專利名稱：對(duì)線粒體通透性轉(zhuǎn)換的誘導(dǎo)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在細(xì)胞中線粒體膜通透性的改變，特別是涉及識(shí)別和使用選擇性地誘導(dǎo)增殖細(xì)胞中MPT(線粒體通透性轉(zhuǎn)換)的化合物。
背景技術(shù)：
線粒體提供ATP來(lái)維持正常的細(xì)胞功能，它們的干擾導(dǎo)致凋亡和壞死細(xì)胞死亡(Crompton，1999)。凋亡和壞死的一個(gè)重要因素是線粒體通透性改變(MPT)，這樣的情況在鈣過(guò)多時(shí)會(huì)發(fā)生。MPT的起因是在線粒體內(nèi)膜打開一種非特異性孔，稱為線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(MPTP)(Crompton等人，1987)。氧化應(yīng)激、腺嘌呤核苷酸損耗和高無(wú)機(jī)磷酸鹽極大地增加了該孔對(duì)鈣濃度的敏感性。MPTP的打開伴隨著所有小溶質(zhì)(＜1.5kD)在線粒體內(nèi)膜兩邊的平衡。所得基質(zhì)中的高蛋白濃度，施加了膠體滲透壓，造成線粒體的廣泛腫脹，并且最終導(dǎo)致凋亡或壞死。
腺嘌呤核苷酸易位體(ANT)是一種30kD的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)橫跨線粒體內(nèi)膜，并且位于MPTP的中心(Crompton等人，1988)。
作為誘導(dǎo)凋亡的方法，需要選擇性地誘導(dǎo)MPT，尤其是在增殖細(xì)胞中。
本發(fā)明涉及一種識(shí)別在線粒體中與ANT結(jié)合的化合物的方法，該化合物選擇性地在增殖細(xì)胞中而不在非增殖或生長(zhǎng)休眠細(xì)胞中誘導(dǎo)MPT。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供一種識(shí)別在增殖細(xì)胞中誘導(dǎo)線粒體通透性轉(zhuǎn)換(MPT)的化合物的方法，其中該方法包括將化合物與細(xì)胞或細(xì)胞提取物接觸，測(cè)定該化合物是否與腺嘌呤核苷酸易位體(ANT)結(jié)合，并且測(cè)定該化合物是否選擇性地在增殖細(xì)胞中誘導(dǎo)MPT。
根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供一種篩選多個(gè)化合物以識(shí)別在增殖細(xì)胞中誘導(dǎo)MPT的化合物的方法，其中該方法包括將多個(gè)化合物與細(xì)胞或細(xì)胞提取物接觸，測(cè)定這些化合物中任意一個(gè)是否與ANT結(jié)合，如果是，分開測(cè)定多個(gè)化合物中的每一個(gè)是否選擇性地在增殖細(xì)胞中誘導(dǎo)MPT。
關(guān)于本發(fā)明的第一和第二方面，在增殖細(xì)胞中選擇性地誘導(dǎo)MPT可以通過(guò)以下方式測(cè)定，例如，對(duì)于根據(jù)本發(fā)明第一和第二方面被識(shí)別為與ANT結(jié)合的化合物，比較其對(duì)增殖細(xì)胞中MPT的影響與對(duì)非增殖或生長(zhǎng)休眠細(xì)胞中MPT的影響。
同樣關(guān)于本發(fā)明的第一和第二方面，在一個(gè)實(shí)施方式中，該方法可以包括測(cè)定過(guò)氧化物陰離子(O2-)細(xì)胞濃度的變化。在另一個(gè)實(shí)施方式中，該方法可以包括測(cè)定細(xì)胞色素C釋放的變化。
根據(jù)本發(fā)明的第三方面，提供一種識(shí)別在增殖細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡的化合物的方法，該方法包括將候選化合物與細(xì)胞或細(xì)胞提取物接觸，測(cè)定細(xì)胞過(guò)氧化物陰離子(O2-)的濃度是否增加，并且測(cè)定該化合物是否選擇性地在增殖細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡。
根據(jù)本發(fā)明的第四方面，提供一種識(shí)別作為血管生成抑制劑的化合物的方法，該方法包括將候選化合物與細(xì)胞或細(xì)胞提取物接觸，測(cè)定細(xì)胞過(guò)氧化物陰離子(O2-)的濃度是否增加，并且測(cè)定該化合物是否為血管生成的抑制劑。
根據(jù)本發(fā)明的第五方面，提供一種在脊椎動(dòng)物中誘導(dǎo)MPT的方法，其中該方法包括對(duì)脊椎動(dòng)物施用有療效量的至少一種根據(jù)本發(fā)明第一至第三方面中任何一個(gè)方法檢測(cè)到的化合物，或者施用有療效量的包括至少一種該化合物和藥學(xué)可接受的載體、佐藥和/或稀釋劑的藥物組合物。
根據(jù)本發(fā)明的第六方面，提供一種在增殖哺乳動(dòng)物細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡的方法，該方法包括對(duì)哺乳動(dòng)物施用凋亡誘導(dǎo)量的根據(jù)本發(fā)明第一至第三方面中任何一個(gè)方法識(shí)別的化合物，或者施用有療效量的包括至少一種該化合物和藥學(xué)可接受的載體、佐藥和/或稀釋劑的藥物組合物。
根據(jù)本發(fā)明的第七方面，提供根據(jù)本發(fā)明第一至第三方面中任何一個(gè)識(shí)別的化合物在誘導(dǎo)凋亡的藥物生產(chǎn)中的用途。
根據(jù)本發(fā)明的第八方面，提供一種在哺乳動(dòng)物中抑制血管生成的方法，該方法包括對(duì)哺乳動(dòng)物施用血管生成抑制量的根據(jù)本發(fā)明第四方面識(shí)別的化合物，或者施用有療效量的包括至少一種該化合物和藥學(xué)可接受的載體、佐藥和/或稀釋劑的藥物組合物。
根據(jù)本發(fā)明的第九方面，提供根據(jù)本發(fā)明第四方面識(shí)別的化合物在抑制血管生成的藥物生產(chǎn)中的用途。
關(guān)于本發(fā)明第一至第九方面中的任何一個(gè)，在一個(gè)實(shí)施方式中，該化合物可以是二硫酚反應(yīng)性化合物。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，該化合物可以具有氧化砷(或氧化砷等效物)部分。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，該氧化砷(或氧化砷等效物)化合物可以具有通式(I)A-[(XBX′)nB′-Y]p(I)其中A包括至少一個(gè)基本上細(xì)胞膜不滲透的側(cè)基；(XBX′)nB′包括一個(gè)合適的連接基團(tuán)，其中n是選自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、1 5、16、17、18、19和20的整數(shù)；Y包括至少一個(gè)氧化砷或氧化砷等效物；以及p是選自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的整數(shù)。
在一個(gè)實(shí)施方式中，通式(I)的化合物可以具有多于6個(gè)的碳原子。
以下特征涉及通式(I)
在一個(gè)實(shí)施方式中，A可以選自天然、非天然和合成的氨基酸，親水胺，包括二肽、三肽、四肽、五肽的肽和多肽，例如單糖、二糖和寡糖(包括取代的變體)的糖殘基，和含有硫醇的蛋白質(zhì)，或其組合。例如，A可以選自谷胱甘肽、葡糖胺、半胱氨酰甘氨酸、磺基丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸、和精氨酸，其中每個(gè)含硫化合物的硫原子可以任選地氧化而形成亞砜或砜。在其它實(shí)施方式中，A可以包括糖殘基，例如葡萄糖、果糖、甘露糖、木糖、來(lái)蘇糖、半乳糖、己糖、蔗糖、山梨糖、半乳糖—蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇等的二糖或寡糖殘基。在其它實(shí)施方式中，A可以是親水胺，例如伯、仲、叔烷基-、芳基-或芳烷基-胺，或例如吡啶、吡咯、咪唑等的雜環(huán)胺。
氨基酸是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所知的，并且在標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)中列出，例如Kingand Stansfield，A Dictionary of Genetics(遺傳學(xué)字典)，第四版，牛津大學(xué)出版社，1990，其內(nèi)容在此引入作為參考。例如，氨基酸可以是α、β或γ氨基酸。本發(fā)明還包括L-和D-型氨基酸。氨基酸的例子包括甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸、精氨酸和組氨酸。
在一個(gè)實(shí)施方式中，A可以選自三酸脲、包括二肽、三肽、四肽和五肽的肽。例如，谷胱甘肽、Cys-Glu-Gly、Arg-Gly-Asp-Cys、Val-Thr-Cys-Gly、Gly-Gly-Cys、Lys-Glu-Gly、Arg-Gly-Asp-Lys、Val-Thr-Lys-Gly、Gly-Gly-Lys、Ser-Glu-Gly、Arg-Gly-Asp-Ser、Val-Thr-Ser-Gly、Gly-Gly-Ser、Asp-Glu-Gly、Arg-Gly-Asp-Asp、Val-Thr-Asp-Gly、Gly-Gly-Asp、Glu-Glu-Gly、Arg-Gly-Asp-Glu、Val-Thr-Glu-Gly、Gly-Gly-Glu等，pressinoic acid、例如3-巰基-1-丙磺酸、巰基丙酸、巰基琥珀酸的小酸分子；例如1-硫代-β-D-葡萄糖、3-巰基-1，2-丙二醇的小醇；小胺，包括例如伯、仲和叔烷基-、芳基-和芳烷基取代的胺；和例如5-巰基-1-四唑乙酸、2-巰基吡啶和2-氨基吡啶的芳香雜環(huán)化合物。
在一個(gè)實(shí)施方式中，A是三肽。例如，A可以是谷胱甘肽，并且在一種形式中該化合物可以由通式(II)代表 其中(XBX′)nB′包括任何合適的連接基團(tuán)，Y包括氧化砷或氧化砷等效物。
在一個(gè)實(shí)施方式中，p是選自1至5的整數(shù)。例如，p可以是1、2、3、4或5。在一個(gè)實(shí)施方式中，p是1或2。在另一個(gè)實(shí)施方式中，p是1。
在一個(gè)實(shí)施方式中，n是選自0至15的整數(shù)。例如，n可以是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。在一個(gè)實(shí)施方式中，n是選自0至10的整數(shù)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，n是選自0至5的整數(shù)，例如，n可以是0、1、2、3、4或5。
