專利名稱：應(yīng)用在腫瘤低氧區(qū)域中選擇性復(fù)制的重組腺病毒載體的靶向腫瘤治療的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及在低氧細(xì)胞中增殖條件復(fù)制型(conditionallyreplication competent)腺病毒載體的方法。更特別地，所述方法包括用條件復(fù)制型腺病毒載體感染低氧細(xì)胞，例如腫瘤內(nèi)的低氧細(xì)胞，由此所述腺病毒載體在低氧細(xì)胞中復(fù)制，殺死該細(xì)胞。
縮寫表Ad腺病毒AdCMV-EGFP具有在組成型CMV啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制下EGFP基因的腺病毒載體AdCMV-dsRed2 具有在組成型CMV啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制下dsRed2基因的復(fù)制缺陷型腺病毒載體
AdHRP-E1A-dsRed2具有在HRP的控制下Ad E1A基因的條件復(fù)制型Ad載體。其也組成型表達(dá)一種紅色熒光標(biāo)記。
AdHRP-E1A-TNF-α具有在HRP的控制下Ad E1A基因和在組成型CMV啟動(dòng)子控制下TNF-α基因的條件復(fù)制型腺病毒載體AdHRP-E1AE4-dsRed2 具有在HRP控制下的Ad E1A和E4基因的條件復(fù)制型Ad載體。其還組成型表達(dá)一種紅色熒光標(biāo)記。
AdHRP-E4-dsRed2 具有在HRP控制下的Ad E4基因的條件復(fù)制型Ad載體。其還組成型表達(dá)一種紅色熒光標(biāo)記。
ARNT芳基受體核轉(zhuǎn)位蛋白(translocator)CMV 巨細(xì)胞病毒DNAse I 脫氧核糖核酸酶IDHFR二氫葉酸還原酶dsRed2 珊瑚?？?Discosoma sp.)紅色熒光蛋白E1A 腺病毒早期基因1AE1B 腺病毒早期基因1BE2A 腺病毒早期基因2AE2B 腺病毒早期基因2BE3 腺病毒早期基因3E4 腺病毒早期基因4EGFP增強(qiáng)的綠色熒光蛋白ex-Flk1 Flk1受體的胞外結(jié)構(gòu)域
HIF低氧可誘導(dǎo)因子HPRT 次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶HRE低氧應(yīng)答元件HRP低氧應(yīng)答啟動(dòng)子HRP-EGFP 其中EGFP的表達(dá)由HRP調(diào)節(jié)的質(zhì)粒載體hsp熱激蛋白HSV-tk 單純皰疹病毒胸苷激酶IL-2 白細(xì)胞介素2IL-12 白細(xì)胞介素12kb 千堿基MOI感染復(fù)數(shù)NIH國(guó)立衛(wèi)生研究院pfu噬斑形成單位PGK磷酸甘油酸激酶PSA前列腺特異性抗原pVHL von Hippel-Lindau蛋白s-Flt1 可溶形式的Flt1受體SV40 猿猴病毒40TAFs 轉(zhuǎn)錄相關(guān)的因子Tm 解鏈溫度TNF-α 腫瘤壞死因子-αTRE轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件VEGF 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VHLvon Hippel-Lindau
背景技術(shù)：
盡管醫(yī)學(xué)研究和技術(shù)有顯著進(jìn)展，但癌癥還是在美國(guó)及全世界導(dǎo)致死亡的最主要疾病之一。僅在美國(guó)每年就有超過(guò)一百萬(wàn)的新病例，而且每年有五十萬(wàn)以上的人死于癌癥。
目前對(duì)癌癥的治療包括手術(shù)切除或放療，但每種治療方法均有限制。在前者情況中，一旦腫瘤已經(jīng)通過(guò)侵入周圍組織或移至遠(yuǎn)處部位而轉(zhuǎn)移，則實(shí)際上不可能通過(guò)手術(shù)除去所有癌細(xì)胞。手術(shù)后剩余的任何這種細(xì)胞均可持續(xù)生長(zhǎng)，導(dǎo)致術(shù)后癌癥復(fù)發(fā)。目前放療策略在治療患者的癌癥中通常也不成功。在放療后，由于通常不可能輸送足夠高劑量的射線以殺死所有的腫瘤細(xì)胞而同時(shí)不損害周圍正常組織，因此癌癥可以復(fù)發(fā)。癌癥也可以由于腫瘤示出對(duì)射線誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡有各種不同的敏感性而復(fù)發(fā)。因此，目前的治療方案不能消除腫瘤細(xì)胞的能力是導(dǎo)致不能成功治療癌癥的一個(gè)重要臨床限制(Lindegaard et al.，1996；Suit，1996；Valter et al.，1999)。
需要更新的治療策略以解決不能成功治療致瘤性疾病的問(wèn)題。腫瘤學(xué)家面對(duì)的主要問(wèn)題之一是選擇性殺死腫瘤細(xì)胞而不導(dǎo)致周圍正常細(xì)胞損害的能力。目前各種各樣的方法是利用在大多數(shù)情況中腫瘤細(xì)胞比正常細(xì)胞生長(zhǎng)迅速的事實(shí)，因此設(shè)計(jì)的殺死快速生長(zhǎng)的細(xì)胞的策略對(duì)腫瘤細(xì)胞略微有選擇性(見Yazawa et al.，2002)。然而，這些方法還殺死機(jī)體內(nèi)正常迅速分化的某些細(xì)胞類型，特別是骨髓中的細(xì)胞，導(dǎo)致并發(fā)癥如貧血和中性粒細(xì)胞減少癥(參見Vose & Armitage，1995)。其它策略基于腫瘤特異性抗原的抗體的產(chǎn)生(參見Sinkovics & Horvath，2000)，但僅鑒別了少數(shù)的這種抗原，限制了這些方法的適用性。因此，需要新的方法以增強(qiáng)癌癥治療方法的選擇性。
近年來(lái)，已經(jīng)嘗試了研發(fā)并應(yīng)用有復(fù)制能力的病毒，這種病毒可在腫瘤細(xì)胞中選擇性復(fù)制并從而殺死腫瘤細(xì)胞(見例如Galanis et al.，2001)。在這種方法中，病毒載體被遺傳工程化為在靶定的腫瘤細(xì)胞中特異性復(fù)制。然后通過(guò)病毒介導(dǎo)的細(xì)胞裂解成功殺死靶定的腫瘤細(xì)胞，這樣可以引起隨后的感染和殺死鄰近的細(xì)胞(Galanis et al.，2001)。
這種方法存在的問(wèn)題是要發(fā)現(xiàn)使病毒選擇性靶向和/或在腫瘤細(xì)胞中復(fù)制的機(jī)制。為此，已經(jīng)嘗試了基于腫瘤細(xì)胞的特異性遺傳特性的選擇性復(fù)制方案(見Galanis et al.，2001及其參考文獻(xiàn))。例如，實(shí)現(xiàn)腫瘤特異性病毒復(fù)制的方法之一涉及重組腫瘤消解性腺病毒載體dl1520，或Onyx-015。設(shè)計(jì)了Onyx-015載體以嘗試提供在缺失p53腫瘤抑制基因的細(xì)胞中選擇性復(fù)制(Bischoff et al.，1996；Ries & Korn，2002)。Onyx-015的設(shè)計(jì)是基于這樣的事實(shí)，即成功的腺病毒復(fù)制需要細(xì)胞p53蛋白的失活，這通過(guò)腺病毒E1B蛋白實(shí)現(xiàn)。Onyx-015在E1B基因有一個(gè)突變，破壞p53失活能力。E1B突變使病毒在缺失p53功能的細(xì)胞中復(fù)制，但防止在有野生型p53的細(xì)胞中復(fù)制。由于p53功能在50％以上的所有腫瘤包括大約70％的一些癌癥如結(jié)腸直腸癌中喪失(見例如Beroud &Soussi，1998；Colman et al.，2000；Hickman et al.，2002)，因此Onyx-15理論上可用于治療一半以上的所有腫瘤。不幸地，近來(lái)產(chǎn)生關(guān)于Onyx-015的特異性的爭(zhēng)論(見Goodrum & Ornelles，1998；Rothmann et al.，1998；Dix et al.，2001；Ries & Korn，2002)。一些研究表明Onyx-015甚至可以在具有野生型p53功能的腫瘤細(xì)胞中復(fù)制(Goodrum & Ornelles，1998；Rothmann et al.，1998)。同時(shí)這種顯然的差別可通過(guò)這樣的事實(shí)和諧，即具有正常p53功能的大多數(shù)腫瘤細(xì)胞在p53途徑的其它部分具有缺陷，但是存在這種載體廣泛應(yīng)用的限制。雖然如此，仍需要一種策略以用于保持野生型p53功能的腫瘤細(xì)胞中。
將腺病毒載體在腫瘤細(xì)胞中靶定復(fù)制的另一種策略包括應(yīng)用腫瘤和/或組織特異性啟動(dòng)子以控制病毒復(fù)制需要的基因的表達(dá)(參見Haviv& Curiel，2001)。一個(gè)典型的實(shí)例是CN706(Calydon，Inc.，Sunnyvale，California，United States of America)，其中前列腺特異性抗原(PSA)基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)腺病毒E1A基因的表達(dá)。見Henderson和Schuur的美國(guó)專利5,871,726。在另一種病毒CV787中也見到特異性，其中大鼠前列腺特異性probasin啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)E1A的表達(dá)，同時(shí)PSA啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)E1B的表達(dá)(Yu et al.，1999)。這種策略的另一種嘗試包括應(yīng)用MUC1啟動(dòng)子以控制E1A的表達(dá)(Kurihara et al.，2000)。這些類型的策略的關(guān)鍵是啟動(dòng)子的特異性。不幸地，僅鑒別了極少量的呈現(xiàn)足夠特異性的啟動(dòng)子用于抗腫瘤策略中。
因此，本領(lǐng)域需要有效的治療方法以特異性靶定并殺死患者體內(nèi)腫瘤細(xì)胞。本發(fā)明解決了本領(lǐng)域中的這種及其它需要。
概述本發(fā)明提供了一種腺病毒載體，其包含在轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件(TRE)的轉(zhuǎn)錄控制下的腺病毒基因，所述TRE包含一個(gè)最小啟動(dòng)子(minimalpromoter)和一個(gè)低氧應(yīng)答元件(HRE)。在一個(gè)實(shí)施方案中，腺病毒基因選自E1A基因，E1B基因，E2A基因，E2B基因，和E4基因。在一個(gè)實(shí)施方案中，腺病毒載體包含在轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件(TRE)的轉(zhuǎn)錄控制下的第二種腺病毒基因。在一個(gè)實(shí)施方案中，最小啟動(dòng)子選自巨細(xì)胞病毒(CMV)最小啟動(dòng)子，人β-肌動(dòng)蛋白最小啟動(dòng)子，人EF2最小啟動(dòng)子，及腺病毒E1B最小啟動(dòng)子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，CMV最小啟動(dòng)子包含SEQ ID NO1。在一個(gè)實(shí)施方案中，低氧應(yīng)答元件(HRE)衍生自人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)基因。在另一個(gè)實(shí)施方案中，HRE包含SEQ ID NO2的5個(gè)串聯(lián)拷貝。在一個(gè)實(shí)施方案中，腺病毒載體進(jìn)一步包含一個(gè)轉(zhuǎn)基因。在一個(gè)實(shí)例中，轉(zhuǎn)基因包含第二種腺病毒基因。在另一個(gè)實(shí)例中，轉(zhuǎn)基因包含編碼免疫刺激分子的核酸。在又一個(gè)實(shí)例中，轉(zhuǎn)基因包含一個(gè)自殺基因。
本發(fā)明還提供了一種包含在TRE的轉(zhuǎn)錄控制下的腺病毒基因的組合物，其中TRE包含一個(gè)最小啟動(dòng)子和一個(gè)HRE。在一個(gè)實(shí)例中，所述組合物進(jìn)一步包含一種藥物可接受的載體。
本發(fā)明還提供了一種抑制腫瘤生長(zhǎng)的方法，所述方法包括將腫瘤中的低氧細(xì)胞與腺病毒載體接觸，從而該載體進(jìn)入細(xì)胞中并抑制腫瘤生長(zhǎng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述接觸是腫瘤內(nèi)給予載體的結(jié)果。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述接觸是靜脈內(nèi)給予載體的結(jié)果。
本發(fā)明還提供了一種宿主細(xì)胞，其包含在TRE的轉(zhuǎn)錄控制下的腺病毒基因，所述TRE包含一個(gè)最小啟動(dòng)子和一個(gè)HRE。
本發(fā)明還提供了一種增殖特異于低氧細(xì)胞的腺病毒的方法，所述方法包括將低氧細(xì)胞與腺病毒載體接觸，從而該腺病毒被增殖為至少104個(gè)病毒顆粒/細(xì)胞的效價(jià)。
本發(fā)明還提供了一種賦予靶細(xì)胞選擇性胞毒性的方法，所述方法包括將允許HRE發(fā)揮功能的細(xì)胞與包含HRE的腺病毒載體接觸，從而該腺病毒載體進(jìn)入細(xì)胞中。
