專利名稱：編碼5－烯醇丙酮莽草酸－3－磷酸合酶(epsps)的表達(dá)盒和包含它的除草劑耐受植物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含編碼5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)的核酸序列的新表達(dá)盒以及它用于獲得抑制此酶的抗除草劑的植物，尤其是膦酸家族的除草劑，特別是N-膦酰甲基甘氨酸家族。
目前技術(shù)水平農(nóng)業(yè)的主要問題之一是在農(nóng)作物生長區(qū)域控制不需要的自身繁殖植物或野草發(fā)育。野草繁衍導(dǎo)致農(nóng)作物削弱以及培育它們的產(chǎn)量減少。為抗擊這些不需要的植物，一般使用除草劑噴射到農(nóng)作物上。
存在許多類型的除草劑，特別是選擇性除草劑，它們僅作用于一組特定植物而不影響農(nóng)作物。選擇性除草劑的缺點(diǎn)是它們的活性譜通常受限制，需要使用具有不同活性譜的其它選擇性除草劑以有效控制野草。此缺點(diǎn)的解決方法是使用能作用于所有植物的總除草劑?？偝輨┑陌型ǔＪ菂⑴c植物重要代謝途徑的酶，使它們具有對遠(yuǎn)緣系統(tǒng)發(fā)育來源的植物有廣譜活性的優(yōu)點(diǎn)。然而，這種除草劑也有主要缺點(diǎn)，當(dāng)它們施用于農(nóng)作物以去除野草時(shí)，它們也作用于農(nóng)作物?？朔巳秉c(diǎn)可通過使用對所述除草劑耐受的農(nóng)作物。這種植物一般通過遺傳工程獲得，通過將編碼抗所述除草劑的酶的基因引入其基因組，從而使它們在其組織中過度表達(dá)所述酶。
EPSPS是參與莽草酸生物合成途徑的質(zhì)體酶，引起芳族氨基酸合成。已知EPSPS是膦酰甲基甘氨酸類型的膦酸家族除草劑的靶酶。抑制5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)的除草劑是作為很有效的葉除草劑而熟知的。此除草劑種類中最熟知的除草劑是草甘膦[N-(膦酰甲基)甘氨酸]。也已知磺酸鹽或fosametine。草甘膦的特征是缺乏對農(nóng)作物種類的選擇性，因此一般在不需要選擇性的條件下使用，例如作為總除草劑。
為克服草甘膦選擇性的問題，已開發(fā)了對此除草劑耐受的植物，通過用編碼草甘膦-耐受EPSPS酶的基因轉(zhuǎn)化所述植物。編碼草甘膦-耐受EPSPS酶的基因特別描述于專利申請EP 0837944。尤其是，草甘膦-耐受的玉米和大豆分別以Roundup-Ready CornTM和Roundup-Ready SoybeanTM的商標(biāo)出售。這樣，草甘膦能施用于農(nóng)作物而不影響已對其耐受的農(nóng)作物。
此策略的成功基本上是基于想要變成耐受的植物組織中酶表達(dá)的質(zhì)量和數(shù)量。這些表達(dá)質(zhì)量和數(shù)量的參數(shù)由引入表達(dá)盒的調(diào)節(jié)元件控制，表達(dá)盒有編碼所述EPSPS酶的核酸序列。對表達(dá)盒必需的調(diào)節(jié)元件是啟動(dòng)子調(diào)節(jié)序列和終止子調(diào)節(jié)序列。表達(dá)盒也能包含信號(hào)肽或轉(zhuǎn)運(yùn)肽以及轉(zhuǎn)錄激活元件或增強(qiáng)子。然而，對表達(dá)盒中核酸系列編碼蛋白表達(dá)的質(zhì)量和數(shù)量貢獻(xiàn)最大的調(diào)節(jié)元件是啟動(dòng)子。鑒定適用于表達(dá)特定蛋白的啟動(dòng)子也主要取決于所述蛋白的性質(zhì)，尤其是所述蛋白表達(dá)的所需數(shù)量和質(zhì)量。與特定啟動(dòng)子相關(guān)的是它控制的核酸序列所編碼產(chǎn)物表達(dá)的量以及此表達(dá)的質(zhì)量，特別是時(shí)空的質(zhì)量。此外，一些啟動(dòng)子是組成型的且其它是誘導(dǎo)型的。
用于植物中想要表達(dá)EPSPS酶的表達(dá)盒中啟動(dòng)子的一個(gè)重要特征是它應(yīng)允許定量表達(dá)，足以賦予草甘膦耐受性給可能受此除草劑影響的植物的所有組織。
本發(fā)明的技術(shù)問題在于獲得表達(dá)盒，其中啟動(dòng)子特別適用于在轉(zhuǎn)化植物中定量和定性表達(dá)EPSPS酶，所述表達(dá)盒然后賦予所述植物對抑制此酶的除草劑的有效耐受性，特別是膦酰甲基甘氨酸家族的除草劑，特別是草甘膦。
允許高水平表達(dá)的啟動(dòng)子一般是高表達(dá)蛋白的啟動(dòng)子。在滿足這些標(biāo)準(zhǔn)的最常用啟動(dòng)子中，作為例子提到細(xì)菌啟動(dòng)子如章魚氨酸合酶基因或胭脂氨酸合酶基因的啟動(dòng)子，病毒啟動(dòng)子如花椰菜花葉病毒35S或19S RNAs的轉(zhuǎn)錄控制基因的啟動(dòng)子(Odell等.，1985，Nature，313，810-812)或者木薯葉脈花葉病毒的啟動(dòng)子(如專利申請WO 97/48819所述)。在植物來源的啟動(dòng)子中，提到核酮糖-二羧化酶/加氧酶(RuBisCO)小亞基基因的啟動(dòng)子、專利申請EP 0 507 698所述組蛋白基因的啟動(dòng)子或水稻肌動(dòng)蛋白基因的啟動(dòng)子(US 5,641,876)。
其它啟動(dòng)子特定在某些組織的細(xì)胞中表達(dá)。這種啟動(dòng)子一般是調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)的啟動(dòng)子，蛋白參與特定組織或器官的功能。在植物中，已知根-特異性啟動(dòng)子如專利申請WO 00/29594所述，花-特異性啟動(dòng)子如專利申請WO 98/22593、WO 99/15679或WO 99/43818所述，果實(shí)-特異性啟動(dòng)子，特別是種子-特異性啟動(dòng)子如專利申請WO 91/13993、WO 92/17580、WO 98/45460、WO 98/45461或WO 99/16890所述。