在一個(gè)實(shí)施方式中，X選自-NR、-S(O)-、-S(O)O-、-S(O)2-、-S(O)2O-、-C(O)-、-C(S)-、-C(O)O-、-C(S)O-、-C(S)S-、-P(O)(R1)-、和-P(O)(R1)O-、或者不存在；B選自C1-C10亞烷基、C2-C10亞烯基、C2-C10亞炔基、C3-C10環(huán)亞烷基、C5-C10環(huán)亞烯基、C3-C10雜環(huán)亞烷基、C5-C10雜環(huán)亞烯基、C6-C12亞芳基、雜亞芳基和C2-C10?；籜′選自-NR-、-O-、-S-、-Se-、-S-S-、S(O)-、-OS(O)-、OS(O)O-、-OS(O)2、-OS(O)2O-、-S(O)O-、-S(O)2-、-S(O)2O-、-OP(O)(R1)-、-OP(O)(R1)O-、-OP(O)(R1)OP(O)(R1)O-、-C(O)-、-C(S)-、-C(O)O-、C(S)O-、-C(S)S-、-P(O)(R1)-、-P(O)(R1)O-、和 或者不存在；其中E是O、S、Se、NR或者N(R)2+；n是0、1或2；并且B′選自C1-C10亞烷基、C2-C10亞烯基、C2-C10亞炔基、C3-C10環(huán)亞烷基、C5-C10環(huán)亞烯基、C3-C10雜環(huán)亞烷基、C5-C10雜環(huán)亞烯基、C6-C12亞芳基、和雜亞芳基或者不存在；并且其中每個(gè)R獨(dú)立地選自氫、C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基、C3-C10環(huán)烷基、C5-C10環(huán)烯基、C3-C10雜環(huán)烷基、C5-C10雜環(huán)烯基、C6-C12芳基、雜芳基、OR2和C2-C10?；?；R′與R相同或兩個(gè)R′可以與連接其的氮原子一起形成5或6員飽和或不飽和雜環(huán)；每個(gè)R1獨(dú)立地選自氫、C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基、C3-C10環(huán)烷基、C5-C10環(huán)烯基、C3-C10雜環(huán)烷基、C5-C10雜環(huán)烯基、C6-C12芳基、雜芳基、鹵代、OR2和N(R)2；每個(gè)R2獨(dú)立地選自氫、C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基、C3-C10環(huán)烷基、C5-C10環(huán)烯基、C3-C10雜環(huán)烷基、C5-C10雜環(huán)烯基、C6-C12芳基、雜芳基和-C(O)R5；每個(gè)R5獨(dú)立地選自氫、C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基、C3-C10環(huán)烷基、C5-C10環(huán)烯基、C3-C10雜環(huán)烷基、C5-C10雜環(huán)烯基、C6-C12芳基、雜芳基、C1-C10烷氧基、C3-C10烯氧基、C3-C10炔氧基、C3-C10環(huán)烷氧基、C5-C10環(huán)烯氧基、C3-C10雜環(huán)烷氧基、C5-C10雜環(huán)烯氧基、C6-C12芳氧基、雜芳氧基、C1-C10烷基硫代、C3-C10烯基硫代、C3-C10炔基硫代、C3-C10環(huán)烷基硫代、C5-C10環(huán)烯基硫代、C3-C10雜環(huán)烷基硫代、C5-C10雜環(huán)烯基硫代、C6-C12芳基硫代、雜芳基硫代、OH、SH和N(R)2；其中對(duì)于每個(gè)B和/或B′是亞芳基的例子，直接連接在各個(gè)亞芳基環(huán)上的取代基(包括氧化砷或者氧化砷等效物)可以在任何可能的位置，例如可以在對(duì)、間或鄰位；并且其中每個(gè)亞烷基、亞烯基、亞炔基、環(huán)亞烷基、環(huán)亞烯基、雜環(huán)亞烷基、雜環(huán)亞烯基、亞芳基、雜亞芳基和酰基可以獨(dú)立地被氫、C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基、C3-C10環(huán)烷基、C5-C10環(huán)烯基、C3-C10雜環(huán)烷基、C5-C10雜環(huán)烯基、C6-C12芳基、雜芳基、氰基、氰酸酯、異氰酸酯、OR2a、SR6、硝基、氧化砷、-S(O)R3、-OS(O)R3、-S(O)2R3、-OS(O)2R3、-P(O)R4R4、-OP(O)R4R4、-N(R″)2、-NRC(O)(CH2)mQ、-C(O)R5； 或者 取代；其中R、R1和R5如上所定義；并且R2a選自氫、C1-C5烷基、C2-C5烯基、C2-C5炔基、C3-C10環(huán)烷基、C5-C10環(huán)烯基、C6-C12芳基、-S(O)R3、-S(O)2R3、-P(O)(R4)2、N(R)2和-C(O)R5；每個(gè)R3獨(dú)立地選自氫、C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基、C3-C10環(huán)烷基、C5-C10環(huán)烯基、C3-C10雜環(huán)烷基、C5-C10雜環(huán)烯基、C6-C12芳基、雜芳基、C1-C10烷氧基、C3-C10烯氧基、C3-C10炔氧基、C3-C10環(huán)烷氧基、C5-C10環(huán)烯氧基、C3-C10雜環(huán)烷氧基、C5-C10雜環(huán)烯氧基、C6-C12芳氧基、雜芳氧基、C1-C10烷基硫代、C3-C10烯基硫代、C3-C10炔基硫代、C3-C10環(huán)烷基硫代、C5-C10環(huán)烯基硫代、C3-C10雜環(huán)烷基硫代、C5-C10雜環(huán)烯基硫代、C6-C12芳基硫代、雜芳基硫代、和N(R)2；每個(gè)R4獨(dú)立地選自氫、C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基、C3-C10環(huán)烷基、C5-C10環(huán)烯基、C3-C10雜環(huán)烷基、C5-C10雜環(huán)烯基、C6-C12芳基、雜芳基、C1-C10烷氧基、C3-C10烯氧基、C3-C10炔氧基、C3-C10環(huán)烷氧基、C5-C10環(huán)烯氧基、C3-C10雜環(huán)烷氧基、C5-C10雜環(huán)烯氧基、C6-C12芳氧基、雜芳氧基、C1-C10烷基硫代、C3-C10烯基硫代、C3-C10炔基硫代、C3-C10環(huán)烷基硫代、C5-C10環(huán)烯基硫代、C3-C10雜壞烷基硫代、C5-C10雜環(huán)烯基硫代、C6-C12芳基硫代、雜芳基硫代、鹵代和N(R)2；R6選自C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基、C3-C10環(huán)烷基、C5-C10環(huán)烯基、C3-C10雜環(huán)烷基、C5-C10雜環(huán)烯基、C6-C12芳基、雜芳基、C1-C10烷基硫代、C3-C10烯基硫代、C3-C10炔基硫代、C3-C10環(huán)烷基硫代、C5-C10環(huán)烯基硫代、C3-C10雜環(huán)烷基硫代、C5-C10雜環(huán)烯基硫代、C6-C12芳基硫代、雜芳基硫代、-S(O)R3、-S(O)2R3和-C(O)R5，R″與R相同或者兩個(gè)R″與連接其的N原子一起，可以形成飽和的、不飽和的或者芳香的雜環(huán)體系；Q選自鹵素和-OS(O)2Q1；其中Q1選自C1-C4烷基、C1-C4全氟烷基、苯基、對(duì)甲基苯基；并且m是1、2、3、4或者5。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，X選自NH、-C(O)-、-C(S)-、-C(O)O-、C(S)O-、和-C(S)S-、或者不存在；B選自C1-C5亞烷基、C2-C5亞烯基、C2-C5亞炔基、C3-C10環(huán)亞烷基、C5-C10環(huán)亞烯基、C6-C12亞芳基和C2-C5酰基；
X′選自-O-、-S-、-NR-、-S-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-P(O)(R1)-、-OP(O)(R1)-、-OP(O)(R1)O-、-OP(O)(R1)OP(O)(R1)O-、-C(O)-、-C(S)-、-C(O)O-、C(S)O-、-C(S)S-、-Se-、 或者不存在；其中E是O、S或者N(R)2+；n是0、1或2；并且B′是選自亞烷基的C1-C5、C2-C5亞烯基、C2-C5亞炔烯、C3-C10環(huán)亞烷基、C5-C10環(huán)亞烯基、和C6-C12亞芳基、或者不存在；并且其中每個(gè)R獨(dú)立地選自氫、C1-C5烷基、C2-C5烯基、C2-C5炔基、C3-C10環(huán)烷基、C5-C10環(huán)烯基、C6-C12芳基、OR2和C2-C10?；?；R′與R相同；每個(gè)R1獨(dú)立地選自氫、C1-C5烷基、C2-C5烯基、C2-C5炔基、C3-C10環(huán)烷基、C5-C10環(huán)烯基、C6-C12芳基、鹵代、OR2和N(R)2；每個(gè)R2獨(dú)立地選自氫、C1-C5烷基、C2-C5烯基、C2-C5炔基、C3-C10環(huán)烷基、C5-C10環(huán)烯基、C6-C12芳基、和-C(O)R5；每個(gè)R5獨(dú)立地選自氫、C1-C5烷基、C2-C5烯基、C2-C5炔基、C3-C10環(huán)烷基、C5-C10環(huán)烯基、C6-C12芳基、C1-C5烷氧基、C3-C5烯氧基、C3-C5炔氧基、C3-C10環(huán)烷氧基、C5-C10環(huán)烯氧基、C6-C12芳氧基、C1-C5烷基硫代、C3-C5烯基硫代、C3-C5炔基硫代、C3-C10環(huán)烷基硫代、C5-C10環(huán)烯基硫代、C6-C12芳基硫代、OH、SH和N(R)2；其中對(duì)于每個(gè)B和/或B′是亞芳基的例子，直接連接在各個(gè)亞芳基環(huán)上的取代基(包括氧化砷或者氧化砷等效物)可以在任何可能的位置，例如可以在對(duì)、間或鄰位，并且其中每個(gè)亞烷基、亞烯基、亞炔基、環(huán)亞烷基、環(huán)亞烯基、亞芳基、和?；梢元?dú)立地被氫、C1-C5烷基、C2-C5烯基、C2-C5炔基、C3-C10環(huán)烷基、C5-C10環(huán)烯基、C6-C12芳基、氰基、鹵代、氰酸酯、異氰酸酯、OR2a、SR6、硝基、氧化砷、-S(O)R3、-OS(O)R3、-S(O)2R3、-OS(O)2R3、-P(O)R4R4、-OP(O)R4R4、-N(R″)2、-NRC(O)(CH2)mQ、-C(O)R5、 或者 取代；其中R、R1和R5如上所定義；并且R2a選自氫、C1-C5烷基、C2-C5烯基、C2-C5炔基、C3-C10環(huán)烷基、C5-C10環(huán)烯基、C6-C12芳基、-S(O)R3、-S(O)2R3、-P(O)(R4)2、N(R)2和-C(O)R5；每個(gè)R3獨(dú)立地選自氫、C1-C5烷基、C2-C5烯基、C2-C5炔基、C3-C10環(huán)烷基、C5-C10環(huán)烯基、C6-C12芳基、C1-C5烷氧基、C3-C5烯氧基、C3-C5炔氧基、C3-C10環(huán)烷氧基、C5-C10環(huán)烯氧基、C6-C12芳氧基、C1-C5烷基硫代、C3-C5烯基硫代、C3-C5炔基硫代、C3-C10環(huán)烷基硫代、C5-C10環(huán)烯基硫代、C6-C12芳基硫代和N(R)2；每個(gè)R4獨(dú)立地選自氫、C1-C5烷基、C2-C5烯基、C2-C5炔基、C3-C10環(huán)烷基、C5-C10環(huán)烯基、C6-C12芳基、C1-C5烷氧基、C3-C5烯氧基、C3-C5炔氧基、C3-C10環(huán)烷氧基、C5-C10環(huán)烯氧基、C6-C12芳氧基、C1-C5烷基硫代、C3-C5烯基硫代、C3-C5炔基硫代、C3-C5環(huán)烷基硫代、C5-C5環(huán)烯基硫代、C6-C12芳基硫代、鹵代和N(R)2；R6獨(dú)立地選自C1-C5烷基、C2-C5烯基、C2-C5炔基、C3-C10環(huán)烷基、C5-C10環(huán)烯基、C6-C12芳基、C1-C5烷基硫代、C3-C5烯基硫代、C3-C5炔基硫代、C3-C10環(huán)烷基硫代、C5-C10環(huán)烯基硫代、C6-C12芳基硫代、-S(O)R3、-S(O)2R3和-C(O)R5，R″與R相同；Q選自鹵素和-OS(O)2Q1；其中Q1選自C1-C4烷基、C1-C4全氟烷基、苯基、對(duì)甲基苯基；并且m是1、2、3、4或者5。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，X不存在；B選自C1-C5亞烷基、C6-C12亞芳基和C2-C5?；?