本發(fā)明還提供了一種抑制腫瘤生長(zhǎng)的方法，所述方法包括(a)將腫瘤內(nèi)低氧細(xì)胞與第一種腺病毒載體接觸，從而第一種腺病毒載體進(jìn)入細(xì)胞中；(b)將低氧細(xì)胞與一種復(fù)制缺陷型腺病毒載體接觸，從而復(fù)制缺陷型腺病毒載體進(jìn)入細(xì)胞中。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一種腺病毒載體包含在TRE的轉(zhuǎn)錄控制下的腺病毒基因，所述TRE包含一個(gè)HRE。在另一個(gè)實(shí)施方案中，復(fù)制缺陷型腺病毒載體包含在組成型啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制下的第二種基因。在另一個(gè)實(shí)施方案中，復(fù)制缺陷型載體包含在TRE的轉(zhuǎn)錄控制下的第二種基因，所述TRE包含一個(gè)HRE。在一個(gè)實(shí)例中，第二種基因是腺病毒基因，例如早期基因。在另一個(gè)實(shí)施例中，第二種基因是自殺基因，包括但非限于TNF-α，Trail，Bax，HSV-tk，胞嘧啶脫氨酶，p450，白喉毒素，可溶的FLT1基因，及胞外FLK-1基因。在又一個(gè)實(shí)例中，第二種基因是免疫刺激分子，包括但非限于IL-2和IL-12。
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供了一種治療方法，該方法利用腺病毒載體在表達(dá)低氧可誘導(dǎo)因子1(HIF-1)的靶組織中條件復(fù)制。這個(gè)及其它目的通過(guò)本發(fā)明全部或部分實(shí)現(xiàn)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員在學(xué)習(xí)了本發(fā)明的如下描述及非限制性實(shí)施例之后將顯而易見本發(fā)明的上述目的，其它目的及優(yōu)勢(shì)。
附圖簡(jiǎn)述

圖1是質(zhì)粒載體HRP-EGFP的示意圖。這個(gè)載體用于產(chǎn)生穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞系，其在低氧條件下表達(dá)EGFP。其含有在低氧應(yīng)答啟動(dòng)子控制下的EGFP基因。
圖2是條件復(fù)制型腺病毒載體AdHRP-E1A-dsRed2的示意圖。這個(gè)載體具有在HRP啟動(dòng)子控制下的E1A基因并組成型表達(dá)一種紅色熒光蛋白報(bào)道基因dsRed2。
圖3是示例的條件復(fù)制型腺病毒載體AdHRP-E4-dsRed2的示意圖，其中僅E4基因在HRP啟動(dòng)子的控制下。這個(gè)載體還組成型表達(dá)一種紅色熒光蛋白報(bào)道基因。
圖4是示例的條件復(fù)制型腺病毒載體AdHRP-E1AE4-dsRed2的示意圖，其中E1A和E4基因均在HRP啟動(dòng)子的控制下。這個(gè)載體還組成型表達(dá)一個(gè)紅色熒光蛋白報(bào)道基因。
圖5是腺病毒載體AdCMV-EGFP和AdCMV-dsRed2的示意圖。每個(gè)載體均是復(fù)制缺陷型腺病毒載體，具有在組成型CMV啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制下的一個(gè)熒光標(biāo)記。這些載體由于在E3多肽編碼序列中存在缺失(用框ΔE3標(biāo)示)及另外存在CMV標(biāo)記構(gòu)建體(用ΔE1標(biāo)示)中斷E1多肽編碼序列而是復(fù)制缺陷的。
圖6A和6B示出用本發(fā)明的腺病毒載體處理小鼠中異種移植腫瘤模型的結(jié)果。
圖6A描述了腺病毒載體AdHRPE1A-TNF-α。這個(gè)載體具有與HRP可操縱連接的腺病毒E1A基因。另外，其具有與組成型CMV啟動(dòng)子可操縱連接的腫瘤壞死因子-α(TNF-α)基因。
圖6B是示出腫瘤內(nèi)注射Ad-HRPE1A-TNF-α抑制這個(gè)異種移植模型中腫瘤生長(zhǎng)的能力的圖表。攜帶腫瘤的小鼠用復(fù)制缺陷型對(duì)照載體(AdCMV-dsRed2，見圖5，實(shí)心方形所示)或AdHRPE1A-TNF-α(實(shí)心三角形所示)注射，并在指定時(shí)間點(diǎn)測(cè)定腫瘤體積及與第0天腫瘤體積對(duì)比(在第0天體積設(shè)定為1.0)。
詳細(xì)描述本發(fā)明一般性涉及在表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子低氧可誘導(dǎo)因子1(HIF-1)的細(xì)胞中增殖條件復(fù)制型腺病毒載體的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括用條件復(fù)制型腺病毒載體感染低氧細(xì)胞，例如腫瘤內(nèi)低氧細(xì)胞，由此腺病毒載體在低氧細(xì)胞中復(fù)制，殺死該細(xì)胞。
I.總則低氧，低于正常組織氧壓的一種狀態(tài)，參與許多人體疾病，包括癌癥。其主要參與腫瘤生長(zhǎng)和發(fā)展。特別地，發(fā)現(xiàn)低氧在促進(jìn)突變形成和選擇惡性腫瘤細(xì)胞中起關(guān)鍵作用。其還參與促進(jìn)腫瘤血管發(fā)生。
細(xì)胞對(duì)低氧的應(yīng)答主要通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子低氧可誘導(dǎo)因子1(HIF-1)介導(dǎo)。在低氧條件下，HIF-1結(jié)合稱為低氧應(yīng)答元件(HRE)的序列，該序列存在于某些低氧應(yīng)答基因的啟動(dòng)子中。HIF-1與含有HRE的啟動(dòng)子的結(jié)合導(dǎo)致正調(diào)節(jié)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。
HIF-1的活性形式是一種異源二聚體，由調(diào)節(jié)成分(HIF-1α)和組成型表達(dá)的芳基烴受體核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ARNT，也稱為HIF-1β)組成。HIF-1介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)是通過(guò)依賴于細(xì)胞的氧狀態(tài)的HIF-1α的翻譯后修飾而發(fā)生的。在正常含氧條件下，HIF-1α通過(guò)脯氨?；u化酶羥化，使用分子氧作為氧供體。這種羥化使得通常存在于細(xì)胞內(nèi)的von Hippel-Lindau蛋白(pVHL)結(jié)合HIF-1α，形成pVHL/HIF-1α復(fù)合物。將pVHL/HIF-1α復(fù)合物進(jìn)行遍在蛋白化并在蛋白酶體中降解。另一方面，在低氧條件下，脯氨?；u化酶活性由于相對(duì)缺乏氧供體而更低。在這些條件下，HIF-1α不被羥化，VHL/HIF-1α復(fù)合物不再形成，而且細(xì)胞內(nèi)HIF-1α穩(wěn)態(tài)水平提高。HIF-1α因此可通過(guò)與HIF-1β復(fù)合而形成活性HIF-1，這樣導(dǎo)致用含有HRE的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄這些基因。
HIF-1結(jié)合導(dǎo)致一些基因的表達(dá)增加，包括轉(zhuǎn)錄因子，生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子，以及參與氧轉(zhuǎn)運(yùn)和鐵代謝，糖酵解和葡萄糖吸收，及應(yīng)激應(yīng)答的基因。另外，低氧調(diào)節(jié)與血管發(fā)生相關(guān)的細(xì)胞增殖和遷移。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)基因，其產(chǎn)物是血管發(fā)生中關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子，在其啟動(dòng)子中含有HRE。HIF-1正調(diào)節(jié)VEGF和FLT-1，一種VEGF受體的表達(dá)。由于細(xì)胞的高生長(zhǎng)速度形成實(shí)體瘤，因此持續(xù)需要新血管以給迅速生長(zhǎng)的腫瘤細(xì)胞提供足夠的養(yǎng)分，包括氧。這些新形成的血管通常特征在于畸形，由此非常容易發(fā)現(xiàn)其中各個(gè)細(xì)胞不能充分氧化的腫瘤部位。事實(shí)上，數(shù)據(jù)提示每個(gè)大于1mm3的腫瘤均有低氧的局部區(qū)域(Dachs &Tozer，2000)。
II.定義以下術(shù)語(yǔ)是為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，陳述如下定義便于解釋本發(fā)明。
II.A.核酸本發(fā)明中應(yīng)用的核酸包括但非限于SEQ ID NO1和2任一項(xiàng)的分離的核酸分子；與SEQ ID NO1和2任一項(xiàng)基本相同的序列；其保守的變體，亞序列及其延長(zhǎng)的序列，互補(bǔ)的DNA分子，及相應(yīng)的RNA分子。本發(fā)明還涵蓋了包含所揭示的核酸序列的基因，cDNA，嵌合基因和載體。
術(shù)語(yǔ)“核酸分子”是指脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其單鏈或雙鏈形式的聚合物。除非特別限制，該術(shù)語(yǔ)涵蓋了含有已知天然核苷酸的類似物的核酸，其具有與參考的天然核酸相似的性質(zhì)。除非特別指出，—特定的核苷酸序列也暗含了其保守修飾的變體(例如簡(jiǎn)并密碼子取代)，其互補(bǔ)序列，亞序列，延長(zhǎng)的序列，以及明確指定的序列。術(shù)語(yǔ)“核酸分子”或“核苷酸序列”也可用于代替“基因”，“cDNA”或“mRNA”。核酸可以衍生自任何來(lái)源，包括任何生物體。
本發(fā)明針對(duì)核酸分子所用術(shù)語(yǔ)“分離的”是指核酸分子遠(yuǎn)離其天然環(huán)境而存在并且不是天然產(chǎn)物。分離的DNA分子可以純化形式存在或者在非天然環(huán)境如轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞中存在。
本發(fā)明針對(duì)兩個(gè)核苷酸序列所用術(shù)語(yǔ)“基本相同”是指兩或多個(gè)序列或亞序列當(dāng)對(duì)比和排列最大相應(yīng)程度時(shí)，在一個(gè)實(shí)例中有至少60％相同性，在另一個(gè)實(shí)施例中有大約70％相同性，在另一個(gè)實(shí)施例中有大約80％相同性，在另一個(gè)實(shí)施例中有大約90-95％相同性，及在另一個(gè)實(shí)例中有大約99％核苷酸相同性，使用如下序列對(duì)比算法之一測(cè)定(在下文標(biāo)題為“核苷酸及氨基酸序列對(duì)比”段落描述)或者通過(guò)目測(cè)測(cè)定。在一個(gè)實(shí)例中，在至少50個(gè)殘基的核苷酸序列中存在基本相同性，在另一個(gè)實(shí)例中至少大約100殘基的核苷酸序列中存在基本相同性，在另一個(gè)實(shí)例中至少大約150個(gè)殘基的核苷酸序列中存在基本相同性，在另一個(gè)實(shí)例中包含完整的編碼序列的核苷酸序列中存在基本相同性。一方面，多態(tài)序列可以是基本相同的序列。術(shù)語(yǔ)“多態(tài)”是指一個(gè)群體中存在兩或多個(gè)遺傳確定的可選序列或等位基因。等位基因差異可以是小如一個(gè)堿基對(duì)。
兩個(gè)核苷酸序列基本相同的另一個(gè)指征是這兩個(gè)分子在嚴(yán)格條件下相互特異性或充分雜交。關(guān)于核酸雜交，對(duì)比的兩個(gè)核酸序列可以稱為“探針”或“靶”?！疤结槨笔侵竻⒖己怂岱肿樱鞍小笔侵笢y(cè)試核酸分子，通常在核酸分子的異源群體中發(fā)現(xiàn)?！鞍行蛄小迸c“測(cè)試序列”同義。
用于雜交研究或分析的核苷酸序列例如包括探針序列，其在一個(gè)實(shí)施方案中互補(bǔ)或模擬本發(fā)明的核酸分子的至少大約14-40個(gè)核苷酸序列。在一個(gè)實(shí)例中，探針包含14-20個(gè)核苷酸，當(dāng)需要時(shí)可以更長(zhǎng)，如30，40，50，60，100，200，300或500個(gè)核苷酸或者直至SEQ ID NO1和2任一項(xiàng)所示的全長(zhǎng)序列。這種片段可易于通過(guò)例如通過(guò)化學(xué)合成方法而直接合成片段，通過(guò)應(yīng)用核酸擴(kuò)增技術(shù)或者通過(guò)將選擇的序列導(dǎo)入重組載體中以重組產(chǎn)生而制備。短語(yǔ)“特異性雜交”是指當(dāng)序列存在于復(fù)合核酸混合物(例如總細(xì)胞DNA或RNA)中時(shí)，在嚴(yán)格條件下一個(gè)分子只與一個(gè)特定的核苷酸序列結(jié)合，形成雙鏈或雜交。短語(yǔ)“充分雜交”是指探針核酸分子與靶核酸分子之間的互補(bǔ)雜交，并包含可以通過(guò)降低雜交介質(zhì)的嚴(yán)格性而調(diào)和最小的錯(cuò)配以達(dá)到希望的雜交。
關(guān)于核酸雜交實(shí)驗(yàn)如Southern和Northern印跡分析的“嚴(yán)格雜交條件”和“嚴(yán)格雜交洗滌條件”是序列和環(huán)境依賴性的。較長(zhǎng)的序列在較高的溫度特異性雜交。關(guān)于核酸雜交的詳盡指導(dǎo)見于Tijssen，1993所述。通常地，選擇的高嚴(yán)格雜交和洗滌條件是針對(duì)特異的序列在指定離子強(qiáng)度和pH下采用低于熱熔點(diǎn)(Tm)大約5℃的條件。典型地，在“嚴(yán)格條件下”，探針與其靶序列特異性雜交，但與其它序列則否。
