專(zhuān)利名稱：Cot102殺蟲(chóng)棉花的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物的基因工程，特別是抗昆蟲(chóng)的轉(zhuǎn)基因棉花植物。本發(fā)明也涉及檢測(cè)來(lái)源于該植物的材料的方法。
背景技術(shù)：
植物害蟲(chóng)是世界上重要農(nóng)作物損失的主要因素。在美國(guó)，由于非哺乳動(dòng)物害蟲(chóng)(包括昆蟲(chóng))侵襲植物，每年損失約80億美元。除了農(nóng)田作物損失外，昆蟲(chóng)害蟲(chóng)對(duì)于蔬菜和水果種植者，對(duì)于觀賞花卉的生產(chǎn)者，和對(duì)于家宅園丁也是負(fù)擔(dān)。
主要通過(guò)化學(xué)殺蟲(chóng)劑的廣泛應(yīng)用控制昆蟲(chóng)害蟲(chóng)，該化學(xué)殺蟲(chóng)劑具有抑制昆蟲(chóng)生長(zhǎng)，妨礙昆蟲(chóng)進(jìn)食或繁殖，或引起死亡的活性。因此可以達(dá)到良好的昆蟲(chóng)害蟲(chóng)控制，但是這些化學(xué)藥品有時(shí)也影響其它有益昆蟲(chóng)。化學(xué)殺蟲(chóng)劑廣泛應(yīng)用引起的另一問(wèn)題是抗藥性昆蟲(chóng)品種的出現(xiàn)。通過(guò)各種抗藥性處理實(shí)踐已經(jīng)部分緩解了這種現(xiàn)象，但是對(duì)可替代的害蟲(chóng)控制劑存在日益增加的需要。生物害蟲(chóng)控制劑，諸如表達(dá)殺蟲(chóng)毒素象δ-內(nèi)毒素的蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)株系也已經(jīng)被施用給作物植物，并且取得了滿意的結(jié)果，提供了化學(xué)殺蟲(chóng)劑的可替代物或補(bǔ)充物。已經(jīng)分離了一些編碼這些δ-內(nèi)毒素的基因，表明在異源宿主中它們的表達(dá)提供了用于經(jīng)濟(jì)上重要的昆蟲(chóng)害蟲(chóng)控制的另一種工具。特別地，轉(zhuǎn)基因植物中殺蟲(chóng)毒素如蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)δ-內(nèi)毒素的表達(dá)提供了免受所選擇昆蟲(chóng)害蟲(chóng)侵害的有效保護(hù)，并且已經(jīng)商品化了表達(dá)這種毒素的轉(zhuǎn)基因植物，使得農(nóng)民能夠減少化學(xué)昆蟲(chóng)控制藥劑的施用。
最近，鑒定了芽孢桿菌屬(Bacillus spp.)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段期間產(chǎn)生的一類(lèi)新的殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)(營(yíng)養(yǎng)殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)(VIPs))。美國(guó)專(zhuān)利5,877,012，6,107,279，和6,137,033描述了從芽孢桿菌屬(Bacillus)物種分離的vip3A毒素基因。VIP3A毒素具有抗廣譜鱗翅目昆蟲(chóng)，包括但不限于草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)，小地老虎(Agrotis ipsilon)，小蔗螟(Diatraea saccharalis)和南美玉米苗斑螟(Elasmopalpuslignosellus)的殺蟲(chóng)活性，并且當(dāng)在轉(zhuǎn)基因植物例如棉花中表達(dá)它時(shí)，給植物提供了免受昆蟲(chóng)進(jìn)食損害的保護(hù)。
棉類(lèi)植物棉屬(Gossypium)是錦葵科(Malvaceae)的成員，包含39個(gè)物種，其中陸地棉(Gossypium hirsutum)是最常栽培的物種。也栽培3種其它物種樹(shù)棉(G.arboreum)，海島棉(G.barbadense)和草棉(G.herbaceum)。種植這些栽培品種主要是為了制成紡織品的種子纖維。棉花適于做為紡織纖維，因?yàn)槌墒斓母衫w維捻在一起，使得可從中紡出結(jié)實(shí)的細(xì)線。其它產(chǎn)品，諸如棉籽油、油餅和棉籽絨是纖維生產(chǎn)的副產(chǎn)品。
每年，世界上由于昆蟲(chóng)害蟲(chóng)對(duì)棉花作物的損害引起了嚴(yán)重的產(chǎn)量損失。有效地控制這些害蟲(chóng)以最小化產(chǎn)量損失具有重要的經(jīng)濟(jì)意義。棉花昆蟲(chóng)害蟲(chóng)的例子包括甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)，棉鈴象(Anthonomusgrandis grandis)，粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)，云紋盲蝽(Neurocolpusnubilus)，棉蚜(Aphis gossypii)，谷實(shí)夜蛾(Heliocoverpa zea)，切根蟲(chóng)(粒膚地虎(Feltia subterranean)，豆雜色夜蛾(Peridroma saucia)，小地老虎(Agrotis ipsilon))，歐洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)，草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)，花薊馬屬(Frankliniella spp.)，大豆夜蛾(Pseudoplusia includens)，蝽象(稻綠蝽(Nezara viridula)，喜綠蝽(Acrosternumhilare)，褐臭蝽(Euschistus servus))，牧草盲蝽(Lygus lineolaris)，煙蚜夜蛾(Heliothis virescens)和粉虱(結(jié)翅粉虱(Trialeurodes abutilonea)，甘薯粉虱(Bemisia tabaci))。
現(xiàn)在，棉花植物的轉(zhuǎn)化和再生是非常完善的方法，典型地基于根瘤農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumfaciens)介導(dǎo)外源DNA轉(zhuǎn)移到棉花植物部分中，并且在組織培養(yǎng)中再生所述植物部分為完全可育的轉(zhuǎn)基因棉花植物。
需要產(chǎn)生抗昆蟲(chóng)的棉花植物，以減少由于昆蟲(chóng)害蟲(chóng)對(duì)棉花作物的損害造成的產(chǎn)量損失?？估ハx(chóng)棉花植物可以減少施用化學(xué)殺蟲(chóng)劑的需要，化學(xué)殺蟲(chóng)劑可能對(duì)其它有益昆蟲(chóng)和環(huán)境是有害的。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明涉及命名為COT102的抗昆蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因棉花事件。本發(fā)明也涉及檢測(cè)來(lái)源該事件的植物材料的方法。在本申請(qǐng)上下文中“COT102事件”指這里所述的原始?xì)⑾x(chóng)轉(zhuǎn)基因棉花植物。這里所用的“殺蟲(chóng)”指對(duì)昆蟲(chóng)的任何抑制作用，包括但不限于進(jìn)食減少、生長(zhǎng)阻滯、生殖力減弱，麻痹或死亡?！吧沉Α卑ㄅc繁殖有關(guān)的所有方面，諸如繁殖能力、繁殖頻率和后代數(shù)量。本發(fā)明也包括來(lái)源于該COT102事件的任何植物材料，包括種子。
COT102事件顯示了包含2個(gè)表達(dá)盒的新基因型。第一個(gè)盒子包含用于在植物中表達(dá)的適合啟動(dòng)子和適合的聚腺苷酸化信號(hào)，該啟動(dòng)子可操作地連接編碼VIP3A殺蟲(chóng)毒素的基因，該VIP3A殺蟲(chóng)毒素可用于控制廣譜鱗翅目昆蟲(chóng)害蟲(chóng)。尤其可以從植物分離適合的啟動(dòng)子。已經(jīng)分離和表征了大量植物啟動(dòng)子，包括組成型、開(kāi)關(guān)型和/或組織特異性啟動(dòng)子。適合的啟動(dòng)子可以選自下列非限制性的群組CaMV35S，F(xiàn)MV35S，遍在蛋白，Act2，NOS，OCS，夜香樹(shù)屬(Cestrum)黃葉卷曲病毒啟動(dòng)子，Patatin，E9，alcA/alcR開(kāi)關(guān)，GST開(kāi)關(guān)，RMS開(kāi)關(guān)，油質(zhì)蛋白，Gelvin，核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶小亞基，肌動(dòng)蛋白7，MR7啟動(dòng)子(玉米)，Gos9(水稻)，GOS2啟動(dòng)子，MasOcs(或超啟動(dòng)子(super promoter))，RolD啟動(dòng)子(毛根農(nóng)桿菌(Agrobacterium rhizogenes))，SuperMAS啟動(dòng)子和Suc2啟動(dòng)子(擬南芥屬(Arabidopsis))。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，啟動(dòng)子是來(lái)源于擬南芥屬(Arabidopsis)的肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子Act2。另外的元件諸如增強(qiáng)子序列也可以摻入表達(dá)盒中以加強(qiáng)基因表達(dá)水平，例如轉(zhuǎn)錄或翻譯增強(qiáng)子，諸如煙草蝕刻病毒(TEV)翻譯激活子(translationactivator)，CaMV35S增強(qiáng)子和FMV35S增強(qiáng)子。做為可替代方案，可能期望包含導(dǎo)向序列，例如以引導(dǎo)VIP3A毒素轉(zhuǎn)運(yùn)到特定細(xì)胞區(qū)室。例如，如果期望提供細(xì)胞外蛋白質(zhì)，那么可以連接細(xì)胞外導(dǎo)向序列和編碼VIP蛋白質(zhì)的多核苷酸。其它靶向的例子包括靶向特定的細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器或區(qū)室，例如利用‘KDEL’保留序列，靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。已經(jīng)分離和表征了大量聚腺苷酸化信號(hào)。植物中起作用的適合聚腺苷酸化信號(hào)的例子包括來(lái)源于根瘤農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)胭脂氨酸合酶基因(nos)，來(lái)源于蛋白酶抑制劑基因II和來(lái)源于α-微管蛋白基因的聚腺苷酸化信號(hào)(EP-A 652,286)。在本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方式中，聚腺苷酸化信號(hào)是來(lái)源于根瘤農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)nos基因的聚腺苷酸化信號(hào)。
