專利名稱：P2y12受體的h2單元型與增加的血栓形成和外周動脈疾病的危險相關的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及與血小板凝集(platelet aggregation)和血栓形成的危險相關的P2Y12受體的多態(tài)性的鑒定。
ADP(腺苷5′-二磷酸)是止血和血栓形成的最重要的介體之一(Storey等，2000)。ADP在血小板上的作用是通過被稱為P2Y1和P2Y12的兩種P2Y受體介導的。大量的證據(jù)表明，P2Y12受體在止血血栓的形成和動脈血栓形成的發(fā)生方面起著關鍵作用(Mills等，1996；Cattaneo等，1999)。P2Y12在動脈血栓形成中的關鍵作用得到噻吩并吡啶類抗血栓形成藥物，如靶向P2Y12受體(Hollopeter等，2001；Quinn等，1999)的氯吡格雷和噻氯匹定，對諸如中風，心肌梗塞和周圍性血管疾病的多種血栓形成疾病的有益作用的證實(Quinn等，1999；和參見CAPRIESteering Committee.Lancet.1996；3481329-1339)。ADP信號傳導涉及由Gq-結(jié)合的P2Y1受體介導的Ca++的瞬時升高(Jin等，1998a)，和由Gj-結(jié)合的P2Y12受體介導的腺苷酸環(huán)化酶的抑制(Hollopeter等，2001；Foster等，2001)。由ADP同時活化Gq和Gj途徑是正常凝聚所必須的(Jin等，1998b；Hechler等，1998a)。通過P2Y1活化Gq途徑導致了血小板形狀的改變，和血小板凝集的可快速逆轉(zhuǎn)波(Jin等，1998a；Hechler等，1998a)，而通過P2Y12活化Gi途徑引起了緩慢發(fā)展和持久的血小板凝集(Hechler等，1998b)。P2Y12的作用并不局限于抑制腺苷酸環(huán)化酶，以及細胞內(nèi)cAMP含量的隨后降低。實際上，業(yè)已證實P2Y12受體能通過磷酸肌醇3-(PI3-)激酶途徑(Kauffenstein等，2001)和/或另一種未鑒定的G蛋白(Daniel等，1999)激活糖蛋白(GP)IIbIIIa整聯(lián)蛋白。因此，P2Y12表現(xiàn)出在接觸ADP時出現(xiàn)的血小板凝集的不可逆轉(zhuǎn)波方面具有重要作用。
最近，由兩個研究小組鑒定了編碼342個氨基酸的受體的P2Y12基因(Hollopeter等，2001；Foster等，2001；Zhang等，2001)。業(yè)已描述了上四位患者，在接觸ADP之后，他們的血小板發(fā)生了很少或沒有可逆的凝集，并且表現(xiàn)出降低前列腺素E1(PGE1)-刺激的血小板的正常腺苷酸環(huán)化酶抑制作用(Nurden等，1995；Cattaneo等，1992)。在一位患者中，這種表型與P2Y12基因異常相關(Hollopeter等，2001)。
業(yè)已報導了產(chǎn)生不可逆轉(zhuǎn)的凝集所需要的ADP的濃度在個體之間具有很大變化(Feng等，1999)。
由于遺傳因素在血小板凝集方面具有重要作用(O′Donnell等，2001)，本發(fā)明人研究了P2Y12基因上的序列變異，這些變異可能解釋血小板凝集對ADP的反應的個體間差異。
本發(fā)明人在P2Y12受體基因上鑒定了三個單核苷酸多態(tài)性(SNP)和核苷酸插入，它們確定了被稱為H1和H2的兩種單元型。H2單元型與響應ADP的較高的最大血小板凝集相關。
與提高的ADP誘導的血小板凝集強烈相關的P2Y12受體單元型的鑒定具有重要的臨床意義，特別是在篩查具有血栓形成，特別是動脈血栓形成(atherothrombosis)的危險，和對噻吩并吡啶類藥治療欠佳反應的對象方面具有重要作用。
考慮到高危外周動脈疾病(PAD)患者中P2Y12受體的特異性，和H 2等位基因在血小板凝集中的功能的增加，本發(fā)明人在病例-對照研究中進一步研究了P2Y12基因H2單元型與PAD的關系。
他們發(fā)現(xiàn)了P2Y12H2單元型與PAD的強烈相關。
根據(jù)以上結(jié)果，本發(fā)明提供了用于區(qū)分P2Y12受體中的H1和H2單元型的方法，后者與出現(xiàn)血栓形成的較高的危險和/或?qū)︵绶圆⑦拎ゎ愃幹委熭^低的敏感性相關。
因此，該方法可用于測定在對象體內(nèi)出現(xiàn)血栓形成，特別是動脈血栓形成的危險。
該方法還可用于測定對象對噻吩并吡啶類藥治療的敏感性。
P2Y12受體如上文所述，業(yè)已克隆了人P2Y12受體。另外，已表征了其他物種中的變體。
在本發(fā)明中，術語“P2Y12受體”表示任何物種，特別是人類的P2Y12受體，不過，還表示如果需要的話，可以使用本發(fā)明的方法的其他哺乳動物或脊椎動物的P2Y12受體。因此，術語“對象”表示任何人類患者或任何哺乳動物或脊椎動物。
人P2Y12cDNA序列可以從Genbank獲得(登記號AF313449和AY136754)。
本發(fā)明人分析了健康人群中的P2Y12基因，并且發(fā)現(xiàn)它包括由位于ATG密碼子的上游、長度大約為1700bp的一個內(nèi)含子分開的至少二個外顯子。外顯子2編碼完整的342個氨基酸的蛋白。因為具有6個核苷酸(nt)的重復序列(表1)，無法確定外顯子1的確切的3′末端和外顯子2的5′起始位點。
表1描述外顯子1的確切的3′末端和外顯子2的5′起始位點的可能的核苷酸序列模式。內(nèi)含子序列用小寫字母表示。在重復序列下面劃線。本發(fā)明人隨意選擇模式1進行核苷酸編號。
表1表示三種可能的序列模式，模式3是最可能的。不過，本發(fā)明人在開始他們的研究工作時隨意選擇了模式1，對研究的多態(tài)性進行編號。因此，對下面的多態(tài)性進行編號時，遵循模式1。