Tm是50％的靶序列與極佳匹配的探針雜交的溫度(在限定的離子強(qiáng)度和pH)。選擇的非常嚴(yán)格的條件與特定探針的Tm相當(dāng)。針對(duì)具有大約100個(gè)以上互補(bǔ)殘基的互補(bǔ)核酸的Southern或Northern印跡分析的嚴(yán)格雜交條件例如是在42℃在具有1mg肝素的50％甲酰胺中雜交過(guò)夜。高嚴(yán)格洗滌條件例如是在65℃在0.1×SSC，SM NaCl中洗滌15分鐘。嚴(yán)格洗滌條件例如是在65℃在0.2×SSC緩沖液中洗滌15分鐘(見Sambrook and Russell，2001針對(duì)SSC緩沖液所述)。通常地，高度嚴(yán)格洗滌之前進(jìn)行低嚴(yán)格洗滌以除去背景探針信號(hào)。針對(duì)大約100個(gè)核苷酸以上的雙鏈體的中等嚴(yán)格洗滌條件例如是在45℃在1×SSC中洗滌15分鐘。針對(duì)大約100個(gè)核苷酸以上的雙鏈體的低嚴(yán)格洗滌條件例如是在40℃在4-6×SSC中洗滌15分鐘。就短探針而言(例如大約10-50個(gè)核苷酸)，嚴(yán)格條件典型地包括低于大約1M Na+離子的鹽濃度，典型地為大約0.01-1M Na+離子濃度(或其它鹽)，pH為7.0-8.3，溫度典型地為至少大約30℃。嚴(yán)格條件也通過(guò)加入去穩(wěn)定劑如甲酰胺而實(shí)現(xiàn)。一般而言，與在特定的雜交分析中針對(duì)不相關(guān)的探針觀測(cè)到的信噪比為2倍(或更高)表明特異性雜交。
以下是可用于克隆與本發(fā)明的參考核苷酸序列基本相同的同源核苷酸序列的雜交和洗滌的實(shí)例在一個(gè)實(shí)例中，探針核苷酸序列與靶核苷酸序列在50℃在7％十二烷基硫酸鈉(SDS)，0.5M NaPO4，1mmEDTA中雜交，隨后在50℃在2×SSC，0.1％SDS中洗滌；在另一個(gè)實(shí)例中，探針與靶序列在50℃在7％十二烷基硫酸鈉(SDS)，0.5M NaPO4，1mm EDTA中雜交，隨后在50℃在1×SSC，0.1％SDS中洗滌；在另一個(gè)實(shí)例中，探針和靶序列在50℃在7％十二烷基硫酸鈉(SDS)，0.5MNaPO4，1mm EDTA中洗滌，隨后在50℃在0.5×SSC，0.1％SDS中洗滌；在另一個(gè)實(shí)例中，探針和靶序列在50℃在7％十二烷基硫酸鈉(SDS)，0.5M NaPO4，1mm EDTA中雜交，隨后在50℃在0.1×SSC，0.1％SDS中洗滌；在另一個(gè)實(shí)例中，探針和靶序列在50℃在7％十二烷基硫酸鈉(SDS)，0.5M NaPO4，1mm EDTA中雜交，隨后在65℃在0.1×SSC，0.1％SDS中洗滌。
兩個(gè)核酸序列基本相同的另一個(gè)指征是由該核酸編碼的蛋白質(zhì)是基本相同的，共享全面的三維結(jié)構(gòu)，是生物學(xué)功能等價(jià)物或者是免疫學(xué)交叉反應(yīng)的。這些術(shù)語(yǔ)在下文標(biāo)題為“多肽”的段落中進(jìn)一步解釋。如果相應(yīng)的蛋白質(zhì)是基本相同的，則在嚴(yán)格條件下彼此不雜交的核酸分子仍是基本相同的。這可以發(fā)生在例如當(dāng)兩個(gè)核苷酸序列由遺傳密碼所允許的顯著簡(jiǎn)并的時(shí)候。
術(shù)語(yǔ)“保守取代變體”是指具有簡(jiǎn)并密碼子取代的核酸序列，其中一或多個(gè)選擇的(或全部的)密碼子的第三個(gè)位置由混和的堿基和/或脫氧肌苷殘基取代(Ohtsuka et al.，1985；Batzer et al.，1991；Rossolini et al1994)。
術(shù)語(yǔ)“亞序列”是指核酸的一個(gè)序列，其包含較長(zhǎng)的核酸序列的一部分。亞序列例如是上述探針，或者引物。術(shù)語(yǔ)“引物”是指一個(gè)鄰近序列，在一個(gè)實(shí)例中其包含選擇的核酸分子的大約8或多個(gè)脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，在另一個(gè)實(shí)例中其包含10-20個(gè)核苷酸，在另一個(gè)實(shí)例中其包含20-30個(gè)核苷酸。本發(fā)明的引物涵蓋了足夠長(zhǎng)的寡核苷酸及合適的序列，以起始本發(fā)明的核酸分子的聚合。
術(shù)語(yǔ)“延長(zhǎng)的序列”是指加入核苷酸(或其它類似分子)摻入核酸中。例如，聚合酶(例如DNA聚合酶)可在核酸分子的3’末端加入序列。另外，核苷酸序列可以與其它DNA序列組合，如啟動(dòng)子，啟動(dòng)子區(qū)域，增強(qiáng)子，聚腺苷酸化信號(hào)，內(nèi)含子序列，另外的限制酶位點(diǎn)，多克隆位點(diǎn)，及其它編碼片段。
本發(fā)明所用術(shù)語(yǔ)“互補(bǔ)序列”是指兩個(gè)核苷酸序列，其包含能彼此配對(duì)在堿基對(duì)之間形成氫鍵的反平行核苷酸序列。如本發(fā)明所用，術(shù)語(yǔ)“互補(bǔ)序列”是指基本互補(bǔ)的核苷酸序列，這可以通過(guò)上述相同核苷酸對(duì)比評(píng)價(jià)，或者限定為在相對(duì)嚴(yán)格條件下(如本文所述)能與所研究的核酸片段雜交?；パa(bǔ)核酸片段的一個(gè)特殊實(shí)例是反義寡核苷酸。
術(shù)語(yǔ)“基因”泛指與生物學(xué)功能相關(guān)的任何DNA片段?；蚝w了這樣的序列，包括但非限于編碼序列，啟動(dòng)子區(qū)域，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列，是調(diào)節(jié)蛋白的特異性識(shí)別序列的非表達(dá)的DNA片段，有助于基因表達(dá)的非表達(dá)的DNA片段，設(shè)計(jì)為具有希望參數(shù)的DNA片段，或其組合?；蚩赏ㄟ^(guò)多種方法獲得，包括從生物樣品中克隆，基于已知或推定的序列信息合成，及重組衍生現(xiàn)有序列。
術(shù)語(yǔ)“基因表達(dá)”一般是指從DNA序列中產(chǎn)生生物學(xué)活性多肽的細(xì)胞過(guò)程。
本發(fā)明也可以應(yīng)用嵌合基因。本文所用術(shù)語(yǔ)“嵌合基因”是指可操縱地與編碼治療性多肽的核苷酸序列連接的啟動(dòng)子區(qū)域；產(chǎn)生反義RNA分子的核苷酸序列；具有三級(jí)結(jié)構(gòu)如發(fā)夾結(jié)構(gòu)的RNA分子；或者雙鏈的RNA分子。
本文所用術(shù)語(yǔ)“可操縱地連接”是指一個(gè)啟動(dòng)子區(qū)域與一個(gè)核苷酸序列以這種方式連接，由此核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄由該啟動(dòng)子區(qū)域控制和調(diào)節(jié)。相似地，稱核苷酸序列在其可操縱地連接的啟動(dòng)子的“轉(zhuǎn)錄控制”下。本領(lǐng)域已知將啟動(dòng)子區(qū)域與核苷酸序列可操縱地連接的技術(shù)。
本文所用術(shù)語(yǔ)“異源基因”，“異源DNA序列”，“異源核苷酸序列”，“外源核酸分子”，或“外源DNA片段”均是指源自與指定的宿主細(xì)胞無(wú)關(guān)的來(lái)源，或者如果源自相同來(lái)源，則是其原始形式的修飾形式。因此，宿主細(xì)胞中的異源基因包括這樣的基因，其對(duì)特殊的宿主細(xì)胞是內(nèi)源的但已經(jīng)修飾，例如通過(guò)誘變或通過(guò)分離自天然轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列而修飾。這個(gè)術(shù)語(yǔ)還包括天然發(fā)生的核苷酸序列的非天然發(fā)生的多個(gè)拷貝。因此，這個(gè)術(shù)語(yǔ)是指對(duì)細(xì)胞是外源或異源的DNA片段，或者與細(xì)胞同源但在宿主細(xì)胞核酸內(nèi)的一個(gè)位置未發(fā)現(xiàn)所述元件。
本文所用術(shù)語(yǔ)“構(gòu)建體”是指能指導(dǎo)特殊的核苷酸序列在合適的宿主細(xì)胞中表達(dá)的DNA序列，包含與感興趣的核苷酸序列可操縱地連接的啟動(dòng)子，其與終止信號(hào)可操縱地連接。這個(gè)術(shù)語(yǔ)還典型地包含核苷酸序列正確翻譯所需的序列。包含感興趣的核苷酸序列的構(gòu)建體可以是嵌合的。構(gòu)建體還可以是天然發(fā)生的但已經(jīng)以重組形式獲得用于異源表達(dá)。
術(shù)語(yǔ)“啟動(dòng)子”或“啟動(dòng)子區(qū)域”均是指基因內(nèi)的一個(gè)核苷酸序列，其位于同一基因的5’至編碼序列并起指導(dǎo)編碼序列轉(zhuǎn)錄的作用。啟動(dòng)子區(qū)域包含一個(gè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，并可以另外包括一或多個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法應(yīng)用一種低氧可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。
“最小啟動(dòng)子”是具有使得基本水平轉(zhuǎn)錄發(fā)生的最小元件的核苷酸序列。同樣，最小啟動(dòng)子不是完整的啟動(dòng)子而是在實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中能指導(dǎo)一種報(bào)道構(gòu)建體基本水平轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子的亞序列。最小啟動(dòng)子包括但非限于CMV最小啟動(dòng)子，HSV-tk最小啟動(dòng)子，猿猴病毒40(SV40)最小啟動(dòng)子，人b-肌動(dòng)蛋白最小啟動(dòng)子，人EF2最小啟動(dòng)子，腺病毒E1B最小啟動(dòng)子，熱激蛋白(hsp)70最小啟動(dòng)子。最小啟動(dòng)子通常用一或多個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件增大以影響可操縱地連接的基因的轉(zhuǎn)錄。例如，細(xì)胞類型特異性或組織特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件可加入最小啟動(dòng)子中以產(chǎn)生指導(dǎo)可操縱地連接的核苷酸序列以細(xì)胞類型特異性或組織特異性方式轉(zhuǎn)錄的重組啟動(dòng)子。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，低氧可誘導(dǎo)啟動(dòng)子包含與人VEGF啟動(dòng)子的HRE的5個(gè)串聯(lián)拷貝連接的CMV最小啟動(dòng)子。
不同的啟動(dòng)子具有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件的不同組合?；蛟诩?xì)胞中表達(dá)與否依賴于組成基因的啟動(dòng)子的特殊轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件與細(xì)胞核內(nèi)存在的不同轉(zhuǎn)錄因子的組合。同樣，啟動(dòng)子根據(jù)其在體內(nèi)或體外的功能活性而通常被分為“組成型”，“組織特異性”，“細(xì)胞類型特異性”，或“可誘導(dǎo)”啟動(dòng)子。例如，組成型啟動(dòng)子是能指導(dǎo)基因在多種細(xì)胞類型中轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。組成型啟動(dòng)子例如包括編碼某些組成型或“管家”功能的如下基因的啟動(dòng)子次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HPRT)，二氫葉酸還原酶(DHFR；(Scharfmann et al.，1991)，腺苷脫氨酶，磷酸甘油酸激酶(PGK)，丙酮酸激酶，磷酸甘油酸變位酶，β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子(見例如Williams et al.，1993)，及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它組成型啟動(dòng)子。另一方面，“組織特異性”或“細(xì)胞類型特異性”啟動(dòng)子在一些組織和細(xì)胞類型中指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄，但在其它組織和細(xì)胞中是失活的。組織特異性啟動(dòng)子例如包括上述PSA啟動(dòng)子(Yu et al.，1999；Lee et al.，2000)，probasin啟動(dòng)子(Greenberg etal.，1994；Yu et al.，1999)，及MUC1啟動(dòng)子(Kurihara et al.，2000)，以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它組織特異性和細(xì)胞類型特異性啟動(dòng)子。
“可誘導(dǎo)”啟動(dòng)子是與其可操縱連接的基因的轉(zhuǎn)錄水平基于某些刺激的存在而變化的啟動(dòng)子。在可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子控制下的基因只在存在誘導(dǎo)劑的情況下才表達(dá)或更大程度表達(dá)(例如在金屬硫蛋白啟動(dòng)子控制下的轉(zhuǎn)錄在存在某些金屬離子的情況下明顯增加)?？烧T導(dǎo)的啟動(dòng)子包括轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件(TRE)，當(dāng)其誘導(dǎo)因子被結(jié)合時(shí)刺激轉(zhuǎn)錄。例如，有血清因子，類固醇激素，視黃酸和環(huán)AMP的TRE。可以選擇含有特殊TRE的啟動(dòng)子以獲得可誘導(dǎo)應(yīng)答，并且在一些情況中，TRE自身可以附著于不同的啟動(dòng)子，從而賦予重組基因可誘導(dǎo)性。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，腺病毒載體包含賦予腺病毒基因HIF-1介導(dǎo)的可誘導(dǎo)性的低氧可誘導(dǎo)啟動(dòng)子。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“低氧可誘導(dǎo)啟動(dòng)子”是指含有低氧應(yīng)答元件的啟動(dòng)子，由此如果存在活性形式的HIF-1，則其結(jié)合并導(dǎo)致可操縱地結(jié)合的核苷酸序列在高于基本水平之上的轉(zhuǎn)錄。同樣，低氧可誘導(dǎo)啟動(dòng)子是在正常含氧條件下，由于沒(méi)有活性HIF-1導(dǎo)致可操縱連接的核苷酸序列在基本水平或之下轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。