；X′選自-O-、-S-、-NR-、-S-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-P(O)(R1)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(O)O-、C(S)O-、-Se-、和 或者不存在；其中E是O、S或者N(R)2+；n是0、1或2；并且B′是C1-C5亞烷基、C6-C12亞芳基或者不存在；其中每個(gè)R獨(dú)立地選自氫、C1-C5烷基、C3-C10環(huán)烷基、C6-C12芳基、OR2和C2-C5?；?；R′與R相同；每個(gè)R1獨(dú)立地選自氫、C1-C5烷基、C3-C10環(huán)烷基、C6-C12芳基、鹵代、OR2和N(R)2；每個(gè)R2獨(dú)立地選自氫、C1-C5烷基、C3-C10環(huán)烷基、C6-C12芳基和-C(O)R5；每個(gè)R5獨(dú)立地選自氫、C1-C5烷基、C2-C5烯基、C3-C10環(huán)烷基、C5-C10環(huán)烯基、C6-C12芳基、C1-C5烷氧基、C3-C5烯氧基、C3-C10環(huán)烷氧基、C5-C10環(huán)烯氧基、C6-C12芳氧基、C1-C5烷基硫代、C3-C5烯基硫代、C3-C10環(huán)烷基硫代、C5-C10環(huán)烯基硫代、C6-C12芳基硫代、OH、SH和N(R)2；其中對(duì)于每個(gè)B和/或B′是亞芳基的例子，直接連接在各個(gè)亞芳基環(huán)上的取代基(包括氧化砷或者氧化砷等效物)可以在各個(gè)環(huán)上的任何可能位置，例如可以在對(duì)、間或鄰位，并且其中每個(gè)亞烷基、亞烯基、亞炔基、環(huán)亞烷基、環(huán)亞烯基、亞芳基、和?；梢元?dú)立地被氫、C1-C5烷基、C2-C5烯基、C2-C5炔基、C3-C10環(huán)烷基、C5-C10環(huán)烯基、C6-C12芳基、鹵代、氰基、氰酸酯、異氰酸酯、OR2a、SR6、硝基、氧化砷、-S(O)R3、-OS(O)R3、-S(O)2R3、-OS(O)2R3、-P(O)R4R4、-OP(O)R4R4、-N(R″)2、-NRC(O)(CH2)mQ、-C(O)R5、 或者 取代；其中R、R1和R5如上所定義；并且R2a選自氫、C1-C5烷基、C3-C10環(huán)烷基、C6-C12芳基、-S(O)R3、-S(O)2R3、-P(O)(R4)2和-C(O)R5；每個(gè)R3獨(dú)立地選自氫、C1-C5烷基、C3-C10環(huán)烷基、C6-C12芳基、C1-C5烷氧基、C3-C10環(huán)烷氧基、C6-C12芳氧基、C1-C5烷基硫代、C3-C10環(huán)烷基硫代、C6-C12芳基硫代和N(R)2；每個(gè)R4獨(dú)立地選自氫、C1-C5烷基、C3-C10環(huán)烷基、C6-C12芳基、C1-C5烷氧基、C3-C10環(huán)烷氧基、C6-C12芳氧基、鹵代和N(R)2；R6選自C1-C5烷基、C3-C10環(huán)烷基、C6-C12芳基、C1-C5烷基硫代、C3-C10環(huán)烷基硫代、C6-C12芳基硫代、-S(O)R3、-S(O)2R3和-C(O)R5。
R″與R相同；Q選自鹵素和-OS(O)2Q1；其中Q1選自C1-C4烷基、C1-C4全氟烷基、苯基、對(duì)甲基苯基；并且m是1、2、3、4或者5。
在另一實(shí)施方式中，X不存在；B選自C1-C5亞烷基、C6-C12亞芳基和C2-C5酰基；X′選自-O-、-S-、-NR-、-C(O)-、和-C(O)O-、或者不存在；n是1；并且B是C1-C5亞烷基、C6-C12亞芳基或者不存在；并且R選自氫、C1-C5烷基、C6-C12芳基和C2-C5?；黄渲袑?duì)于每個(gè)B和/或B′是亞芳基的例子，直接連接在各個(gè)亞芳基環(huán)上的取代基(包括氧化砷或者氧化砷等效物)可以在各個(gè)環(huán)上的任何可能位置，例如可以在對(duì)、間或鄰位，并且其中每個(gè)亞烷基、亞芳基、和酰基可以獨(dú)立地被氫、C1-C5烷基、C2-C5烯基、C2-C5炔基、C3-C10環(huán)烷基、C5-C10環(huán)烯基、C6-C12芳基、鹵代、氰基、氰酸酯、異氰酸酯、OR2a、SR6、硝基、氧化砷、-S(O)R3、-S(O)2R3、-P(O)R4R4、-N(R″)2、-NRC(O)(CH2)mQ、-C(O)R5、 或者 取代；
其中每個(gè)R獨(dú)立地選自氫、C1-C5烷基、C6-C12芳基和C2-C5酰基；R2a選自氫、C1-C5烷基、C6-C12芳基、-S(O)R3、-S(O)2R3、-P(O)(R4)2和-C(O)R5；每個(gè)R3獨(dú)立地選自氫、C1-C5烷基、C6-C12芳基、C1-C5烷氧基、C6-C12芳氧基、C1-C5烷基硫代和C6-C12芳基硫代；每個(gè)R4獨(dú)立地選自氫、C1-C5烷基、C6-C12芳基、C1-C5烷氧基、C6-C12芳氧基、C1-C5烷基硫代、C6-C12芳基硫代、鹵代和N(R)2；每個(gè)R5獨(dú)立地選自氫、C1-C5烷基、C6-C12芳基、C1-C5烷氧基、C6-C12芳氧基、C1-C5烷基硫代、C6-C12芳基硫代、OH、SH和N(R)2；R6選自C1-C5烷基、C6-C12芳基、C1-C5烷基硫代、C6-C12芳基硫代、-S(O)R3、-S(O)2R3和-C(O)R5，R″與以上R相同；Q選自鹵素和-OS(O)2Q1；其中Q1選自C1-C4烷基、C1-C4全氟烷基、苯基、對(duì)甲基苯基；并且m是1、2、3、4或者5。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，X不存在；B是C2-C5酰基；X′是NR；n是1；B′是亞苯基；并且R是H；其中直接連在亞苯基環(huán)上的取代基可以在任何可能的位置，例如由通式(III)所示 其中R7至R10獨(dú)立地選自氫、C1-C5烷基、C6-C12芳基、鹵素、羥基、氨基、硝基、羧基、C1-C5烷氧基、-OS(O)2R3和-NHC(O)CH2Q，其中Q是鹵素、-OS(O)2CH3、-OS(O)2C6H5和-OS(O)2-對(duì)甲苯基；并且其中當(dāng)R7至R10的任何一個(gè)是C1-C5烷基、C6-C12芳基、C1-C5烷氧基、-OS(O)2R3時(shí)，能夠與亞苯基形成稠環(huán)；而且進(jìn)一步的，其中R7至R10的至少一個(gè)是C1-C5烷基、C6-C12芳基、C1-C5烷氧基、或者-OS(O)2R3，與R7至R10中的其它至少任何一個(gè)結(jié)合，能夠與亞苯基形成稠環(huán)。
更典型地，R7至R10獨(dú)立地選自氫、鹵素、羥基、氨基、硝基、氰基、羧基、C1-C5烷氧基、甲基、乙基、異丙基、叔丁基、苯基和-NHC(O)CH2Q，其中Q是鹵素、-OS(O)2CH3、-OS(O)2C6H5和-OS(O)2-對(duì)甲苯基。
例如當(dāng)側(cè)基A是谷胱甘肽時(shí)，通式(III)的化合物可以表示為
此外，當(dāng)B′是亞芳基時(shí)，連在亞芳基環(huán)的取代基可以在該亞芳基環(huán)的任何可能的位置。例如，該取代基可以在相對(duì)于-As＝O基團(tuán)的間位或?qū)ξ弧?br> 在另一個(gè)實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明識(shí)別的氧化砷化合物選自下列化合物

和 化合物“GSAO”(4-(N-(S-谷胱甘肽基乙酰基)氨基)苯基氧化砷，4-(N-(S-glutathionylacetyl)amino)-phenylarsenoxide)已經(jīng)在先前的國(guó)際專利申請(qǐng)WO01/21628中說(shuō)明，其整個(gè)內(nèi)容在此引入以供相互參考。
可以與ANT相互作用的其它化合物包括根據(jù)以下通式(V)說(shuō)明的化合物 其中Q是任何鹵素。
可以與ANT相互作用的氧化砷化合物的另一種形式是根據(jù)通式(VI)的化合物 其中G選自氫、鹵素、羥基、氨基、硝基、氰基、羧基、C1-C5烷氧基、C1-C5烷基和C6-C12芳基和-NHC(O)CH2Q，其中Q是鹵素、-OS(O)2CH3、-OS(O)2C6H5或-OS(O)2-對(duì)甲苯基。
典型地，G選自氫、鹵素、羥基、氨基、硝基、羧基、C1-C5烷氧基、甲基、乙基、異丙基、叔丁基、苯基、和-NHC(O)CH2Q，其中Q是包括鹵素、-OS(O)2CH3、-OS(O)2C6H5和-OS(O)2-對(duì)甲苯基的基團(tuán)。
在一個(gè)實(shí)施方式中，在通式VI的化合物中，G是羥基、氟、氨基或硝基。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，基團(tuán)G位于相對(duì)于氧化砷基團(tuán)的鄰、間或?qū)ξ?。例如，在另一個(gè)實(shí)施方式中，G在相對(duì)于氧化砷基團(tuán)的鄰或?qū)ξ弧?br> 典型地，當(dāng)基團(tuán)G與砷原子在相互的鄰位或?qū)ξ簧蠒r(shí)，該砷原子的活性可以被G改性。例如，當(dāng)G是例如OH(在生理pH下電離成O-)的供電子基團(tuán)時(shí)，該砷原子可能對(duì)二硫酚失活，可能變得更具選擇性，例如，只能與反應(yīng)性非常強(qiáng)的二硫酚反應(yīng)。另外，當(dāng)G是例如NO2的吸電子基團(tuán)時(shí)，電子密度可能從砷原子處被拉走，使它對(duì)二硫酚更加具有反應(yīng)性。可以通過(guò)操縱G來(lái)選擇性地抑制一些氧化還原蛋白質(zhì)，而非其它。
典型地，在這種能與ANT相互作用的氧化砷化合物中，氧化砷基團(tuán)(-As＝O)可以被氧化砷等效物代替。
氧化砷等效物在本文定義為任何顯示出基本與-As＝O相同的對(duì)二硫酚親和性的二硫酚反應(yīng)物種。典型地，氧化砷等效物包括二硫酚反應(yīng)性物質(zhì)，比如As、Ge、Sn和Sb物種。更加典型地，氧化砷等效物可以表示為-D(Z1)(Z2)。期望氧化砷等效物表現(xiàn)出與相應(yīng)的氧化砷相同的或基本相同的活性。
典型地，對(duì)于-D(Z1)(Z2)形式的氧化砷等效物，例如D是As、RSn、Sb、或者RGe，而且Z1和Z2是不穩(wěn)定的基團(tuán)(即在生理?xiàng)l件下基團(tuán)容易被取代)。Z1和Z2可以相同或不同，可以相連或者彼此獨(dú)立(僅與砷原子相連)。
合適的氧化砷等效物包括-D(Z1)(Z2)，其中Z1和Z2選自O(shè)H、C1-C10烷氧基、C6-C10芳氧基、C1-C10烷基硫代、C6-C10芳基硫代、C1-C10烷基硒基、C6-C10芳基硒基，F(xiàn)、Cl、Br和I； 其中E1＝E2＝O，E1＝O并且E2＝S或者E1＝E2＝S；M是R，R″″獨(dú)立地選自氫、C1-C10烷基、C6-C12芳基、鹵素、C1-C10烷氧基、C6-C10芳氧基、羥基和羧基；而且n＝1至10。
對(duì)于D(Z1)(Z2)形式的氧化砷等效物，當(dāng)D是As，而Z1和Z2是OH時(shí)，該氧化砷等效物可以與聚合的物種相平衡，如下所示。
關(guān)于以上描述的平衡，許多元素的羥基物種與相應(yīng)的聚合酐存在平衡，砷是這些元素之一(Doak & Freedman，1970)。因此，氧化砷化合物實(shí)際上可能作為低或中分子量聚合物存在(例如n＝3至6)。然而，該脫水反應(yīng)是可逆的，因此可以預(yù)料到溶解的聚合酐起到了氧化砷等效物的作用，也就是說(shuō)，可以預(yù)料到它們基本上通過(guò)與單體-As(OH)2物種相同的方式連接到空間相鄰的二硫酚上。

其中X3＝NH，Y1＝O；X3＝Y(jié)1＝O或者X3＝S，Y1＝O，而R′選自氫、C1-C10烷基、C6-C12芳基、和羧基，或者二十個(gè)氨基酸支鏈之一； 其中X3＝Y(jié)1＝O；X3＝NH，Y1＝O；X3＝S，Y1＝O；X3＝Y(jié)1＝NH；或者X3＝S，Y1＝NH；或者X3＝S，Y1＝NH，而R11至R14選自氫、C1-C10烷基、C6-C12芳基、和CO2H； 其中X3＝Y(jié)1＝O，或者X3＝NH，Y1＝O；而R11至R14選自氫、C1-C10烷基、C6-C12芳基、鹵素、C1-C10烷氧基、和CO2H。