描述本發(fā)明涉及新表達(dá)盒，表達(dá)盒包括以轉(zhuǎn)錄方向彼此功能性連接的在植物細(xì)胞或植物中有功能的啟動(dòng)子調(diào)節(jié)序列、編碼5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)的核酸序列和在植物細(xì)胞或植物中有功能的終止序列，特征在于啟動(dòng)子調(diào)節(jié)序列是選自CsVMV(木薯葉脈花葉病毒)植物病毒啟動(dòng)子調(diào)節(jié)序列的核酸序列。
表達(dá)語“彼此功能性連接”指所述嵌合基因元件以彼此相連的方式使它們的功能協(xié)同且能表達(dá)編碼序列。例如，當(dāng)能確保所述編碼序列表達(dá)時(shí)，啟動(dòng)子與編碼序列功能性連接。構(gòu)建根據(jù)發(fā)明的嵌合基因和其不同元件的裝配可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)完成，特別是Sambrook等.(1989，《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊》(Molecular CloningA Laboratory Manual)，Nolan C.編輯.，New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press)所述技術(shù)。表達(dá)語“在植物細(xì)胞或植物中有功能”指能在植物細(xì)胞或植物中發(fā)揮功能。
CsVMV啟動(dòng)子調(diào)節(jié)序列描述于專利申請WO 97/48819(其內(nèi)容納入本文供參考)，特別是包括專利申請WO 97/48819的一種序列標(biāo)識(shí)符SEQ ID No.1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16代表的核苷酸序列之一的啟動(dòng)子調(diào)節(jié)序列，更特別是專利申請WO 97/48819的序列標(biāo)識(shí)符SEQ ID 3代表的核苷酸序列。
根據(jù)發(fā)明的第一個(gè)較佳實(shí)施方案，表達(dá)盒的啟動(dòng)子調(diào)節(jié)序列以轉(zhuǎn)錄方向包括核酸序列X、Y和Z，它們分別由本專利申請的SEQ ID NO 1、2和3定義。
根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的表達(dá)盒啟動(dòng)子調(diào)節(jié)序列由本專利申請的SEQ ID NO 4表示。
根據(jù)發(fā)明的第二個(gè)較佳實(shí)施方案，表達(dá)盒的啟動(dòng)子調(diào)節(jié)序列以轉(zhuǎn)錄方向包括上面定義的核酸序列X、Y、Y和Z。含重復(fù)核酸序列Y的啟動(dòng)子調(diào)節(jié)序列稱為雙CsVMV。雙CsVMV的核酸序列優(yōu)選由本專利申請的SEQ ID NO 5表示。
本發(fā)明也涉及能與上面核酸序列選擇性雜交的序列、與上面序列同源的序列和所述序列的功能片段。
根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“核酸序列”指核苷酸或多核苷酸序列，可以是DNA或RNA類型，優(yōu)選DNA類型，特別是雙鏈的。
根據(jù)發(fā)明，表達(dá)語“能選擇性雜交的序列”指與上面序列雜交的序列，雜交水平顯著大于背景噪音。背景噪音可能與現(xiàn)有其它DNA序列雜交有關(guān)，特別是cDNA文庫中存在的其它c(diǎn)DNA。能選擇性雜交的序列與上面根據(jù)發(fā)明的SEQ ID所定義序列間的相互作用產(chǎn)生的信號(hào)水平一般比產(chǎn)生背景噪音的其它DNA序列相互作用的信號(hào)水平強(qiáng)10倍，優(yōu)選100倍。相互作用水平可測量，例如用放射性元素如32P標(biāo)記探針。選擇性雜交一般在很嚴(yán)格的介質(zhì)條件下獲得(例如0.03M NaCl和0.03M檸檬酸鈉，約50℃-60℃)。雜交當(dāng)然可以根據(jù)當(dāng)前技術(shù)水平的常規(guī)方法完成(特別是Sambrook等.，1989，《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊》)。
根據(jù)發(fā)明，術(shù)語“同源”指相對編碼發(fā)明融合蛋白的核苷酸序列表現(xiàn)出一種或多種序列修飾的核酸片段。這些修飾可根據(jù)常規(guī)突變技術(shù)獲得，或另外選擇合成寡核苷酸，寡核苷酸用于通過雜交制備所述序列。關(guān)于可能引起相同氨基酸表達(dá)的多種核酸組合，根據(jù)發(fā)明的參考序列與相應(yīng)同系物間有很大的差異。相對參考序列的同源程度有利地為至少70％，優(yōu)選至少80％，更優(yōu)選至少90％。這些修飾一般且優(yōu)選為中性，即它們不影響融合蛋白的一級序列。
測量和鑒定核酸序列間同源性的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的?？墒褂美鏟ILEUP或BLAST程序(特別是Altschul等.，1993，J.Mol.Evol.36290-300；Altschul等.，1990，J.Mol.Biol.215403-10)。