根據(jù)模式1，序列SEQ ID No 1代表內(nèi)含子的5′序列，而序列SEQID No 2代表外顯子2的5′序列，根據(jù)本發(fā)明，它們是P2Y12基因中的感興趣的部分。這兩種序列都顯示下面定義的H2單元型。起始密碼子ATG的A核苷酸是SEQ ID No 2上的17號核苷酸。
H1/H2單元型本發(fā)明人業(yè)已對P2Y12基因進行了測序，并且發(fā)現(xiàn)三種感興趣的單核苷酸多態(tài)性(SNPS)和單核苷酸插入多態(tài)性(表2)。在本發(fā)明中，這些多態(tài)性有時又被稱作″感興趣的多態(tài)性位置″。
表2在所述研究群體中檢測的多態(tài)性的描述。所述H1/H2單元型是由i-C139T，i-T744C(也被錯誤地稱為i-T745C)，i-ins801A(也被錯誤地稱為i-ins802A)和G52T多態(tài)性確定的。
兩種變異位于5′內(nèi)含子(在本文中被縮寫為″i″)起始位點后139個核苷酸和744個核苷酸，所述變異分別由C至T(i-C139T)和T至C(i-T744C)的轉(zhuǎn)換構(gòu)成。另一種多態(tài)性由位于內(nèi)含子的801號位置上的單核苷酸插入(A)(i-ins801A)構(gòu)成。另外兩種多態(tài)性出現(xiàn)在外顯子2上，并且分別由位于ATG密碼子的第一個核苷酸后17個核苷酸和35個核苷酸的C至T轉(zhuǎn)換(C34T)和G至T顛換(G52T)構(gòu)成；它們都不改變編碼的氨基酸(分別為Asn6和Gly12)。C34T多態(tài)性與對ADP響應的最大凝集沒有關系。
由于在100位白色人種的健康志愿者群體中i-C139T，i-T744C，i-ins801A和G52T多態(tài)性是完全連鎖不平衡的，本發(fā)明人將主要等位基因的單元型命名為″H1″(139號位置上的C，744號位置上的T，和i-ins801A在所述內(nèi)含子上的缺乏，以及外顯子2的52號位置上的G)，并且將次要等位基因的單元型命名為″H2″(139號位置上的T，744號位置上的C，i-ins801A在所述內(nèi)含子上的存在，和外顯子2的52號位置上的T)。單元型H1和H2的相應的等位基因頻率為86％和14％。所有多態(tài)性的等位基因頻率符合哈迪-溫伯格平衡。
與H2等位基因的非攜帶者(H1/H1)相比，H2等位基因的攜帶者(H1/H2或H2/H2)在體外具有更強的ADP-刺激的血小板凝集，細胞內(nèi)cAMP水平的調(diào)節(jié)不同。
具有H2單元型的P2Y12受體基因的分離的核酸同樣是本發(fā)明的一部分。
因此，本發(fā)明的一個主題是編碼P2Y12受體的分離的核酸，所述核酸包括P2Y12基因序列，它同時具有T在所述內(nèi)含子的139號位置上的存在，C在所述內(nèi)含子的744號位置上的存在，A在所述內(nèi)含子的801號位置上的插入，和T在外顯子2的52號位置上的存在。
所述核酸優(yōu)選包括SEQ ID No 1和/或SEQ ID No 2。
血栓形成危險本發(fā)明提供了一種用于測定在對象體內(nèi)患血栓形成的危險的體外方法，該方法包括鑒定P2Y12受體在內(nèi)含子(SEQ ID No 1)的139，744，和801號位置，和在外顯子2(SEQ ID No 2)的52號位置上的多態(tài)性，其中，T在所述內(nèi)含子的139號位置上的存在，C在所述內(nèi)含子的744號位置上的存在，A在所述內(nèi)含子的801號位置上的插入，和T在外顯子2的52號位置上的存在的同時出現(xiàn)，被命名為H2單元型，并且指示了與對照對象相比，患血栓形成的更高危險，其中所述對照對象即在所述任何等位基因上都沒有H2單元型的對象(即H1/H1對象)。
患血栓形成的更高的危險是指，與非攜帶者相比，在H2等位基因攜帶者中的明顯更大的危險。
這種相對危險性通常是通過病例-對照研究并且使用比數(shù)比(oddsratio，OR)評估的。1.1的OR相當于患病的危險提高了10％，而2的OR相當于危險增加了100％。
患血栓形成的危險與血小板凝集的誘導相關。
血小板對于動脈血栓形成來說是特別重要的，并且還通過與功能紊亂的內(nèi)皮細胞的黏附和生長因子和細胞因子的釋放參與動脈粥樣硬化損傷的開始和發(fā)展。動脈粥樣硬化疾病的最重要的血管靶標包括腦動脈床、冠狀動脈床和下肢動脈床。
在本發(fā)明中，術語″血栓形成″表示在血管中或在心臟管腔中血液凝塊的形成。
在優(yōu)選實施方案中，包括動脈血栓形成。
術語″動脈血栓形成″，″動脈粥樣硬化″和″動脈的血栓形成″是同義詞。
動脈血栓形成是很多血栓形成疾病，如中風，心肌梗塞和外周動脈疾病(PAD)的主要現(xiàn)象。
動脈血栓形成和動脈粥樣硬化疾病的同時出現(xiàn)在外周動脈疾病(PAD)中是特別重要的。實際上，PAD與冠狀動脈和腦血管的動脈硬化癥事件的高危險相關，并且流行病學研究業(yè)已證實了75％的PAD患者死于血管疾病(Ouriel等，2001)。
因此，在對象體內(nèi)鑒定P2Y12受體的H2單元型進一步指示了患這種血栓形成疾病，特別是PAD的較高危險。
在本發(fā)明的含義內(nèi)，上文所定義的″血栓形成″包括其他血栓形成狀態(tài)，如靜脈血栓形成和靜脈血栓栓塞病，以及血栓性微血管病或血管內(nèi)彌散性血凝固。
對噻吩并吡啶類藥治療的敏感性本發(fā)明還提供了一種用于測定對象對噻吩并吡啶類藥治療的敏感性的體外方法，該方法包括鑒定P2Y12受體在內(nèi)含子(SEQ ID No 1)的139，744，和801號位置，和在外顯子2(SEQ ID No 2)的52號位置上的多態(tài)性，其中，T在所述內(nèi)含子的139號位置上的存在，C在所述內(nèi)含子的744號位置上的存在，A在所述內(nèi)含子的801號位置上的插入，和T在外顯子的52號位置上的存在的同時出現(xiàn)，被命名為H2單元型，并且，當存在于至少一個等位基因上時，指示與對照對象相比，所述對象對噻吩并吡啶類藥治療具有較低的敏感性，其中所述對照對象即沒有H2等位基因的對象(即H1/H1對象)。