典型地，(XBX′)B′如上所定義。
縮略語(yǔ)和定義在本說(shuō)明書中，縮寫MPT代表線粒體通透性轉(zhuǎn)換。
在本說(shuō)明書中，縮寫MPTP代表線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔。
在本說(shuō)明書中，縮寫ANT代表腺嘌呤核苷酸易位體。
在本說(shuō)明書中，EGTA是乙二醇-雙(β-氨基乙基醚)-N，N，N′，N′-四乙酸。
在本說(shuō)明書中，PAO代表苯基氧化砷。
在本說(shuō)明書中，術(shù)語(yǔ)“包括”是指“主要包括，但不是必須僅有”。而且，由“包括”變化的詞，例如“含有”有相一致的意義。
在本說(shuō)明書中，術(shù)語(yǔ)“氧化砷”指的是-As＝O基團(tuán)。
在本說(shuō)明書中，寫為-As＝O和-As(OH)的基團(tuán)被認(rèn)為是同義的。
在本說(shuō)明書中，術(shù)語(yǔ)“氧化砷等效物”指的是任何對(duì)二硫酚顯示出與-As＝O或As(OH)2基本相同的親和性的二硫酚反應(yīng)物種，該術(shù)語(yǔ)包括，例如，含有過(guò)渡元素的基團(tuán)，和當(dāng)溶解在水介質(zhì)中(例如細(xì)胞培養(yǎng)緩沖液和包含于被處理的有機(jī)體中的流體)時(shí)水解成-As＝O或-As(OH)2的任何三價(jià)砷。
在本說(shuō)明書中，術(shù)語(yǔ)“基本上細(xì)胞膜不滲透的基團(tuán)”指的是任何限制化合物穿過(guò)細(xì)胞膜并進(jìn)入細(xì)胞的速度的基團(tuán)?；旧霞?xì)胞膜不滲透的基團(tuán)可以通過(guò)一個(gè)或更多例如電荷、大小(分子量)、極性、親油性、親水性等的性質(zhì)限制化合物進(jìn)入細(xì)胞的速度。
本文所使用的術(shù)語(yǔ)“砷化物”包括任何含砷的化合物。
本文所使用的術(shù)語(yǔ)“?；保ň哂心┒唆驶〈膯蝺r(jià)和二價(jià)烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基和環(huán)烯基部分，其中連接可能發(fā)生在烴基部分、羰基部分或者兩者上。
本文所使用的術(shù)語(yǔ)“烷基”，其意義包括單價(jià)、飽和、直鏈和支鏈烴基。
本文所使用的術(shù)語(yǔ)“烯基”，其意義包括具有至少一個(gè)雙鍵的單價(jià)、直鏈和支鏈烴基。
本文所使用的術(shù)語(yǔ)“炔基”，其意義包括具有至少一個(gè)三鍵的單價(jià)、直鏈和支鏈烴基。
本文所使用的術(shù)語(yǔ)“亞烷基”，其意義包括二價(jià)、飽和、直鏈烴基。
本文所使用的術(shù)語(yǔ)“亞烯基”，其意義包括具有至少一個(gè)雙鍵的二價(jià)、直鏈烴基。
本文所使用的術(shù)語(yǔ)“亞炔基”，其意義包括具有至少一個(gè)三鍵的二價(jià)、直鏈烴基。
本文所使用的術(shù)語(yǔ)“芳基”，其意義包括單價(jià)、單環(huán)、多環(huán)、共軛和稠合的芳香烴基。
本文所使用的術(shù)語(yǔ)“亞芳基”，其意義包括二價(jià)、單環(huán)、多環(huán)、共軛和稠合的芳香烴基。
本文所使用的術(shù)語(yǔ)“空間相鄰的二硫酚”，其意義包括化學(xué)結(jié)構(gòu)上相鄰的硫醇，以及由于分子構(gòu)型而空間相鄰的硫醇。
本文所使用的術(shù)語(yǔ)“環(huán)烷基”，其意義包括單價(jià)、飽和、單環(huán)、雙環(huán)、多環(huán)或稠合多環(huán)的烴基。
本文所使用的術(shù)語(yǔ)“環(huán)亞烷基”，其意義包括二價(jià)、飽和、單環(huán)、雙環(huán)、多環(huán)或稠合多環(huán)的烴基。
本文所使用的術(shù)語(yǔ)“環(huán)烯基”，其意義包括具有至少一個(gè)雙鍵的單價(jià)、飽和、單環(huán)、雙環(huán)、多環(huán)或稠合多環(huán)的烴基。
本文所使用的術(shù)語(yǔ)“環(huán)亞烯基”，其意義包括具有至少一個(gè)雙鍵的二價(jià)、飽和、單環(huán)、雙環(huán)、多環(huán)或稠合多環(huán)的烴基。
本文所使用的術(shù)語(yǔ)“鹵代”包括氟代、氯代、溴代和碘代。
本文所使用的術(shù)語(yǔ)“雜芳基”，其意義包括具有1至12個(gè)原子且其中1至6個(gè)原子是選自O(shè)、N和S的雜原子的單價(jià)、單環(huán)、多環(huán)、共軛和稠合的芳香基。
本文所使用的術(shù)語(yǔ)“雜亞芳基”，其意義包括具有1到12個(gè)原子且其中1至6個(gè)原子是選自O(shè)、N和S的雜原子的二價(jià)、單環(huán)、多環(huán)、共軛和稠合的芳香基。
本文所使用的術(shù)語(yǔ)“雜環(huán)烷基”，其意義包括單價(jià)、飽和、單環(huán)、雙環(huán)、多環(huán)或稠合的基團(tuán)，其中1至5個(gè)原子是選自O(shè)、N或S的雜原子。
本文所使用的術(shù)語(yǔ)“雜環(huán)亞烷基”，其意義包括二價(jià)、飽和、單環(huán)、雙環(huán)、多環(huán)或稠合多環(huán)的基團(tuán)，其中1至5個(gè)原子是選自O(shè)、N或S的雜原子。
本文所使用的術(shù)語(yǔ)“雜環(huán)烯基”，其意義包括具有至少一個(gè)雙鍵的單價(jià)、飽和、單環(huán)、雙環(huán)、多環(huán)或稠合多環(huán)的基團(tuán)，其中1至5個(gè)原子是選自O(shè)、N或S的雜原子。
本文所使用的術(shù)語(yǔ)“雜環(huán)亞烯基”，其意義包括具有至少一個(gè)雙鍵的二價(jià)、飽和、單環(huán)、雙環(huán)、多環(huán)或稠合多環(huán)的基團(tuán)，其中1至5個(gè)原子是選自O(shè)、N或S的雜原子。
本文所使用的術(shù)語(yǔ)“苯基胂酸”被認(rèn)為與“苯胂酸”同義。


圖1.通過(guò)與ANT反應(yīng)和對(duì)其擾動(dòng)，由GSAO引發(fā)的MTP打開。A GSAO、GSAA、和GSCA的結(jié)構(gòu)。B GSAO引發(fā)的線粒體腫脹。腫脹是通過(guò)在60分鐘過(guò)程中，監(jiān)測(cè)伴隨的520nm處光散射的降低來(lái)測(cè)定的。跡線代表對(duì)至少兩個(gè)不同線粒體標(biāo)本所做的三個(gè)試驗(yàn)中最低的。在部分i，線粒體與0(●)、25(○)、50(▲)、100(△)或200(■)μM GSAO一起培養(yǎng)。對(duì)于孔打開的陽(yáng)性對(duì)照是150μM Ca2+和6mM Pi(□)。在部分ii，線粒體與0(●)、100μM GSCA(△)、100μM GSAA(▲)或者100μM GSAO(■)一起培養(yǎng)?？状蜷_的陽(yáng)性對(duì)照是25μM PAO(○)。在部分iii，線粒體與100μM GSAO在沒(méi)有(■)或與3mM Mg2+()、100μM EGTA(△)、10μMBKA(▲)、5μM CsA()、或者8mM ADP(○)一起培養(yǎng)。未處理的(●)被作為對(duì)比。C增加Ca2+濃度使MPTP對(duì)GSAO更敏感。線粒體在沒(méi)有或者在增加的Ca2+濃度下與50(●)、75(○)、100(■)或200μM(□)GSAO一起培育，并且測(cè)量半最大腫脹(half-maximal swelling)時(shí)間。D用GSAO-B標(biāo)記ANT。分離的大鼠線粒體在沒(méi)有(帶1)或在四倍摩爾過(guò)量的2，3-二巰基丙醇(DMP)存在下(帶2)用GSAO-B標(biāo)記，并且在鏈霉抗生物素—瓊脂糖珠上收集生物素標(biāo)記的蛋白質(zhì)，通過(guò)SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡分析ANT。E GSAO與曙紅-馬來(lái)酰亞胺對(duì)ANT的Cys160的烷基化作用相競(jìng)爭(zhēng)。大鼠亞線粒體顆粒在沒(méi)有(帶1)或在GSAO存在下(帶2)用曙紅-5-馬來(lái)酰亞胺標(biāo)記，該曙紅標(biāo)記的ANT通過(guò)SDS-PAGE分析，并通過(guò)透射檢測(cè)。
圖2.集中在活細(xì)胞線粒體中的GSAO。與GSAO-F(i)和Mitotracker Red(ii)一起培養(yǎng)的BAE細(xì)胞的共焦顯微術(shù)，顯示化合物在單細(xì)胞的線粒體中的共存(colocalisation)。當(dāng)與DMP(iii和iv)一起培養(yǎng)時(shí)，GSAO-F不對(duì)細(xì)胞著色。五價(jià)砷、GSAA-F也不對(duì)細(xì)胞著色(v和vi)。
圖3.GSAO在增殖細(xì)胞中，而非生長(zhǎng)休眠、內(nèi)皮細(xì)胞中引發(fā)的線粒體去極和凋亡。A GSAO降低了增殖細(xì)胞，而非生長(zhǎng)休眠、內(nèi)皮細(xì)胞的成活能力。相反，PAO對(duì)于兩種類型的細(xì)胞具有同等的毒性。BAE細(xì)胞在含有0.25％血清的培養(yǎng)基中保持24h，然后與GSAO(i)或PAO(ii)一起在含有0.25％或10％血清的培養(yǎng)基中進(jìn)一步培養(yǎng)48小時(shí)。經(jīng)過(guò)48小時(shí)處理后，測(cè)定附著細(xì)胞的數(shù)量。結(jié)果是三個(gè)試驗(yàn)的平均±SE。B GSAO在BAE細(xì)胞中引發(fā)的線粒體去極和誘導(dǎo)的凋亡。細(xì)胞在含有10％血清和GSAO的培養(yǎng)基中培育48小時(shí)，然后用JC-1或膜聯(lián)蛋白V標(biāo)記。測(cè)量對(duì)線粒體膜去極(JC-1綠/紅熒光)和誘導(dǎo)凋亡(與膜聯(lián)蛋白V結(jié)合)有效的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。在兩個(gè)不同的試驗(yàn)中觀察到相同的結(jié)果。
圖4.在增殖細(xì)胞中，而非生長(zhǎng)休眠、內(nèi)皮細(xì)胞中，由GSAO抑制ATP生成并使過(guò)氧化物含量增加。A BAE細(xì)胞在含有0.5％或10％血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí)，然后在GSAO存在下進(jìn)一步培養(yǎng)24小時(shí)。在部分i，細(xì)胞ATP水平通過(guò)使用熒光素/熒光素霉分析測(cè)定。結(jié)果是四個(gè)試驗(yàn)的平均±SEM。在部分ii，從壬基吖啶橙(NAO)的吸收測(cè)定線粒體質(zhì)量。結(jié)果是兩個(gè)試驗(yàn)的平均±范圍。B在BAE細(xì)胞中用二氫乙叉基(dihydroethidine)測(cè)定的過(guò)氧化物含量，該BAE細(xì)胞在含有0.5％或10％血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí)，然后在GSAO存在下進(jìn)一步培養(yǎng)24小時(shí)。結(jié)果是兩次試驗(yàn)的平均±范圍。C在含有10％血清和GSAO的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí)的BAE細(xì)胞中O2-(y軸)的同時(shí)測(cè)量。在每一個(gè)象限中細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)顯示在最外的角上。