測量和鑒定多肽或蛋白間同源性的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的?？墒褂美鏤WGCG包和BESTFITT程序來計(jì)算同源性(Deverexu等.，1984，Nucleic Acid Res.12，387-395)。
根據(jù)發(fā)明，術(shù)語“片段”指根據(jù)發(fā)明的DNA序列片段，即上面已缺失部分但保持所述序列功能的序列。
根據(jù)發(fā)明，術(shù)語“EPSPS”指任何天然或突變的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶，其酶活性在于從磷酸烯醇丙酮酸(PEP)和3-磷酸莽草酸合成5-0-(1-羧乙烯基)-3-磷酸莽草酸(E.C.2.5.1.19；Morell等.，1967，J.Biol.Chem.242，82-90)。特別所述EPSPS酶可源自于任何類型的生物體。根據(jù)發(fā)明的EPSPS酶也具有耐受膦酰甲基甘氨酸家族除草劑的性質(zhì)，特別是對于草甘膦。
已知編碼EPSPS的序列自然耐受膦酰甲基甘氨酸家族的除草劑，特別是草甘膦，或如此使用這些序列。例如，提到細(xì)菌鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)的AroA基因序列(Comai等.，1983，Science 221，370-371)、細(xì)菌農(nóng)桿菌(Agrobacterium)屬的CP4基因序列(WO 92/04449)或者編碼矮牽牛EPSPS(Shah等.，1986，Science 233，478-481)、番茄EPSPS(Gasser等.，1988，J.Biol.Chem.263，4280-4289)或參屬(Eleusine)EPSPS(WO 01/66704)的基因序列。
也已知通過突變使編碼EPSPS的序列對草甘膦耐受。例如，提到編碼細(xì)菌來源(Stalker等.，1985，J.Biol.Chem.260(8)，4724-4728)或植物來源(EP0293358；Ruff等.，1991，Plant Physiol.96(S)，摘要592；WO 91/04323；WO 92/06201；EP 0837944)的突變EPSPS的基因序列。編碼根據(jù)發(fā)明優(yōu)選的突變植物EPSPS的基因序列編碼專利申請EP 0837944所述的玉米EPSPS，包括用異亮氨酸在102位取代蘇氨酸的第1個(gè)突變和用絲氨酸在106位取代脯氨酸的第2個(gè)突變。由于EPSPS間強(qiáng)的序列同源性，更特別在植物EPSPS間，攜帶相同突變的水稻EPSPS也描述于專利申請WO 00/66746和WO 00/66747。一般，本發(fā)明可使用任何EPSPS和編碼它們的基因，基因攜帶上述蘇氨酸/異亮氨酸和脯氨酸/絲氨酸突變，無論這些氨基酸相對玉米EPSPS的102位和106位的相對位置如何。為了應(yīng)用此原理，本領(lǐng)域技術(shù)人員通過使用序列排列的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)容易在任何EPSPS序列中找到待突變的2種氨基酸。
根據(jù)發(fā)明的較佳實(shí)施方案，編碼表達(dá)盒中所含EPSPS的核酸序列是編碼氨基酸突變的EPSPS的序列，氨基酸突變對應(yīng)于102位的蘇氨酸和106位的脯氨酸，所述位置相對于玉米EPSPS序列。
根據(jù)發(fā)明的另一個(gè)較佳實(shí)施方案，編碼表達(dá)盒中所含EPSPS的核酸序列是編碼突變的EPSPS的序列，包括102位的異亮氨酸和106位的絲氨酸，所述位置相對于玉米EPSPS序列。
根據(jù)發(fā)明的又一個(gè)較佳實(shí)施方案，編碼表達(dá)盒中所含EPSPS的核酸序列是編碼玉米突變的EPSPS的序列，包括102位的異亮氨酸和106位的絲氨酸。
在可用于根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)盒的終止序列中，提到例如編碼根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)胭脂氨酸合酶的基因的nos終止序列(Bevan等.，1983，Nucleic Acids Res.11(2)，369-385)或如專利申請EP 0 633 317所述組蛋白基因的終止序列。
根據(jù)發(fā)明的表達(dá)盒也可包括編碼信號(hào)肽或轉(zhuǎn)運(yùn)肽的亞細(xì)胞定址序列(？addressing sequence)。這種序列位于編碼EPSPS的核酸序列上游或下游，能指導(dǎo)所述EPSPS特異地到宿主生物體的細(xì)胞區(qū)室中。例如，表達(dá)盒可包括編碼信號(hào)肽或轉(zhuǎn)運(yùn)肽的序列用于指導(dǎo)EPSPS到特定的細(xì)胞質(zhì)區(qū)室中，如線粒體、胞質(zhì)內(nèi)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或液泡。
這種序列的作用特別描述于期刊Plant Molecular Biology(1998)38期，大部分是關(guān)于將蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到植物細(xì)胞的不同區(qū)室中(在植物細(xì)胞中分選蛋白到液泡，127-144頁；核孔復(fù)合體，145-162頁；蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到和穿過葉綠體包膜(envelopemembranes)，91-207頁；靶向葉綠體中類囊體蛋白的多種途徑，209-221頁；植物中的線粒體蛋白輸入，311-338頁)。