在本發(fā)明中，″噻吩并吡啶類藥治療″表示目前所采用的抗血栓形成治療，它包括施用諸如氯吡格雷或噻氯匹定等噻吩并吡啶類藥物，或能阻斷ADP和P2Y12之間的相互作用的任何其他制劑。
″對象對噻吩并吡啶類藥治療的敏感性″表示進行這種治療的對象的反應的多樣性。對所述治療較低的敏感性相當于較差的反應，因此是不理想的。
為了在早期階段幫助醫(yī)生設計最適用于所述對象的治療方案，確定對象對噻吩并吡啶類藥治療的敏感性是特別有價值的。
H2等位基因之存在的鑒定上述方法，即用于測定血栓形成風險的方法和測定對噻吩并吡啶類藥治療的敏感性的方法，包括鑒定P2Y12受體基因的H1/H2單元型。
所述鑒定可以通過本領域技術人員所熟知的任何技術進行。
在實施本發(fā)明的方法時，可以通過從所述個體內(nèi)獲得DNA，并且確定感興趣的P2Y12受體基因的多態(tài)性位置上的序列，來確定個體的有關H1/H2單元型的多態(tài)性形式。
所述DNA可以從任何細胞來源獲得。臨床應用中可以使用的細胞來源的非限定性例子包括血細胞，口腔細胞，子宮頸陰道細胞，來自尿道的上皮細胞，胎兒細胞，毛發(fā)，或通過活組織檢查獲得的存在于組織中的任何細胞。細胞還可以從體液中獲得，體液包括，但不局限于血液，唾液，汗液，尿液，腦脊髓液，糞便，在感染或發(fā)炎部位的組織分泌液。DNA可以利用本領域標準的多種方法中的任意一種從所述細胞來源或體液中提取。應當理解的是，用于提取DNA的特定方法取決于所述來源的性質(zhì)。在另一種實施方案中，分析是在不提取DNA的情況下進行的，例如，對全血進行(Mercier等，1990)。
對H1/H2單元型的多態(tài)性位置上的DNA序列的確定，是通過本領域已知的任何方法實現(xiàn)的。用于基因型分析的多種方法是現(xiàn)有的(Antonarakis等，1989；Cooper等，1991；Grompe，1993)。所述方法包括，但不局限于直接測序，限制片段長度多態(tài)性(RFLP)分析，與標記特異性寡核苷酸雜交，等位基因特異性PCR，使用誘變引物的PCR，連接酶-PCR，HOT裂解，變性梯度凝膠電泳(DGGE)，溫度變性梯度凝膠電泳(TGGE)，單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)和變性高效液相層析(Kuklin等，1997)。直接測序可以通過任何方法進行，包括，但不局限于使用Maxam-Gi1bert方法的化學測序；使用Sanger方法的酶促測序；質(zhì)譜分析測序；使用芯片型技術的測序(例如，參見Little等，1996)；和實時定量PCR。優(yōu)選的是，首先使用特定的擴增引物，通過凝集酶鏈反應(PCR)對來自對象的DNA進行擴增。不過，還可以采用若干種其他方法，可以不依賴于PCR對DNA進行研究，如寡核苷酸連接測定(OLI)，滾環(huán)擴增(RCA)或InvaderTM測定。
在本發(fā)明的具體實施方案中，提供了用于鑒定對象體內(nèi)與血栓形成相關或與對噻吩并吡啶類藥治療較低的敏感性相關的P2Y12受體的單元型的至少一種多態(tài)性的體外方法，該方法包括在P2Y12受體基因的至少一個區(qū)域上分析生物學樣品的基因組DNA，所述區(qū)域位于內(nèi)含子(SEQ IDNo 1)的139，744，和801號位置和外顯子2(SEQ ID No 2)的52號位置周圍；其中，T在所述內(nèi)含子的139號位置上的存在，C在所述內(nèi)含子的744號位置上的存在，A在所述內(nèi)含子的801號位置上的插入，和T在外顯子2的52號位置上的存在的同時出現(xiàn)，被命名為H2單元型，并且，當存在于至少一個等位基因上時，指示與對照對象相比，具有患血栓形成的較高危險或?qū)︵绶圆⑦拎ゎ愃幹委熅哂休^低敏感性。
所述分析優(yōu)選可以包括擴增所述基因組DNA的所述區(qū)域的步驟(例如，通過PCR擴增)。
在一個具體實施方案中，所述分析是對分離的(即提取的)基因組DNA進行的。
用于鑒定P2Y12受體多態(tài)性的優(yōu)選技術包括測序。
試劑盒根據(jù)本發(fā)明的一個方面，H1/H2單元型是通過讓所述對象的DNA與任選地標記過的核酸探針接觸檢測的。
還可將引物用于擴增包括感興趣的多態(tài)性位置的P2Y12基因的部分或?qū)λM行測序。
所述探針或引物是能夠與包括所述感興趣的多態(tài)性位置的P2Y12基因序列的部分特異性雜交的核酸。這意味著，它們是能夠與所提及核酸序列在高嚴格條件下雜交(Sambrook等，1989)的序列。所述條件是根據(jù)解鏈溫度Tm和高離子強度確定的。優(yōu)選的是，最理想的序列是能夠在(Tm-5℃)至(Tm-30℃)的溫度范圍，更優(yōu)選(Tm-5℃)至(Tm-10℃)溫度范圍內(nèi)雜交的序列。6×SSC的離子強度是更優(yōu)選的。例如，高嚴格性雜交條件相當于最高Tm，例如，50％甲酰胺，5×或6×SCC。SCC是0.15M NaCl，0.015M檸檬酸鈉。雜交要求兩種核酸包括互補序列，不過，根據(jù)雜交的嚴格性，堿基之間的錯配是可能的。用于雜交核酸的合適的嚴格性取決于核酸的長度和互補程度，本領域眾所周知的變量。兩種核酸序列之間相似或同源程度越高，具有所述序列的核酸雜交體的Tm值越高。核酸雜交的相對穩(wěn)定性(相對于較高的Tm)按以下順序減弱RNA:RNA，DNA:RNA，DNA:DNA。對于長度超過100個核苷酸的雜交來說，業(yè)已推導出了用于計算Tm的方程(參見Sambrook等，同上，9.50-9.51)。對于較短核酸，即寡核苷酸的雜交來說，錯配的位置變得更為重要，并且寡核苷酸的長度決定它的特異性(參見Sambrook等，同上，11.7-11.8)。可雜交核酸的最低長度至少為大約10個核苷酸；優(yōu)選至少大約15個核苷酸；更優(yōu)選所述長度至少為大約20個核苷酸。