圖5.相比于腫瘤細(xì)胞，GSAO對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞選擇性的毒性。GSAO對(duì)兩類原生內(nèi)皮細(xì)胞(A和B)和五種腫瘤細(xì)胞系(C-G)的細(xì)胞增殖和成活能力的影響。測(cè)試四種人類(BxPC-3胰腺、HT1080纖維肉瘤、A549肺、和HL60紅細(xì)胞白血病(erythroidleukaemia))和一種鼠科動(dòng)物(LLC肺)的腫瘤細(xì)胞系。結(jié)果是三個(gè)處理的平均±SEM。
圖6.由GSAO誘導(dǎo)的線粒體中細(xì)胞色素c的釋放。A大鼠肝線粒體與100μMGSAO一起培育0-60分鐘，而釋放到培養(yǎng)基中的細(xì)胞色素c通過(guò)蛋白質(zhì)印跡測(cè)量。該圖顯示了蛋白質(zhì)印跡和相應(yīng)的量化。B大鼠肝線粒體與0、100μM GSAO、100μM GSAO和5μM環(huán)孢霉素A(CsA)一起培養(yǎng)30分鐘，或者與150μM Ca2+和6mMPi一起培養(yǎng)30分鐘作為陽(yáng)性對(duì)照。釋放到培養(yǎng)基中的細(xì)胞色素c通過(guò)蛋白質(zhì)印跡測(cè)量。
圖7.在小鼠中由GSAO抑制的CAM血管生成以及腫瘤血管生成和腫瘤生長(zhǎng)。A用含有10μg GSAA(上)或GSAO(下)的甲基纖維素盤培養(yǎng)48小時(shí)后，CAM的照片。虛點(diǎn)圈顯示盤的位置。B每粒5、10或50μg GSAO在5個(gè)區(qū)域中對(duì)抑制血管生成有效的區(qū)域數(shù)量。GSAA在達(dá)到每粒50μg時(shí)不抑制CAM血管生成。C-E承受～0.1g BxPC-3(部分C)或HT1080(部分D)腫瘤的SCID小鼠，或者承受～0.1gLLC腫瘤(部分E)的C57BI6/J小鼠，被隨機(jī)地分成兩組(n＝4)，并且用GSAA或GSAO在含有100mM甘氨酸的0.2mL PBS中以10mg/kg/day處理。數(shù)據(jù)點(diǎn)是腫瘤體積的平均±SE。E部分C所示的試驗(yàn)中的BxPC-3腫瘤的組織切片，經(jīng)過(guò)GSAA或GSAO處理31天后，分析血管生成(CD31)、增殖(PCNA)和凋亡(TUNEL)。
圖8.相比于GSAO，化合物1-11、13-15和20-23對(duì)BAE細(xì)胞的抗增殖活性。
圖9.在亞苯基環(huán)的鄰位或?qū)ξ痪哂醒趸榛鶊F(tuán)的化合物對(duì)BAE細(xì)胞抗增殖活性的比較。
圖10.GSAO和相關(guān)類似物對(duì)BAE細(xì)胞活性與分子量之間的關(guān)系。
圖11.GSAO和相關(guān)類似物對(duì)BAE細(xì)胞活性與LogP重量之間的關(guān)系。
圖12.GSAO類似物和GSAO對(duì)MPTP的誘導(dǎo)的比較。
圖13.GSAO和相關(guān)類似物對(duì)MPTP的誘導(dǎo)與分子量之間的關(guān)系。
圖14.GSAO和相關(guān)類似物對(duì)MPTP的誘導(dǎo)與LogP之間的關(guān)系。
圖15.對(duì)BAE細(xì)胞抗增殖活性和MPTP誘導(dǎo)的比較。
圖16.GSAO和化合物1與DTT的相互作用的比較。
圖17.由GSAO或o-GSAO誘導(dǎo)的線粒體通透性轉(zhuǎn)換。腫脹通過(guò)520nm處光散射的降低來(lái)測(cè)定。分離的線粒體與不同濃度的GSAO(部分A)或o-GSAO(部分B)一起培養(yǎng)。在兩個(gè)不同試驗(yàn)中隨著GSAO或o-GSAO濃度而變的腫脹的半衰期示于部分C。隨著GSAO或者PAO濃度而變的腫脹的半衰期示于部分D。在部分A和部分B的陽(yáng)性對(duì)照是150μM Ca2+和6mM Pi(■)。
圖18.GSAO或o-GSAO對(duì)線粒體通透性轉(zhuǎn)變的影響對(duì)鈣的依賴關(guān)系。線粒體在增加的Ca2+濃度下與不同濃度的GSAO(部分A)或o-GSAO(部分B)一起培養(yǎng)，并且測(cè)量半最大腫脹時(shí)間。
圖19.ANT配體對(duì)o-GSAO誘導(dǎo)的線粒體通透性轉(zhuǎn)換的阻礙。線粒體與200μMo-GSAO一起在沒(méi)有或在EGTA、Mg2+、CsA或ADP存在下培養(yǎng)。陽(yáng)性對(duì)照是150μM Ca2+和6mM Pi(■)。
圖20.在含有10％血清的培養(yǎng)基中與GSAO或者o-GSAO一起培養(yǎng)48小時(shí)后，附著的BAE(部分A)或者BxPC-3(部分B)細(xì)胞的保持量。每一個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)是三重測(cè)定的平均±SE。BAE細(xì)胞的結(jié)果來(lái)自6個(gè)(GSAO)或者2個(gè)(o-GSAO)不同的試驗(yàn)。
圖21.在含有0.25％(○)或10％(●)血清的培養(yǎng)基中與GSAO(A)或者o-GSAO(B)一起培養(yǎng)48小時(shí)后，附著的BAE細(xì)胞的保持量。每一個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)是三重測(cè)定的平均±SE。
圖22.o-GSAO的毒性。Balb-C小鼠(6-8周齡，每組3只)用o-GSAO在0.1mLPBS中以1或10mg/kg/day經(jīng)皮下處理。該數(shù)據(jù)點(diǎn)是小鼠重量的平均±SE。
圖23.o-GSAO相比于GSAO的抗腫瘤功效。承受～40mm3BxPC-3腫瘤的Balb-C裸鼠被隨機(jī)地分成四組(每組n＝10或11)，并且用GSAO(部分A)或者o-GSAO(部分B)在0.1mL PBS中以1或10mg/kg/day進(jìn)行皮下處理。部分C和D是各組小鼠的重量，其中箭頭指示處理的開始。該數(shù)據(jù)點(diǎn)是腫瘤體積或者小鼠重量的平均±SE。由于在11只小鼠中的7只在注射點(diǎn)壞死和發(fā)炎(3/11是嚴(yán)重潰瘍，4/11是中度潰瘍)，用10mg/kg o-GSAO(部分B)的處理在第14天停止。在這組中(部分D)也有一些重量損失。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明涉及識(shí)別在線粒體中與ANT結(jié)合的化合物的方法，該化合物選擇性地在增殖細(xì)胞中而不在非增殖細(xì)胞中誘導(dǎo)MPT。
ANT是一種30kD的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)橫跨線粒體內(nèi)膜，并且位于MPTP的中心(Crompton等人，1988)。在ANT的基質(zhì)一側(cè)，有三個(gè)不成對(duì)的半胱氨酸-Cys57，Cys160和Cys257。(Halestrap等人，1997)。ANT活性通過(guò)與Ca2+、親環(huán)蛋白D和腺嘌呤核苷酸結(jié)合來(lái)控制。親環(huán)蛋白D(Crompton等人，1988)和腺嘌呤核苷酸(Haworth & Hunter，1979a，b；Haworth & Hunter，2000)結(jié)合到ANT的基質(zhì)一側(cè)，而對(duì)于Ca2+的作用點(diǎn)還沒(méi)確定。有一些已知的MPTP調(diào)節(jié)劑，似乎通過(guò)調(diào)節(jié)這三種化合物的結(jié)合而起作用。主要引發(fā)MPTP打開的是基質(zhì)中Ca2+濃度的升高。Ca2+與EGTA的螯合作用阻礙了孔的打開。Ca2+引發(fā)點(diǎn)(可能是在ANT上)的特異性似乎是絕對(duì)的，因?yàn)槔鏜g2+的其它二價(jià)金屬離子起到抑制劑作用(Haworth &Hunter，1979a)。在亞毫摩爾Ca2+濃度時(shí)，使親環(huán)蛋白D與ANT結(jié)合對(duì)于孔的打開是必要的(Halestrap等人，2002)。環(huán)孢霉素A(CsA)通過(guò)與親環(huán)蛋白D結(jié)合并且將其從ANT置換而阻礙孔的打開(Crompton等人，1988)?；|(zhì)ADP也是孔打開的重要的調(diào)節(jié)劑，它與ANT結(jié)合并且降低了引發(fā)點(diǎn)對(duì)于Ca2+的敏感性(Haworth &Hunter，1979a，b)。米酵菌酸(Bonkrekic acid，BKA)也與ANT相互作用并且降低其對(duì)于Ca2+的敏感性(Hunter & Haworth，1979)。
一般來(lái)說(shuō)，根據(jù)本發(fā)明識(shí)別在增殖細(xì)胞中誘導(dǎo)MPT的化合物的方法，包括將細(xì)胞或細(xì)胞提取物與候選化合物接觸，測(cè)定該化合物是否與ANT結(jié)合，然后測(cè)定該化合物是否選擇性地在增殖細(xì)胞中誘導(dǎo)MPT。評(píng)估一個(gè)化合物是否選擇性地在增殖細(xì)胞中誘導(dǎo)MPT，可以通過(guò)比較識(shí)別為與ANT結(jié)合的化合物對(duì)增殖細(xì)胞中MPT的影響，和該化合物對(duì)非增殖或生長(zhǎng)休眠細(xì)胞中MPT的影響來(lái)測(cè)定。
MPT的誘導(dǎo)可以用本領(lǐng)域所知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)監(jiān)測(cè)。例如，對(duì)于不同濃度的化合物，分光光度監(jiān)測(cè)特定波長(zhǎng)的光散射的變化。合適的波長(zhǎng)典型地是520nm。
可以通過(guò)使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞線粒體對(duì)化合物的吸收。例如，可以使用熒光標(biāo)記化合物或者可以將熒光團(tuán)連接到化合物上。合適的熒光團(tuán)的例子包括熒光素和CyTM5.5。化合物的亞細(xì)胞位置可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)檢測(cè)，包括共焦熒光顯微技術(shù)。此外，化合物可以連接例如生物素的其它可檢測(cè)的基團(tuán)，并且通過(guò)例如鏈霉親和素-Alexa Fluor 488的鏈霉親和素染色來(lái)檢測(cè)。
線粒體跨膜電位可以用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)評(píng)估，包括例如JC-1的染料，和例如膜聯(lián)蛋白V-FITC的著色劑。通過(guò)這些技術(shù)能夠測(cè)定細(xì)胞是否經(jīng)受了MPT，并且評(píng)估是否誘導(dǎo)了凋亡。
例如過(guò)氧陰離子(O2-)和氫過(guò)氧化物(H2O2)的反應(yīng)性氧物種，作為ATP產(chǎn)物的副產(chǎn)物而產(chǎn)生，并且在細(xì)胞增殖中起到信號(hào)中間體的重要作用，但是它們通過(guò)破壞脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、DNA和RNA在較高濃度抑制增殖并且誘導(dǎo)凋亡(Zanetti等人，2001)。O2-在線粒體中通過(guò)Mn過(guò)氧化物歧化酶(SOD)轉(zhuǎn)化成H2O2，但是也能夠通過(guò)陰離子通道從線粒體中釋放，并在其中通過(guò)胞質(zhì)Cu/Zn SOD歧化成H2O2(VandenHoek等人，1998)。