根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，轉(zhuǎn)運(yùn)肽可以是葉綠體或線粒體定址信號(hào)，它然后在葉綠體或線粒體中被切割。
轉(zhuǎn)運(yùn)肽可以是單或雙轉(zhuǎn)運(yùn)肽。雙轉(zhuǎn)運(yùn)肽任選通過中間序列分離，即它們以轉(zhuǎn)錄方向包括編碼植物基因轉(zhuǎn)運(yùn)肽的序列，植物基因編碼位于質(zhì)體的酶、植物基因成熟N-末端部分的一部分序列，植物基因編碼位于質(zhì)體的酶、以及然后編碼植物基因第二種轉(zhuǎn)運(yùn)肽的序列，植物基因編碼位于質(zhì)體的酶。例如，這些雙轉(zhuǎn)運(yùn)肽描述于專利申請EP 0 508 909。
根據(jù)發(fā)明，表達(dá)盒也可包括其它調(diào)節(jié)序列，調(diào)節(jié)序列位于啟動(dòng)子和編碼序列間，如轉(zhuǎn)錄激活物(增強(qiáng)子)，例如專利申請WO 87/07644所述煙草花葉病毒(TMV)、Carrington和Freed所述煙草蝕紋病毒(TEV)或玄參花葉病毒(US 5 994 521)的轉(zhuǎn)錄激活物。根據(jù)發(fā)明的表達(dá)盒也可包含內(nèi)含子，特別是促進(jìn)單子葉植物中基因表達(dá)的內(nèi)含子，如專利申請WO 99/34005所述水稻肌動(dòng)蛋白基因的內(nèi)含子1或玉米adh1內(nèi)含子，或者是促進(jìn)雙子葉植物基因表達(dá)的內(nèi)含子，如擬南芥屬組蛋白內(nèi)含子(EP 0850311)。
本發(fā)明也涉及克隆和/或表達(dá)載體，包括根據(jù)發(fā)明的表達(dá)盒。根據(jù)發(fā)明的載體用于轉(zhuǎn)化宿主生物體，特別是植物，并在其中表達(dá)EPSPS。此載體可以是質(zhì)粒、粘粒、噬菌體或病毒。用于轉(zhuǎn)化根據(jù)發(fā)明的植物細(xì)胞或植物的載體優(yōu)選是質(zhì)粒。一般，此載體的主要性質(zhì)應(yīng)是在宿主生物體細(xì)胞中維持本身和自身復(fù)制的能力，特別是通過復(fù)制起點(diǎn)的存在，以及在其中表達(dá)EPSPS的能力。選擇這種載體以及將根據(jù)發(fā)明的表達(dá)盒插入其中的技術(shù)廣泛描述于Sambrook等。(1989，《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊》，Nolan C.編輯.，New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press)且是本領(lǐng)域技術(shù)人員的一般知識(shí)的一部分。除根據(jù)發(fā)明的表達(dá)盒之外，本發(fā)明所用載體也有利地包含另一個(gè)含選擇標(biāo)記的表達(dá)盒。此選擇標(biāo)記能選擇有效轉(zhuǎn)化的宿主生物體，即摻入載體的生物體。根據(jù)發(fā)明的一個(gè)特定實(shí)施方案，待轉(zhuǎn)化的宿主生物體是植物。在可使用的選擇標(biāo)記中，提到的標(biāo)記包含抗生素抗性基因，例如潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(Gritz等.，1983，Gene 25179-188)，也提到含除草劑耐受基因的標(biāo)記，如用于耐受雙丙氨膦的bar基因(White等.，NAR 181062，1990)、用于耐受草甘膦的EPSPS基因(EP 0837944)或另外用于耐受異唑的HPPD基因(WO 96/38567)。同樣提到編碼易鑒定酶如GUS酶的基因和編碼色素或酶的基因，酶調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化細(xì)胞中的色素生成。這種選擇標(biāo)記基因特別描述于專利申請WO 91/02071、WO 95/06128、WO 96/38567和WO 97/04103。
本發(fā)明也涉及用上述載體轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞。術(shù)語“轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞”指將根據(jù)發(fā)明的表達(dá)盒摻入其基因組的植物細(xì)胞，因而產(chǎn)生EPSPS。為獲得根據(jù)發(fā)明的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，本領(lǐng)域技術(shù)人員可使用許多已知的轉(zhuǎn)化方法之一。這些方法之一是使待轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞接觸聚乙二醇(PEG)和發(fā)明的載體(Chang和Cohen，1979，Mol.Gen.Genet.168(1)，111-115；Mercenier和Chassy，1988，Biochimie 70(4)，503-517)。電穿孔是另一種方法，使待轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞或組織和發(fā)明載體經(jīng)受電場(Andreason和Evans，1988，Biotechniques 6(7)，650-660；Shigekawa和Dower，1989，Aust.J.Biotechnol.3(1)，56-62)。另一種方法是通過微注射將載體直接注射到植物細(xì)胞或植物組織中(Gordon和Ruddle，1985，Gene 33(2)，121-136)?？