根據(jù)本發(fā)明，也可以密碼子優(yōu)化或者以其它方式改變編碼VIP3A蛋白質(zhì)的多核苷酸，這樣一旦該多核苷酸被摻入到植物材料中，例如就可以增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄。這種密碼子優(yōu)化也可以用于改變?nèi)魏无D(zhuǎn)化細(xì)胞中產(chǎn)生的RNA轉(zhuǎn)錄物的預(yù)測(cè)二級(jí)結(jié)構(gòu)，或者用于破壞未改變的轉(zhuǎn)錄物中存在的隱蔽RNA不穩(wěn)定性元件，因此增加轉(zhuǎn)化細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄物的穩(wěn)定性和可利用性(Abler和Green(1996)Plant Molecular Biology(32)，63-78頁(yè))。
第二個(gè)盒子包含當(dāng)表達(dá)時(shí)可以用做選擇性標(biāo)記的基因。已經(jīng)表征了大量選擇性標(biāo)記，包括賦予對(duì)抗生素耐受性的一些選擇性標(biāo)記和賦予對(duì)除草劑耐受性的其它選擇性標(biāo)記。適合的選擇性標(biāo)記基因的例子包括賦予對(duì)潮霉素、卡那霉素或慶大霉素耐受性的選擇性標(biāo)記基因。其它適合的選擇性標(biāo)記包括賦予對(duì)除草劑諸如基于草甘膦的除草劑的耐受性或?qū)Χ舅刂T如eutypine的抗性的基因。也可以利用其它形式篩選諸如基于激素的篩選系統(tǒng)諸如Hiroyrasu Ebinuma等(1997)PNAS，94卷，2117-2121頁(yè)的多自動(dòng)轉(zhuǎn)化(MAT)系統(tǒng)；使用已知綠色熒光蛋白、β-葡糖醛酸酶的可觀察的篩選系統(tǒng)和任何其它篩選系統(tǒng)諸如甘露糖異構(gòu)酶(PositechTM)，木糖異構(gòu)酶和2-脫氧葡萄糖(2-DOG)。在本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方式中，選擇性標(biāo)記基因是賦予對(duì)潮霉素耐受性的選擇性標(biāo)記基因。其它表達(dá)盒可選地包含在COT102事件中。例如，這些表達(dá)盒可以提供其它的期望益處諸如除草劑抗性。
第一和第二個(gè)表達(dá)盒可以在相同或不同質(zhì)粒上被引入植物中。如果第一和第二表達(dá)盒存在相同質(zhì)粒上，并且通過(guò)農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法被引入到植物中，則它們可以存在于相同或不同T-DNA區(qū)中。在本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方式中，第一和第二個(gè)表達(dá)盒存在于相同T-DNA區(qū)上。
根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了多核苷酸，其包含來(lái)自于SEQ ID NO1的26個(gè)核苷酸序列的至少17個(gè)鄰接核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述多核苷酸包含來(lái)自于SEQ ID NO1的至少18個(gè)鄰接核苷酸。在進(jìn)一步實(shí)施方式中，所述多核苷酸包含來(lái)自于SEQ ID NO1的至少20個(gè)鄰接核苷酸。在另一實(shí)施方式中，所述多核苷酸包含來(lái)自于SEQ ID NO1的至少22個(gè)鄰接核苷酸。在進(jìn)一步實(shí)施方式中，所述多核苷酸包含來(lái)自于SEQ IDNO1的至少24個(gè)鄰接核苷酸。在進(jìn)一步實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了包含SEQ ID NO1序列的多核苷酸。
在本發(fā)明另一個(gè)方面，提供了多核苷酸，其包含來(lái)自于SEQ ID NO2的26個(gè)核苷酸序列的至少17個(gè)鄰接核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述多核苷酸包含來(lái)自于SEQ ID NO2的至少18個(gè)鄰接核苷酸。在進(jìn)一步實(shí)施方式中，所述多核苷酸包含來(lái)自于SEQ ID NO2的至少20個(gè)鄰接核苷酸。在進(jìn)一步實(shí)施方式中，所述多核苷酸包含來(lái)自于SEQ ID NO2的至少22個(gè)鄰接核苷酸。然而，在進(jìn)一步實(shí)施方式中，所述多核苷酸包含來(lái)自于SEQ ID NO2的至少24個(gè)鄰接核苷酸。在再進(jìn)一步實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了包含SEQ ID NO2序列的多核苷酸。
在本發(fā)明另一方面，提供了包含SEQ ID NO7序列的上述多核苷酸。在本發(fā)明另一方面，提供了包含SEQ ID NO21序列的上述多核苷酸。
在本發(fā)明另一方面，提供了一種包含多核苷酸的植物，該多核苷酸包含SEQ ID NO1和/或SEQ ID NO2的至少17個(gè)鄰接核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述植物包含SEQ ID NO1和/或SEQ ID NO2的至少18個(gè)鄰接核苷酸。在進(jìn)一步實(shí)施方式中，所述植物包含SEQ ID NO1和/或SEQ IDNO2的至少20個(gè)鄰接核苷酸。在進(jìn)一步實(shí)施方式中，所述植物包含SEQ IDNO1和/或SEQ ID NO2的至少22個(gè)鄰接核苷酸。在進(jìn)一步實(shí)施方式中，所述植物包含SEQ ID NO1和/或SEQ ID NO2的至少24個(gè)鄰接核苷酸。然而，在進(jìn)一步實(shí)施方式中，所述植物包含SEQ ID NO1和/或SEQ ID NO2的序列。還是在進(jìn)一步實(shí)施方式中，所述植物還包含SEQ ID NO7序列。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述植物包含SEQ ID NO21序列。在本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方式中，所述植物是棉花植物。在進(jìn)一步實(shí)施方式中，所述植物是作為COT102事件的殺蟲(chóng)棉花植物，或者來(lái)源于它的植物。
本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉植物轉(zhuǎn)化方法。特別地，已經(jīng)在廣泛植物物種中表征了兩種主要的技術(shù)通過(guò)農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)的轉(zhuǎn)化和通過(guò)直接DNA轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)化。
農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化是用于雙子葉植物轉(zhuǎn)化的常用方法。將要引入到植物中的外源DNA克隆到雙元載體的左和右邊界共有序列之間。這是T-DNA區(qū)。雙元載體被轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)細(xì)胞中，隨后，該農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)細(xì)胞用于感染植物組織。包含外源DNA的載體T-DNA區(qū)被插入到植物基因組中。標(biāo)記基因盒和性狀基因盒可以存在于相同載體中的相同T-DNA區(qū)上，不同T-DNA區(qū)上，或者甚至是不同載體中的不同T-DNA區(qū)上。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，這些盒子存在于相同T-DNA區(qū)上。
做為可替代方案，直接DNA轉(zhuǎn)移可以用于將DNA直接引入到植物細(xì)胞中。直接轉(zhuǎn)移的一個(gè)適合方法可以是利用基因槍?zhuān)冒迦胗肈NA的載體轟擊植物細(xì)胞(粒子介導(dǎo)的生物彈擊轉(zhuǎn)化)；另一種確立的方法是‘whiskers’，其包括將DNA包被到刺穿細(xì)胞的碳化硅纖維上。轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的其它方法包括原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(可選地在聚乙二醇存在的情況下)；在包含多核苷酸或載體的介質(zhì)中超聲處理植物組織、細(xì)胞或原生質(zhì)體；多核苷酸或載體顯微插入到植物材料中(可選地利用已知的碳化硅‘whiskers’技術(shù))，電穿孔等等。
轉(zhuǎn)化后，必須從轉(zhuǎn)化的植物組織再生轉(zhuǎn)基因植物，并且利用適合的標(biāo)記諸如潮霉素抗性標(biāo)記選擇具有外源DNA的后代。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉適當(dāng)再生介質(zhì)的組成。