本文還公開了識(shí)別能夠在增殖細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡的化合物的方法，其中該方法包括使細(xì)胞或細(xì)胞提取物與候選化合物接觸，測(cè)定細(xì)胞過(guò)氧陰離子(O2-)的濃度是否增加，然后測(cè)定該化合物是否選擇性地在增殖細(xì)胞而不是非增殖或生長(zhǎng)休眠細(xì)胞中誘導(dǎo)了凋亡。評(píng)估化合物是否選擇性地在增殖細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡，可以由本領(lǐng)域的技術(shù)人員通過(guò)比較在增殖細(xì)胞中，與在非增殖或生長(zhǎng)休眠細(xì)胞中，該化合物對(duì)細(xì)胞過(guò)氧陰離子水平的影響而容易地確定。
細(xì)胞色素C從線粒體內(nèi)膜空間的釋放也是已知的在細(xì)胞中引發(fā)凋亡的因素。在增殖細(xì)胞(相對(duì)于非增殖細(xì)胞)中測(cè)量細(xì)胞色素C水平的變化，可用于識(shí)別干擾線粒體功能的化合物。
本文還公開了識(shí)別可作為血管生成抑制劑的化合物的方法，其中該方法包括將細(xì)胞或細(xì)胞提取物與候選化合物接觸，測(cè)定細(xì)胞過(guò)氧陰離子(O2-)的濃度是否增加，并且由此確定該化合物是否是血管生成的抑制劑。
血管生成是指從現(xiàn)有血管中生出新毛細(xì)管，并且由增殖的內(nèi)皮細(xì)胞所推動(dòng)。血管生成在胚胎形成過(guò)程中發(fā)生，而且是在成人中(Carmeliet & Jain，2001)。普通的成年哺乳動(dòng)物的血管生成，限定于雌性的生殖周期、傷口愈合和一些病理狀況。血管生成是例如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、糖尿病視網(wǎng)膜病變和癌癥的疾病的關(guān)鍵因素。腫瘤的擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移取決于腫瘤的血管生成(Hanahan & Folkman，1996)。
治療應(yīng)用由與ANT結(jié)合的化合物干擾MPT可能誘導(dǎo)凋亡。例如過(guò)氧陰離子(O2-)的反應(yīng)性氧物種在細(xì)胞增殖中起到信號(hào)中間體的重要作用，然而提高的濃度可以抑制增殖并且誘導(dǎo)凋亡。因此，與ANT結(jié)合并且選擇性地抑制線粒體功能的化合物，或者相比于非增殖細(xì)胞，在增殖細(xì)胞中增加過(guò)氧陰離子細(xì)胞水平的化合物，可能對(duì)于治療脊椎動(dòng)物的各種疾病和生理情況具有潛在的治療作用。
此外，細(xì)胞色素C從線粒體內(nèi)膜空間的釋放是已知的在細(xì)胞中引發(fā)凋亡的因素。細(xì)胞色素C被認(rèn)為直接促進(jìn)了凋亡蛋白酶(caspases)的活化。因此，干擾線粒體功能的化合物(例如通過(guò)與ANT結(jié)合及誘導(dǎo)MPT)能導(dǎo)致在增殖細(xì)胞(相對(duì)于非增殖細(xì)胞)中細(xì)胞色素C細(xì)胞水平的增加，并且可能對(duì)于治療脊椎動(dòng)物的各種疾病和生理情況具有潛在的治療作用。
失調(diào)和疾病的例子可以分組為如下的廣泛類別血管生成依賴性疾病、細(xì)胞增殖性疾病(例如牛皮癬、IBD、惡性腫瘤、再狹窄)、炎性失調(diào)、自身免疫性疾病、血管病、血栓癥、癌癥、神經(jīng)變性病(例如阿茲海默癥、帕金森氏病)、骨髓發(fā)育異常綜合癥、缺血/再灌注損傷和器官移植損傷。
典型地，癌癥選自致癌腫瘤、上皮源腫瘤，例如結(jié)腸直腸癌、乳腺癌、肺癌、頭和頸腫瘤、肝癌、胰腺癌、卵巢癌、胃癌、腦癌、膀胱癌、前列腺癌和泌尿/生殖道癌；例如肉瘤的間質(zhì)腫瘤；和例如B細(xì)胞淋巴瘤的造血腫瘤。
典型地，癌癥是造血腫瘤。更典型地，癌癥是固體腫瘤。
本發(fā)明其它可能的治療應(yīng)用包括炎性失調(diào)和/或自身免疫性疾病的治療，包括以下例子風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、血清陰性關(guān)節(jié)炎性皮疹和其它炎性關(guān)節(jié)炎性皮疹、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多動(dòng)脈炎和相關(guān)綜合癥、系統(tǒng)性硬化癥、Sjgren’s綜合癥和其它炎性眼病、混合性結(jié)締組織病、多肌炎和皮肌炎、風(fēng)濕性多肌痛癥和巨細(xì)胞性動(dòng)脈炎、炎性關(guān)節(jié)病、非炎性關(guān)節(jié)病和軟組織風(fēng)濕、反射交感性營(yíng)養(yǎng)不良。
血管病和血栓癥的例子包括動(dòng)脈粥樣硬化病變進(jìn)展；例如短暫性缺血、完全中風(fēng)(completed stroke)和頸動(dòng)脈手術(shù)后的腦血管意外；急性心肌梗死(原發(fā)性和繼發(fā)性)；心絞痛；冠狀動(dòng)脈旁路移植閉塞；經(jīng)皮經(jīng)腔內(nèi)冠脈成形術(shù)后閉塞；冠脈內(nèi)支架術(shù)后閉塞；周邊動(dòng)脈血管疾病的血管閉塞；在手術(shù)后、或在懷孕中，或在固定中的靜脈血栓栓塞性疾病。
小血管病的例子包括血管球性腎炎；血栓性血小板減少性紫癜；溶血性尿毒綜合癥；胎盤功能不足和先兆子癇。
本發(fā)明也應(yīng)用于治療血管綜合癥和骨髓增生性疾病。
本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)用于識(shí)別在下列情況下預(yù)防血栓形成的化合物人工/修復(fù)的血管分流和嫁接；修復(fù)的心臟瓣；體外循環(huán)術(shù)；血液灌流和血液透析。
典型地，根據(jù)本發(fā)明識(shí)別的化合物可以與其它已知的治療劑結(jié)合使用，例如外科和/或治療劑，包括化學(xué)治療劑或者放射治療劑。例如，當(dāng)用于治療固體腫瘤時(shí)，根據(jù)本發(fā)明識(shí)別的化合物可以與化學(xué)治療劑一起施用，例如阿酶素、紅豆杉醇、氟尿嘧啶、馬法蘭、順鉑、α-干擾素、COMP(環(huán)磷酰胺、長(zhǎng)春新堿、甲氨喋呤和強(qiáng)的松)、依托泊苷、mBACOD(甲氨喋呤、博來(lái)酶素、亞德里亞酶素、環(huán)磷酰胺、長(zhǎng)春新堿和地塞米松)、PROMACE/MOPP(強(qiáng)的松、甲氨喋呤(w/亞葉酸援救)、亞德里亞酶素、環(huán)磷酰胺、紅豆杉醇、依托泊苷/二氯甲基二乙胺、長(zhǎng)春新堿、強(qiáng)的松和甲芐肼)、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春堿、血管抑制素、TNP-470、戊聚糖聚礬、血小板因子4、血管生成抑制素、LM-609、SU-101、CM-101、Techgalan、薩利多胺、SP-PG等。其它化學(xué)治療劑包括烷基化劑，例如包括二氯甲基二乙胺、苯丙氨酸氮芥(melphan)、苯丁酸氮芥、環(huán)磷酰胺和異環(huán)磷酰胺的氮芥；包括卡氮芥、環(huán)己亞硝脲、甲基環(huán)己亞硝脲和鏈脲酶素的亞硝基脲；包括白消安的烷基磺酸鹽；包括氮烯唑胺的三嗪；包括噻替派和六甲基三聚氰胺的亞乙基亞胺；包括甲氨喋呤的葉酸類似物；包括5-氟尿嘧啶、胞嘧啶阿拉伯糖苷的嘧啶類似物；包括6-巰基嘌呤和6-硫鳥嘌呤的嘌呤類似物；包括放射菌素D的抗腫瘤抗生素；包括亞德里亞酶素、博來(lái)酶素、絲裂酶素C和methramycin的蒽環(huán)酶素；包括三苯氧胺和皮質(zhì)類固醇的激素和激素拮抗劑，以及包括順鉑和布喹那的各種制劑。
典型地，根據(jù)本發(fā)明要治療的生理系統(tǒng)(例如肝系統(tǒng)、胰腺系統(tǒng))可以在施用本發(fā)明的體系前的手術(shù)中分離。
化合物或藥物組合物的單一或多重給藥，可以根據(jù)治療醫(yī)師選擇的劑量水平和方式進(jìn)行。不管怎樣，根據(jù)本發(fā)明識(shí)別的化合物或藥物組合物，應(yīng)該以治療患者足夠有效的化合物的量而提供。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠通過(guò)常規(guī)試驗(yàn)，確定根據(jù)本發(fā)明使用的化合物或藥物組合物的有效且無(wú)毒的量，從而用于檢測(cè)凋亡細(xì)胞和/或治療或預(yù)防失調(diào)和疾病。通常，預(yù)計(jì)有效的劑量范圍是每Kg體重每24小時(shí)大約0.0001mg至大約1000mg；典型地，每kg體重每24小時(shí)大約0.001mg至大約750mg；每kg體重每24小時(shí)大約0.01mg至大約500mg；每kg體重每24小時(shí)大約0.1mg至大約500mg；每Kg體重每24小時(shí)大約0.1mg至大約250mg；每Kg體重每24小時(shí)大約1.0mg至大約250mg。更典型地，預(yù)計(jì)有效的劑量范圍在每Kg體重每24小時(shí)大約1.0mg至大約200mg范圍內(nèi)；每kg體重每24小時(shí)大約1.0mg至大約100mg；每kg體重每24小時(shí)大約1.0mg至大約50mg；每kg體重每24小時(shí)大約1.0mg至大約25mg；每Kg體重每24小時(shí)大約5.0mg至大約50mg；每Kg體重每24小時(shí)大約5.0mg至大約20mg；每kg體重每24小時(shí)大約5.0mg至大約15mg。
另外可選的，有效劑量可能高達(dá)大約500mgm2。通常，預(yù)計(jì)有效的劑量范圍是大約25至大約500mg/m2，優(yōu)選大約25至大約350mg/m2，更優(yōu)選大約25至大約300mg/m2，進(jìn)一步優(yōu)選大約25至大約250mgm2，仍進(jìn)一步優(yōu)選大約50至大約250mg/m2，更進(jìn)一步優(yōu)選大約75至大約150mg/m2。
關(guān)于本文公開的氧化砷(或者氧化砷等效物)化合物，有效的劑量范圍可以是每kg體重每24小時(shí)大約0.0001mg至大約100mg化合物。例如，有效的劑量范圍可以是每kg體重每24小時(shí)大約0.001mg至大約100mg化合物。例如，有效的劑量范圍可以是每kg體重每24小時(shí)大約0.01mg至大約50mg化合物。例如，有效的劑量范圍可以是每kg體重每24小時(shí)大約0.1mg至大約20mg化合物。例如，有效的劑量范圍可以是每Kg體重每24小時(shí)大約0.1mg至大約10mg化合物。
關(guān)于與根據(jù)本發(fā)明識(shí)別的化合物一起使用的附加活性劑，有效的劑量范圍可以是每Kg體重每24小時(shí)大約0.0001mg至大約100mg制劑，優(yōu)選每kg體重每24小時(shí)大約0.001mg至大約100mg制劑，更優(yōu)選是每Kg體重每24小時(shí)大約0.01mg至大約50mg制劑，進(jìn)一步優(yōu)選每Kg體重每24小時(shí)大約0.1mg至大約20mg制劑，仍進(jìn)一步優(yōu)選每Kg體重每24小時(shí)大約0.1mg到大約10mg制劑。
緩釋制劑也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
典型地，該化合物可以在病癥治療期間施用。
此外，根據(jù)本發(fā)明使用的化合物的最佳用量和每次劑量的間隔，將通過(guò)所治療病癥的本質(zhì)和程度、施藥的形式、程序和施用點(diǎn)，以及所治療的特定脊椎動(dòng)物的本質(zhì)來(lái)決定，這對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。同樣，此最佳條件可以通過(guò)常規(guī)技術(shù)來(lái)確定。
