸內(nèi)感染的有效性。
實驗設(shè)計下列實驗來評估嗜酸乳桿菌和乳酸雙歧桿菌的組合作為預(yù)防由腸致病性大腸桿菌(″EPEC″)導(dǎo)致的腹瀉的方法，其中用這種病原體有意感染猴子嬰兒。
對恒河猴新生兒(黃褐色獼猴(Macaca mulatto))以唯一的方式喂養(yǎng)人化的嬰兒配方食品(S26，可從Wyeth Nutrition獲得)或來自出生的母乳。
在八(8)至九(9)周齡的開始，給予猴子109集落形成單位(cfu)的腸致病性大腸桿菌(EPEC)E2348/69。以通過胃插管法給予人化嬰兒配方食品或母奶的方式施用EPEC。評估糞便稠度、食欲、體溫和脫水。在EPEC給藥的當(dāng)天和在接種后的第3、6、和19或21天從每只猴子獲得直腸擦抹物。
通過混合150克含有1010cfu/g的每種微生物的嗜酸乳桿菌NCFM(North Carolina Dairy Foundation的商標(biāo))和嬰兒雙歧桿菌BB1(都從Rhodia公司獲得)的等量混合物來制備益生菌。將益生菌只摻入人化的配制品中。在研究結(jié)束前7天，將所有喂養(yǎng)配制品的猴子轉(zhuǎn)變?yōu)檠a充有如上所述的益生菌混合物的配制品。以每種細(xì)菌為1.3×1010cfu/L的滴度喂養(yǎng)益生菌。
收集直腸擦抹物并如下所述進(jìn)行微生物評估。
為了評估外源導(dǎo)入的致病和益生細(xì)菌的集群，發(fā)展了能夠鑒定特異性的微生物種類的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)分析。設(shè)計只檢測令人感興趣的種類的引物以便排除屬內(nèi)的其他種類。從在LAC25平板上生長的兩組糞便培養(yǎng)物的樣品中分離DNA，一組為有氧生長的而第二組為無氧生長的。隨后冷凍兩組糞便培養(yǎng)物。如下進(jìn)行PCR反應(yīng)94℃30秒，50℃1分鐘，以及72℃1分鐘，進(jìn)行5個循環(huán)，然后立即為94℃30秒，56℃1分鐘，以及72℃1分鐘，進(jìn)行30個循環(huán)。引入最終的延伸時間(72℃10分鐘)以保證完全合成所有的DNA產(chǎn)物。通過瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，并且經(jīng)透射目測觀察。
通過16S核糖體的方法證實乳酸雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌的鑒定。從由菌落分離的基因組DNA對來自乳酸雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌的特定長度的16SrRNA基因區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增。由于種屬之間16SrRNA基因的同源性，從大腸桿菌(第005和531位)設(shè)計引物，其從令人感興趣的種類特異地產(chǎn)生唯一長度的可區(qū)別產(chǎn)物。利用AmpliTaq FS DNA聚合酶和羅丹明染料終止劑進(jìn)行16SrRNA擴(kuò)增產(chǎn)物的循環(huán)測序，并且在ABIPrism 377DNA測序儀上電泳。利用PE/Applied生物系統(tǒng)DNA編輯和裝配軟件分析數(shù)據(jù)。將來自擴(kuò)增產(chǎn)物的序列與序列數(shù)據(jù)庫相比較并產(chǎn)生表現(xiàn)出種屬水平相配的大于99％準(zhǔn)確度的16SrRNA序列同源性。
根據(jù)這些鑒定設(shè)計引物對。參考公共的DNA數(shù)據(jù)庫以確定適于獨特PCR引物對的細(xì)菌DNA區(qū)域。乳酸雙歧桿菌引物對靶向乳酸雙歧桿菌的413bp區(qū)域，而嗜酸乳桿菌引物對靶向嗜酸乳桿菌的460bp區(qū)域。為了便于在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行鑒定，通過添加GC-尾部來改進(jìn)嗜酸乳桿菌的引物。
設(shè)計成特異地檢測嗜酸乳桿菌的引物對針對鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌(L.plantarum)和鼠李糖乳桿菌GG是有效的。設(shè)計成能特異地檢測乳酸雙歧桿菌的引物對針對青春雙歧桿菌(B.adolescentis)、嬰兒雙歧桿菌、和雙歧雙歧桿菌是有效的。在每種情況中只檢測到令人感興趣的種類。