另外，如本發(fā)明所用，細(xì)胞中存在活性HIF-1不僅包括其中細(xì)胞缺氧的條件，而且還包括其中聚集活性形式HIF-1并可結(jié)合HRE的任何其它條件。這種其它條件包括其中不發(fā)生HIF-1α與pVHL之間相互作用并因此不發(fā)生HIF-1α遍在蛋白化和降解的條件。例如，活性HIF-1可以作為脯氨?；u化酶多肽的活性修飾(例如突變)的結(jié)果而形成，由此不發(fā)生HIF-1α的羥化?；蛘撸谌鄙賞VHL的細(xì)胞中，活性HIF-1聚集(見例如Clifford & Maher，2001)。“正常含氧條件”或“含氧正?！笔侵刚５难躏柡蜖顟B(tài)，其中HIF-1α多肽通過(guò)上述脯氨酰基羥化酶而羥化，并因此細(xì)胞不聚集活性形式的HIF-1。
當(dāng)應(yīng)用啟動(dòng)子時(shí)，術(shù)語(yǔ)“連接”是指啟動(dòng)子元件的物理性接近，由此它們一起發(fā)揮指導(dǎo)可操縱連接的核苷酸序列轉(zhuǎn)錄的功能。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，最小啟動(dòng)子與HRE連接，導(dǎo)致腺病毒基因在含有活性HIF-1轉(zhuǎn)錄因子的細(xì)胞中低氧可誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列”或“轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件”均是指啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)的一個(gè)核苷酸序列，其使得對(duì)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子應(yīng)答。應(yīng)答可涵蓋轉(zhuǎn)錄量的減少或增加，并且是通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子與包含轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件的DNA分子的結(jié)合而介導(dǎo)的。在一個(gè)實(shí)例中，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件是HRE。
術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)錄因子”一般是指通過(guò)與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件及進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的細(xì)胞成分包括RNA聚合酶，轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子(TAF)，染色質(zhì)重塑蛋白(chromatin-remodeling protein)相互作用而調(diào)節(jié)基因表達(dá)的一種蛋白質(zhì)，及影響基因轉(zhuǎn)錄的任何其它相關(guān)蛋白。
術(shù)語(yǔ)“報(bào)道基因”或“標(biāo)記基因”或“可選擇的標(biāo)記”均是指編碼易于觀測(cè)和/或定量的產(chǎn)物的異源基因。報(bào)道基因是異源的，其源自與指定的宿主細(xì)胞無(wú)關(guān)的來(lái)源，或者如果源自同樣的來(lái)源則是其原始形式的修飾形式。可操縱地與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)域連接的可檢測(cè)的報(bào)道基因的非限制性實(shí)例可見于Alam & Cook(1990)Anal Biochem 188245-254及PCT國(guó)際公開文本No.WO 97/47763所述。進(jìn)行轉(zhuǎn)錄分析的報(bào)道基因例如包括lacZ基因(見例如Rose & Botstein(1983)Meth Enzymol 101167-180)，綠色熒光蛋白(GFP；Cubitt et al.，1995)，熒光素酶和氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)。產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法的報(bào)道基因包括但非限于抗生素抗性基因，例如抗生素抗性基因賦予新霉素抗性?？梢允褂萌魏魏线m的報(bào)道和檢測(cè)方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員意識(shí)到對(duì)本發(fā)明無(wú)特殊選擇或限制。
報(bào)道基因的量可通過(guò)在性質(zhì)上或數(shù)量上確定報(bào)道基因產(chǎn)物的存在或活性的任何方法測(cè)定。將通過(guò)每個(gè)測(cè)試啟動(dòng)子區(qū)域片段指導(dǎo)的報(bào)道基因表達(dá)的量與在沒(méi)有啟動(dòng)子區(qū)域片段的情況中包含報(bào)道基因的對(duì)照構(gòu)建體對(duì)比報(bào)道基因表達(dá)的量。當(dāng)與對(duì)照構(gòu)建體相比，在測(cè)試構(gòu)建體中報(bào)道基因表達(dá)的量顯著增加時(shí)，則鑒別一個(gè)啟動(dòng)子區(qū)域片段具有啟動(dòng)子活性。本文所用術(shù)語(yǔ)“顯著增加”是指在可測(cè)定的性質(zhì)中數(shù)量上的改變，其高于測(cè)定技術(shù)中固有的誤差幅度，在一個(gè)實(shí)例中與對(duì)照測(cè)定相比增加大約2倍或更高，在另一個(gè)實(shí)例中，增加大約5倍或更高，在另一個(gè)實(shí)例中增加大約10倍或更高。
本發(fā)明進(jìn)一步包括包含所揭示的核苷酸序列的腺病毒載體。本文所用術(shù)語(yǔ)“載體”是指具有序列的DNA分子，其使得那些序列移至一種相容的宿主細(xì)胞中。載體還包括核苷酸序列以允許與載體內(nèi)的核苷酸序列連接，其中這種核苷酸序列在相容的宿主細(xì)胞中也復(fù)制。載體還可以介導(dǎo)治療性多肽的重組生產(chǎn)，如下文進(jìn)一步描述。
本發(fā)明的核酸可以被克隆，合成，重組改變，誘變或其組合。本領(lǐng)域已知用于分離核酸的標(biāo)準(zhǔn)重組DNA和分子克隆技術(shù)。例如，非限制的方法例如Silhavy et al.，1984；Ausubel et al.，1992；Glover & Hames，1995和Sambrook & Russell，200所述。產(chǎn)生堿基對(duì)改變，缺失或少量插入的位點(diǎn)特異性誘變方法也為本領(lǐng)域所已知，如已有的出版物所述(見例如Adelman et al.，1983；Sambrook & Russell，2001)。
II.B.多肽本發(fā)明應(yīng)用的多肽包括但非限于如下所述治療性多肽；與如下所述治療肽基本相同的多肽；如下所述治療性多肽的多肽片段(在一個(gè)實(shí)施方案中是生物學(xué)功能片段)；包含如下所述治療性多肽，其生物學(xué)功能類似物的融合蛋白；及與特異性識(shí)別如下所述治療性多肽的抗體交叉反應(yīng)的多肽。本發(fā)明應(yīng)用的多肽包括但非限于分離的多肽，多肽片段，包含所揭示的氨基酸序列的融合蛋白，生物學(xué)功能類似物，及與特異性識(shí)別所揭示的多肽的抗體交叉反應(yīng)的多肽。
關(guān)于多肽所用術(shù)語(yǔ)“分離的”是指多肽遠(yuǎn)離其天然環(huán)境而存在并且不是天然產(chǎn)物。分離的多肽可以純化的形式存在或者在非天然環(huán)境如轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞中存在。
關(guān)于兩或多個(gè)多肽序列所用術(shù)語(yǔ)“基本相同”是測(cè)定多肽序列具有相同或功能等價(jià)的氨基酸，在一個(gè)實(shí)例中具有大約35％或45％，在另一個(gè)實(shí)例中具有45-55％，及在另一個(gè)實(shí)例中有55-65％的相同或功能等價(jià)的氨基酸。在另一個(gè)實(shí)例中，兩或多個(gè)“基本相同的”多肽序列具有大約70％，或者在另一個(gè)實(shí)例中具有大約80％，在另一個(gè)實(shí)例中具有大約90％，在另一個(gè)實(shí)例中具有大約95％，及在另一個(gè)實(shí)例中有大約99％的相同或功能等價(jià)的氨基酸?！跋嗤浴卑俜直燃按_定相同性的方法見下文標(biāo)題為“核苷酸和氨基酸序列對(duì)比”的段落所述。
基本相同的多肽還涵蓋了呈現(xiàn)一個(gè)保守的三維結(jié)構(gòu)的兩或多個(gè)多肽。可使用計(jì)算方法對(duì)比結(jié)構(gòu)表現(xiàn)，并可以產(chǎn)生結(jié)構(gòu)模型并易于將其調(diào)整為鑒別重要的活性位點(diǎn)或配體結(jié)合位點(diǎn)的相似性(見Barton，1998；Saqi et al.，1999；Henikoff et al.，2000；Huang et al.，2000)。
關(guān)于氨基酸序列所用術(shù)語(yǔ)“功能等價(jià)物”為本領(lǐng)域所已知，是基于氨基酸側(cè)鏈取代的相對(duì)相似性而言(見Henikoff & Henikoff，2000)。需要考慮的相關(guān)因素包括側(cè)鏈?zhǔn)杷?，親水性，電荷及大小。例如，精氨酸，賴氨酸和組氨酸均是正電荷殘基；丙氨酸，甘氨酸和絲氨酸的大小均是較小的；苯丙氨酸，色氨酸和酪氨酸均具有一般相似的形狀。通過(guò)如下文進(jìn)一步描述的這種分析，精氨酸，賴氨酸和組氨酸；丙氨酸，甘氨酸和絲氨酸；及苯丙氨酸，色氨酸和酪氨酸是生物學(xué)功能等價(jià)物。
在產(chǎn)生生物學(xué)功能等價(jià)的氨基酸取代中，可考慮氨基酸的親水指數(shù)?；诎被岬氖杷院碗姾商匦灾付嗣總€(gè)氨基酸的親水性指數(shù)，這些是異亮氨酸(+4.5)；纈氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；蘇氨酸(-0.7)；絲氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；組氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；賴氨酸(-3.9)及精氨酸(-4.5)。
本領(lǐng)域已知氨基酸親水性指數(shù)在賦予蛋白質(zhì)活性生物學(xué)功能方面的重要性(Kyte & Doolittle，1982)。已知可以用某些氨基酸取代具有相似親水性指數(shù)或分值的其它氨基酸并仍保持相似的生物學(xué)活性。在基于親水性指數(shù)的改變中，在一個(gè)實(shí)例中氨基酸的取代包括具有原始數(shù)值±2范圍內(nèi)的親水性指數(shù)的那些氨基酸，在另一個(gè)實(shí)例中，包括具有原始數(shù)值±1范圍內(nèi)的親水性指數(shù)的那些氨基酸，在另一個(gè)實(shí)例中，包括具有原始數(shù)值±0.5范圍內(nèi)的親水性指數(shù)的那些氨基酸。
本領(lǐng)域還理解基于親水性可有效產(chǎn)生相似氨基酸取代。美國(guó)專利No.4,554,101陳述了蛋白質(zhì)的最大局部平均親水性，由其鄰近氨基酸的親水性決定，與其免疫原性和抗原性相關(guān)，例如與蛋白質(zhì)的生物學(xué)性質(zhì)相關(guān)。應(yīng)理解可以用一個(gè)氨基酸取代具有相似親水性值的另一個(gè)氨基酸，并仍獲得一種生物學(xué)等價(jià)蛋白質(zhì)。
如美國(guó)專利No.4,554,101所述，對(duì)氨基酸殘基已得出如下親水性值精氨酸(+3.0)；賴氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；絲氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；蘇氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；組氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；纈氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；異亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。
在基于相似親水性值產(chǎn)生改變時(shí)，在一個(gè)實(shí)例中氨基酸的取代是親水性指數(shù)在原始數(shù)值±2范圍內(nèi)的那些氨基酸，在另一個(gè)實(shí)例中，是親水性指數(shù)在原始數(shù)值±1范圍內(nèi)的那些氨基酸，在另一個(gè)實(shí)例中，是親水性指數(shù)在原始數(shù)值±0.5范圍內(nèi)的那些氨基酸。
本發(fā)明的方法也可應(yīng)用多肽片段或多肽的功能部分，如白細(xì)胞介素多肽。這種功能部分不需要包含天然基因產(chǎn)物的所有或基本所有氨基酸序列。術(shù)語(yǔ)“功能性”包括多肽的任何生物學(xué)活性或特征。在白細(xì)胞介素多肽的情況中，生物學(xué)活性例如是如本文所述的體內(nèi)免疫刺激活性或抗血管發(fā)生活性。