最佳的療程，例如對(duì)于特定天數(shù)每天化合物的施用劑量，可以由本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)用常規(guī)療程的測(cè)定試驗(yàn)來(lái)確定，這對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員也是顯而易見(jiàn)的。
根據(jù)本發(fā)明方法識(shí)別的化合物可以單獨(dú)施用，通常優(yōu)選該化合物作為藥物組合物/制劑而施用。可以根據(jù)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的方法制備常規(guī)藥物制劑，由此可以含有藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑和/或佐藥。
本發(fā)明將通過(guò)以下實(shí)施例進(jìn)一步舉例說(shuō)明。
實(shí)施例1化合物的合成方法GSAA的合成通過(guò)Donoghue等人(2000)和WO 01/21628說(shuō)明的方法的改進(jìn)方法制備BRAA。將對(duì)氨苯基胂酸(20.6g，95mmol)分批加入碳酸鈉(20g，189mmol)的水溶液(200mL)中。當(dāng)所有固體溶解后，發(fā)現(xiàn)該溶液的pH是10，然后在4℃冷卻2小時(shí)。將溴乙酰溴(15mL，173mmol)的無(wú)水二氯甲烷(35mL)溶液分兩部分加入，每次加入后強(qiáng)烈地?fù)u動(dòng)2～3分鐘。將該混合物靜置幾分鐘，并且將較低的有機(jī)層排出。通過(guò)滴加98％硫酸將溶液酸化至大約pH 2-3，使4-(N-(溴乙酰)氨基)苯胂酸(BRAA)沉淀，然后通過(guò)真空過(guò)濾收集并干燥，得到為白色固體的BRAA。
將BRAA(3.38g，10mmol)、還原型谷胱甘肽(3.23g，10.5mmol)和碳酸氫鈉(3.15g，37.5mmol)一起混合，并將該固體混合物分批溶解于0.5M的碳酸氫鹽緩沖液(100mL)中。發(fā)現(xiàn)該清澈溶液的pH是9，并徹底混合，在室溫下過(guò)夜。第二天，滴加32％鹽酸將該溶液酸化到中性pH，通過(guò)將該酸化的溶液滴加到充分?jǐn)嚢璧臒o(wú)水乙醇(1L)中使產(chǎn)物從醇中沉淀。將該混合物在室溫下攪拌1小時(shí)，然后靜置3小時(shí)直到析出沉淀。將乙醇清液倒出并保留～300mL，然后在2000g旋轉(zhuǎn)離心5分鐘。產(chǎn)物4-(N-((S-谷胱甘肽基)乙?；?氨基)苯胂酸(GSAA)通過(guò)在新鮮的無(wú)水乙醇中重懸浮和再離心而洗滌。將此洗滌過(guò)程再重復(fù)兩次，通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)將最終的懸浮液旋干而得到為白色固體的GSAA。GSAA通過(guò)1H-NMR(D2O，300 MHz)和13C-NMR(D2O，75 MHz)表征，分子量是564。
GSAO的合成GSAO的完整合成在國(guó)際專利申請(qǐng)WO 01/21628中說(shuō)明，其全部?jī)?nèi)容在此引入作為交叉參照。BRAA由以上描述的方法制備。然后通過(guò)Donoghue等人(2000)說(shuō)明的方法，將BRAA轉(zhuǎn)化成4-(N-(溴乙酰)氨基)苯亞胂酸(BRAO)。BRAO轉(zhuǎn)化成GSAO的過(guò)程是Donoghue等人(2000)說(shuō)明的方法的改進(jìn)，該方法如下。將還原型谷胱甘肽(16g，52mmol)在氮?dú)夥障氯芙庠诿撗跛?1L)中(脫氧水的制備是在氮?dú)夥障?，通過(guò)煮沸然后冷卻到室溫而進(jìn)行)。將BRAO(25g，77mmol)懸浮于該溶液中，并將該混合物強(qiáng)烈地?cái)嚢柚钡轿慈芙獾腂RAO失去漂浮的趨勢(shì)，這時(shí)降低攪拌速度。在氮?dú)夥障拢尤肴野?16mL，11.6g，115mmol)，并將混合物攪拌至少18小時(shí)。通過(guò)快速真空過(guò)濾將一些無(wú)色的固體除去，并將濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮成粘性凝膠。用乙醇(250mL)稀釋該凝膠，增加攪拌速度，然后加入丙酮(250mL)，從而形成白色固體。在氮?dú)庀聰嚢?小時(shí)后，將固體用真空過(guò)濾收集，并在室溫下真空干燥到恒重。通過(guò)1H-NMR分析該材料而測(cè)定三乙胺的量。以10M水溶液的形式將一當(dāng)量的氫氧化鈉(即每mmol三乙胺對(duì)應(yīng)1mmol NaOH)加入該材料的最少量脫氧水溶液中。在氮?dú)庀聦⒃撊芤簲嚢?小時(shí)，通過(guò)在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中移除溶劑而得到GSAO(作為鈉鹽)。通過(guò)以下方法表征GSAO1H-NMR(D2O，400MHz)、13C-NMR(D2O，100MHz)、HPLC和紅外光譜(石蠟糊)。元素分析符合GSAO.2H2O的組成，而質(zhì)譜得到在549.1m.u.[GSAO+H]+的原分子離子。通過(guò)HPLC分析GSAO的純度＞94％。
GSCA的合成GSCA通過(guò)與GSAA相似的方法制備，如下使用4-氨基苯甲酸代替對(duì)氨苯基胂酸。通過(guò)以上說(shuō)明的對(duì)氨苯基胂酸的制備方法，制備冷卻的4-氨基苯甲酸(13g，95mmol)堿性溶液，并以同樣的方式與溴乙酰溴反應(yīng)。排出較低的有機(jī)層，而4-(N-(溴乙酰)氨基)苯甲酸(BRCA)自身直接從溶液中析出。完全按照GSAA下面的制備方法，只是用BRCA(2.58g，10mmol)代替BRAA，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后獲得為白色固體的GSCA。GSCA通過(guò)1H-NMR(D2O，300MHz)和13C-NMR(D2O，75MHz)表征，并且其二鈉鹽的分子量是528。
GSAO和GSAA的生物素和熒光素衍生物的合成GSAO-B按照Donoghue等人(2000)說(shuō)明的方法生成，其分子量是1001。將熒光素-5-EX琥珀酰亞胺酯(Molecular Probes，Eugene，OR)(2.4mg，4.1μmol)的DMSO(240μL)溶液加入含GSAO或GSAA(33.8mM)的Mes緩沖液中，pH 5.5(5mM，473μL)，將該混合物用碳酸氫鹽緩沖液，pH 9(0.5M，3.287mL)稀釋，并且在室溫靜置80分鐘。然后用含甘氨酸(100mM)的PBS(4mL)稀釋該反應(yīng)，并在室溫下靜置過(guò)夜。最終的溶液含有三價(jià)砷(2.00mM)和甘氨酸(50mM)。熒光素-5X與GSAO或者GSAA的摩爾比是～1.5∶1。GSAO-和GSAA-熒光素(GSAO-F和GSAA-F)的分子量分別是1024和1040。
2-(2-溴乙酰鄰氨基)苯胂酸的合成將鄰氨基苯基胂酸(4.70g，21.7mmol)溶解在1.85M KOH(25mL)中，然后用Na2CO3(6g)處理，并用H2O(25mL)稀釋。該溶液在冰中冷卻30分鐘，然后加入250mL的分液漏斗中。將溴乙酰溴(4mL，46.0mmol)的CH2Cl2(20mL)溶液經(jīng)過(guò)大約30分鐘小心地加入分液漏斗中，并頻繁地?fù)u動(dòng)，釋放出CO2(g)。在停止放出CO2后，將CH2Cl2分離，水層用濃H2SO4酸化。所得白色沉淀通過(guò)過(guò)濾收集(6g，82％產(chǎn)率)。
2-(2-溴乙酰鄰氨基)苯亞胂酸的合成將2-(2-溴乙酰氨基)苯胂酸(6g，17.8mmol)溶解于HBr/MeOH(1∶1)中。加入NaI(80mg)，該反應(yīng)用N2換氣并冷卻到0℃。SO2以大約4個(gè)泡/秒的速度通入，15分鐘后開始形成白色沉淀。在反應(yīng)升至室溫后，進(jìn)一步通入SO22.5小時(shí)。隨后反應(yīng)用N2換氣10分鐘，通過(guò)過(guò)濾收集固體，并用H2O(×3)、醚(×2)洗滌，得到1.35g 2-(2-溴乙酰氨基)苯亞胂酸。從初始濾液中進(jìn)一步得到0.25g。總產(chǎn)率(1.60g，28％)。
2-(2-溴乙酰對(duì)氨基)苯胂酸的合成將對(duì)氨苯基胂酸(20g，92mmol)溶解在1.85M KOH(100mL)中，然后用Na2CO3(30g)和H2O(100mL)處理。該溶液在冰中冷卻30分鐘，然后加入500mL的分液漏斗中。往分液漏斗中小心地加入溴乙酰溴(16mL，184mmol)的CH2Cl2(60mL)溶液，并頻繁地?fù)u動(dòng)，釋放出CO2(g)。此過(guò)程大約經(jīng)過(guò)2小時(shí)。在停止放出CO2(g)后，將CH2Cl2分離，水層用98％ H2SO4酸化。所得白色沉淀通過(guò)過(guò)濾收集，并在干燥器中干燥18小時(shí)。得到24g(72mmol，78％產(chǎn)率)。
2-(2-溴乙酰對(duì)氨基)苯亞胂酸的合成將2-(2-溴乙酰對(duì)氨基)苯胂酸(15g，45mmol)溶解在150mL 48％的HBr(水)/MeOH(1∶1)中。加入NaI(200mg，13mmol)，該反應(yīng)用N2換氣并在冰中冷卻。SO2(g)以大約2個(gè)泡/秒的速度通入，5小時(shí)后，開始形成白色沉淀。反應(yīng)加溫到25℃后，進(jìn)一步通入SO2(g)2小時(shí)。反應(yīng)用N2換氣10分鐘，通過(guò)過(guò)濾收集固體，再用H2O(×3)、醚(×2)洗滌，得到1.35g 2-(2-溴乙酰氨基)苯亞胂酸。獲得5.5g(17mmol，38％產(chǎn)率)。
NH2-Glu-Cys-(CH2CONH-C6H4-o-As{OH}2)-Gly-OH“o-GSAO”(1)的合成將2-(2-溴乙酰氨基)苯亞胂酸(288mg，0.90mmol)懸浮在脫氣H2O(5mL)中。加入NEt3(250μL，1.7mmol)，隨后加入谷胱甘肽(160mg，0.521mmol)。該反應(yīng)混合物的pH確定為pH≥8。在N2下將白色懸浮液劇烈攪拌20小時(shí)。將該反應(yīng)通過(guò)玻璃燒結(jié)的過(guò)濾器過(guò)濾，濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮。將殘留物轉(zhuǎn)移到塑料試管中，并加入2mL EtOH/丙酮(1∶1)，而得到白色沉淀。在試管上封蓋并在4℃儲(chǔ)存1.5小時(shí)。將上層清液離心并倒出而剩下白色固體，將該白色固體移出并在真空下進(jìn)一步干燥。將干燥的粉末狀o-GSAO溶解在H2O(4mL)中，并注入半制備的HPLC，C18Vydac Protein & Peptide柱中。緩沖液A含O.1％ TFA的過(guò)濾和脫氣水；緩沖液B含0.1％ TFA的過(guò)濾和脫氣乙腈-過(guò)濾和脫氣水(9∶1)。收集餾分并凍干。o-GSAO的結(jié)構(gòu)由LC-MS(M+548.4)和1H-NMR確定。分四批用HPLC純化的純度是96.9％～98.8％。
Retro-HO-Cys-(CH2CONHC6H4-p-As{OH}2)-羰基-Glu-OH(3)的合成將2-(2-溴乙酰對(duì)氨基)苯亞胂酸(80mg，0.25mmol)懸浮于脫氣H2O(2mL)中。加入NEt3(70μL，0.5mmol)，隨后加入retro-HO-Cys-羰基-Glu-OH(50mg，O.17mmol)。該溶液的pH確定為pH≥8。在N2下將白色懸浮液劇烈攪拌16小時(shí)。該反應(yīng)通過(guò)一次性的0.45μM過(guò)濾盤過(guò)濾，濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮。將殘留物轉(zhuǎn)移到塑料試管中，并加入2mL EtOH/丙酮(1∶1)，從而得到白色沉淀。在試管上封蓋并在4℃儲(chǔ)存1.5小時(shí)。將溶液離心并倒出而剩下白色固體，將該白色固體再溶解到MeCN-水中。粗樣由RP-HPLC和LCMS分析。產(chǎn)品用半制備的RP-HPLC提純。組分在旋轉(zhuǎn)干燥儀上干燥。