優(yōu)選的探針或引物在下面的


或?qū)嵤├信丁?br> 當所述引物是誘變引物時，用于確定所述雜交條件的上述規(guī)則需要調(diào)整。誘變引物的序列可能實際上相對野生型序列是部分改變了的，以便在擴增特定等位基因時導入限制位點。另外，所述誘變引物的長度常常為30-40個核苷酸。
本發(fā)明還提供了適用于確定P2Y12受體的H1/H2單元型的至少一種多態(tài)性的試劑盒。
所述試劑盒可以包括以下部分(i)……of DNA，并且可以預先標記。或者，所述探針可以是未標記過的，并且用于標記的成分可以包含在所述試劑盒的獨立容器中；和(ii)雜交試劑所述試劑盒還可以包括特定雜交方法所需要的其他適當包裝的試劑和材料，如果適合的話包括固相基質(zhì)，和標準物。
在另一種實施方案中，所述試劑盒可以包括(i)序列確定或擴增引物測序引物可以是預先標記的或可以包括親和純化或連接部分；和(ii)序列確定或擴增試劑所述試劑盒還可以包括特定測序擴增方法所需要的其他適當包裝的試劑和材料。在一種優(yōu)選實施方案中，所述試劑盒包括一組測序或擴增引物，它們的序列相應于靠近至少一個所述多態(tài)性位置的序列，以及用于檢測每一種多態(tài)性序列的存在的工具。
在一個具體實施方案中，提供了一種試劑盒，它包含對擴增包括內(nèi)含子(SEQ ID No 1)的139，744和801號位置和/或外顯子2(SEQ IDNo 2)的52號位置中的至少一個的全部或部分P2Y12基因特異的核苷酸引物對。
下面的附圖和實施例舉例說明了本發(fā)明，而不限定它的范圍。

圖1是表示在P2Y12基因中所述引物和多態(tài)性的位置的示意圖。
用引物E和J獲得了大約3100bp的PCR產(chǎn)物。然后，用以下引物進行序列分析B5’TCATGCCAGACTAGACCGAA3’(SEQ ID N°3)，C5’ATCGATCGCTACCAGAAGACCACC3’(SEQ ID N°4)，E5’GGCTGCAATAACTACTACTT3’(SEQ ID N°5)，F(xiàn)5’AATTCCTTTCTGTCCTTAATT3’(SEQ ID N°6)，G5’TAAATAGGTGAGGAGATGCTG3’(SEQ ID N°7)，H5’TGCATTTCTTGTTGGTTACCT3’(SEQ ID N°8)，J5’GTCGTTTGTTTTGCTGCTAATA3’(SEQ ID N°9)，K5’CATTGAGAATTTCAGCTCCC3’(SEQ ID N°1O)，L5’ATACTAACTACTACAATGAAGAT3’(SEQ ID N°11)和M5’CCTTACACCCTGAGCCAAAC3’(SEQ ID N°12).
ATG和TAA分別是起始和終止密碼子。i-C139T，i-T744C，i-ins801A，C34T和G52T是存在于所述研究群體中的多態(tài)性。
圖2是顯示在98位健康志愿者中對ADP的最大血小板凝集反應的圖。在3分鐘的孵育時間之后，用2μM ADP刺激血小板(250×109/L，存在于檸檬酸化的PRP中)。在第一次觀察和第二次觀察(一周之后)時記錄的凝集之間的和諧系數(shù)(concordance coefficient)為77％(P＜0.001)。
圖3是顯示P2Y12單元型響應2μM ADP的最大凝集的圖。將每一位志愿者在第一次觀察和第二次觀察時記錄的最大凝集值的平均值用于分析。不具有H2等位基因的對象(H1/H1，n＝74)的中間值為34.7％，而攜帶一個H2等位基因(H1/H2，n＝21)的對象的中間值為67.9％，而攜帶兩個H2等位基因的三個對象(H2/H2)的中間值為82.4％(P＝0.0071)。
圖4是顯示在H2單元型的攜帶者和非攜帶者中ADP對伊洛前列素誘導的cAMP形成的抑制作用的圖。在37℃下孵育1分鐘之后，將伊洛前列素(20μg/μL最終濃度)添加到檸檬酸化的PRP中。1分鐘之后添加鹽水(對照)或1、2或5μM的ADP。3分鐘之后終止反應，并且使用商業(yè)化測定試劑盒測定cAMP濃度。三角形和圓分別表示H2單元型的攜帶者和非攜帶者。平均值±SEM。
實施例實施例1P2Y12基因序列變異的鑒定方法對象招募年齡在18-35歲之間的98位不相關的健康的白色人種男性志愿者，并且在Clinical Investigation Center of Hpital Européen Georges Pompidou進行研究。這些志愿者是不吸煙者，沒有明顯的個人和家族性醫(yī)學病史，并且在采集血液之前至少10天沒有進行過任何藥物治療。在被招募進來之前，進行了身體檢查和常規(guī)實驗室測定，包括白血細胞，紅血細胞和血小板計數(shù)，平均血小板體積，凝血酶原時間(PT)，活化的部分促凝血酶原激酶時間(aPTT)，血漿血纖蛋白原和C-反應性蛋白測定。對在第0天(觀察1)和第7天(觀察2)從所有志愿者體內(nèi)獲得的血液進行凝集測定。從20位志愿者的小組中獲得第三種血液樣品進行血小板cAMP測定，并且比較在檸檬酸化的和水蛭素抗凝的富含血小板的血漿(PRP)中的最大凝集。所有志愿者都提供了他們的書面知情同意，并且這項研究方案得到了地方道德協(xié)會的同意。
樣品制備在過夜禁食之后，使用19號針頭，在上午8點到10點之間將靜脈血液采集到裝有0.105M檸檬酸鈉(1體積/9體積)(BD VacutainerR，Becton Dickinson，Le Pont de Claix，法國)或50μg/mL lepirudine(Refludan，Hoechst，Paris，法國)的試管中，并且不使用止血帶。將前2ml血液扔掉。通過在室溫下以1000rpm的速度離心10分鐘獲得富含血小板的血漿(PRP)。
將通過以4000rpm的速度進一步離心15分鐘獲得的自身的缺少血小板的血漿用于把PRP的血小板數(shù)量調(diào)整到250×109/L。