如這里所述，本發(fā)明這方面的植物對(duì)來(lái)自于實(shí)夜蛾屬(Heliothissp.)，Helicoverpa sp.和貪夜蛾屬(Spodoptera sp.)的一個(gè)或多個(gè)物種的、可能侵襲該植物的昆蟲(chóng)具有殺蟲(chóng)作用。這里所用的“侵襲”指一種或多種昆蟲(chóng)以任何方式的攻擊、進(jìn)食或損害。因此，例如，本發(fā)明植物將提供抗害蟲(chóng)昆蟲(chóng)諸如谷實(shí)夜蛾(Helicoverpa zea)侵襲的自衛(wèi)機(jī)制。結(jié)果，與相同品種非轉(zhuǎn)基因棉花植物比較，在所述植物栽培期間需要減少數(shù)量的殺蟲(chóng)噴霧劑。并且昆蟲(chóng)害蟲(chóng)造成的產(chǎn)量損失保持在最小水平。
本發(fā)明不限于COT102事件本身，而是進(jìn)一步延及包括來(lái)源于其的任何植物材料，包括種子，只要它們含有至少一種本發(fā)明多核苷酸。本發(fā)明包括但不限于來(lái)源于與COT102事件育種雜交的植物，或者通過(guò)常規(guī)育種或其它方法由此來(lái)源的衍生物。本發(fā)明也包括來(lái)源于COT102事件的植物材料，該植物材料與COT102事件比較，可以包含另外的、修飾的或較少的多核苷酸序列，或者顯示其它的表型特征。例如，可能期望轉(zhuǎn)化來(lái)源于COT102事件的植物材料以產(chǎn)生具有另外性狀諸如第二昆蟲(chóng)抗性基因的新事件。這個(gè)方法稱為基因堆積(gene stacking)。第二個(gè)昆蟲(chóng)抗性基因可以編碼例如來(lái)源于蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)，嗜線蟲(chóng)致病桿菌(Xenorhabdus nematophilus)，發(fā)光光桿狀菌(Photorabdusluminescens)物種的殺蟲(chóng)凝集素，殺蟲(chóng)蛋白酶抑制劑和殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)。
優(yōu)選地，第二個(gè)昆蟲(chóng)抗性基因編碼來(lái)源于細(xì)菌蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)的Cry基因，該Cry基因產(chǎn)生具有和VIP不同的作用方式或昆蟲(chóng)腸道中的結(jié)合位點(diǎn)的毒素用以控制不同的昆蟲(chóng)物種。本發(fā)明進(jìn)一步提供了來(lái)源于COT102事件的植物材料，該植物材料具有另外的性狀諸如除草劑抗性、線蟲(chóng)抗性或真菌抗性。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述另外性狀是除草劑抗性。在進(jìn)一步實(shí)施方式中，所述除草劑抗性性狀提供了對(duì)包含草甘膦酸或農(nóng)業(yè)學(xué)上可接受的其鹽的除草劑的抗性。還是在進(jìn)一步實(shí)施方式中，由編碼EPSP合酶或其突變體的基因提供所述的除草劑抗性性狀。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了控制昆蟲(chóng)的方法，該方法包括在所述昆蟲(chóng)取食地點(diǎn)，提供來(lái)源于COT102事件的植物材料。本發(fā)明進(jìn)一步提供了控制昆蟲(chóng)的方法，該方法包括在所述昆蟲(chóng)取食地點(diǎn)，提供來(lái)源于COT102事件的植物材料，并且給所述植物材料施用其它農(nóng)用化學(xué)品諸如除草劑、殺真菌劑和包括其它殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)的其它殺蟲(chóng)化合物?？赡艿臍⑾x(chóng)化合物的例子包括殺蟲(chóng)凝集素、殺蟲(chóng)蛋白酶抑制劑和來(lái)源于蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)，嗜線蟲(chóng)致病桿菌(Xenorhabdus nematophilus)或發(fā)光光桿狀菌(Photorabdus luminescens)物種的殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)?？赡艿幕瘜W(xué)藥品的例子包括合成除蟲(chóng)菊酯類(lèi)、氨基甲酸酯類(lèi)、吡蟲(chóng)啉、有機(jī)氯制劑和大分子諸如多殺菌素，阿維菌素或依馬菌素。
然而，根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了檢測(cè)來(lái)源于COT12轉(zhuǎn)基因事件的植物材料的方法，該方法包括獲得用于分析的樣品；從樣品提取DNA；提供設(shè)計(jì)用于結(jié)合多核苷酸的引物對(duì)，該多核苷酸包含SEQ ID NO1和/或SEQ ID NO2的至少17個(gè)鄰接核苷酸；擴(kuò)增位于引物結(jié)合位點(diǎn)之間的區(qū)域；并且檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的存在。因?yàn)榭梢缘玫絊EQ ID NOs1和2，所以可以利用分子生物學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的參數(shù)，設(shè)計(jì)該檢測(cè)方法中使用的適合引物對(duì)。例如，可以將引物對(duì)的1個(gè)或2個(gè)引物設(shè)計(jì)成載體特異性，性狀基因特異性，啟動(dòng)子特異性的，或者對(duì)插入DNA和基因組DNA之間連接處序列特異和/或標(biāo)記特異性的。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述引物序列如SEQ ID NO3和SEQ ID NO4所描述。
在本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方式中，用所述方法擴(kuò)增的區(qū)域(“擴(kuò)增子”)長(zhǎng)度是在300和1000堿基對(duì)之間。在進(jìn)一步實(shí)施方式中，擴(kuò)增子長(zhǎng)度是在500和900堿基對(duì)之間。還是在進(jìn)一步實(shí)施方式中，擴(kuò)增子長(zhǎng)度是800堿基對(duì)。在進(jìn)一步實(shí)施方式中，利用上述方法，聯(lián)合序列SEQ ID NO3和SEQ ID NO4引物產(chǎn)生了擴(kuò)增子，并且其長(zhǎng)度是800堿基對(duì)。
可以聯(lián)合使用以檢測(cè)COT102事件的可替代引物包括對(duì)COT102事件特異并且產(chǎn)生962bp擴(kuò)增子的SEQ ID NOs 18和19，對(duì)VIP基因特異并且產(chǎn)生556bp擴(kuò)增子的SEQ ID NOs 22和23，或者對(duì)賦予對(duì)抗生素潮霉素抗性的基因特異并且產(chǎn)生367bp擴(kuò)增子的SEQ ID NOs 24和25。
根據(jù)本發(fā)明的這方面，有許多可以使用的擴(kuò)增方法?；镜脑?，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)，是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。典型地在利用瓊脂糖凝膠電泳大小分離后，通過(guò)用溴化乙錠染色和用UV光激發(fā)可以觀察來(lái)自于該P(yáng)CR反應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式利用了PCR原理的變型諸如TaqManTM。這種方法包括用熒光染料標(biāo)記參與擴(kuò)增過(guò)程的至少一個(gè)引物。當(dāng)未結(jié)合時(shí)，引物采取檢測(cè)不到熒光的構(gòu)象。然而，當(dāng)引物結(jié)合一段DNA時(shí)，構(gòu)象改變，并且可以檢測(cè)到熒光。用這種方式，可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)擴(kuò)增過(guò)程，熒光的強(qiáng)度直接對(duì)應(yīng)于擴(kuò)增的水平。本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方式包括，但不限于RACE PCR。
本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方式包括利用多重PCR(multiplex PCR)區(qū)分純合COT102植物材料和雜合COT102植物材料。本領(lǐng)域技術(shù)人員稱之為接合性測(cè)試(zygosity testing)，并且其包括結(jié)合棉花基因組和/或插入DNA的特定部分的3種PCR引物的使用。用在這種接合性測(cè)試中的適合引物被描述為SEQ ID NOs 18到20。
本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了檢測(cè)來(lái)源于COT102事件的植物材料的方法，該方法包括獲得用于分析的樣品；提供探針，該探針被設(shè)計(jì)成當(dāng)多核苷酸是單鏈時(shí)結(jié)合所述多核苷酸的互補(bǔ)序列，該多核苷酸包含SEQ IDNO1和/或SEQ ID NO2的至少17個(gè)鄰接核苷酸；雜交所述探針和樣品；并且檢測(cè)該探針是否已經(jīng)雜交。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述探針包括SEQ IDNO1和/或SEQ ID NO2序列。在本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方式中提供了利用選自SEQ ID NO5，SEQ ID NO6和SEQ ID NO7的探針，檢測(cè)來(lái)源于COT102事件的植物材料的方法。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述探針包含SEQ ID NO5。在進(jìn)一步實(shí)施方式中，所述探針由SEQ ID NO5組成。例如，探針可以是PCR產(chǎn)物或限制消化片段。在進(jìn)一步實(shí)施方式中，可以用熒光、放射性、酶性或其它適合的標(biāo)記標(biāo)記這里所述的探針，以能夠檢測(cè)到雜交。由于本領(lǐng)域技術(shù)人員已經(jīng)從本公開(kāi)受益，所以他們將知道如何設(shè)計(jì)適合的引物。