本發(fā)明還包括治療性多肽的較長(zhǎng)的序列。例如，可將一或多個(gè)氨基酸加入多肽的N末端或C末端。本發(fā)明還提供了包含治療性多肽序列(例如白細(xì)胞介素多肽序列)的融合蛋白。本領(lǐng)域已知制備這種蛋白質(zhì)的方法。在一個(gè)實(shí)例中，融合蛋白包括治療性多肽的任何生物學(xué)活性。在白細(xì)胞介素多肽的情況中，在一個(gè)實(shí)施方案中生物學(xué)活性是天然白細(xì)胞介素的任何生物學(xué)活性，例如本文所述的體內(nèi)免疫刺激或抗血管發(fā)生活性。任選地，融合蛋白可具有由融合的異源序列提供的額外的生物學(xué)活性。
本發(fā)明還涵蓋了治療性多肽的功能類似物。功能類似物呈現(xiàn)治療性多肽(例如白細(xì)胞介素多肽)的至少一種生物學(xué)功能。關(guān)于氨基酸序列，本文所用生物學(xué)功能類似物是其中某些但不是大多數(shù)或全部氨基酸被取代的肽。功能類似物可以在相應(yīng)的核酸分子水平產(chǎn)生，改變這種序列以編碼希望的氨基酸改變。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以導(dǎo)入改變以改良多肽的生物學(xué)功能，例如改良多肽(例如白細(xì)胞介素多肽)的治療效力。
本發(fā)明還涵蓋了所述多肽的重組產(chǎn)生。簡(jiǎn)而言之，將編碼治療性多肽的核酸序列克隆入一個(gè)構(gòu)建體中，將該構(gòu)建體導(dǎo)入一個(gè)宿主生物體中，在此其被重組產(chǎn)生。
術(shù)語(yǔ)“宿主生物體”是已經(jīng)導(dǎo)入所述腺病毒載體的任何生物體。在一個(gè)實(shí)施方案中，宿主生物體是溫血脊椎動(dòng)物，在另一個(gè)實(shí)施方案中，是哺乳動(dòng)物。
II.C.核苷酸和氨基酸序列對(duì)比關(guān)于兩或多個(gè)核苷酸或多肽序列所用術(shù)語(yǔ)“相同的”或“相同性”百分比是指兩或多個(gè)序列或亞序列當(dāng)進(jìn)行最大相應(yīng)程度對(duì)比或排列時(shí)，是相同的或具有指定百分比的相同氨基酸殘基或核苷酸，使用一種本文所述序列對(duì)比算法或通過(guò)目測(cè)測(cè)定。
關(guān)于核苷酸或多肽序列所用術(shù)語(yǔ)“基本相同”是指一個(gè)特殊的序列由于一或多個(gè)缺失，取代或添加而與天然發(fā)生的序列不同，其凈效應(yīng)(neteffect)保留天然基因，基因產(chǎn)物或序列的至少一些生物學(xué)活性。這種序列包括“突變”序列，或者其中生物學(xué)活性在一定程度上改變但保留至少一些原始生物學(xué)活性的序列。本文所用術(shù)語(yǔ)“天然發(fā)生的”用于描述天然發(fā)現(xiàn)的一種成分，其與人工產(chǎn)生的成分截然不同。例如，存在于生物體中的一個(gè)蛋白質(zhì)或核苷酸序列是天然發(fā)生的，其可以分離自天然來(lái)源并未在實(shí)驗(yàn)室中被人工修飾。
就序列對(duì)比而言，典型地將一個(gè)序列作為參比序列以與測(cè)試序列對(duì)比。當(dāng)使用序列對(duì)比算法時(shí)，將測(cè)試序列和參比序列輸入計(jì)算機(jī)程序，如果需要?jiǎng)t指定亞序列坐標(biāo)(subsequence coordinate)，選擇序列算法程序參數(shù)。然后基于選擇的程序參數(shù)，序列對(duì)比算法計(jì)算指定的測(cè)試序列與參比序列的序列相同性百分比。
可以進(jìn)行最佳序列對(duì)比，例如通過(guò)Smith & Waterman(1981)的局部同源算法，通過(guò)Needleman & Wunsch(1970)的同源序列對(duì)比算法，通過(guò)Pearson & Lipman(1988)的相似性搜索方法，通過(guò)這些算法的計(jì)算機(jī)執(zhí)行程序(GCG WISCONSIN PACKAGE中的GAP，BESTFIT，F(xiàn)ASTA和TFASTA，得自Accelrys，Inc.，San Diego，California，United States ofAmerica)，或者通過(guò)目測(cè)(一般見Ausubel et al.，1992)進(jìn)行。
確定序列相同性百分比和序列相似性的算法例如是BLAST算法，這是Altschul等在1990年描述的。進(jìn)行BLAST分析的軟件可通過(guò)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)公開獲得。這個(gè)算法包括首先通過(guò)鑒別質(zhì)詢(query)序列中長(zhǎng)度W的短語(yǔ)而鑒別高分值的序列對(duì)(HSP)，當(dāng)與數(shù)據(jù)庫(kù)序列中同樣長(zhǎng)度一個(gè)字對(duì)比時(shí)其匹配或滿足一些正值的閾值T。T是指鄰近字分值的閾值。這些初始的鄰近字采樣數(shù)(hits)作為種子開始搜索以發(fā)現(xiàn)含有其的較長(zhǎng)的HSP。然后只要累積的序列對(duì)比分值增加，這個(gè)字采樣數(shù)沿著每個(gè)序列的兩個(gè)方向延伸。就核苷酸序列而言，累積的分值是使用參數(shù)M(一對(duì)匹配殘基的獎(jiǎng)分；總是＞0)和N(錯(cuò)配殘基的罰分；總是＜0)計(jì)算的。就氨基酸序列而言，分值矩陣用于計(jì)算累積分值。當(dāng)累積序列對(duì)比分值通過(guò)低于其最大獲得值X時(shí)，字采樣數(shù)在每個(gè)方向的延伸就停止，累積的分值由于一或多個(gè)負(fù)分值的殘基對(duì)比的累積而為零或小于零，或者達(dá)到每個(gè)序列的末端。BLAST算法的參數(shù)W，T和X決定了序列對(duì)比的敏感性和速度。BLASTN程序(就核苷酸序列而言)用作默認(rèn)值，字長(zhǎng)W＝11，期望值E＝10，截?cái)嘀禐?00，M＝5，N＝-4，雙鏈對(duì)比。就氨基酸序列而言，BLASTP程序用作默認(rèn)值，字長(zhǎng)(W)為3，期望值(E)為10，BLOSUM62分值矩陣(見Henikoff & Henikoff，1992)。
除了計(jì)算序列相同性百分比之外，BLAST算法還進(jìn)行兩個(gè)序列之間的相似性統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(見例如Karlin & Altschul，1993)。由BLAST算法提供的一種相似性測(cè)定是最小總和概率(P(N))，其提供了兩個(gè)核苷酸或氨基酸序列之間的匹配偶然發(fā)生的概率的指征。例如在一個(gè)實(shí)例中，如果測(cè)試的核酸序列與參考核酸序列的對(duì)比中最小總和概率低于大約0.1，則認(rèn)為測(cè)試核酸序列與參考序列相似，在另一個(gè)實(shí)例中低于大約0.01，在另一個(gè)實(shí)例中低于大約0.001。
III.腺病毒載體在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的腺病毒載體是條件復(fù)制型。也就是說(shuō)，它們含有在可誘導(dǎo)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制下復(fù)制需要的一或多個(gè)功能性基因。這延遲了在體內(nèi)未控制的復(fù)制并降低了病毒感染的不利副作用。也可以使用有復(fù)制能力的自身限制性或自身破壞病毒載體，可以使用復(fù)制缺陷型病毒載體。
將一個(gè)核酸構(gòu)建體摻入病毒基因組可以任選通過(guò)將該構(gòu)建體連接入病毒基因組的一個(gè)合適的限制位點(diǎn)而進(jìn)行。然后將病毒基因組通過(guò)任何合適的方法包裝入病毒外殼或殼體中。特別地，可以使用任何合適的包裝細(xì)胞系以產(chǎn)生本發(fā)明的病毒載體。這些包裝細(xì)胞系補(bǔ)足本發(fā)明的條件復(fù)制缺陷型病毒基因組，因?yàn)樗鼈儼ㄖ糜谠跅l件復(fù)制型載體中缺失的可誘導(dǎo)啟動(dòng)子下的基因，典型地?fù)饺肫浠蚪M中。因此，包裝細(xì)胞系的應(yīng)用使得本發(fā)明的病毒載體可以培養(yǎng)產(chǎn)生。
本發(fā)明的腺病毒載體被設(shè)計(jì)為優(yōu)先在表達(dá)高水平HIF-1的細(xì)胞中復(fù)制，包括但非限于腫瘤低氧區(qū)域中存在的細(xì)胞。這可以通過(guò)將復(fù)制所必需的腺病毒基因置于低氧應(yīng)答啟動(dòng)子(HRP)的轉(zhuǎn)錄控制下而實(shí)現(xiàn)。這個(gè)啟動(dòng)子優(yōu)先指導(dǎo)低氧細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的能力通過(guò)產(chǎn)生一個(gè)質(zhì)粒而評(píng)價(jià)，所述質(zhì)粒含有可操縱地與一個(gè)增強(qiáng)的綠色熒光蛋白(EGFP)編碼序列連接的啟動(dòng)子，如實(shí)施例1所述。HRP-EGFP構(gòu)建體用于從兩個(gè)腫瘤細(xì)胞系中建立穩(wěn)定的亞系(subline)HCT116，人結(jié)腸癌細(xì)胞系；4T1，鼠乳腺腺癌。在含氧正常的條件下生長(zhǎng)的細(xì)胞不表達(dá)EGFP。來(lái)自暴露于低氧條件(氧壓為0.5-1.5％)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)的亞系細(xì)胞示出在保溫24小時(shí)后強(qiáng)力表達(dá)EGFP。
在一個(gè)實(shí)施方案中，使用腫瘤內(nèi)注入的構(gòu)建體的條件復(fù)制能力提供了在腫瘤低氧區(qū)域中的載體復(fù)制。本發(fā)明的一個(gè)特征是將載體有效地集中在規(guī)定的部位鄰近的低氧細(xì)胞中分布和復(fù)制的方法。腺病毒報(bào)道基因構(gòu)建體的體內(nèi)腫瘤內(nèi)復(fù)制在皮下腫瘤模型中評(píng)價(jià)，如實(shí)施例2所述。
HRP限制低氧細(xì)胞轉(zhuǎn)錄的能力在體內(nèi)通過(guò)用穩(wěn)定的亞系在小鼠中建立皮下腫瘤而測(cè)試，如實(shí)施例2所述。使皮下腫瘤生長(zhǎng)至直徑為1.0-1.5cm。然后從處死的小鼠中切下腫瘤并檢測(cè)EGFP表達(dá)。EGFP報(bào)道基因只在腫瘤的低氧區(qū)域中表達(dá)。
在使低氧可誘導(dǎo)的載體在腫瘤內(nèi)復(fù)制最大化及伴隨著同一載體潛在免疫原性系統(tǒng)復(fù)制最小化的嘗試中，應(yīng)用低氧應(yīng)答啟動(dòng)子產(chǎn)生構(gòu)建體。如本文所揭示，可以實(shí)現(xiàn)載體在腫瘤內(nèi)高度復(fù)制同時(shí)在周圍細(xì)胞中復(fù)制基本被消除。因此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，腺病毒載體在腫瘤內(nèi)的HIF-1可誘導(dǎo)復(fù)制可導(dǎo)致腫瘤生長(zhǎng)抑制。
根據(jù)本發(fā)明的方法可使用任何低氧可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，包括但非限于包含與HIF-1結(jié)合序列連接的一個(gè)最小啟動(dòng)子的重組啟動(dòng)子。在一個(gè)實(shí)例中，HIF-1結(jié)合序列是HRE。HRE已經(jīng)在一些低氧可誘導(dǎo)基因的啟動(dòng)子中發(fā)現(xiàn)，包括磷酸甘油酸激酶-1(Firth et al.，1994；Semenza et al.，1994)，促紅細(xì)胞生成素(Pugh et al.，1991；Semenza et al.，1991)及VEGF(Liu et al.，1995；Forsythe et al.，1996)。
就應(yīng)答低氧被正調(diào)節(jié)的基因而言，其中賦予低氧可誘導(dǎo)性的確切序列還未確定，應(yīng)答序列可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法限定。在候選啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)，與核酸序列結(jié)合的調(diào)節(jié)蛋白的存在可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的多種方法檢測(cè)(Ausubel et al.，1992)。簡(jiǎn)而言之，體內(nèi)足跡法(footprinting assay)表明在活的或透化的細(xì)胞(permeabillized cell)內(nèi)保護(hù)DNA序列免于化學(xué)和酶修飾。相似地，體外足跡法使用蛋白質(zhì)提取物示出保護(hù)DNA序列免于化學(xué)或酶修飾。硝酸纖維素濾膜結(jié)合分析和凝膠電泳遷移率變動(dòng)分析(EMSA)基于候選轉(zhuǎn)錄因子而追蹤放射標(biāo)記的調(diào)節(jié)DNA元件的存在。計(jì)算機(jī)分析程序例如TFSEARCH版本1.3(Yutaka Akiyama″TFSEARCHSearching Transcription Factor BindingSites″，http//www.rwcp.or.jp/papia/)可以用于將已知的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件的共有序列定位于基因組區(qū)域內(nèi)。
本發(fā)明的低氧可誘導(dǎo)啟動(dòng)子可以與額外的元件連環(huán)或組合以擴(kuò)增轉(zhuǎn)錄活性。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，低氧可誘導(dǎo)啟動(dòng)子包含來(lái)自與CMV最小啟動(dòng)子連接的人VEGF基因的HRE的5個(gè)串聯(lián)拷貝。