血小板凝集研究在血液采集之后2小時之內(nèi)進行凝集研究。在37℃下，通過采用光度測定方法在四通道凝集檢測儀(RegulestAmneville，F(xiàn)rance)上測定凝集。在37℃下將PRP的280-μL等份樣品培養(yǎng)3分鐘，然后以1100rpm的速度攪拌2分鐘，然后添加20μL的鹽水或ADP(Sigma-Aldrich，St Quentin Fallavier，F(xiàn)rance)，ADP濃度為1，2或5μM(最終濃度)。記錄血小板凝集反應5分鐘時間。
cAMP測定在20位挑選的對象中測定血小板cAMP含量，這包括將270μL的PRP與10μL穩(wěn)定的前列環(huán)素類似物伊洛前列素溶液一起孵育(20g/L，最終濃度)(Ilom édine，Schering-PLough)1分鐘，邊進行攪拌，然后添加20μL的鹽水或ADP(1，2或5μM)。3分鐘之后，通過添力20μL的12％三氯乙酸終止該反應。然后提取cAMP，并且按照生產(chǎn)商的說明用酶免疫測定(EIA)(Amersham，Pharmacia Biotech，Orsay，F(xiàn)rance)進行測定，而不了解所述對象的P2Y12基因型。
基因分型研究按照生產(chǎn)商的說明，通過使用Qiamp Maxi Kit(Qiagen，Courtaboeuf，F(xiàn)rance)從外周血單個核細胞中分離基因組DNA。
P2Y12受體。本發(fā)明人利用了Hollopeter等，(2001)報導的cDNA序列，該序列可以通過GenBank登錄號AF313449獲得。假設P2Y12基因組構(gòu)與七種其他跨膜結(jié)構(gòu)域受體基因的組構(gòu)相同，其中這些基因大部分包括由一個內(nèi)含子隔開的兩個外顯子，本發(fā)明人用被稱為E和J的兩種寡核苷酸作正義和反義引物進行了初步擴增實驗；它們位于所述報導過的cDNA的5′和3′末端(圖1)。然后用Pre-Sequencing Kit(AmershamPharmacia Biotech)純化所述擴增產(chǎn)物。
純化之后，使用引物E，B和J進行循環(huán)測序反應。隨后用若干種其他引物(G，H，K和L)(圖1)進行的測序，使得我們能夠測定所述擴增產(chǎn)物的核苷酸序列。用ABI Prism 3700(Applera)進行序列分析。
對群體中的40位對象進行篩選，足以鑒定頻率為5％或以上的多態(tài)性，置信區(qū)間(CI)為95％。因此，通過用引物K對外顯子1的58個核苷酸進行測序，用引物E和G對它的3′側(cè)翼區(qū)的947個核苷酸進行測序，用L，C和M對外顯子2的1274個核苷酸進行測序，并且用引物H對它的5′側(cè)翼區(qū)的570個核苷酸進行測序，篩選了第一個系列的48位連續(xù)健康志愿者的P2Y12基因多態(tài)性。
所述引物如圖1所示。然后通過使用靶向所述鑒定的多態(tài)性的引物在另外50位對象中對P2Y12基因進行測序。
在不了解血小板凝集結(jié)果的情況下分析PCR和測序結(jié)果。在模棱兩可的情況下重復基因分型。對所有98位對象進行了成功的基因分型。
血小板RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄通過以4000rpm的速度離心15分鐘，使4ml的PRP(109血小板)沉淀，按照生產(chǎn)商的說明，使用RNeasy試劑盒(Qiagen)提取RNA。用10單位的RNasinTM核糖核苷酸酶抑制劑(Promega，Charbonnières，F(xiàn)rance)，100單位的Superscript II RnaseH-逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen)和1.5mM隨機六核苷酸(Amersham Pharmacia biotech)進行逆轉(zhuǎn)錄。cDNA在-20℃下保存。
統(tǒng)計分析結(jié)果表示為平均值±SEM，偏斜變量(skewed variables)除外，后者被表示為中間值。用和諧檢驗(concordance test)比較在第一次觀察和第二次觀察獲得的每一個對象的值(Lin，1989)。利用x2測定比較觀察到的等位基因和基因型頻率和哈迪-溫伯格平衡預測結(jié)果。采用非參數(shù)Kruskall-Wallis測定測試在基因型組之間的趨勢。在校正其他變量之后測定了基因型和對ADP的最大血小板凝集反應之間的關系，這使用多變量對數(shù)回歸模型，其中，最大凝集＜50％被編碼為0，而最大凝集≥50％被編碼為1?？紤]突變等位基因純合的對象數(shù)量少(＜7)，無論何種多態(tài)性，將這些對象與雜合的對象合并在一起進行回歸分析。
用STATA 7.0軟件包(Stata Corp，College Station，TX)進行統(tǒng)計檢驗，并且將P值＜0.05的差別視為統(tǒng)計學上顯著的。
結(jié)果為了評估ADP-誘導的血小板凝集的可變性，本發(fā)明人測試了從98位健康志愿者中每一個的體內(nèi)獲得的間隔一周的兩份樣品。圖2比較了在兩次觀察中在檸檬酸化的PRP中對2μM ADP的最大凝集反應。鑒定了至少兩種表現(xiàn)型類型。
在47位對象中在兩次觀察時的最大凝集都低于50％(48.0％)。另外，在該小組中的43位對象(91.5％)具有與可逆的第一階段吻合的凝集特征。相反，在29位對象中(29.6％)在兩次觀察中的最大凝集超過50％，這些對象中的28位(96.5％)具有ADP-誘導的凝集的不可逆轉(zhuǎn)的第二階段。由于在兩次觀察之間的最大凝集是穩(wěn)定的(r2＝77％，P＜0.001)，我們將每個對象的平均值(以下稱之為最大凝集)用于隨后的分析。