捎欣厥褂谩吧飳?dǎo)彈”法。它是用粒子轟擊植物細(xì)胞或植物組織，發(fā)明的載體吸收于粒子上((Bruce等.，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(24)，9692-9696；Klein等.，1992，Biotechnology10(3)，286-291；美國專利號(hào)4,945,050)。轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞優(yōu)選用農(nóng)桿菌屬細(xì)菌完成，優(yōu)選通過用根癌農(nóng)桿菌(Knopf，1979，Subcell.Biochem.6，143-173；Shaw等.，1983，Gene23(3)315-330)或發(fā)根農(nóng)桿菌(A.rhizogenes)(Bevan和Chilton，1982，Annu.Rev.Genet.16357-384；Tepfer和Casse-Delbart，1987，Microbiol.Sci.4(1)，24-28)感染所述植物細(xì)胞或組織。用根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞優(yōu)選根據(jù)Ishida等所述方案(1996，Nat.Biotechnol.14(6)，745-750)完成。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)根據(jù)待轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的性質(zhì)選擇適當(dāng)方法。
本發(fā)明的一個(gè)主題是產(chǎn)生對EPSPS-抑制除草劑耐受的植物的方法，特別是膦酰甲基甘氨酸家族的除草劑，特別是草甘膦。此方法是從上述轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞中再生轉(zhuǎn)化植物。通過此方法，根據(jù)發(fā)明的轉(zhuǎn)化植物的基因組中包含根據(jù)發(fā)明的表達(dá)盒且在其組織中表達(dá)EPSPS。
因此，本發(fā)明包括含根據(jù)發(fā)明的表達(dá)盒的轉(zhuǎn)化植物、這些植物的部分和這些植物的后代。表達(dá)語“這些植物的部分”指這些植物的任何器官，無論是地上或是地下。地上器官是莖、葉和花。地下器官主要是根，但它們也可以是塊莖。術(shù)語“后代”主要指種子，種子包含衍生自自這些植物彼此再生的胚。通過擴(kuò)展，術(shù)語“后代”應(yīng)用于在各新生代形成的所有種子，各代來源于植物與根據(jù)發(fā)明方法轉(zhuǎn)化的植物間的雜交。
因此，本發(fā)明的一個(gè)主題是轉(zhuǎn)化植物，有至少1個(gè)根據(jù)發(fā)明的表達(dá)盒以穩(wěn)定方式整合到基因組中。
因而轉(zhuǎn)化的植物耐受EPSPS-抑制除草劑，特別是膦酰甲基甘氨酸家族的除草劑，特別是草甘膦。
根據(jù)發(fā)明的轉(zhuǎn)化植物也包括來源于生長和/或雜交上面植物的轉(zhuǎn)化植物，同樣包括這些植物的種子。
當(dāng)然，除根據(jù)發(fā)明的表達(dá)盒之外，根據(jù)發(fā)明的轉(zhuǎn)化細(xì)胞和植物可包括至少1個(gè)其它表達(dá)盒，表達(dá)盒包含編碼感興趣蛋白的多核苷酸。在編碼感興趣蛋白的多核苷酸中，提到編碼另一種抗除草劑的酶的多核苷酸，例如用于編碼耐受雙丙氨膦的bar酶的多核苷酸(White等.，NAR 181062，1990)、或用于編碼耐受異唑的HPPD酶的多核苷酸(WO 96/38567；WO 99/24585；WO 99/24586)。也提到編碼殺蟲毒素的多核苷酸，例如編碼細(xì)菌蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)毒素的多核苷酸(例如參見國際專利申請WO 98/40490)。其它抗疾病的多核苷酸也能包含于這些植物，例如專利申請EP 0 531 498或美國專利5,866,778所述編碼草酸氧化酶的多核苷酸或編碼抗細(xì)菌和/或抗真菌肽的多核苷酸，如專利申請WO 97/30082、WO 99/24594、WO 99/02717、WO 99/53053和WO 99/91089所述。同樣提到編碼植物農(nóng)藝學(xué)特征的多核苷酸，特別是美國專利5,552,306和US 5,614,313及專利申請WO 98/46763和WO 98/46764所述編碼δ-6去飽和酶的多核苷酸或編碼專利申請WO 00/01833和WO 00/36127所述編碼絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶(SAT)的多核苷酸。
另外的表達(dá)盒也可通過根據(jù)發(fā)明的載體整合。在此情況中，載體包括根據(jù)發(fā)明的表達(dá)盒和至少1個(gè)編碼另一感興趣蛋白的表達(dá)盒。
它們也可通過至少1個(gè)其它載體整合，載體包括所述另外的表達(dá)盒，根據(jù)上面定義的常規(guī)技術(shù)。
根據(jù)發(fā)明的植物也能通過雜交親代獲得，1個(gè)親代攜帶根據(jù)發(fā)明的表達(dá)盒，另1個(gè)攜帶編碼至少1種其它感興趣蛋白的另一表達(dá)盒。
根據(jù)發(fā)明的轉(zhuǎn)化植物可以是單子葉植物或雙子葉植物。這些植物優(yōu)選是具有農(nóng)藝學(xué)興趣的植物。單子葉植物有利地是小麥、玉米或水稻，雙子葉植物有利地是油菜、大豆、煙草或棉花。