在本發(fā)明進(jìn)一步實(shí)施方式中，提供了在嚴(yán)格條件下雜交探針和樣品，并且檢測(cè)探針是否已經(jīng)雜交的方法。嚴(yán)格雜交條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，并且包括，例如在約65℃，在含有6x SSC，0.01％SDS和0.25％脫脂奶粉的溶液中雜交，接著在相同的溫度，在含有0.2x SSC和0.1％SDS的溶液中洗滌。
基于雜交原理，用于檢測(cè)來(lái)源于COT102事件的植物材料的適合技術(shù)包括但不限于Southern印跡，Northern印跡和原位雜交。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉這些技術(shù)。
典型地，這些技術(shù)包括溫育探針和樣品，洗滌以移除未結(jié)合的探針和檢測(cè)探針是否已經(jīng)雜交。所述的檢測(cè)方法取決于探針?biāo)綐?biāo)記的類(lèi)型，例如，通過(guò)X光片曝光和顯影可以檢測(cè)放射性標(biāo)記的探針。做為可替代的方案，通過(guò)底物轉(zhuǎn)化實(shí)現(xiàn)顏色變化可以檢測(cè)酶標(biāo)記的探針。
在本發(fā)明的進(jìn)一步方面，提供了檢測(cè)來(lái)源于COT102事件的植物材料的方法，該方法包括獲得用于分析的樣品；提供設(shè)計(jì)的抗體，該抗體可結(jié)合植物中所包含的VIP蛋白質(zhì)，該植物包含來(lái)源于SEQ ID NO1和/或SEQID NO2的至少17個(gè)鄰接核苷酸；溫育所述的抗體和樣品；檢測(cè)是否該抗體已經(jīng)結(jié)合。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述VIP蛋白質(zhì)包含SEQ IDNO8序列。
基于所述抗體結(jié)合，檢測(cè)來(lái)源于COT102事件的植物材料的適合方法包括，但不限于Western印跡，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)和SELDI質(zhì)譜分析。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉這些免疫學(xué)技術(shù)。典型的步驟包括溫育樣品和結(jié)合VIP蛋白質(zhì)的抗體，沖洗以移除未結(jié)合的抗體，和檢測(cè)是否抗體已經(jīng)結(jié)合。許多這種檢測(cè)方法是基于酶促反應(yīng)的，例如可以用酶諸如辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗體，并且在應(yīng)用適合的底物后，檢測(cè)顏色改變。適合的抗體可以是單克隆或多克隆抗體。
在本發(fā)明的另一方面，提供了檢測(cè)來(lái)源于COT102事件的植物材料的方法，該方法包括獲得用于分析的樣品；制備樣品的蛋白質(zhì)提取物；提供設(shè)計(jì)用來(lái)檢測(cè)樣品中VIP蛋白質(zhì)的存在的檢測(cè)條；溫育檢測(cè)條和樣品；和檢測(cè)VIP蛋白質(zhì)是否存在。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述VIP蛋白質(zhì)包含SEQ ID NO8序列。
用于COT102的可替代的基于抗體的檢測(cè)方法利用測(cè)量棒(dipsticks)或檢測(cè)條。典型的步驟包括溫育檢測(cè)條和樣品，并且觀察檢測(cè)條上存在或不存在有色條帶。有色條帶表明樣品中蛋白質(zhì)的存在。這種測(cè)量棒(dipsticks)或檢測(cè)條檢測(cè)是蛋白質(zhì)特異性的，并且可以用于田地中樣品的快速檢測(cè)。
在本發(fā)明的進(jìn)一步方面，提供了檢測(cè)來(lái)源于COT102事件的植物材料的方法，該方法包括獲得用于分析的樣品；使物種草地貪夜蛾(Spodopterafrugiperda)(對(duì)VIP3A敏感)的一個(gè)或多個(gè)昆蟲(chóng)暴露于樣品；使物種歐洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)的一個(gè)或多個(gè)昆蟲(chóng)暴露于樣品，做為對(duì)照；檢測(cè)是否樣品對(duì)來(lái)源于每個(gè)物種的昆蟲(chóng)具有殺蟲(chóng)作用；并且比較該結(jié)果和真實(shí)的COT102生物測(cè)定模式(bioassay profile)。利用相同條件的昆蟲(chóng)產(chǎn)生真實(shí)COT102生物測(cè)定模式，其中，將該昆蟲(chóng)暴露于相同劑量和類(lèi)型COT102植物材料，并且在將昆蟲(chóng)暴露于COT102樣品后相同長(zhǎng)度的時(shí)間檢測(cè)殺蟲(chóng)作用。草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)是COT102陽(yáng)性對(duì)照，因?yàn)樗鼘?duì)適合劑量的VIP3A敏感，而歐洲玉米螟(Ostrinianubilalis)是陰性對(duì)照，因?yàn)樗鼘?duì)適合劑量的VIP3A不敏感。
在本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方式中，檢測(cè)來(lái)源于COT102事件的植物材料的方法包括但不限于葉片飼喂的生物測(cè)定法，其中用一種或多種害蟲(chóng)昆蟲(chóng)侵襲COT102事件或者來(lái)源于COT102事件的任何植物材料的葉片或其它適合的植物部分。通過(guò)在給定時(shí)間期間后估測(cè)葉片或植物部分的損害，估測(cè)死亡率或?qū)ハx(chóng)的另一種殺蟲(chóng)作用可以進(jìn)行檢測(cè)。可以用于這種生物測(cè)定的可替代植物部分包括棉鈴和棉蕾。可以在田地或溫室中進(jìn)行這種生物測(cè)定，并且可以經(jīng)歷天然或人工昆蟲(chóng)侵襲。
在本發(fā)明另一方面，本發(fā)明提供了試劑盒(kit of parts)，其包含用于檢測(cè)樣品中來(lái)源于COT102事件的植物材料存在的手段(means)。優(yōu)選地，所述試劑盒包含用于檢測(cè)樣品中多核苷酸或上述多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)或VIP蛋白質(zhì)存在的手段，該多核苷酸包含來(lái)源于SEQ ID NO1和/或SEQ ID NO2的至少17個(gè)鄰接核苷酸。在本發(fā)明的實(shí)施方式中，所述試劑盒可以包含DNA擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)諸如PCR或TaqManTM。在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方式中，所述試劑盒可以包含探針雜交檢測(cè)技術(shù)諸如Southern印跡，Northern印跡或原位雜交。在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方式中，所述試劑盒可以包含抗體結(jié)合檢測(cè)技術(shù)諸如Western印跡，ELISAs，SELDI質(zhì)譜分析或檢測(cè)條。在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方式中，所述試劑盒可以包含昆蟲(chóng)生物測(cè)定檢測(cè)技術(shù)諸如葉片飼喂生物測(cè)定或死亡率生物測(cè)定。在本發(fā)明進(jìn)一步實(shí)施方式中，所述試劑盒可以包含上述檢測(cè)技術(shù)的任意組合。還是在進(jìn)一步實(shí)施方式中，所述試劑盒可以以說(shuō)明書(shū)形式包含上述一種或多種方法。
實(shí)施例通過(guò)下面非限制性實(shí)施例結(jié)合下面有關(guān)序列表，本發(fā)明將更清楚明了。
SEQ ID NO 1延伸越過(guò)下述連接處的多核苷酸序列，在事件COT102中，COT102插入片段5’末端在該連接處插入到棉花基因組中。
SEQ ID NO 2延伸越過(guò)下述連接處的多核苷酸序列，在COT102事件中，COT102插入片段3’末端在該連接處插入到棉花基因組中。
SEQ ID NO 3-4適于用做COT102事件檢測(cè)引物的多核苷酸序列。
SEQ ID NO 5-7適于用做COT102事件檢測(cè)探針的多核苷酸序列。
SEQ ID NO 8VIP3A毒素蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
SEQ ID NOs 9-17適于用做COT102事件檢測(cè)中的TaqMan引物的多核苷酸序列。
SEQ ID NOs 18-20適于用做通過(guò)接合性測(cè)試檢測(cè)COT102事件的引物的多核苷酸序列。
SEQ ID NO 21表征COT102事件的多核苷酸序列。
SEQ ID NOs 22-25適于用做COT102事件檢測(cè)引物的多核苷酸序列。
實(shí)施例1克隆和轉(zhuǎn)化1.1載體克隆使用從自制載體限制消化和片段連接的標(biāo)準(zhǔn)基因克隆技術(shù)構(gòu)建轉(zhuǎn)化載體pNOV3001。該載體包含選擇性標(biāo)記盒，該標(biāo)記盒包含泛素(UBQ3)啟動(dòng)子、UBQ3內(nèi)含子、編碼賦予潮霉素抗性的蛋白質(zhì)的基因序列和nos聚腺苷酸化序列。該載體也包含靶基因表達(dá)盒，該表達(dá)盒包含肌動(dòng)蛋白(Act2)啟動(dòng)子、Act2內(nèi)含子、密碼子已經(jīng)被優(yōu)化用于玉米中表達(dá)的編碼VIP3A基因的序列和nos聚腺苷酸化序列。選擇性標(biāo)記盒和包含VIP3A的盒子被克隆到載體pNOV3001的T-DNA區(qū)中，位于左和右邊界序列之間。為了進(jìn)行原核生物篩選，該載體也包含賦予對(duì)抗生素，壯觀霉素抗性的基因。