兩組不同表型的血小板凝集的存在，以及隨時間發(fā)展的ADP反應的穩(wěn)定性，暗示了ADP對血小板凝集之影響的可能的遺傳控制作用。因此，本發(fā)明人在所述研究群體中分析了P2Y12基因，并且發(fā)現(xiàn)它包括由一個長度大約為1700bp的內(nèi)含子隔開的至少兩個外顯子，內(nèi)含子位于ATG密碼子的上游(圖1)。外顯子2編碼完整的342個氨基酸的蛋白。由于6個核苷酸(nt)的重復序列(表1)，不能確定外顯子1的確切的3′末端和外顯子2的5′起始位點。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了確定H1和H2單元型的三個SNPs和單核苷酸插入多態(tài)性(表2)。
H2單元型與對ADP反應的較高的最大凝集相關，在不攜帶H2等位基因的對象(H1/H1，n＝74)中的中值為34.7％，在攜帶一個H2等位基因的對象(H1/H2，n＝21)中為67.9％，而在攜帶兩個H2等位基因的對象(H2/H 2)中為82.4％(圖3，P＝0).0071)。多變量對數(shù)回歸分析表明，該相關性的比數(shù)比(OR)(OR 3.3，95％C11.1-10.4)在對年齡，體重指數(shù)，血小板數(shù)，平均血小板體積，白細胞數(shù)，血纖蛋白原，PT，aPTT和PIA1/PIA2基因型進行校準之后沒有明顯改變。C34T多態(tài)性與響應ADP的最大凝集沒有關系。
為了研究H2單元型和位于外顯子1和2之間的內(nèi)含子的可能的剪接變體的關系，本發(fā)明人對P2Y12cDNA進行了擴增和測序，所述cDNA是通過對來自具有H1/H1(n＝3)，H1/H2(n＝3)和H2/H2(n＝3)基因型的志愿者的血小板mRNA進行逆轉(zhuǎn)錄獲得的。核苷酸測序沒有發(fā)現(xiàn)變異，而無論單元型如何。另外，所述序列特征與H1/H2對象中的兩個等位基因的擴增一致，表明了這兩種mRNA變體都是轉(zhuǎn)錄的(數(shù)據(jù)未顯示)。
為了進一步研究H2單元型和ADP-刺激的血小板凝集之間的關系，本發(fā)明人隨機挑選H2單元型的10個攜帶者和10個非攜帶者。由于ADP-誘導的血小板凝集被認為是依賴于細胞外Ca++濃度的(Packam等，1987)，他們在含有低Ca++濃度(檸檬酸-抗凝PRP)的培養(yǎng)基和在含有生理學Ca++濃度(水蛭素-抗凝PRP)的培養(yǎng)基中測定了對2μM ADP的最大凝集。對于檸檬酸化的血液來說，H2等位基因的攜帶者和非攜帶者分別具有71.5％±5.2％和50.7％±7.2％的最大凝集(P＝0.023)。類似的，在水蛭素-抗凝固血液中，H2等位基因的攜帶者和非攜帶者分別具有53.8％±3.9％和42.8％±3.4％的最大凝集(P＝0.034)。
為了確定H2單元型和腺苷酸環(huán)化酶的P2Y12調(diào)控之間可能的聯(lián)系，本發(fā)明人測定了ADP在來自相同的20位對象的血小板中抑制伊洛前列素刺激的cAMP積累的能力。ADP以濃度依賴性方式在來自非攜帶者的血小板中抑制cAMP形成，在1，2和5μM ADP的濃度下的抑制率分別為13％，31％和37％(圖4)，與之對照的是在H2單元型攜帶者中的抑制率分別為31％，39％和50％(P＝0.028)。
討論本發(fā)明人在P2Y12受體基因中鑒定了三種單核苷酸多態(tài)性(SNP)和核苷酸插入，由此確定了被稱為H1和H2的兩種單元型。H2單元型與對ADP反應的增加的最大血小板凝集相關。這至少部分與通過ADP調(diào)控cAMP抑制作用的機制的差異相關。
業(yè)已證實，在大群體研究中，ADP-誘導的血小板反應表現(xiàn)出在產(chǎn)生＞50％凝集的二相性反應需要的ADP濃度方面具有顯著的可變性(Feng等，1999)。在本研究中，在98位健康志愿者中ADP-誘導的凝集在間隔一周的兩次測定之間是穩(wěn)定的，即在更新大部分血小板之后。以上結(jié)果指示了ADP-誘導的血小板凝集的遺傳學控制。
為了進一步研究H2單元型的攜帶者和非攜帶者對ADP的凝集反應之間的差異，本發(fā)明人檢查了伊洛前列素-刺激的血小板的腺苷酸環(huán)化酶抑制。如圖4所示，發(fā)現(xiàn)了H2單元型和由ADP導致的細胞內(nèi)cAMP濃度降低之間的相關性。
用諸如噻吩并吡啶類藥噻氯匹定和氯吡格雷等特異性P2Y12受體抑制劑獲得的數(shù)據(jù)，證實了P2Y12是負責腺苷酸環(huán)化酶抑制和隨后的細胞內(nèi)cAMP減少的僅有的已知血小板ADP受體(Geiger等，1999)。另外，選擇性的P2Y1受體拮抗劑對ADP-誘導的腺苷酸環(huán)化酶抑制不起作用(Jin等，1998a)。因此，在ADP刺激之后，H2單元型的攜帶者和非攜帶者之間的血小板cAMP濃度的差別，是對在這兩組對象中觀察到的最大ADP-誘導的凝集的差別的似乎合理的解釋，不過，我們不能排除腺苷酸環(huán)化酶獨立型機制的作用(Kauffenstein等，2001)。
業(yè)已用洗滌過的血小板表征了Ca++濃度對ADP-誘導的凝集的影響(Packam等，1987)。在將水蛭素用作抗凝血劑時，血液Ca++濃度為大約1.1mM，并且與檸檬酸化的PRP相比，ADP誘導更少的顆粒內(nèi)容物釋放(Mustard等，1975)。不過，盡管在我們的研究中，水蛭素抗凝PRP中的最大凝集較低，但H2等位基因保持與凝集反應相關。
H2單元型增強針對ADP反應的血小板凝集的分子機制尚有待確立。由于在本研究群體中篩查了P2Y12基因的完整的編碼序列，可以排除影響蛋白結(jié)構(gòu)的氨基酸取代。另外，對兩種單元型進行的cDNA分析，在外顯子1-外顯子2結(jié)合部分發(fā)現(xiàn)了正常序列，排除了剪接片體。因此，血小板上受體數(shù)量的增加最有可能解釋H2單元型和對ADP的血小板反應性之間的關系。業(yè)已披露了其他基因上的能增強轉(zhuǎn)錄效率和蛋白合成數(shù)量的內(nèi)含子和外顯子增強子區(qū)上的多態(tài)性(Scohy等，2000；Watakabe等，1993)。