或者或另外，低氧可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子可以與作為mRNA翻譯的增強(qiáng)子的元件組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，mRNA翻譯的增強(qiáng)子是HRE。
本發(fā)明的低氧可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子可進(jìn)一步應(yīng)答可用于本文所述組合治療中的非低氧刺激。例如，mortalin啟動(dòng)子是由低劑量的電離輻射誘導(dǎo)的(Sadekova et al.，1997)，hsp27啟動(dòng)子是由17β-雌二醇和雌激素受體興奮劑激活的(Porter et al.，2001)，HLA-G啟動(dòng)子是由亞砷酸鹽誘導(dǎo)的，hsp啟動(dòng)子可以通過(guò)光力學(xué)治療激活(Luna et al.，2000)。因此，本發(fā)明應(yīng)用的低氧可誘導(dǎo)啟動(dòng)子可包含支持組合治療的額外的可誘導(dǎo)特征或者額外的DNA元件。可以在放療之前，期間或之后給予病毒；或者在化療之前，期間或之后給予病毒；和/或在光力學(xué)治療之前，期間或之后給予病毒。
低氧可誘導(dǎo)啟動(dòng)子可衍生自任何生物學(xué)來(lái)源，包括來(lái)自與治療的指定對(duì)象異源的來(lái)源。例如，人VEGF啟動(dòng)子在牛肺動(dòng)脈內(nèi)皮(BPAE)細(xì)胞中可指導(dǎo)有效地低氧可誘導(dǎo)的表達(dá)(Liu et al.，1995)。
IV.轉(zhuǎn)基因本發(fā)明的方法應(yīng)用腺病毒載體以在細(xì)胞中復(fù)制，從而導(dǎo)致細(xì)胞裂解。為了更有效地殺死含有腺病毒載體的細(xì)胞，本發(fā)明還提供了包含轉(zhuǎn)基因的腺病毒載體。根據(jù)本發(fā)明，轉(zhuǎn)基因可包含一種治療性基因，包括但非限于腫瘤抑制基因，編程性細(xì)胞死亡誘導(dǎo)基因，抗血管發(fā)生基因，自殺前體藥物轉(zhuǎn)化酶基因，細(xì)菌毒素基因，反義基因，腫瘤抑制基因，免疫刺激基因，或者其組合。
如本文所用術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)基因”是指導(dǎo)入細(xì)胞中的任何核苷酸序列，從而使得核苷酸序列在細(xì)胞中表達(dá)。轉(zhuǎn)基因可包括與細(xì)胞衍生自其中的生物體部分或完全異源(即外源)的基因，或者可以是與已經(jīng)包含在細(xì)胞內(nèi)的基因相同或同源的核苷酸序列。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因包含一種治療基因。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因是由條件復(fù)制型腺病毒載體編碼的。然而，可有效包裝入腺病毒病毒體中的外源核苷酸的數(shù)目是大約2000個(gè)堿基對(duì)。因此，本發(fā)明的條件復(fù)制型腺病毒載體除了每個(gè)轉(zhuǎn)基因必需的啟動(dòng)子和聚腺苷酸化序列之外，可任選地包含不超過(guò)大約1.4-1.6千堿基對(duì)(kb)的轉(zhuǎn)基因。大于這個(gè)范圍的轉(zhuǎn)基因典型地由其它機(jī)制提供。如下文所述，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種方法，其中轉(zhuǎn)基因由復(fù)制缺陷型腺病毒載體輸送，復(fù)制缺陷型腺病毒載體在存在有復(fù)制能力的病毒的細(xì)胞中自身成為有復(fù)制能力的。這是由于從前者缺失的基本早期基因產(chǎn)物由后者提供而發(fā)生。
本發(fā)明的方法可用于通過(guò)導(dǎo)致細(xì)胞裂解的腺病毒載體復(fù)制而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。本發(fā)明的腺病毒載體可另外包括一種轉(zhuǎn)基因，所述轉(zhuǎn)基因包含編碼具有治療性生物學(xué)活性的多肽(也稱為治療性多肽)的核酸分子。治療性多肽例如包括但非限于免疫刺激分子，腫瘤抑制基因產(chǎn)物/抗原，自殺基因產(chǎn)物，及抗血管發(fā)生因子(見Mackensen et al.，1997；Walther &Stein，1999；Kirk & Mule，2000及其所引用的參考文獻(xiàn))。
血管發(fā)生和抑制的免疫應(yīng)答在惡性疾病和腫瘤生長(zhǎng)，侵潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的發(fā)病機(jī)理中起關(guān)鍵作用。因此，在一個(gè)實(shí)例中，治療性多肽具有誘導(dǎo)體內(nèi)免疫應(yīng)答和/或抗血管發(fā)生應(yīng)答的能力。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的腺病毒載體編碼一種治療性基因，其表現(xiàn)免疫刺激和抗血管發(fā)生雙重活性，例如IL-12(見Dias et al.，1998及下文引用的參考文獻(xiàn))，干擾素-α(見O′Byrne et al.，2000及其引用的參考文獻(xiàn))，或者趨化因子(見Nomura &Hasegawa，2000及其引用的參考文獻(xiàn))。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的腺病毒載體編碼具有免疫刺激活性的基因產(chǎn)物和具有抗血管發(fā)生活性的基因產(chǎn)物(見例如Narvaiza et al.，2000)。
IL-12，任選地與共同刺激劑B7.1組合，是一種代表性治療性多肽，因?yàn)榫幋aIL-12或B7.1以及IL-12和B7.1組合的病毒的局部應(yīng)用呈現(xiàn)出改良抗腫瘤的免疫應(yīng)答(Ptzer et al.，1997)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包含編碼能激發(fā)免疫應(yīng)答和/或抗血管發(fā)生應(yīng)答的IL-12多肽的一種腺病毒載體。白細(xì)胞介素-12(IL-12)是由兩個(gè)亞基p35和p40組成的二硫鍵連接的異源二聚體。IL-12刺激T細(xì)胞和NK細(xì)胞以分泌干擾素-γ(IFN-γ)并增加T細(xì)胞和NK細(xì)胞增殖和溶細(xì)胞活性(Kobayashi et al.，1989；Wolf et al.，1991；D’Andre et al.，1992；Gately et al.，1994；Robertson et al.，1992)。通過(guò)這些功能，IL-12促進(jìn)早期炎癥應(yīng)答和支持細(xì)胞介導(dǎo)的免疫性的CD4+T輔助(Th1)細(xì)胞的發(fā)育(Manetti et al.，1993；Hsieh et al.，1993)。IL-12進(jìn)一步抑制血管發(fā)生，可能通過(guò)NK細(xì)胞介導(dǎo)的機(jī)制進(jìn)行(Voest et al.，1995；Majewski et al.，1996；Yao et al.，1999)。在一個(gè)實(shí)例中，由本發(fā)明的基因治療構(gòu)建體編碼的IL-12多肽展示天然發(fā)生的IL-12多肽的一或多種生物學(xué)性質(zhì)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包含編碼IL-12多肽的腺病毒載體。IL-2是一種免疫刺激分子，其在多種癌癥中示出治療活性，所述癌癥包括腎癌，乳腺癌，膀胱癌和惡性黑素瘤。IL-2的抗腫瘤活性與其擴(kuò)展并激活表達(dá)IL-2受體的NK細(xì)胞和T細(xì)胞的能力相關(guān)(見例如Margolin，2000；Gore，1996；Deshmukh et al.，2001；Larchian et al.，2000；Horiguchiet al.，2000；及其引用的參考文獻(xiàn))。IL-2也成功用于與抗腫瘤疫苗共同給予(見Overwijk et al.，2000及其引用的參考文獻(xiàn))。
在一個(gè)實(shí)例中，由本發(fā)明的腺病毒載體編碼的IL-2多肽展示出天然發(fā)生的IL-2多肽的一或多種生物學(xué)性質(zhì)。IL-2誘導(dǎo)的增殖可例如通過(guò)在CTLL-2細(xì)胞中摻入3H-胸苷而測(cè)定，如歐洲專利No.0 439 095所述。IL-2多肽的生物學(xué)性質(zhì)可使用前述出版物中描述的方法進(jìn)一步評(píng)價(jià)。
如本文所用術(shù)語(yǔ)“自殺基因”是指編碼一種多肽的基因，導(dǎo)致產(chǎn)生該多肽的細(xì)胞死亡。自殺基因可編碼例如直接通過(guò)誘導(dǎo)編程性細(xì)胞死亡而導(dǎo)致細(xì)胞死亡的基因。這種基因稱作“編程性細(xì)胞死亡誘導(dǎo)基因”，包括但非限于TNF-α(Idriss & Naismith，2000)，Trail(Srivastava，2001)，Bax和Bcl-2(Shen & White，2001)。編碼直接殺死細(xì)胞的蛋白質(zhì)的其它基因包括細(xì)菌毒素基因，其通常在某些細(xì)菌的基因組中發(fā)現(xiàn)并且編碼對(duì)真核細(xì)胞有毒性的多肽(即細(xì)菌毒素)。細(xì)菌毒素包括但非限于白喉毒素(Frankel et al.，2001)。
或者，自殺基因可編碼將一種前體藥物轉(zhuǎn)化為毒性化合物的多肽。這種自殺前體藥物轉(zhuǎn)化酶包括但非限于HSV-tk多肽，其將9-(1，3-二羥-2-丙氧甲基)鳥嘌呤轉(zhuǎn)化為毒性核苷酸類似物(Freeman et al.，1996)；胞嘧啶脫氨酶，其將非毒性核苷酸類似物5-氟胞嘧啶轉(zhuǎn)化為毒性類似物5-氟尿嘧啶(Yazawa et al.，2002)；及細(xì)胞色素p450，其將某些脂族胺N-氧化物轉(zhuǎn)化為毒性代謝物(Patterson，2002)。
另外，自殺基因可編碼干擾與細(xì)胞存活或增殖相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)的一種多肽。這種級(jí)聯(lián)包括但非限于由Flt1和Flk1受體酪氨酸激酶介導(dǎo)的級(jí)聯(lián)(參見Klohs，et al.，1997)?？筛蓴_Flt1和/或Flk1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的多肽包括但非限于可溶的Flt1受體(s-Flt1；Shibuya，2001)及Flk-1受體的胞外結(jié)構(gòu)域(ex-Flk1；Lin et al.，1998)。
V.治療方法本發(fā)明的治療方法包括將腫瘤內(nèi)的低氧細(xì)胞與腺病毒載體接觸，從而該載體進(jìn)入細(xì)胞并抑制腫瘤生長(zhǎng)。例如，所揭示的腺病毒載體可用于治療原發(fā)的和轉(zhuǎn)移的實(shí)體瘤，及乳腺癌，結(jié)腸癌，直腸癌，肺癌，口咽癌，咽癌，食管癌，胃癌，胰腺癌，肝癌，膽囊癌，膽管癌，小腸癌，尿道包括腎，膀胱和尿道上皮癌，女性生殖道包括子宮頸，子宮，卵巢癌、絨毛膜癌和妊娠滋養(yǎng)層疾病，男性生殖道包括前列腺，精囊，睪丸癌和生殖細(xì)胞瘤，內(nèi)分泌腺包括甲狀腺，腎上腺和垂體癌，皮膚包括血管瘤，黑素瘤，骨或軟組織中產(chǎn)生的肉瘤，及Kaposi′s肉瘤，腦、神經(jīng)、眼和腦膜瘤包括星形細(xì)胞瘤，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤，成膠質(zhì)細(xì)胞瘤，成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤，神經(jīng)瘤，成神經(jīng)細(xì)胞瘤，施萬(wàn)細(xì)胞瘤(Schwannomas)和腦膜瘤，自惡性血液病產(chǎn)生的實(shí)體瘤如白血病，及包括綠色白血病，漿細(xì)胞瘤，蕈樣肉芽腫病的斑和腫瘤及皮膚T細(xì)胞淋巴瘤/白血病，淋巴瘤包括Hodgkin′s和非Hodgkin′s淋巴瘤。
本發(fā)明的組合物當(dāng)單獨(dú)應(yīng)用或者與常規(guī)給予患者以治療疾病包括血管發(fā)生疾病的放療，光力學(xué)治療和/或化療組合應(yīng)用時(shí)，也可以用于預(yù)防上述腫瘤的轉(zhuǎn)移。例如，腫瘤可以常規(guī)應(yīng)用手術(shù)，光力學(xué)治療，放療和/或化療治療，隨后給予本發(fā)明的組合物以延長(zhǎng)微小轉(zhuǎn)移的休眠期及穩(wěn)定任何殘余原發(fā)腫瘤并抑制其生長(zhǎng)。事實(shí)上，可在放療、化療和/或光力學(xué)治療之前，期間或之后給予病毒。
本發(fā)明的組合物和方法非限于用于由于低氧導(dǎo)致HIF-1表達(dá)增加的細(xì)胞中。它們也可用于其中HRE可發(fā)揮調(diào)節(jié)可操縱地連接的核苷酸序列轉(zhuǎn)錄功能的任何細(xì)胞中。例如，已經(jīng)報(bào)道了在家族性血管瘤綜合征中pVHL功能喪失，在多數(shù)偶發(fā)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)成血管細(xì)胞瘤(hemangioblastoma)和透明細(xì)胞腎癌中也如此(參見Ivan & Kaelin，2001)。此外，與腎細(xì)胞癌和/或成血管細(xì)胞瘤相關(guān)的pVHL突變均示出干擾pVHL調(diào)節(jié)HIF-1α活性的能力(Maxwell et al.，2001)。因此，本發(fā)明的組合物和方法可應(yīng)用于喪失pVHL功能的細(xì)胞。