利用標(biāo)準(zhǔn)農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)轉(zhuǎn)化技術(shù)，將該載體轉(zhuǎn)化到根瘤農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)株系EHA101中，并且通過(guò)轉(zhuǎn)化細(xì)胞對(duì)壯觀霉素的抗性篩選它們。
1.2植物轉(zhuǎn)化通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的陸地棉栽培品種Coker312(Gossypium hirsutum L.cv Coker 312)轉(zhuǎn)化產(chǎn)生COT102事件。
利用足以覆蓋要消毒種子量的乙醇，在70％乙醇中對(duì)Coker 312種子進(jìn)行表面消毒30秒。用乙醇洗種子，在無(wú)菌水中漂洗，并且浸泡在12％Clorox+吐溫20溶液中20分鐘。進(jìn)行3次這種洗滌程序。然后，將種子放置在發(fā)芽培養(yǎng)基上(Stewart和Hsu，1977)，并且允許在30℃萌發(fā)7-10天。
在適合的抗生素中過(guò)夜培養(yǎng)2ml含有pNOV3001構(gòu)建體的農(nóng)桿菌培養(yǎng)物，然后在無(wú)菌培養(yǎng)皿中用MSNH培養(yǎng)基(19∶1)稀釋。將下胚軸切割成6-8mm長(zhǎng)，并且放置在稀釋的農(nóng)桿菌溶液中至少30秒。從農(nóng)桿菌溶液中移走下胚軸外植體，在無(wú)菌濾紙上吸干以除去過(guò)量的細(xì)菌。將下胚軸放置在T2培養(yǎng)基(MS鹽，B5維生素，0.1mg/L 2，4-D，0.5mg/L細(xì)胞分裂素，30g/L葡萄糖，2g/L Phytagel-pH5.8)上，并且在黑暗中與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)72小時(shí)。
再一次在無(wú)菌濾紙上吸干下胚軸外植體，并且轉(zhuǎn)移到含有MS2NK培養(yǎng)基(MS鹽，B5維生素，2mg/L NAA，0.1mg/L細(xì)胞分裂素，30g/L葡萄糖，2g/L Phytogel，500mg/L頭孢噻肟，10mg/L潮霉素-pH 5.8)的平板上。用parafilm包裹該平板，并且在30℃，在光照下溫育幾個(gè)月直到形成愈傷組織。
將愈傷組織分割得盡可能地小，并且放置在含有10ml液體MSNH培養(yǎng)基(MS鹽，B5維生素，30g/L葡萄糖-pH 5.8)的50ml錐形瓶中。在30℃，在光照下，以110rpm振蕩懸浮的愈傷組織直到可以觀察到小白色稍微圓形的細(xì)胞簇為止。洗細(xì)胞，并且鋪在固體MSNH培養(yǎng)基(MS鹽，B5維生素，30g/L葡萄糖，2g/L Phytogel-pH 5.8)平板上。每月檢查平板的體細(xì)胞胚發(fā)育。
從平板挑取成熟的體細(xì)胞胚，并且放置在含有SA培養(yǎng)基(Stewart和Hsu鹽，20g/L蔗糖，20g/L瓊脂-pH 5.8)的平板上。將胚平板放置在黑暗中大約14天。修剪成熟胚的根，并且將胚轉(zhuǎn)移到SGA培養(yǎng)基(Stewart和Hsu鹽，5g/L蔗糖，1.5g/L Phytagel，5g/L瓊脂-pH 6.8)。
第一片真葉出現(xiàn)后，將年幼的植物移到含有SGA培養(yǎng)基的小型罐頭瓶中。當(dāng)植物達(dá)到7-10cm高度時(shí)，切下頂部，并且轉(zhuǎn)移到另一個(gè)罐頭瓶中。當(dāng)發(fā)育出良好的根系時(shí)，將這樣生根的插條移植到盆中，并且在溫室中培養(yǎng)。
1.3轉(zhuǎn)基因?qū)W的鑒定和篩選用PCR篩選推定的轉(zhuǎn)基因植物的VIP3A基因的存在。利用抗草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)的殺昆蟲(chóng)活性通過(guò)昆蟲(chóng)生物測(cè)定法鑒定和篩選陽(yáng)性事件(參見(jiàn)實(shí)施例7)。通過(guò)TaqManTM分析表征殺昆蟲(chóng)品系的拷貝數(shù)(參見(jiàn)實(shí)施例2)。在田間試驗(yàn)中觀察來(lái)源于3個(gè)單拷貝&2個(gè)雙拷貝事件的T1種子的昆蟲(chóng)抗性和農(nóng)藝學(xué)性狀。根據(jù)具有單拷貝轉(zhuǎn)基因、通過(guò)ELISA鑒定到的良好蛋白質(zhì)表達(dá)(參見(jiàn)實(shí)施例4)、抗谷實(shí)夜蛾(Helicoverpa zea)的良好殺昆蟲(chóng)活性和田間性能，選定了兩個(gè)事件COT101和COT102。在田間試驗(yàn)第二年末，比較兩個(gè)事件的結(jié)果，COT102是進(jìn)步的。
1.4COT102序列的證實(shí)從COT102事件分離基因組DNA。利用該基因組DNA，利用標(biāo)準(zhǔn)DNA測(cè)序技術(shù)，測(cè)序在COT102事件中DNA插入位點(diǎn)和棉花基因組DNA的連接處。
實(shí)施例2用TaqManTM進(jìn)行COT102檢測(cè)2.1DNA提取利用WizardTMMagnetic 96 DNA植物系統(tǒng)(Promega，#FF3760)，根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)，從葉片組織提取DNA，同時(shí)在開(kāi)始該方法前進(jìn)行下面附加的步驟研磨葉片材料后，向每個(gè)孔添加0.9ml棉花提取緩沖液(0.2MTris pH 8.0，50mM EDTA，0.25M NaCl，0.1％v/v 2-巰基乙醇，2.5％w/v聚乙烯-吡咯烷酮)，重懸浮植物組織，以4,000rpm(2755g)離心該板10分鐘。吸取和棄掉上清液后，添加300μl裂解緩沖液A(Promega)，并且從這點(diǎn)以后利用制造商的方案。該方法產(chǎn)生了大約85μl純化的基因組DNA，濃度大約是10ng/μl。
2.2TaqMan PCR反應(yīng)利用標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)混合物建立TaqManTMPCR反應(yīng)，該反應(yīng)混合物包含625μl 2x用于Q-PCR的Jumpstart Master Mix(Sigma，#P2893)，補(bǔ)加有15mM MgCl2和200nM Strata-ROX25μl 50x FAM引物/探針混合物25μl 50x TET引物/探針混合物200μl 水。
50x引物/探針混合物包含1mM濃度的每種引物各45μl，100μM濃度的探針50μl和860μl 1x TE，并且在4℃，貯藏在琥珀試管中。所使用的適宜引物/探針序列組合的例子是引物名稱引物序列5’-3’SEQ IDGhCHI2b-FGGTCCCTGGATACGGTGTCA SEQ ID NO9正向GhCHI2b-RTTGAGGGTTGGATCCTTTGC SEQ ID NO10反向GhCHI2b-TET CCAACATCATCAATGGTGGCATCGAAT SEQ ID NO11探針 (5’標(biāo)記＝TET，3’標(biāo)記＝TAMRA)潮霉素-F CAGGCAGGTCTTGCAACGT SEQ ID NO12正向潮霉素-R CGAGAGCCTGACCTATTGCATSEQ ID NO13反向潮霉素-FAMACACCCTGTGCACGGCGGG SEQ ID NO14探針 (5’標(biāo)記＝FAM，3’標(biāo)記＝TAMRA)Vip3-FATGAAGACCCTGCGCTACGA SEQ ID NO15正向Vip3-RACGCCCAGTGGCATGTAGA SEQ ID NO16反向Vip3-FAM AGCGAGGCCGAGTACCGCACCSEQ ID NO17探針 (5’標(biāo)記＝FAM，3’標(biāo)記＝TAMRA)
將7μl Master Mix分配到384孔TaqManTM測(cè)定板的每個(gè)孔中。向適合的孔添加3μl DNA模板。將3μl拷貝對(duì)照稀釋系列添加到特定孔中做為對(duì)照。利用下面的循環(huán)條件，在ABI7900(Applied Biosystems)中進(jìn)行反應(yīng)步驟溫度 時(shí)間1 50℃ 2分鐘2 95℃ 10分鐘3 95℃ 15秒4 60℃ 1分鐘5 回到步驟3，重復(fù)40次利用SDS2.0軟件(Applied Biosystems)分析數(shù)據(jù)。
實(shí)施例3通過(guò)PCR進(jìn)行COT102檢測(cè)3.1基因組DNA提取如實(shí)施例2.1中所述從COT102提取基因組DNA。
3.2多重PCR接合性測(cè)定設(shè)計(jì)PCR引物以結(jié)合COT102盒插入位點(diǎn)上游的棉花基因組DNA序列(SEQ ID NO18)；COT102盒序列本身(SEQ ID NO19)；和插入COT102序列時(shí)置換的棉花基因組DNA序列(SEQ ID NO20)。當(dāng)存在COT102插入片段時(shí)，引物對(duì)SEQ ID NO18和19擴(kuò)增962bp大小的PCR片段。對(duì)于每個(gè)待檢測(cè)的樣品建立如下50μl PCR反應(yīng)1x JumpState ReadyMix REDTaq PCR(SigmaP-1107) 25μl40pmole引物1(SEQ ID NO18) 4μl40pmole引物2(SEQ ID NO19) 4μl40pmole引物3(SEQ ID NO20) 4μl40ng基因組DNA 4μlddH2O9μl在熱循環(huán)儀中94℃加熱PCR反應(yīng)物2分鐘，接著進(jìn)行下面的35個(gè)循環(huán)94℃，30秒，60℃，30秒，72℃，1分鐘。通過(guò)在72℃加熱5分鐘完成反應(yīng)。
3.3分析在瓊脂糖凝膠上電泳PCR反應(yīng)物，并且用溴化乙錠染色后，在UV光下觀察DNA條帶。3條條帶的存在表明樣品是COT102純合植物；2條帶(其中一條帶是962bp大小)表明樣品是COT102雜合植物；2條帶(沒(méi)有962bp大小的條帶)表明樣品是純合野生型棉花植物。