實施例2H2單元型與下肢外周動脈疾病(PAD)的相關方法從巴黎地區(qū)招募了年齡小于70歲的連續(xù)的白種人男性PAD患者。PAD患者被定義為具有下肢癥狀性動脈粥樣硬化疾病，踝/臂收縮壓比＜0.90，或具有以前有手術或血管內(nèi)血管再生的、有癥狀的下肢動脈粥樣硬化疾病的病史。在先前所述對照組的703位白種人男性中隨機選擇年齡匹配的沒有動脈疾病病史的對照對象，所述對照組是為了研究血管疾病中的遺傳學危險因素而設計的(Arnaud等，2000)。所需對象數(shù)量的計算，是基于實施例1中所述P2Y12H2單元型的等位基因頻率，并且進行測定，以便檢測2或2以上的比數(shù)比。當α＝0.05和β＝0.20時，需要對150個病例和300個對照進行研究。在兩年時間內(nèi)，包括185個病例，和與331個對照匹配。每一個病例與兩個對照匹配，其中的38個病例除外，這些病例各自與一個對照匹配。
病例和對照對象提供了書面知會同意，并且研究方案得到了Paris-Cochin道德協(xié)會的批準。
P2Y12基因的H2等位基因的測定是通過如實施例1所披露的凝集酶鏈反應和序列分析完成的。
結(jié)果和討論表3歸納了病例和對照的特征(表3)。
表3對象特征。數(shù)值是以每一組的平均值±SD或百分比的形式提供的。LDL和HDL，低和高密度脂蛋白；BMI，體重指數(shù)。

兩組的吸煙狀態(tài)，高血壓和糖尿病的發(fā)病率顯著不同。在這兩組中高膽固醇血癥是類似的。
病例更經(jīng)常用降脂藥物處理，并且具有較低的總膽固醇值和LDL膽固醇值。大部分PAD患者患有間歇性跛行，并且在31％的患者中目前存在冠狀動脈或缺血性腦血管疾病。在PAD患者中，30％的對象具有至少一個H2等位基因，而在對照組中的比例為21％(p＝0.03)。在表4中提供了對數(shù)回歸結(jié)果。
表4.在病例和對照中P2Y12H1/H2單元型的基因型頻率，具有PAD的單變量和多變量OR。將H1/H2和H2/H2組合合并在一起，進行OR計算。多變量分析的OR對在“方法”中定義的高血壓，高膽固醇血癥，糖尿病和煙草使用進行校準。

H2等位基因與PAD相關，在單變量分析中，OR＝1.6。在對包括高血壓，高膽固醇血癥，糖尿病和吸煙狀態(tài)在內(nèi)的常見的心血管危險因素進行校正后，所述相關得到加強，OR＝2.2(p＝0.004)。
這是表明功能性P2Y12基因多態(tài)性和動脈粥樣硬化疾病之間相關的第一項研究。P2Y12是在PAD患者體內(nèi)導致血栓形成并發(fā)癥的一系列事件中的重要步驟。
H2單元型和PAD的相關突出了血小板在動脈粥樣硬化形成中的作用。
參考文獻Antonarakis等(1989)，N.Engl.J.Med.320153-163Arnaud等(2000)Arterioscler Thromb Vasc Biol 20(3)892-8Cattaneo等(1992)Blood 802787-2796Cattaneo等(1999)Arterioscler Thromb Vasc Biol 192281-2285Cooper等(1991)Diagnosis of genetic disease usingrecombinant DNA，第三版，Hum.Genet，87519-560Daniel等，(1999)Thromb Haemost 821322-1326Feng等(1999)Arterioscler Thromb Vasc Biol 191142-1147Foster等(2001)J Clin Invest 1071591-1598Geiger等(1999)Arterioscler Thromb Vasc Biol192007-2011Grompe，(1993)Nat.Genet.5(2)111-7Hechler等(1998a)Blood 92152-159Hechler等(1998b)Br J Haematol 103858-866Hollopeter(2001)Nature 409202-207Kuklin等(1997-98)，Genet.Test，1(3)201-6Jin等(1998)J Biol Chem 2732030-2034Jin等(1998)Proc Natl Acad Sci U S A 958070-8074Kauffenstein(2001)FEBS Lett 505281-290Lin等(1989)Biometrics 45255-268Little等(1996)Genet.Anal.6151Mercier等(1990)Acids Research，18(19)5908Mills等(1996)Thromb Haemost 76835-856.
Mustard等(1975)Am J Physiol 2281757-1765Nurden等(1995)J Clin Invest 951612-1622O′Donnell等(2001)Circulation 1033051-3056Ouriel等(2001)Lancet 358(9289)1257-64Packham等(1987)Blood 70647-651Quinn等(1999)Circulation 1001667-1672
Sambrook等(1989)Molecular CloningA Laboratory ManualScohy等(2000)Nucleic Acids Res 283743-3751Storey等(2000)Br J Haematol 110925-934Watakabe等(1993)Genes Dev 7407-418Zhang等(2001)J Biol Chem 2768608-8615
序列表<110>INSERM et al.