另外，近期的報(bào)道提示HIF-1在一些腫瘤細(xì)胞中積聚，甚至在正常含氧條件下。長(zhǎng)期以來(lái)已知一些癌細(xì)胞在需氧條件下展示高速度的糖酵解，這是稱為Warburg作用的一個(gè)現(xiàn)象。有跡象提示W(wǎng)arburg作用的特征在于HIF-1在腫瘤正常含氧部位的轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中積聚，導(dǎo)致在需氧條件下糖酵解。另外HIF-1在這些細(xì)胞中的誘導(dǎo)看來(lái)是由pp60c-Src蛋白介導(dǎo)的(見Karni et al.，2002)，其與一些形式的人體癌癥相關(guān)(參見Brickell，1992)。因此，本發(fā)明的組合物和方法可用于pp60c-Src活性增加的細(xì)胞。
pp60c-Src的增加或VHL功能的喪失因此使得HIF-1選擇性條件復(fù)制型腺病毒載體在無(wú)低氧的情況中在腫瘤細(xì)胞中復(fù)制(例如衍生自VHL缺陷的透明細(xì)胞腎癌的那些腫瘤細(xì)胞)。在這些情況中，每個(gè)腫瘤細(xì)胞均被靶定，因?yàn)镠IF-1在每個(gè)細(xì)胞中均是激活的。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供了通過(guò)用兩種不同的腺病毒載體在靶組織中共同感染細(xì)胞而抑制靶組織生長(zhǎng)的一種方法，所述兩種不同的腺病毒載體一個(gè)是包含在HRE的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)下的腺病毒基因的條件復(fù)制型載體，另一個(gè)是包含轉(zhuǎn)基因的復(fù)制缺陷型腺病毒載體。組合方法的應(yīng)用提供了這樣的優(yōu)勢(shì)，其中條件復(fù)制型腺病毒具有僅攜帶大約2kb的轉(zhuǎn)基因能力(如果外源啟動(dòng)子小)以攜帶轉(zhuǎn)基因。因此，需要擴(kuò)展腺病毒載體攜帶轉(zhuǎn)基因的能力，其在許多情況中超過(guò)2kb。復(fù)制缺陷型病毒與條件復(fù)制型病毒聯(lián)合應(yīng)用，則可顯著擴(kuò)展輸送轉(zhuǎn)基因的能力。在第一代E1，E3缺陷的腺病毒載體的情況中，該能力為大約8kb。在第三代無(wú)內(nèi)容載體(gutless vector)的情況中，該能力將達(dá)到大約37kb。無(wú)內(nèi)容載體的構(gòu)建見Mitani et al.，1995；Fisher et al.，1996；Kochanek et al.，1996；Kumar-Singh & Chamberlain，1996；Hardy et al.，1997；Parks &Graham，1997；Morsy et al.，1998；PCT國(guó)際公開文本No.WO 98/54345、WO97/45550和WO 96/33280；及美國(guó)專利No.5,871,982等所述。
V.A.對(duì)象本發(fā)明在其許多實(shí)施方案中治療的對(duì)象是人，盡管應(yīng)理解本發(fā)明的原理表明本發(fā)明對(duì)無(wú)脊椎動(dòng)物及所有脊椎動(dòng)物物種，包括哺乳動(dòng)物均是有效的，這些動(dòng)物均包含在術(shù)語(yǔ)“對(duì)象(subject)”的范疇內(nèi)。另外，哺乳動(dòng)物應(yīng)理解為包括其中需要治療或預(yù)防癌癥的任何哺乳動(dòng)物物種，特別是農(nóng)業(yè)和家養(yǎng)哺乳動(dòng)物物種。
本發(fā)明的方法特別用于治療溫血脊椎動(dòng)物。因此，本發(fā)明涉及哺乳動(dòng)物和鳥類。
更特別地，提供了哺乳動(dòng)物的治療，哺乳動(dòng)物如人、以及瀕臨滅絕的哺乳動(dòng)物(如西伯利亞虎)、對(duì)人有經(jīng)濟(jì)重要性(供人消費(fèi)的農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物)和/或社會(huì)重要性(作為寵物飼養(yǎng)的或在動(dòng)物園中飼養(yǎng)的動(dòng)物)的哺乳動(dòng)物，例如除人以外的食肉動(dòng)物(如貓和狗)，豬(豬(pig)、肥豬(hog)和野豬)，反芻動(dòng)物(牛(cattle)、公牛(oxen)、綿羊、長(zhǎng)頸鹿、鹿、山羊、野牛和駱駝)和馬。還提供了鳥類的治療，包括瀕臨滅絕的鳥類、動(dòng)物園飼養(yǎng)的鳥類和禽類的治療，特別是家養(yǎng)禽類即家禽如火雞、雞、鴨、鵝、珍珠雞(guinea fowl)等的治療，因?yàn)樗鼈儗?duì)于人類有經(jīng)濟(jì)重要性。因此，還包括家畜、包括但不限于家養(yǎng)豬(豬和肥豬)、反芻動(dòng)物、馬、禽類等的治療。
V.B.制劑在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明請(qǐng)求保護(hù)的腺病毒載體包含一種包括藥物學(xué)可接受的載體的組合物?？梢允褂萌魏魏线m的藥物制劑制備用于給予個(gè)體的腺病毒載體。
例如，合適的制劑可以包括水性和非水性無(wú)菌注射溶液，其可以含有抗氧化劑、緩沖液、抑菌劑、殺菌抗生素和使制劑與計(jì)劃接受者的體液等滲的溶質(zhì)；水性和非水性無(wú)菌懸浮液，其可以包括懸浮劑和增稠劑。制劑可以以單劑量或多劑量容器例如密封安瓿和小瓶提供，并可以在冷凍或冷凍干燥(凍干)條件下儲(chǔ)存，僅需要在即將使用前添加無(wú)菌液體載體例如水進(jìn)行注射。一些舉例性的成分為SDS，在一個(gè)例子中范圍為0.1-10mg/ml，在另一個(gè)例子中為約2.0mg/ml；和/或甘露醇或另一種糖，例如范圍為10-100mg/ml，在另一個(gè)例子中約30mg/ml；和/或磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)。
應(yīng)理解的是除了上述特別描述的成分之外，本發(fā)明的制劑根據(jù)制劑的類型還可以包括現(xiàn)有技術(shù)中常規(guī)的其它成分。在可能的制劑中，可以使用無(wú)菌無(wú)熱原的水溶液和非水溶液。
本發(fā)明的治療方案和藥物組合物可以與附加的佐劑或生物應(yīng)答修飾劑一起使用，這些佐劑或生物應(yīng)答修飾劑包括但不限于細(xì)胞因子IFN-α，IFN-γ，IL-2，IL-4，IL-6，TNF，或影響免疫細(xì)胞的其它細(xì)胞因子。根據(jù)本發(fā)明的這一方面，所公開的腺病毒載體可以在組合療法中與一或多種這些細(xì)胞因子一起給藥。
V.C.給藥給予本發(fā)明的腺病毒載體的合適方法包括但不限于靜脈內(nèi)或腫瘤內(nèi)注射?；蛘?，腺病毒載體可以以任何其它方式沉積在需治療的部位，例如將包含腺病毒載體的組合物噴霧在肺通道中。給予本發(fā)明的治療組合物的特定模式取決于許多因素，包括待治療的細(xì)胞的分布和豐度、采用的載體、載體的額外的靶向組織或細(xì)胞的特征以及載體從其給藥部位代謝或除去的機(jī)制。例如，相對(duì)淺表的腫瘤可以進(jìn)行腫瘤內(nèi)注射，相反，內(nèi)部腫瘤可以通過(guò)靜脈內(nèi)注射來(lái)治療。
在一個(gè)實(shí)施方案中，給藥方法包括用于在需要治療的部位區(qū)域化載體輸送或積累的特征。在一個(gè)實(shí)例中，腺病毒載體被腫瘤內(nèi)輸送。在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)靜脈內(nèi)注射構(gòu)建體實(shí)現(xiàn)腺病毒載體向腫瘤的選擇性輸送。
為了將腺病毒載體輸送到肺通道，本發(fā)明的腺病毒載體可以配制成氣溶膠或粗噴霧劑(coarse spray)。制備和給予氣溶膠或噴霧制劑的方法可參見例如Cipolla et al.，2000和U.S.Patent Nos.5,858,784；6,013,638；6,022,737；和6,136,295。
V.D.劑量有效量的本發(fā)明的腺病毒載體組合物被給予需要其的個(gè)體?！爸委熡行Я俊笔侵委熃M合物的足以產(chǎn)生可測(cè)量應(yīng)答(例如在正在治療的個(gè)體中的溶細(xì)胞應(yīng)答)的量。在一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)量抑制腫瘤生長(zhǎng)的活性。本發(fā)明藥物組合物中活性成分的實(shí)際劑量水平可以進(jìn)行變化，從而給予在特定個(gè)體中有效實(shí)現(xiàn)所需的治療應(yīng)答的活性化合物的量。所選擇的劑量水平取決于治療組合物的活性、給藥途徑、與其它藥物或治療的聯(lián)合、正在治療的癥狀的嚴(yán)重程度以及個(gè)體的狀態(tài)和以前的病史。但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員了解從低于達(dá)到所需治療效果所需的水平的化合物劑量開始，并逐漸增加劑量直至達(dá)到所需效果。
治療組合物的效力可以進(jìn)行變化，因此“治療有效”量可以有變化。但是，使用本文下述的分析方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地評(píng)價(jià)本發(fā)明的候選調(diào)節(jié)物的效力和效能并相應(yīng)地調(diào)整治療方案。
在閱讀了本發(fā)明在此披露的信息后，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠考慮特定制劑、組合物的給藥方法以及腫瘤大小而針對(duì)各個(gè)患者調(diào)整劑量。計(jì)算劑量可進(jìn)一步考慮患者身高和體重、癥狀的嚴(yán)重程度和階段以及是否存在額外的有害的身體條件。這種調(diào)整或改變以及何時(shí)和如何進(jìn)行這種調(diào)整或改變是醫(yī)藥領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。
對(duì)于病毒載體的局部給藥，先前的臨床研究證實(shí)為毒性最小可以注射高至1013噬斑形成單位(pfu)的病毒。在人類患者中，通常使用1×109-1×1013pfu(參見Habib et al.，1999)。為了確定這一范圍內(nèi)的合適劑量，初步治療可以從1×109pfu起始，在不出現(xiàn)劑量限制毒性時(shí)可以逐步增加劑量水平。毒性可以使用國(guó)立癌癥研究院發(fā)布的標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)并合理地定義為任何4級(jí)毒性或任何3級(jí)毒性持續(xù)1周以上。也可修改劑量以使抗腫瘤或抗血管發(fā)生活性最大化。用于評(píng)價(jià)抗腫瘤和/或抗血管發(fā)生活性的代表性標(biāo)準(zhǔn)和方法如以下所述。對(duì)于復(fù)制型病毒載體，在某些情況下可以使用約1×107-1×108pfu的劑量。
實(shí)際上，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種在靶組織如腫瘤、另一種低氧組織或表達(dá)HIF-1的其它組織中選擇性繁殖腺病毒的方法。本文描述的腺病毒構(gòu)建體被包裝進(jìn)腺病毒載體中，制備的病毒效價(jià)達(dá)到至少1×106-1×107pfu/ml。將腺病毒構(gòu)建體以1.0pfu/靶細(xì)胞的量給予。因此，給予最低水平的腺病毒構(gòu)建體從而在病毒繁殖時(shí)提供治療水平，這構(gòu)成了本發(fā)明的一個(gè)方面。
實(shí)施例下述實(shí)施例用于描述請(qǐng)求保護(hù)的本發(fā)明內(nèi)容的模式。下述實(shí)施例的某些方面描述了本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)或預(yù)期能很好實(shí)施請(qǐng)求保護(hù)的本發(fā)明內(nèi)容的技術(shù)和程序。這些實(shí)施例示出了本發(fā)明人的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室實(shí)踐?；诒景l(fā)明的披露和現(xiàn)有技術(shù)水平，本領(lǐng)域技術(shù)人員能理解下述實(shí)施例僅是為了舉例，在不偏離本發(fā)明請(qǐng)求保護(hù)的內(nèi)容的范圍情況下可以進(jìn)行多種變化、修飾和改變。
實(shí)施例1在暴露于低氧的細(xì)胞中EGFP的體外表達(dá)構(gòu)建了基于VEGF啟動(dòng)子中的HIF-1結(jié)合元件的啟動(dòng)子。所述低氧應(yīng)答啟動(dòng)子(HRP)包含與巨細(xì)胞病毒(CMV)的最小啟動(dòng)子連接的來(lái)自人VEGF啟動(dòng)子的HRE的5個(gè)串聯(lián)拷貝。為了測(cè)試這一質(zhì)粒的活性，構(gòu)建如圖1所示的質(zhì)粒，其中HRP控制增強(qiáng)型的綠色熒光蛋白(EGFP)基因的表達(dá)。使用HRP-EGFP構(gòu)建體從兩個(gè)腫瘤細(xì)胞系建立穩(wěn)定的亞系，這兩個(gè)腫瘤細(xì)胞系為人結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116和鼠乳腺腺癌4T1。暴露于低氧條件(氧壓力為0.5-1.5％)的來(lái)自穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)的亞系的細(xì)胞在保溫24小時(shí)后顯示強(qiáng)烈的EGFP表達(dá)。