3.4事件特異性PCR設(shè)計(jì)一種PCR引物以結(jié)合VIP3A基因的3’末端(SEQ ID NO3)。設(shè)計(jì)另一種PCR引物以結(jié)合COT102插入位點(diǎn)3’末端下游的側(cè)翼基因組DNA序列的互補(bǔ)鏈(SEQ ID NO4)。利用COT102基因組，在PCR反應(yīng)中一起使用這些引物，產(chǎn)生800bp片段擴(kuò)增物。當(dāng)該引物用在利用Coker312未轉(zhuǎn)化棉花基因組DNA樣品的PCR反應(yīng)中時(shí)，沒(méi)有片段被擴(kuò)增。
在第二對(duì)引物中，設(shè)計(jì)一種引物以結(jié)合潮霉素基因(SEQ ID NO19)，并且設(shè)計(jì)另一種引物以結(jié)合COT102插入位點(diǎn)5’末端上游的側(cè)翼基因組DNA序列(SEQ ID NO18)。在利用COT102基因組DNA的PCR反應(yīng)中一起使用這些引物，產(chǎn)生962bp片段擴(kuò)增物。當(dāng)該引物用在利用Coker 312未轉(zhuǎn)化棉花基因組DNA樣品的PCR反應(yīng)中時(shí)，沒(méi)有片段被擴(kuò)增。
實(shí)施例4通過(guò)Southern印跡進(jìn)行COT102檢測(cè)4.1用于Southern印跡的DNA提取利用研缽和研杵，在液氮中研磨大約5到10g植物組織。在12.5ml提取緩沖液A(0.2M Tris pH 8.0，50mM EDTA，0.25M NaCl，0.1％v/v β-巰基乙醇，2.5％w/v聚乙烯-吡咯烷酮)中重懸浮植物組織，以4,000rpm離心10分鐘(2755g)。棄掉上清液后，在2.5ml提取緩沖液B(0.2M TrispH8.0，50mM EDTA，0.5M NaCl，1％v/v β-巰基乙醇，2.5％w/v聚乙烯-吡咯烷酮，3％肌氨酰，20％乙醇)中重懸浮沉淀，并且在37℃溫育30分鐘。在溫育期間，用無(wú)菌環(huán)混合樣品一次。溫育后，添加等體積的氯仿/異戊醇(24∶1)，通過(guò)倒置輕輕混合，以4,000rpm離心20分鐘。收集含水層，并且在添加0.54體積異丙醇后以4,000rpm離心5分鐘以沉淀DNA。棄掉上清液，并且在500μl TE中重懸浮DNA沉淀。為了降解任何存在的RNA，在37℃，將DNA和1μl 30mg/ml RNAase A溫育30分鐘，以4,000rpm離心5分鐘，并且在0.5體積7.5M醋酸銨和0.54體積異丙醇存在的情況下，通過(guò)以14,000rpm離心10分鐘沉淀DNA。棄掉上清液后，用500μl 70％乙醇洗沉淀，并且使其干燥后在100μl TE中重懸浮。
4.2限制酶消化利用分光光度計(jì)或熒光計(jì)定量DNA(利用1xTNE和Hoechst染料)。在總體積50μl中，每次消化利用8μg DNA，制備適宜的酶消化產(chǎn)物。消化包括BamHI，EcoRI，EcoRV，HindIII，NcoI，SacI，ScaI，SpeI和PstI的單獨(dú)和組合。特別地，BamHI和EcoRI雙消化用于檢測(cè)VIP3A基因的完整性；BamHI和EcoRV雙消化用于檢測(cè)VIP3A基因座數(shù)和潮霉素基因的完整性；BamHI單消化用于檢測(cè)VIP3A基因座數(shù)量。對(duì)于每種酶，在適當(dāng)?shù)臏囟认聹赜^(guò)夜消化物。以真空離心蒸發(fā)濃縮器(speed vacuum)旋轉(zhuǎn)樣品以減少體積到30μl。
4.3凝膠電泳向來(lái)源于上述4.2的每個(gè)樣品添加溴酚藍(lán)加樣染料，并且將每個(gè)樣品加樣到含有溴化乙錠的0.8％TBE瓊脂糖凝膠上。在60伏特下電泳凝膠過(guò)夜。
在0.25M HCl中洗凝膠15分鐘以使DNA脫嘌呤，然后用水洗。設(shè)定Southern印跡如下在盤(pán)中放置20張厚的干燥印跡紙，其上再放置4張薄的干燥印跡紙。在0.4M NaOH中預(yù)先濕潤(rùn)1張薄印跡紙，并且放置在該堆紙上，接著放置也在0.4M NaOH中預(yù)先濕潤(rùn)的1張Hybond-N+轉(zhuǎn)移膜(Amersham Pharmacia Biotech，#RPN303B)。凝膠置放在上部確保在凝膠和膜之間沒(méi)有氣泡。3張另外預(yù)先浸泡的印跡紙被放置在凝膠上部，并且用0.4M NaOH填滿緩沖液盤(pán)。用預(yù)先浸泡在0.4M NaOH中的燈芯連接凝膠堆層和緩沖液盤(pán)，開(kāi)始DNA轉(zhuǎn)移到膜上。在室溫下進(jìn)行大約4小時(shí)的DNA轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)移后，在2x SSC中漂洗Hybond膜10秒，DNA通過(guò)UV交聯(lián)與膜結(jié)合。
4.4雜交用PCR制備適合的DNA探針。在4μl TE中煮沸25ng探針DNA 5分鐘，放置在冰上7分鐘，然后轉(zhuǎn)移到Rediprime II(Amersham PharmaciaBiotech，#RPN1633)試管中。向Rediprime試管添加5μl P32標(biāo)記的dCTP后，在37℃溫育探針15分鐘。根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)，通過(guò)微離心G-50柱子(Amersham Pharmacia Biotech，#27-5330-01)離心，以移除未摻入的dNTPs，純化該探針。利用閃爍計(jì)數(shù)儀測(cè)量探針活性。
通過(guò)在65℃用20ml預(yù)加溫的Church預(yù)雜交溶液(500mMNaPO4，1mMEDTA，7％SDS，1％BSA)濕潤(rùn)該Hybond膜30分鐘，預(yù)雜交該Hybond膜。煮沸標(biāo)記的探針5分鐘，并且放置在冰上10分鐘。向預(yù)雜交緩沖液添加適合量的探針(每1ml預(yù)雜交緩沖液1百萬(wàn)次計(jì)數(shù))，在65℃過(guò)夜進(jìn)行雜交。第二天，棄掉雜交緩沖液，在用20ml Church沖洗溶液1(40mMNaPO4，1mM EDTA，5％SDS，0.5％BSA)漂洗后，在65℃，在150ml Church沖洗溶液1中洗膜20分鐘。用Church沖洗溶液2(40mMNaPO4，1mM EDTA，1％SDS)重復(fù)該過(guò)程2次。將該膜暴露于磷光屏或X光片以檢測(cè)探針結(jié)合的位置。
實(shí)施例5通過(guò)ELISA進(jìn)行COT102檢測(cè)5.1蛋白質(zhì)提取收獲用于分析的棉花植物組織，并且在-70℃冷凍。將新鮮組織研磨成細(xì)粉末，并且稱重，放入標(biāo)記的聚丙烯試管中。對(duì)于新鮮組織以2∶1比率(提取緩沖液體積樣品鮮重)，或者對(duì)于凍干組織以30∶1比率(提取緩沖液體積樣品干重)，向樣品添加提取緩沖液(100mM Tris，100mM硼酸鈉，5mMMgCl2，0.05％吐溫20，0.2％抗壞血酸鈉，水，pH7.8，1mMAEBSF，0.001mM亮抑酶肽)。利用裝配有PTA 10TS減少泡沫發(fā)生器的Brinkman PT10/35 Polytron漩渦樣品和勻漿，直到混合物變成液態(tài)為止。以10,000xg離心提取物15分鐘。蛋白質(zhì)提取物上清液貯藏在2-8℃。
5.2ELISA方法ELISA方法使用了下面的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。在乙醇中浸泡96孔板2小時(shí)，并且空氣干燥。用每孔50μl山羊抗VIP3A抗體包被該板，并且在2-8℃過(guò)夜溫育。用1X ELISA沖洗緩沖液(100mM Tris，0.5％吐溫-20，75mM NaCl，pH8.5)沖洗3次后，通過(guò)簡(jiǎn)單地在紙巾上倒置輕拍，干燥該板。向每孔添加150μl封閉溶液(10mM NaPO4，140mM NaCl，1％BSA，0.02％疊氮化鈉，用單堿價(jià)的NaPi和二堿價(jià)的NaPi滴定到pH7.4)，接著在室溫下溫育45分鐘。如上所述沖洗該板3次。
VIP3A標(biāo)準(zhǔn)和蛋白質(zhì)提取物樣品一式三份地施用到該板的適合孔中，每孔50μl總體積。在2-8℃溫育該板1小時(shí)30分鐘，接著室溫下進(jìn)一步溫育30分鐘。用ELISA沖洗溶液沖洗該板3次，然后在35-39℃與每孔50μl兔抗VIP3A抗體溫育1小時(shí)。用ELISA沖洗緩沖液沖洗該板3次，并且在室溫下與每孔50μl驢抗兔堿性磷酸酶溫育30分鐘。接著，用ELISA沖洗溶液再?zèng)_洗3次，向每孔添加50μl磷酸酶底物溶液，并且在室溫下溫育該板30分鐘。通過(guò)向每孔添加50μl 3M NaOH終止反應(yīng)。在405nm，利用Ceres 900C多孔板讀數(shù)器測(cè)量每孔中溶液的吸光度，利用KC3曲線擬合軟件(Bio-Tek Instruments Inc.)分析結(jié)果。通過(guò)參照VIP3A蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品，計(jì)算樣品中VIP3A的濃度。
實(shí)施例6通過(guò)測(cè)量棒(dip stick)進(jìn)行COT102檢測(cè)6.1蛋白質(zhì)提取將約2cm2的一片葉片組織放置在含有提取緩沖液的試管中。通過(guò)用塑料攪拌器切割和浸解(mascerate)組織，從組織提取蛋白質(zhì)。
6.2測(cè)量棒檢測(cè)檢測(cè)條被放置在試管中，并且溫育5-10分鐘以產(chǎn)生結(jié)果。檢測(cè)條包含抗VIP3A抗體結(jié)合的第一條帶，和對(duì)照抗體結(jié)合的第二條帶。溫育后，檢測(cè)條結(jié)果視窗中雙紅色線表明存在VIP3A。下邊的線表明Vip3A蛋白質(zhì)的存在，而下邊的線是對(duì)照，表明該檢測(cè)方法正確地工作。