<12D>P2Y12受體的H2單元型與增加的血栓形成和外周動脈疾病的危險相關<130>BET 03P0927<160>12<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>947<212>DNA<213>智人<400>1aggtaatgtt atttctacaa gtacttgaca aatatatgta tttacactct gatatgtgtg 60tacatttttt ccaagtttct cttaaaattg taaaccttaa taactatcaa tgcaagcatg 120tatttggaat aaaaattata attaaaatag aagtctaatt agtgatgtca gagacaattg 180ttaattagcc tctttattaa gaaaaattat acaaagcata gaaataaaat ataaatggtc 240ttagttactt tgcctcaagt ataaaatgag atttaaatac agataaaggg agctgaaatt 300ctcaatgtca agaatacttg ttaaatatct tacagactac acaaaatgta tattcactaa 360gtcgaatttc caaaacggtc agggatgaac taagaccaca cagcagtagc aggaaaggtt 420aaaatcagtg atcttgtatt ggaaaacatt aggttttgtt tagcattatt ttaaagcgct 480aaataggtga ggagatgctg aaaattgaag ccatactgtg acaacatgat tcttaatcgt 540tttccttcca taattaagga cagaaaggaa ttccatggac attttgggga atttaagtgc 600tacattcatt tatctaaata tcttttacac gaaagttatt ttttaaaatt tgttatttgt 660actttcaata tatctctgat tattaagaat attttatata gaatcaattt cacttatctc 720tggtgaaata aaaagattac aaacgtcatt tcaaattccc aagatgtaga tgccatatag 780catattcaag tcacttgtta agttttcatt atagctgcct attgtggtaa taacctatat 840tttattttag ctaccattac acactccata aatctggaaa gtatgccctg ttttgaggaa 900tgccaactca tgaccatata tacacaggcc atttctgact cttattt 947<210>2<211>130<212>DNA<213>智人<400>2aggtaaccaa caagaaatgc aagccgtcga caatctcacc tctgcgcctg gtaacaccag 60
tctgtgcacc agagactaca aaatcaccca ggtcctcttc ccactgctct acactgtcct 120gttttttgtt130<210>3<211>20<212>DNA<213>人工引物<400>3tcatgccaga ctagaccgaa 20<210>4<211>24<212>DNA<213>人工引物<400>4atcgatcgct accagaagac cacc 24<210>5<211>20<212>DNA<213>人工引物<400>5ggctgcaata actactactt 20<210>6<211>21<212>DNA<213>人工引物<400>6aattcctttc tgtccttaat t21<210>7<211>21<212>DNA<213>人工引物<400>7taaataggtg aggagatgct g21<210>8<211>21<212>DNA<213>人工引物<400>8tgcatttctt gttggttacc t21<210>9<211>22
<212>DNA<213>人工引物<400>9gtcgtttgtt ttgctgctaa ta 22<210>10<211>20<212>DNA<213>人工引物<400>10cattgagaat ttcagctccc 20<210>11<211>23<212>DNA<213>人工引物<400>11atactaacta ctacaatgaa gat 23<210>12<211>20<212>DNA<213>人工引物<400>12ccttacaccc tgagccaaac 20
權利要求
1.一種用于測定在對象體內(nèi)患血栓形成危險的體外方法，該方法包括鑒定P2Y12受體在內(nèi)含子(SEQ ID No 1)的139，744，和801號位置，和外顯子2(SEQ ID No 2)的52號位置上的多態(tài)性，其中，T在所述內(nèi)含子的139號位置上的存在，C在所述內(nèi)含子的744號位置上的存在，A在所述內(nèi)含子的801號位置上的插入，和T在外顯子2的52號位置上的存在的同時出現(xiàn)，被命名為H2單元型，并且，當存在于至少一個等位基因上時，指示與沒有任何H2等位基因的對照對象相比，出現(xiàn)血栓形成的危險較高。
2.如權利要求1的方法，其中，所述血栓形成是動脈血栓形成。
3.如權利要求2的方法，其中，H2單元型在至少一個等位基因上的存在進一步指示出現(xiàn)外周動脈疾病(PAD)的較高危險。
4.一種用于測定對象對噻吩并吡啶類藥治療的敏感性的體外方法，該方法包括鑒定P2Y12受體在內(nèi)含子(SEQ ID No 1)的139，744，和801號位置，和外顯子2(SEQ ID No 2)的52號位置上的多態(tài)性，其中，T在所述內(nèi)含子的139號位置上的存在，C在所述內(nèi)含子的744號位置上的存在，A在所述內(nèi)含子的801號位置上的插入，和T在外顯子2的52號位置上的存在的同時出現(xiàn)，被命名為H2單元型，并且，當存在于至少一個等位基因上時，指示與沒有任何H2等位基因的對照對象相比，所述對象對噻吩并吡啶類藥治療具有較低的敏感性。
5.如權利要求4的方法，其中，所述噻吩并吡啶類藥治療是使用噻氯匹定或氯吡格雷治療。
6.一種用于鑒定對象體內(nèi)與血栓形成相關或與對噻吩并吡啶類藥治療較低的敏感性相關的P2Y12受體單元型的至少一種多態(tài)性的體外方法，該方法包括分析生物學樣品的基因組DNA，以對P2Y12受體基因的至少一個區(qū)域進行分析，所述區(qū)域位于內(nèi)含子(SEQ ID No 1)的139，744，和801號位置，和外顯子2(SEQ ID No 2)的52號位置周圍；其中，T在所述內(nèi)含子的139號位置上的存在，C在所述內(nèi)含子的744號位置上的存在，A在所述內(nèi)含子的801號位置上的插入，和T在外顯子2的52號位置上的存在的同時出現(xiàn)，被命名為H2單元型，并且，當存在于至少一個等位基因上時，指示與對照對象相比，具有患血栓形成的較高危險或?qū)︵绶圆⑦拎ゎ愃幹委熅哂休^低敏感性。
7.如權利要求6的方法，其中，所述分析是在從所述生物學樣品中提取的基因組DNA上進行的。
8.如權利要求6或7中任意一項的方法，其中，所述分析包括擴增所述基因組DNA的所述區(qū)域的步驟。
9.如權利要求6-8中任意一項的方法，其中，所述P2Y12受體的多態(tài)性是通過測序鑒定的。
10.一種編碼P2Y12受體的分離的核酸，所述核酸包括P2Y12基因序列，該序列中同時出現(xiàn)T在所述內(nèi)含子的139號位置上的存在，C在所述內(nèi)含子的744號位置上的存在，A在所述內(nèi)含子的801號位置上的插入，和T在外顯子2的52號位置上的存在。
11.一種適用于如權利要求1-6中任意一項的方法的試劑盒，該試劑盒包括特異用于擴增包括內(nèi)含子(SEQ ID No 1)的139，744和801號位置和/或外顯子2(SEQ ID No 2)的52號位置中的至少一個的P2Y12基因之全部或部分的核苷酸引物對。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于測定在對象體內(nèi)出現(xiàn)血栓形成的危險的體外方法，并且涉及一種用于測定對象對噻吩并吡啶類藥治療的敏感性的體外方法。這兩種方法都涉及鑒定P2Y
文檔編號C12Q1/68GK1705754SQ200380101367
公開日2005年12月7日 申請日期2003年10月14日 優(yōu)先權日2002年10月15日
發(fā)明者M·艾阿馳, P·高瑟姆, P·方塔納, S·甘德利勒, A·杜邦, J－L·倫尼 申請人:國家健康醫(yī)學研究所, 公共救濟事業(yè)局-巴黎醫(yī)院, 雷內(nèi)笛卡爾巴黎第五大學