實(shí)施例2在皮下腫瘤中HRP-驅(qū)動(dòng)的EGFP表達(dá)通過(guò)給小鼠皮下注射105-106個(gè)細(xì)胞建立腫瘤。注射的細(xì)胞是用包含控制EGFP基因表達(dá)的人工低氧應(yīng)答啟動(dòng)子的構(gòu)建體(HRP-EGFP；見圖1)穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)的4T1細(xì)胞。使腫瘤生長(zhǎng)至直徑約為5-8mm。在即將切下腫瘤并處死小鼠前，給小鼠腹膜內(nèi)注射哌莫硝唑(pimonidazole)。哌莫硝唑染色是鑒別腫瘤內(nèi)低氧區(qū)域的標(biāo)準(zhǔn)方法(Raleigh et al.，1998)。然后用抗哌莫硝唑抗體染色腫瘤的冷凍切片并在熒光顯微鏡下觀察。還觀察了相同切片的EGFP表達(dá)模式。在每一切片中均觀察到EGFP表達(dá)模式與哌莫硝唑染色一致，證實(shí)了HRP-EGFP報(bào)道基因適合報(bào)道低氧腫瘤區(qū)域。
實(shí)施例3條件復(fù)制型腺病毒載體的體外復(fù)制構(gòu)建一種包含在HRP啟動(dòng)子控制下的腺病毒E1A基因的腺病毒載體(AdHRP-E1A-dsRed2；見圖2)。將編碼紅色熒光蛋白的報(bào)道基因(dsRed2)工程化入所述載體以利于跟蹤病毒感染和復(fù)制。然后這一載體在HCT116人結(jié)腸癌細(xì)胞系中進(jìn)行測(cè)試。低氧導(dǎo)致這一病毒載體的活性復(fù)制。熒光顯微鏡證實(shí)在暴露于低氧條件的細(xì)胞中有明顯更多的病毒復(fù)制和感染。當(dāng)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行測(cè)量時(shí)，dsRed2表達(dá)的差異至少為100倍，這由噬斑形成分析證實(shí)。E1A蛋白的Western印跡分析表明E1A僅在被置于低氧條件下的細(xì)胞中以顯著水平表達(dá)。
實(shí)施例4條件復(fù)制型載體的體內(nèi)復(fù)制用HRP-EGFP構(gòu)建體轉(zhuǎn)導(dǎo)的HCT116細(xì)胞(見圖1)用于在裸鼠中建立腫瘤。攜帶這些腫瘤的小鼠然后用攜帶紅色熒光蛋白的腺病毒載體(AdHRP-E1A-dsRed2；見圖2)感染。腫瘤細(xì)胞表達(dá)在HRP控制下的EGFP蛋白，而病毒載體編碼紅色熒光標(biāo)記，從而使得可以比較病毒復(fù)制和腫瘤低氧的相對(duì)表達(dá)模式。
報(bào)道基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的HCT116細(xì)胞皮下注射進(jìn)裸鼠中。腫瘤生長(zhǎng)3-4周，長(zhǎng)至直徑8-10mm。以1×108噬斑形成單位(pfu)的劑量腫瘤內(nèi)注射AdHRP-E1A-dsRed2。3-10天后處死動(dòng)物，切下腫瘤進(jìn)行切片分析。低氧應(yīng)答載體在低氧區(qū)域復(fù)制效率極高，導(dǎo)致dsRed2高水平表達(dá)。dsRed2的表達(dá)與EGFP的表達(dá)一致，說(shuō)明腫瘤低氧區(qū)域的選擇性。另外，低氧應(yīng)答啟動(dòng)子顯示出比在CMV啟動(dòng)子控制下的非復(fù)制型腺病毒載體Ad-CMV-dsRed2基因有極大的優(yōu)勢(shì)。用復(fù)制缺陷型dsRed2病毒感染的細(xì)胞顯示出在感染的腫瘤區(qū)域和熒光強(qiáng)度方面均效率較低。這些結(jié)果證實(shí)低氧選擇性復(fù)制型腺病毒的明顯優(yōu)勢(shì)。
實(shí)施例5體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)抑制HCT116(人結(jié)腸癌)細(xì)胞以3.0×106細(xì)胞/小鼠皮下注射進(jìn)裸鼠。當(dāng)腫瘤達(dá)到直徑5-10mm時(shí)，腫瘤內(nèi)注射病毒載體。對(duì)照組(圖6B，實(shí)心方塊)用AdCMV-dsRed2(圖5)注射，而治療組(圖6B，實(shí)心三角)用AdHRP-E1A-TNF-α(圖6A)注射，其是包含與HRP可操縱連接的E1A基因和包含組成型表達(dá)的TNF-α基因的條件復(fù)制型腺病毒載體。每個(gè)腫瘤用2.0×109pfu的合適病毒進(jìn)行腫瘤內(nèi)注射。每2-3天確定腫瘤體積。通過(guò)將第0天(即在即將注射載體前的時(shí)間點(diǎn))每個(gè)腫瘤的體積設(shè)為1.0而計(jì)算相對(duì)體積。如圖6B所示，用條件復(fù)制型腺病毒載體注射的腫瘤比對(duì)照生長(zhǎng)顯著慢。
實(shí)施例6E1-缺陷的AdCMV-EGFP在存在條件復(fù)制型腺病毒載體時(shí)的復(fù)制測(cè)試了條件復(fù)制型腺病毒載體支持復(fù)制缺陷型腺病毒載體的復(fù)制的能力。構(gòu)建了一種復(fù)制缺陷型腺病毒載體，AdCMV-EGFP(見圖5)，其編碼一種組成型活性的EGFP基因。在這一載體中，E1和E3基因被缺失，EGFP基因(在組成型活性CMV啟動(dòng)子控制下)被插入病毒的E1區(qū)。使用上述編碼組成型活性dsRed蛋白的條件復(fù)制型腺病毒載體AdHRP-E1A-dsRed2(見圖2)。
90％鋪滿的HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞用兩種載體的每一種以每個(gè)病毒感染復(fù)數(shù)(MOI)為0.5感染。感染后5小時(shí)，將細(xì)胞置于Bactron室中的低氧條件(1％O2濃度)下24小時(shí)。在低氧保溫后，將細(xì)胞進(jìn)一步在含氧量正常條件下保溫24小時(shí)。然后用熒光顯微術(shù)觀察細(xì)胞中EGFP和dsRed表達(dá)。絕大多數(shù)細(xì)胞對(duì)兩種熒光標(biāo)記均為陽(yáng)性，或者對(duì)于兩種熒光標(biāo)記均為陰性。極少數(shù)細(xì)胞僅一種標(biāo)記或另一種標(biāo)記呈陽(yáng)性。存在兩種熒光標(biāo)記均呈陽(yáng)性的細(xì)胞表明用條件復(fù)制型載體共感染細(xì)胞使得復(fù)制缺陷型腺病毒能復(fù)制并有效表達(dá)編碼的基因。
參考文獻(xiàn)下列參考文獻(xiàn)和說(shuō)明書中所引用的參考文獻(xiàn)在此并入?yún)⒖家匝a(bǔ)充、解釋、提供背景知識(shí)或教導(dǎo)本文所用的方法學(xué)、技術(shù)和/或組合物。
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應(yīng)理解在不偏離本發(fā)明的范圍的前提下可對(duì)本發(fā)明加以各種改變。另外，前文的描述只是例證了本發(fā)明而無(wú)限制之意。
序 列 表序列表<110>杜克大學(xué)<120>應(yīng)用在腫瘤低氧區(qū)域中選擇性復(fù)制的重組腺病毒載體的靶向腫瘤治療<130>180/156<160>2<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>60<212>DNA<213>Cytomegalovirus<400>1gatctgacgg ttcactaaac gagctctgct tatatagacc tcccaccgta cacgcctacc60<210>2<211>35<212>DNA<213>Homo sapiens<400>2ccacagtgca tacgtgggct ccaacaggtc ctctt3權(quán)利要求
1.一種腺病毒載體，其包含在轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件(TRE)的轉(zhuǎn)錄控制下的腺病毒基因，所述TRE包含一個(gè)最小啟動(dòng)子和一個(gè)低氧應(yīng)答元件(HRE)。
2.權(quán)利要求1的腺病毒載體，其中腺病毒基因選自E1A基因、E1B基因、E2A基因、E2B基因和E4基因。
3.權(quán)利要求1的腺病毒載體，其進(jìn)一步包含在TRE的轉(zhuǎn)錄控制下的第二種腺病毒基因。
4.權(quán)利要求1的腺病毒載體，其中所述最小啟動(dòng)子選自巨細(xì)胞病毒(CMV)最小啟動(dòng)子、人肌動(dòng)蛋白最小啟動(dòng)子、人EF2最小啟動(dòng)子及腺病毒E1B最小啟動(dòng)子。
5.權(quán)利要求4的腺病毒載體，其中CMV最小啟動(dòng)子包含SEQ IDNO1。
6.權(quán)利要求1的腺病毒載體，其中HRE衍生自人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)啟動(dòng)子。
7.權(quán)利要求6的腺病毒載體，其中HRE包含SEQ ID NO2。
8.權(quán)利要求7的腺病毒載體，其中HRE包含SEQ ID NO2的5個(gè)串聯(lián)拷貝。
9.權(quán)利要求1的腺病毒載體，其進(jìn)一步包含一個(gè)轉(zhuǎn)基因。
10.權(quán)利要求9的腺病毒載體，其中所述轉(zhuǎn)基因是第二種腺病毒基因。
11.權(quán)利要求9的腺病毒載體，其中所述轉(zhuǎn)基因編碼一種免疫刺激分子。
12.權(quán)利要求11的腺病毒載體，其中所述免疫刺激分子選自IL-2和IL-12。
13.權(quán)利要求9的腺病毒載體，其中所述轉(zhuǎn)基因是一種自殺基因。
14.權(quán)利要求13的腺病毒載體，其中所述自殺基因選自TNF-α基因、Trai1基因、Bax基因、HSV-tk基因、胞嘧啶脫氨酶基因、p450基因、白喉毒素基因、s-Flt1基因和ex-Flk1基因。
15.一種包含權(quán)利要求1的腺病毒載體的組合物。
16.權(quán)利要求15的組合物，其進(jìn)一步包含一種藥物可接受的載體。
17.一種抑制腫瘤生長(zhǎng)的方法，所述方法包括將腫瘤內(nèi)低氧細(xì)胞與權(quán)利要求1的腺病毒載體接觸，從而載體進(jìn)入細(xì)胞并抑制腫瘤生長(zhǎng)。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述接觸是通過(guò)腫瘤內(nèi)注射給予腺病毒載體而達(dá)到的。
19.權(quán)利要求17的方法，其中所述接觸是通過(guò)靜脈內(nèi)注射給予腺病毒載體而達(dá)到的。
20.權(quán)利要求17的方法，其進(jìn)一步包括將腫瘤暴露于治療有效量的第二種處理，所述第二種處理選自電離輻射、化療、及光動(dòng)力治療。
21.一種包含權(quán)利要求1的腺病毒載體的宿主細(xì)胞。
22.一種賦予靶細(xì)胞選擇性胞毒性的方法，所述方法包括將允許HRE發(fā)揮功能的細(xì)胞與權(quán)利要求1的腺病毒載體接觸，從而腺病毒載體進(jìn)入細(xì)胞中。
23.一種在表達(dá)HIF-1的靶組織中選擇性增殖腺病毒的方法，所述方法包括將靶組織與權(quán)利要求1的腺病毒接觸，從而腺病毒被增殖達(dá)到效價(jià)為至少1.0×107pfu/ml。
24.一種抑制靶組織生長(zhǎng)的方法，所述方法包括(a)將靶組織中低氧細(xì)胞與第一種腺病毒載體接觸，從而第一種腺病毒載體進(jìn)入細(xì)胞；及(b)將低氧細(xì)胞與一種復(fù)制缺陷型腺病毒載體接觸，從而所述復(fù)制缺陷型腺病毒載體進(jìn)入細(xì)胞。
25.權(quán)利要求24的方法，其中所述靶組織是腫瘤。
26.權(quán)利要求24的方法，其中第一種腺病毒載體包含在含HRE的TRE的轉(zhuǎn)錄控制下的一種腺病毒基因。
27.權(quán)利要求24的方法，其中所述復(fù)制缺陷型腺病毒載體包含第二種基因。
28.權(quán)利要求27的方法，其中所述復(fù)制缺陷型腺病毒載體包含在一個(gè)組成型啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制下的第二種基因。
29.權(quán)利要求27的方法，其中所述復(fù)制缺陷型腺病毒載體包含在含HRE的TRE的轉(zhuǎn)錄控制下的第二種基因。
30.權(quán)利要求24的方法，其中(a)第一種腺病毒載體包含在含HRE的TRE轉(zhuǎn)錄控制下的至少兩個(gè)腺病毒必需基因；及(b)第一種腺病毒載體中的在含HRE的TRE的轉(zhuǎn)錄控制下的所述腺病毒必需基因中的至少兩個(gè)在所述復(fù)制缺陷型腺病毒載體中是缺陷型的。
31.權(quán)利要求30的方法，其中所述兩個(gè)腺病毒必需基因每一個(gè)均選自E1A基因、E1B基因、E2A基因、E2B基因和E4基因。
32.權(quán)利要求27的方法，其中第二種基因是自殺基因。
33.權(quán)利要求32的方法，其中自殺基因選自TNF-α基因、Trail基因、Bax基因、HSV-tk基因、胞嘧啶脫氨酶基因、p450基因、和白喉毒素基因、s-Flt1基因及ex-Flk1基因。
34.權(quán)利要求27的方法，其中第二種基因編碼一種免疫刺激分子。
35.權(quán)利要求32的方法，其中所述免疫刺激分子選自IL-2和IL-12。
36.權(quán)利要求24的方法，其進(jìn)一步包括將靶組織暴露于治療有效量的第二種治療，所述第二種治療選自電離輻射、化療和光動(dòng)力治療。
全文摘要
本發(fā)明提供了條件復(fù)制型腺病毒載體，其賦予表達(dá)HIF－1的細(xì)胞選擇性胞毒性，通過(guò)感染細(xì)胞以允許載體內(nèi)存在的HIF－1可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子發(fā)揮功能而進(jìn)行。本發(fā)明還提供了基于所述載體的組合物和宿主細(xì)胞，以及增殖和使用所述載體的方法。本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種抑制腫瘤生長(zhǎng)的方法，通過(guò)用條件復(fù)制型腺病毒載體聯(lián)合復(fù)制缺陷型腺病毒載體一起感染腫瘤內(nèi)細(xì)胞而進(jìn)行。
文檔編號(hào)C12N15/861GK1720066SQ200380104707
公開日2006年1月11日 申請(qǐng)日期2003年10月1日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月1日
發(fā)明者李川源, 黃倩, 馬克·W.·德沃斯特 申請(qǐng)人:杜克大學(xué)