實(shí)施例7通過(guò)昆蟲(chóng)生物測(cè)定進(jìn)行COT102檢測(cè)7.1葉片生物測(cè)定按如下所述，對(duì)草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)，谷實(shí)夜蛾(Helicoverpa zea)和煙蚜夜蛾(Heliothis virescens)進(jìn)行葉片測(cè)定用300μl到500μl蒸餾水浸泡墊片，并且放置在Gelman皿中。從8到12英寸高的棉花植物切下測(cè)量的約0.5平方英寸到0.75平方英寸之間的葉片，并且放置在墊片上。在每個(gè)皿中放置8到10條昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)，用蓋子蓋住該皿。在28℃溫育該皿。在侵襲后第3和第6天，計(jì)數(shù)每個(gè)皿中葉片的損害，并且與對(duì)照植物比較。
7.2棉鈴生物測(cè)定用水飽和4個(gè)吸水墊，并且放置在大塑料杯里面。每個(gè)用100μl蒸餾水浸泡的另外3個(gè)厚玻璃濾器放置在小玻璃杯中，該小玻璃杯裝在大玻璃杯里面。切下1.25英寸長(zhǎng)的棉鈴，浸入在10mg/ml到20mg/ml制霉菌素(Nystatin)中，并且放置在小玻璃杯中濾器上。將50條昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)放置在棉蕾或棉鈴上，并且用蓋子蓋上大玻璃杯。7天后，用外加50條幼蟲(chóng)再次侵襲棉蕾或棉鈴。
在室溫下溫育該試驗(yàn)大約3周。然后切開(kāi)棉鈴以檢測(cè)損害。將棉鈴的損害與對(duì)照樣品比較。
7.3凍干葉片生物測(cè)定如下，利用冷凍干燥的葉組織，對(duì)煙蚜夜蛾(Heliothis virescens)進(jìn)行生物測(cè)定在摘取葉片時(shí)，在干冰上快速冷凍末端葉，并且過(guò)夜凍干。在研缽和研杵中將冷凍干燥的組織研磨成細(xì)粉末，并且重懸浮在0.2％瓊脂溶液中以制備8％(0.08g/ml)葉粉末懸浮液。將懸浮液覆蓋在96孔板中人工昆蟲(chóng)餌料上面，并且讓其干燥。向每個(gè)孔放入單條新生昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)，并且密封該板。在28℃，溫育該板。在侵襲后第6天，計(jì)數(shù)幼蟲(chóng)的死亡率，并且與對(duì)照樣品比較。所獲得的結(jié)果如下

序列表序列表<110>SYNGENTA LIMITED<120>COT102殺蟲(chóng)棉花<130>70159<160>25<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>COT102核苷酸基序<400>1ggcaaatatt caggtaaaca aattga26<210>2<211>26<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>COT102核苷酸基序<400>2ctatcagtgt ttaataaata tgggca26<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>COT102核苷酸基序<400>3aaggacgtga gcgagatgtt20<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>COT102核苷酸基序<400>4tgtgacaccg atccacctaa20<210>5<211>290<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>COT102核苷酸基序<400>5gacaaggaca gcttgagcga ggtgatctac ggcgacatgg acaagctgct gtgtccggac60cagagcgagc aaatctacta caccaacaac atcgtgttcc cgaacgagta cgtgatcacc120aagatcgact tcaccaagaa gatgaagacc ctgcgctacg aggtgaccgc caacttctac180gacagcagca ccggcgagat cgacctgaac aagaagaagg tggagagcag cgaggccgag240taccgcaccc tgagcgcgaa cgacgacggc gtctacatgc cactgggcgt290<210>6<211>347<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>COT102核苷酸基序<400>6cgccgtgcac agggtgtcac gttgcaagac ctgcctgaaa ccgaactgcc cgctgttctg60cagccggtcg cggaggccat ggatgcgatc gctgcggccg atcttagcca gacgagcggg120ttcggcccat tcggaccgca aggaatcggt caatacacta atggcgtgat ttcatatgcg180cgattgctga tccccatgtg tatcactggc aaactgtgat ggacgacacc gtcagtgcgt240ccgtcgcgca ggctctcgat gagctgatgc tttgggccga ggactgcccc gaagtccggc300acctcgtgca cgcggatttc ggctccaaca atgtcctgac ggacaat347
<210>7<211>7474<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>COT102核苷酸基序<400>7gtaaacaaat tgacgcttag acaacttaat aacacattgc ggacgttttt aatgtacgcc60atgctggccg cccggggtac ccaattcccg atctagtaac atagatgaca ccgcgcgcga120taatttatcc tagtttgcgc gctatatttt gttttctatc gcgtattaaa tgtataattg180cgggactcta atcataaaaa cccatctcat aaataacgtc atgcattaca tgttaattat240tacatgctta acgtaattca acagaaatta tatgataatc atcgcaagac cggcaacagg300attcaatctt aagaaacttt attgccaaat gtttgaacga tcggggaaat tcggggatcc360cggtcggcat ctactctatt cctttgccct cggacgagtg ctggggcgtc ggtttccact420atcggcgagt acttctacac agccatcggt ccagacggcc gcgcttctgc gggcgatttg480tgtacgcccg acagtcccgg ctccggatcg gacgattgcg tcgcatcgac cctgcgccca540agctgcatca tcgaaattgc cgtcaaccaa gctctgatag agttggtcaa gaccaatgcg600gagcatatac gcccggagcc gcggcgatcc tgcaagctcc ggatgcctcc gctcgaagta660gcgcgtctgc tgctccatac aagccaacca cggcctccag aagaagatgt tggcgacctc720gtattgggaa tccccgaaca tcgcctcgct ccagtcaatg accgctgtta tgcggccatt780
gtccgtcagg acattgttgg agccgaaatc cgcgtgcacg aggtgccgga cttcggggca840gtcctcggcc caaagcatca gctcatcgag agcctgcgcg acggacgcac tgacggtgtc900gtccatcaca gtttgccagt gatacacatg gggatcagca atcgcgcata tgaaatcacg960ccatgtagtg tattgaccga ttccttgcgg tccgaatggg ccgaacccgc tcgtctggct1020aagatcggcc gcagcgatcg catccatggc ctccgcgacc ggctgcagaa cagcgggcag1080ttcggtttca ggcaggtctt gcaacgtgac accctgtgca cggcgggaga tgcaataggt1140caggctctcg ctgaatgccc caatgtcaag cacttccgga atcgggagcg cggccgatgc1200aaagtgccga taaacataac gatctttgta gaaaccatcg gcgcagctat ttacccgcag1260gacatatcca cgccctccta catcgaagct gaaagcacga gattcttcgc cctccgagag1320ctgcatcagg tcggagacgc tgtcgaactt ttcgatcaga aacttctcga cagacgtcgc1380ggtgagttca ggctttttca tatcttattg cccccctaga gtcgagatcc acctgaaata1440aaacaataga acaagtagaa accaatcagc gaacatatac caaatcaaaa gccgtaagag1500aaatcaaaac aacaccaaag agaaacggat ctaaacataa gaaacctaaa acagagagaa1560tcgaacaaag aaaacacaaa aattgaatag atcgtccttg aaaatcctaa tttcacaatc1620aagcaagaaa ttacacagat gtaaacacta cgaatcgata tcttagtaat caggacaaaa1680tttagaagct ggattgacga aacgaacaat attgtcaaaa gcaatttata caaaagattc1740aataatccac ataacaaaaa ttggagatca gatacgaatc aaaaacaaaa agaatcagaa1800aatatacctt gaaagagaga gtcgcgagag atttgcagag atcgctttag gctttgggag1860