本發(fā)明也涉及關(guān)于EPSPS-抑制除草劑保護(hù)農(nóng)作物的方法，特別是膦酰甲基甘氨酸家族的除草劑，特別是草甘膦，特征在于所述植物用載體轉(zhuǎn)化，載體包括根據(jù)發(fā)明的表達(dá)盒。
本發(fā)明同樣涉及根據(jù)發(fā)明處理植物的方法，特征在于所述植物用EPSPS-抑制除草劑處理，特別是膦酰甲基甘氨酸家族的除草劑，特別是草甘膦。
本發(fā)明也涉及控制農(nóng)作物中野草的方法，特征在于培育包含根據(jù)發(fā)明的表達(dá)盒的轉(zhuǎn)化植物，在于所述植物用EPSPS-抑制除草劑處理，特別是膦酰甲基甘氨酸家族的除草劑，特別是草甘膦。
本發(fā)明同樣涉及培育轉(zhuǎn)化植物的方法，包括根據(jù)發(fā)明的表達(dá)盒，特征是在適合生長所述植物的田間區(qū)域種植所述轉(zhuǎn)化植物的種子，將農(nóng)用化學(xué)品組合物施用于所述田間區(qū)域，而基本上不影響所述轉(zhuǎn)化種子或所述轉(zhuǎn)化植物，然后當(dāng)生長植物達(dá)到所需成熟度時(shí)收獲它們，且任選地從收獲植物中分離種子。
根據(jù)發(fā)明，術(shù)語“農(nóng)用化學(xué)品組合物”指包括至少1種活性產(chǎn)物的任何農(nóng)用化學(xué)品組合物，活性產(chǎn)物具有下列活性除草、殺真菌、殺細(xì)菌、殺病毒或殺蟲。
根據(jù)發(fā)明培育方法的一個(gè)較佳實(shí)施方案，農(nóng)用化學(xué)品組合物包括有至少1種除草活性的至少1種活性產(chǎn)物，更優(yōu)選EPSPS-抑制除草劑，特別是膦酰甲基甘氨酸家族的除草劑，特別是草甘膦。
從下面的實(shí)驗(yàn)例子可更清楚地理解發(fā)明的不同方面。
下面這些例子描述的所有方法或操作通過例子給出且對應(yīng)于選擇各種可用方法用于獲得相同結(jié)果。此選擇對結(jié)果的質(zhì)量沒有影響，因此本領(lǐng)域技術(shù)人員可使用任何合適方法以獲得相同結(jié)果。尤其是，所用全部重組DNA技術(shù)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案完成，除非例子中另有說明，描述于Sambrook等.(1989，《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊》，第2版，Nolan C.編輯.，New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press)、Sambrook和Russel(2001，《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊》，第3版，Cold Spring HarborLaboratory Press，NY)、Ausubel等.(1994，《最新分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》(CurrentProtocols in Molecular Biology)，Current protocols，USA，第1和2卷)和Brown(1998，《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室傳真》(Molecular Biology LabFax)，第2版，Academic Press，UK)。用于植物分子生物學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)材料和方法描述于CroyR.D.D.(1993，《植物分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室傳真》(Plant Molecular Biology LabFax)，BIOS Scientific Publications Ltd(UK)和Blackwell Scientific Publications(UK))。PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))的標(biāo)準(zhǔn)材料和方法也描述于Dieffenbach和Dveksler(1995，《PCR引物實(shí)驗(yàn)室手冊》(PCR PrimerA laboratory manual)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY)和McPherson等.(2000，《PCR-基礎(chǔ)從背景到實(shí)驗(yàn)臺(tái)》(PCR-BasicsFrom background to bench)，第1版，Springer Verlag，Germany)。
實(shí)施例實(shí)施例1CsVMV啟動(dòng)子序列克隆入多克隆載體pRD 254由Scripps研究所(La Jolla，CA，USA)提供的質(zhì)粒pILTAB 357包含pBIN 19載體(Clontech)中的下列元件-CsVMV啟動(dòng)字(序列由SEQ ID NO 4描述)-多克隆位點(diǎn)-NOS終止子在CsVMV啟動(dòng)子序列中定義3個(gè)區(qū)域，稱為CsVMV X、CsVMV Y和CsVMV Z。
-CsVMV X從位置10到位置227(SEQ ID NO 1，長度218bp)-CsVMV Y從位置228到位置394(SEQ ID NO 2，長度167bp)-CsVMV Z從位置397到位置522(SEQ ID NO 3，長度126bp)在CsVMV啟動(dòng)子的原始序列中，X和Y區(qū)毗鄰且Y和Z區(qū)由2bp序列AT分開。
克隆載體pRD 254相當(dāng)于商業(yè)載體pBlueScript II SK(-)(Clontech)，它進(jìn)行突變以便替代具有Pvu II位點(diǎn)的ApR基因中包含的獨(dú)特Sca I位點(diǎn)。