也發(fā)展了PCR方法并用于確定動物體是否已經(jīng)通過外源導(dǎo)入的腸致病性大腸桿菌(EPEC)E2348/69而具有集落菌。PCR方法包括在如上所述的PCR反應(yīng)前從60個冷凍樣品的每一種分離的DNA。根據(jù)公開的序列信息，設(shè)計能夠特異性地檢測編碼EPEC的BFP蛋白質(zhì)基因的326bp區(qū)域的EPEC PCR引物。被設(shè)計成能檢測EPEC的EPEC引物針對腸產(chǎn)毒性大腸桿菌(ETEC)是有效的。只檢測到EPEC。
通過PCR檢查來自猴子的糞便擦抹樣品中EPEC DNA的存在。在采取處理的第0天、感染當(dāng)天，在任何樣品中沒有檢測到EPEC。在處理的第3天(用EPEC感染后)，所有的樣品被測試為EPEC陽性。令人驚訝地，在研究的最后一天，在處理的第19或21天，在從喂養(yǎng)了補充有益生菌的配制品的猴子采集的任何糞便擦抹樣品中沒有檢測到EPEC；而在來自哺母乳的猴子的所有糞便擦抹樣品中檢測到了EPEC。
表1說明PCR測定的結(jié)果。接種EPEC的猴子在單個EPEC接種后直到3周具有EPEC-陽性的擦抹物。這表明這些猴子中菌落的成功的集群化。而到研究結(jié)束時在EPEC接種和集落化之后，這些用補充有益生菌的配制品喂養(yǎng)的猴子具有EPEC-陰性的糞便擦抹物。相比之下，沒有接收益生菌的哺乳猴子保持EPEC-陽性。
表1
ND＝未進(jìn)行；-/+指示在重復(fù)試驗中有變化的結(jié)果在喂養(yǎng)了配制品的猴子中完成補充益生菌的方案后，通過如上所述的PCR分析確證益生菌(嗜酸乳桿菌NCFM和乳酸雙歧桿菌BBI)在腸內(nèi)的集群化。表1證明了在腸內(nèi)施用人益生菌而在恒河猴幼兒中集群化。同時，從來自猴子胃腸道的分離物中沒有檢測到致病性的大腸桿菌。
實施例1的嬰兒配方食品可類似地用于消滅來自猴子胃腸道的致病大腸桿菌。
本發(fā)明可以以其他特定的形式具體體現(xiàn)而不背離其精神和基本的特征，因此應(yīng)該參考所附的權(quán)利要求書，而不是上述說明書來表明本
權(quán)利要求
1.一種營養(yǎng)性組合物，包括低聚果糖、唾液酸乳糖和益生細(xì)菌。
2.如權(quán)利要求1中所述的營養(yǎng)性組合物，其中益生細(xì)菌是嗜酸乳桿菌和乳酸雙歧桿菌。
3.如權(quán)利要求2中所述的營養(yǎng)性組合物，包括、或能夠包括用水稀釋后的0.1g/L至10g/L的低聚果糖、6mg/L至10g/L的唾液酸乳糖、106至1014cfu/L的嗜酸乳桿菌和106至1014cfu/L的乳酸雙歧桿菌。
4.一種消滅患者胃腸道中的致病生物的方法，包括對所述的患者腸內(nèi)施用包括低聚果糖、唾液酸乳糖和益生細(xì)菌的營養(yǎng)性組合物。
5.低聚果糖、唾液酸乳糖和益生細(xì)菌在制備用于消滅胃腸道中的致病生物的藥物中的用途，該藥物是用于腸內(nèi)給藥的營養(yǎng)性組合物的形式。
6.用作藥物的如權(quán)利要求1中所述的營養(yǎng)性組合物。
7.如權(quán)利要求5中所述的用途，其中所述的藥物是嬰兒配方食品的形式。
8.如權(quán)利要求5或7中所述的用途，其中所述的益生細(xì)菌是嗜酸乳桿菌和乳酸雙歧桿菌。
9.如權(quán)利要求8中的用途，其中所述的藥物包括在用水稀釋后或能夠包括0.1g/L至10g/L的低聚果糖、6mg/L至10g/L的唾液酸乳糖、106至1014cfu/L的嗜酸乳桿菌和106至1014cfu/L的乳酸雙歧桿菌。
10.如權(quán)利要求8中所述的用途，其中所述的藥物包含或在用水稀釋后能夠包含0.3g/L至6g/L的低聚果糖、60mg/L至1g/L的唾液酸乳糖、108至1012cfu/L的嗜酸乳桿菌和108至1012cfu/L的乳酸雙歧桿菌。
11.如權(quán)利要求8中所述的用途，其中所述的藥物包括或在用水稀釋后能夠包括0.3g/L至6g/L的低聚果糖、60mg/L至1g/L的唾液酸乳糖、108至1012cfu/L的嗜酸乳桿菌和108至1012cfu/L的乳酸雙歧桿菌。
12.低聚果糖、唾液酸乳糖、嗜酸乳桿菌和乳酸雙歧桿菌細(xì)菌在制備用于預(yù)防由腸致病性大腸桿菌導(dǎo)致的腹瀉的藥物中的用途，該藥物是用于腸內(nèi)給藥的嬰兒配方食品的形式。
全文摘要
提供包括低聚果糖、唾液酸乳糖和益生細(xì)菌的營養(yǎng)性組合物，其可用于消滅患者胃腸道中的致病微生物。
文檔編號A23L1/30GK1703149SQ200380101177
公開日2005年11月30日 申請日期2003年10月8日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月11日
發(fā)明者S·M·考普, J·L·威爾遜, B·M·科斯特克, D·C·弗蘭茨 申請人:惠氏公司