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gcaacaagga gaccaagctg atcgtgccac cgagcggctt catcagcaac atcgtggaga6240acggcagcat cgaggaggac aacctggagc cgtggaaggc caacaacaag aacgcctacg6300tggaccacac cggcggcgtg aacggcacca aggccctgta cgtgcacaag gacggcggca6360tcagccagtt catcggcgac aagctgaagc cgaagaccga gtacgtgatc cagtacaccg6420tgaagggcaa gccatcgatt cacctgaagg acgagaacac cggctacatc cactacgagg6480acaccaacaa caacctggag gactaccaga ccatcaacaa gcgcttcacc accggcaccg6540acctgaaggg cgtgtacctg atcctgaaga gccagaacgg cgacgaggcc tggggcgaca6600acttcatcat cctggagatc agcccgagcg agaagctgct gagcccggag ctgatcaaca6660ccaacaactg gaccagcacc ggcagcacca acatcagcgg caacaccctg accctgtacc6720agggcggccg cggcatcctg aagcagaacc tgcagctgga cagcttcagc acctaccgcg6780tgtacttcag cgtgagcggc gacgccaacg tgcgcatccg caactcccgc gaggtgctgt6840tcgagaagag gtacatgagc ggcgccaagg acgtgagcga gatgttcacc accaagttcg6900agaaggacaa cttctacatc gagctgagcc agggcaacaa cctgtacggc ggcccgatcg6960tgcacttcta cgacgtgagc atcaagtagg agctctagat ccccgaattt ccccgatcgt7020tcaaacattt ggcaataaag tttcttaaga ttgaatcctg ttgccggtct tgcgatgatt7080atcatataat ttctgttgaa ttacgttaag catgtaataa ttaacatgta atgcatgacg7140ttatttatga gatgggtttt tatgattaga gtcccgcaat tatacattta atacgcgata7200gaaaacaaaa tatagcgcgc aaactaggat aaattatcgc gcgcggtgtc atctatgtta7260
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<223>COT102核苷酸基序<400>22gatcggggtc aggaaggtct20<210>23<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>COT102核苷酸基序
<400>23cagcatcatg aacgagcact20<210>24<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>COT102核苷酸基序<400>24cagcgagagc ctgacctatt20<210>25<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>COT102核苷酸基序<400>25caggacattg ttggagccga20
權(quán)利要求
1.一種多核苷酸，其包含來(lái)自SEQ ID NO1的26個(gè)核苷酸序列的至少17個(gè)鄰接核苷酸。
2.如權(quán)利要求1所述的多核苷酸，其包含來(lái)自SEQ ID NO1的26個(gè)核苷酸序列的至少18個(gè)鄰接核苷酸。
3.如權(quán)利要求1所述的多核苷酸，其包含來(lái)自SEQ ID NO1的26個(gè)核苷酸序列的至少20個(gè)鄰接核苷酸。
4.如權(quán)利要求1所述的多核苷酸，其包含SEQ ID NO1的序列。
5.一種多核苷酸，其包含來(lái)自SEQ ID NO2的26個(gè)核苷酸序列的至少17個(gè)鄰接核苷酸。
6.如權(quán)利要求5所述的多核苷酸，其包含來(lái)自SEQ ID NO2的26個(gè)核苷酸序列的至少18個(gè)鄰接核苷酸。
7.如權(quán)利要求5所述的多核苷酸，其包含來(lái)自SEQ ID NO2的26個(gè)核苷酸序列的至少20個(gè)鄰接核苷酸。
8.如權(quán)利要求5所述的多核苷酸，其包含SEQ ID NO2的序列。
9.根據(jù)前述任何一個(gè)權(quán)利要求所述的多核苷酸，其包含SEQ IDNO21的序列。
10.一種抗昆蟲(chóng)的植物，其包含VIP3A蛋白質(zhì)和如權(quán)利要求1至9任一權(quán)利要求所述的多核苷酸。
11.如權(quán)利要求10所述的植物，其是棉花植物。
12.如權(quán)利要求11所述的一種殺蟲(chóng)棉花植物，其來(lái)源于COT102事件。
13.一種檢測(cè)來(lái)源于COT102事件的植物材料的方法，該方法包括●獲得用于分析的樣品；●提供該樣品的DNA；●提供一對(duì)引物，該引物被設(shè)計(jì)成當(dāng)如權(quán)利要求1至9任一權(quán)利要求所述的多核苷酸是單鏈時(shí)，能結(jié)合該多核苷酸；●擴(kuò)增位于該引物結(jié)合位點(diǎn)之間的區(qū)域；和●檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的存在；由此，擴(kuò)增產(chǎn)物的存在表明樣品來(lái)源于COT102事件。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其中第一個(gè)引物具有SEQ ID NO3的序列，第二個(gè)引物具有SEQ ID NO4的序列。
15.一種檢測(cè)來(lái)源于COT102事件的植物材料的方法，該方法包括●獲得用于分析的樣品；●提供探針，該探針被設(shè)計(jì)成當(dāng)如權(quán)利要求1至9任一權(quán)利要求所述的多核苷酸是單鏈時(shí)，能結(jié)合所述多核苷酸的互補(bǔ)鏈；●使所述探針和樣品雜交；和●檢測(cè)該探針是否已經(jīng)雜交；由此，探針的雜交表明該樣品來(lái)源于COT102事件。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其中探針的序列選自SEQ ID NO5，SEQ ID NO6和SEQ ID NO7。
17.如權(quán)利要求15或16所述的方法，其中在嚴(yán)格雜交條件下，該探針與樣品雜交。
18.一種檢測(cè)來(lái)源于COT102事件的植物材料的方法，該方法包括●獲得用于分析的樣品；●提供抗體，該抗體被設(shè)計(jì)成結(jié)合如權(quán)利要求10到12任一權(quán)利要求所述植物中包含的VIP蛋白質(zhì)；●溫育所述抗體和樣品；和●檢測(cè)該抗體是否已經(jīng)結(jié)合；由此，已經(jīng)結(jié)合的抗體的存在表明該樣品來(lái)源于COT102事件。
19.一種檢測(cè)來(lái)源于COT102事件的植物材料的方法，該方法包括●獲得用于分析的樣品；●制備樣品的蛋白質(zhì)提取物；●提供檢測(cè)條，該檢測(cè)條被設(shè)計(jì)成檢測(cè)存在于樣品中的VIP蛋白質(zhì)的存在；●溫育檢測(cè)條和樣品；和●檢測(cè)VIP蛋白質(zhì)是否存在；其中，VIP蛋白質(zhì)的存在表明該樣品來(lái)源于COT102事件。
20.如權(quán)利要求18或19所述的方法，其中VIP蛋白質(zhì)具有SEQ IDNO8的序列。
21.一種檢測(cè)來(lái)源于COT102事件的植物材料的方法，該方法包括●獲得用于分析的樣品；●使草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)物種的一個(gè)或多個(gè)昆蟲(chóng)暴露于該樣品；●使歐洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)物種的一個(gè)或多個(gè)昆蟲(chóng)暴露于該樣品，做為對(duì)照；●檢測(cè)樣品是否對(duì)每個(gè)物種的昆蟲(chóng)具有殺蟲(chóng)作用；和●比較該結(jié)果和真實(shí)的COT102生物測(cè)定模式。
22.一種試劑盒，其包含用于檢測(cè)樣品中來(lái)源于COT102事件的植物材料的存在的手段。
23.如權(quán)利要求22所述的試劑盒，其包含用于檢測(cè)樣品中如權(quán)利要求1至9任一權(quán)利要求所述多核苷酸，或者如權(quán)利要求1至9任一權(quán)利要求所述多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)，或者VIP蛋白質(zhì)的存在的手段。
24.如權(quán)利要求22或23所述的試劑盒，其包含說(shuō)明書(shū)形式的如權(quán)利要求13至21任一權(quán)利要求所述一種或多種方法。
全文摘要
本發(fā)明涉及抗昆蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因棉花植物。特別地，本發(fā)明涉及命名為COT102的特定事件。本發(fā)明也涉及COT102事件特有的多核苷酸，包含所述多核苷酸的植物，和檢測(cè)COT102事件的方法。該COT102事件顯示了包含2個(gè)表達(dá)盒的新基因型。第一個(gè)盒子包含用于在植物中表達(dá)的適合啟動(dòng)子和適合的聚腺苷酸化信號(hào)，該啟動(dòng)子可操作地連接編碼VIP3A殺蟲(chóng)毒素的基因，該VIP3A殺蟲(chóng)毒素可用于控制廣譜鱗翅目昆蟲(chóng)害蟲(chóng)。第二個(gè)盒子包含當(dāng)其表達(dá)時(shí)能用做選擇性標(biāo)記的基因。
文檔編號(hào)C12N15/82GK1708588SQ200380102137
公開(kāi)日2005年12月14日 申請(qǐng)日期2003年10月23日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月29日
發(fā)明者D·M·埃利斯, D·V·奈格羅特, 施良, F·A·施特科斯基, C·R·托馬斯 申請(qǐng)人:辛根塔參與股份公司