pILTAB 357的Hind III和Xba I位點(diǎn)間包含的532bp克隆入克隆載體pRD254，以便獲得質(zhì)粒pRD 257。
實(shí)施例2CsVMV-EPSPS表達(dá)盒的產(chǎn)生開發(fā)了導(dǎo)入質(zhì)粒的表達(dá)盒，稱為pSF29。
pSF29盒包括序列標(biāo)識(shí)符SEQ ID NO 4所述CsVMV啟動(dòng)子、編碼專利申請EP0508909所定義最佳化轉(zhuǎn)運(yùn)肽(OTP)的序列、編碼玉米EPSPS的序列，包括專利申請0837944所述蘇氨酸102異亮氨酸和脯氨酸106絲氨酸突變，及Bevan等.(1983，Nucleic Acids Res.11(2)，369-385)所述nos終止子。
實(shí)施例3將表達(dá)盒整合到農(nóng)桿菌T-DNA-載體中穿梭質(zhì)粒用于在超雙元質(zhì)粒pTVK 291中重組(Jun等.，1987)。2個(gè)質(zhì)粒上存在的獨(dú)特COS位點(diǎn)間的重組產(chǎn)生對應(yīng)于2個(gè)質(zhì)粒的融合的單環(huán)分子。
通過DH5α[pSF29]、C2110[pTVK 291]和JC2073菌株(“輔助”菌株)的三親代雜交獲得pSF29與超雙元質(zhì)粒pTVK 291間的重組。所得質(zhì)粒稱為pSFK29。所得菌株C2110[pSFK29]在LB培養(yǎng)基上選擇，培養(yǎng)基含3種抗生素慶大霉素、卡那霉素和萘啶酸。萘啶酸可相對DH5α或JC2073選擇C2110；因?yàn)镃2110含有對萘啶酸的染色體抗性，抗性在雜交中不能轉(zhuǎn)移到其它菌株。結(jié)合慶大霉素和卡那霉素能選擇含pSF29和pTVK 291的細(xì)菌。此外，pSF29不能在C2110中復(fù)制，除非它與pTVK 291重組，因?yàn)镃2110含pTVK 291攜帶的RK2復(fù)制起點(diǎn)，但不含pSF29攜帶的pBR 322復(fù)制起點(diǎn)。
重組質(zhì)粒然后通過第2次三親代雜交轉(zhuǎn)移到農(nóng)桿菌菌株LBA 4404。所得菌株LBA 4404[pSFK29]在AB培養(yǎng)基上選擇(選擇農(nóng)桿菌)，培養(yǎng)基含卡那霉素和慶大霉素。
實(shí)施例4用具CsVMV-EPSPS表達(dá)盒的根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化玉米通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化玉米Zea mays是根據(jù)Ishida，Y.等.，(1996，NatureBiotechnology，14，745-750)所述方法完成。實(shí)施例3所述卸甲(di sarmed)根癌農(nóng)桿菌菌株與未成熟玉米胚共培養(yǎng)。對胚選擇施用0.88mM草甘膦。獲得自抗性杯花萼(calices)的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物然后回交，測試它們后代的草甘膦耐受性。
實(shí)施例5測試轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的草甘膦耐受性每次作用獲得的20個(gè)種子在小盆豐富的混合肥料中溫室播種，3-到4-葉階段的萌后處理用對應(yīng)于4kg/ha的草甘膦劑量進(jìn)行(即4kg活性物質(zhì)每5001)，使用校準(zhǔn)處理塔。然后計(jì)算處理后存活的產(chǎn)物。結(jié)果顯示90％含CsVMV-EPSPS表達(dá)盒的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物有能耐受對應(yīng)于4kg/ha草甘膦劑量的植物。每次測試的耐受植物數(shù)量不一致是由于這些產(chǎn)物是性狀雜合子(CsVMV-EPSPS表達(dá)盒)且具有1個(gè)或多個(gè)整合座位，一些轉(zhuǎn)化產(chǎn)物通過盒插入位置提供更佳的EPSPS表達(dá)，因此對草甘膦耐受性更佳。
序列表<110>拜爾農(nóng)科股份有限公司(Bayer CropScience S.A.)<120>編碼5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)的表達(dá)盒和包含它的除草劑耐受植物<130>BCS 02-4012<160>5<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>219<212>DNA<213>木薯葉脈花葉病毒<400>1agaaggtaat tatccaagat gtagcatcaa gaatccaatg tttacgggaa aaactatgga 60agtattatgt gagctcagca agaagcagat caatatgcgg cacatatgca acctatgttc 120aaaaatgaag aatgtacaga tacaagatcc tatactgcca gaatacgaag aagaatacgt 180agaaattgaa aaagaagaac caggcgaaga aaagaatct219<210>2<211>168<212>DNA<213>木薯葉脈花葉病毒<400>2tgaagacgta agcactgacg acaacaatga aaagaagaag ataaggtcgg tgattgtgaa 60agagacatag aggacacatg taaggtggaa aatgtaaggg cggaaagtaa ccttatcaca 120aaggaatctt atcccccact acttatcctt ttatattttt ccgtgtca 168<210>3<211>127<212>DNA<213>木薯葉脈花葉病毒<400>3tttttgccct tgagttttcc tatataagga accaagttcg gcatttgtga aaacaagaaa60
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權(quán)利要求
1.一種表達(dá)盒，盒包括以轉(zhuǎn)錄方向彼此功能性連接、在植物細(xì)胞或植物中有功能的啟動(dòng)子調(diào)節(jié)序列、編碼EPSPS的核酸序列和在植物細(xì)胞或植物中有功能的終止調(diào)節(jié)序列，其特征在于，啟動(dòng)子調(diào)節(jié)序列選自CsVMV(木薯葉脈花葉病毒)植物病毒啟動(dòng)子調(diào)節(jié)序列的核酸序列。
2.如權(quán)利要求1所述的表達(dá)盒，其特征在于，啟動(dòng)子調(diào)節(jié)序列以轉(zhuǎn)錄方向包含核酸序列X、Y和Z，它們分別由SEQ ID NO 1、2和3定義。
3.如權(quán)利要求1和2所述的表達(dá)盒，其特征在于，啟動(dòng)子調(diào)節(jié)序列由SEQ IDNO 4表示。
4.如權(quán)利要求1所述的表達(dá)盒，其特征在于，啟動(dòng)子調(diào)節(jié)序列由SEQ ID NO 5表示。
5.如權(quán)利要求1到4中任一項(xiàng)所述的表達(dá)盒，其特征在于，編碼EPSPS的核酸序列是編碼氫基酸突變的EPSPS的序列，氨基酸突變對應(yīng)于102位的蘇氨酸和106位的脯氨酸，所述位置相對于玉米EPSPS序列。
6.如權(quán)利要求5所述的表達(dá)盒，其特征在于，編碼EPSPS的核酸序列是編碼突變EPSPS的序列，包括在102位的異亮氨酸和106位的絲氨酸，所述位置相對于玉米EPSPS序列。
7.如權(quán)利要求6所述的表達(dá)盒，其特征在于，編碼突變EPSPS的核酸序列是編碼玉米突變EPSPS的序列，包括在102位的異亮氨酸和106位的絲氨酸。
8.如權(quán)利要求1到7中任一項(xiàng)所述的表達(dá)盒，其特征在于，所述表達(dá)盒也包含雙轉(zhuǎn)運(yùn)肽，雙轉(zhuǎn)運(yùn)肽以轉(zhuǎn)錄方向包含編碼植物基因轉(zhuǎn)運(yùn)肽的序列，植物基因編碼位于質(zhì)體的酶、植物基因成熟N-末端部分的一部分序列，植物基因編碼位于質(zhì)體的酶、以及然后編碼植物基因第二種轉(zhuǎn)運(yùn)肽的序列，植物基因編碼位于質(zhì)體的酶。
9.轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或植物的克隆和/或表達(dá)載體，其特征在于，所述載體包含至少1個(gè)權(quán)利要求1到8中任一項(xiàng)所述的表達(dá)盒。
10.一種轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，其特征在于，所述細(xì)胞包含權(quán)利要求1到8中任一項(xiàng)所述的表達(dá)盒。
11.一種轉(zhuǎn)化的植物，其特征在于，所述植物包含權(quán)利要求1到8中任一項(xiàng)所述的表達(dá)盒。
12.如權(quán)利要求11所述的轉(zhuǎn)化植物種子，其特征在于，所述種子包含權(quán)利要求8所述的表達(dá)盒。
13.如權(quán)利要求11所述的處理植物方法，其特征在于，所述植物用EPSPS-抑制除草劑處理。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述EPSPS-抑制除草劑是草甘膦。
15.一種控制農(nóng)作物中野草的方法，其特征在于，培育權(quán)利要求11所述的轉(zhuǎn)化植物，所述植物用EPSPS-抑制除草劑處理。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，所述EPSPS-抑制除草劑是草甘膦。
17.一種培育權(quán)利要求11所述的轉(zhuǎn)化植物的方法，其特征在于，所述方法是在適合生長所述植物的田間區(qū)域種植所述轉(zhuǎn)化植物的種子，將農(nóng)用化學(xué)品組合物施用于所述田間區(qū)域，而基本上不影響所述轉(zhuǎn)化種子或所述轉(zhuǎn)化植物，然后當(dāng)生長植物達(dá)到所需成熟度時(shí)收獲它們，且任選地從收獲植物中分離種子。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含編碼EPSPS的核酸序列的新表達(dá)盒。特別是本發(fā)明涉及新表達(dá)盒，表達(dá)盒包含以轉(zhuǎn)錄方向彼此功能性連接、在植物細(xì)胞或植物中有功能的啟動(dòng)子調(diào)節(jié)序列、編碼EPSPS的核酸序列和在植物細(xì)胞或植物中有功能的終止序列，特征在于啟動(dòng)子調(diào)節(jié)序列是選自CsVMV(木薯葉脈花葉病毒)植物病毒啟動(dòng)子調(diào)節(jié)序列的核酸序列。
文檔編號(hào)C12N15/83GK1720330SQ200380105147
公開日2006年1月11日 申請日期2003年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月12日
發(fā)明者F·施米特, J·-M·費(fèi)呂略, A·薩利安德, E·佩吉特 申請人:拜爾農(nóng)科股份有限公司