Retro-HO-Cys-(CH2CONHC6H4-p-As{OH}2)-羰基-Glu-OH(4)的合成將2-(2-溴乙酰對(duì)氨基)苯亞胂酸(80mg，0.25mmol)懸浮在脫氣H2O(2mL)中。加入NEt3(70μL，0.5mmol)，隨后加入Retro-HO-Cys-羰基-Glu-OH(50mg，0.17mmol)。該溶液的pH確定為pH≥8。在N2下將白色懸浮液劇烈攪拌16小時(shí)。該反應(yīng)通過(guò)一次性的0.45μM過(guò)濾盤過(guò)濾，濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮。將殘留物轉(zhuǎn)移到塑料試管中，并加入2mL EtOH/丙酮(1∶1)，從而得到白色沉淀。在試管上封蓋并在4℃儲(chǔ)存1.5小時(shí)。將溶液離心并倒出而剩下白色固體，將該白色固體再溶解到MeCN-水中。粗樣由RP-HPLC和LCMS分析。產(chǎn)品用半制備的RP-HPLC提純。組分在旋轉(zhuǎn)干燥儀上干燥。
H-Arg-Gly-Asp-Cys(CH2CONHC6H4-p-As{OH}2)-OH(6)的合成將2-(2-溴乙酰對(duì)氨基)苯亞胂酸(80mg，0.25mmol)懸浮于脫氣H2O(4mL)中。加入NEt3(70μL，0.5mmol)，隨后加入H-Arg-Gly-Asp-Cys-OH(50mg，0.11mmol)。該溶液的pH確定為pH≥8。在N2下將白色懸浮液劇烈攪拌16小時(shí)。該反應(yīng)通過(guò)一次性的0.45μM過(guò)濾盤過(guò)濾，濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮。將殘留物轉(zhuǎn)移到塑料試管中，并加入2mL EtOH/丙酮(1∶1)，從而得到白色沉淀。在試管上封蓋并在4℃儲(chǔ)存1.5小時(shí)。將溶液離心并倒出而剩下白色固體，將該白色固體再溶解到MeCN-水中。粗樣由RP-HPLC和LCMS分析。產(chǎn)品用半制備的RP-HPLC提純。組分在旋轉(zhuǎn)干燥儀上干燥。
H-Gly-Gly-Cys(CH2CONHC6H4-p-As{OH}2)-OH(7)的合成將2-(2-溴乙酰對(duì)氨基)苯亞胂酸(288mg，0.90mmol)懸浮在脫氣H2O(4mL)中。加入NEt3(220μL，1.6mmol)，隨后加入H-Gly-Gly-Cys-OH(141.2mg，0.6mmol)。該溶液的pH確定為pH≥8。在N2下將白色懸浮液劇烈攪拌16小時(shí)。該反應(yīng)通過(guò)一次性的0.45μm過(guò)濾盤過(guò)濾，濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮。將殘留物轉(zhuǎn)移到塑料試管中，并加入2mL EtOH/丙酮(1∶1)，從而得到白色沉淀。在試管上封蓋并在4℃儲(chǔ)存1.5小時(shí)。將溶液離心并倒出而剩下白色固體，將該白色固體再溶解到MeCN-水中。粗樣由RP-HPLC和LCMS分析。產(chǎn)品用半制備的RP-HPLC提純。組分在旋轉(zhuǎn)干燥儀上干燥。
H-Val-Thr-Cys(CH2CONHC6H4-p-As{OH}2)-Gly-OH(8)的合成將2-(2-溴乙酰對(duì)氨基)苯亞胂酸(80mg，0.25mmol)懸浮在脫氣H2O(4mL)中。加入NEt3(70μL，0.5mmol)，隨后加入H-Val-Thr-Cys-Gly-OH(50mg，0.13mmol)。該溶液的pH確定為pH≥8。在N2下將白色懸浮液劇烈攪拌16小時(shí)。該反應(yīng)通過(guò)一次性的0.45μM過(guò)濾盤過(guò)濾，濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮。將殘留物轉(zhuǎn)移到塑料試管中，并加入2mL EtOH/丙酮(1∶1)，從而得到白色沉淀。在試管上封蓋并在4℃儲(chǔ)存1.5小時(shí)。將溶液離心并倒出而剩下白色固體，將該白色固體再溶解到MeCN-水中。粗樣由RP-HPLC和LCMS分析。產(chǎn)品用半制備的RP-HPLC提純。組分在旋轉(zhuǎn)干燥儀上干燥。
H-Cys-(CH2CONHC6H4-p-As{OH}2)-Tyr-PHe-Gln-Asn-Cys-(CH2CONHC6H4-p-As{OH}2)-OH(9)的合成Pressionoic acid的還原將該肽溶解于用N2脫氣的10mL 0.1M碳酸氫鈉的DTT溶液(99mg，0.65mmol)中。該溶液的pH確定為pH≥8，并且用N2覆蓋混合物。在用AcOH將溶液酸化2小時(shí)后，將混合物凍干。溶解于0.1％ TFA水溶液中，然后通過(guò)半制備的RP-HPLC提純。凍干。
將2-(2-溴乙酰對(duì)氨基)苯亞胂酸(26mg，0.081mmol，1.4eq.)懸浮于脫氣H2O(3mL)中。加入Net3(20μL，0.14mmol)，隨后加入pressionoic acid(22mg，0.028mmol)。該溶液的pH確定為pH≥8。在N2下將白色懸浮液劇烈攪拌16小時(shí)。該反應(yīng)通過(guò)一次性的0.45μM過(guò)濾盤過(guò)濾，濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮。將殘留物轉(zhuǎn)移到塑料試管中，并加入2mL EtOH/丙酮(1∶1)，從而得到白色沉淀。在試管上封蓋并在4℃儲(chǔ)存1.5小時(shí)。將溶液離心并倒出而剩下白色固體，將該白色固體再溶解到MeCN-水中。粗樣由RP-HPLC和LCMS分析。產(chǎn)品用半制備的RP-HPLC提純。組分在旋轉(zhuǎn)干燥儀上干燥。
3-S-(CH2CONHC6H4-p-As{OH}2)-1-丙磺酸(10)的合成將2-(2-溴乙酰對(duì)氨基)苯亞胂酸(288mg，0.90mmol)懸浮在脫氣H2O(4mL)中。加入Net3(220μL，1.6mmol)，隨后加入3-巰基丙磺酸(106.9mg，0.6mmol)。該溶液的pH確定為pH≥8。在N2下將白色懸浮液劇烈攪拌16小時(shí)。該反應(yīng)通過(guò)一次性的0.45μM過(guò)濾盤過(guò)濾，濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮。將殘留物轉(zhuǎn)移到塑料試管中，并加入2mL EtOH/丙酮(1∶1)，從而得到白色沉淀。在試管上封蓋并在4℃儲(chǔ)存1.5小時(shí)。將溶液離心并倒出而剩下白色固體，將該白色固體再溶解到MeCN-水中。粗樣由RP-HPLC和LCMS分析。產(chǎn)品用半制備的RP-HPLC提純。組分在旋轉(zhuǎn)干燥儀上干燥。
3-S-(CH2CONHC6H4-p-As{OH}2)-1-丙酸(11)的合成將2-(2-溴乙酰對(duì)氨基)苯亞胂酸酸(288mg，0.90mmol)懸浮在脫氣H2O(4mL)中。加入Net3(210μL，1.5mmol)，隨后加入巰基丙酸(53μL，0.6mmol)。該溶液的pH確定為pH≥8。在N2下將白色懸浮液劇烈攪拌16小時(shí)。該反應(yīng)通過(guò)一次性的0.45μM過(guò)濾盤過(guò)濾，濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮。將殘留物轉(zhuǎn)移到塑料試管中，并加入2mLEtOH/丙酮(1∶1)，從而得到白色沉淀。在試管上封蓋并在4℃儲(chǔ)存1.5小時(shí)。將溶液離心并倒出而剩下白色固體，將該白色固體再溶解到MeCN-水中。粗樣由RP-HPLC和LCMS分析。產(chǎn)品用半制備的RP-HPLC提純。組分在旋轉(zhuǎn)干燥儀上干燥。
1-S-(CH2CONHC6H4-p-As{OH}2)-巰基琥珀酸(13)的合成將2-(2-溴乙酰對(duì)氨基)苯亞胂酸(288mg，0.90mmol)懸浮在脫氣H2O(4mL)中。加入Net3(210μL，1.5mmol)，隨后加入巰基琥珀酸(90mg，0.6mmol)。該溶液的pH確定為pH≥8。在N2下將白色懸浮液劇烈攪拌16小時(shí)。該反應(yīng)通過(guò)一次性的0.45μM過(guò)濾盤過(guò)濾，濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮。將殘留物轉(zhuǎn)移到塑料試管中，并加入2mL EtOH/丙酮(1∶1)，從而得到白色沉淀。在試管上封蓋并在4℃儲(chǔ)存1.5小時(shí)。將溶液離心并倒出而剩下白色固體，將該白色固體再溶解到MeCN-水中。粗樣由RP-HPLC和LCMS分析。產(chǎn)品用半制備的RP-HPLC提純。組分在旋轉(zhuǎn)干燥儀上干燥。
1-S-(CH2CONHC6H4-p-As{OH}2)-β-D-葡萄糖(14)的合成將2-(2-溴乙酰對(duì)氨基)苯亞胂酸(288mg，0.90mmol)懸浮在脫氣H2O(4mL)中。加入Net3(210μL，1.5mmol)，隨后加入1-硫代-β-D-葡萄糖(130.9mg，0.6mmol)。該溶液的pH確定為pH≥8。在N2下將白色懸浮液劇烈攪拌16小時(shí)。該反應(yīng)通過(guò)一次性的0.45μM過(guò)濾盤過(guò)濾，濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮。將殘留物轉(zhuǎn)移到塑料試管中，并加入2mL EtOH/丙酮(1∶1)，從而得到白色沉淀。在試管上封蓋并在4℃儲(chǔ)存1.5小時(shí)。將溶液離心并倒出而剩下白色固體，將該白色固體再溶解到MeCN-水中。粗樣由RP-HPLC和LCMS分析。產(chǎn)品用半制備的RP-HPLC提純。組分在旋轉(zhuǎn)干燥儀上干燥。
3-S-(CH2CONHC6H4-p-As{OH}2)-1，2-丙二醇(15)的合成將2-(2-溴乙酰對(duì)氨基)苯亞胂酸(288mg，0.90mmol)懸浮在脫氣H2O(4mL)中。加入Net3(210μL，1.5mmol)，隨后加入3-巰基-1，2-丙二醇(65μL，0.6mmol)。該溶液的pH確定為pH≥8。在N2下將白色懸浮液劇烈攪拌16小時(shí)。該反應(yīng)通過(guò)一次性的0.45μM過(guò)濾盤過(guò)濾，濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮。將殘留物轉(zhuǎn)移到塑料試管中，并加入2mL EtOH/丙酮(1∶1)，從而得到白色沉淀。在試管上封蓋并在4℃儲(chǔ)存1.5小時(shí)。將溶液離心并倒出而剩下白色固體，將該白色固體再溶解到MeCN-水中。粗樣由RP-HPLC和LCMS分析。產(chǎn)品用半制備的RP-HPLC提純。組分在旋轉(zhuǎn)干燥儀上干燥。
5-S-(CH2CONHC6H4-p-As{OH}2)-1-四唑乙酸(21)的合成將2-(2-溴乙酰對(duì)氨基)苯亞胂酸(288mg，0.90mmol)懸浮在脫氣H2O(5mL)中。加入Net3(210μL，1.5mmol)，隨后加入5-巰基-四唑乙酸(110mg，0.6mmol)。該溶液的pH確定為pH≥8。在N2下將白色懸浮液劇烈攪拌16小時(shí)。該反應(yīng)通過(guò)一次性的0.45μM過(guò)濾盤過(guò)濾，濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮。將殘留物轉(zhuǎn)移到塑料試管中，并加入2mL EtOH/丙酮(1∶1)，從而得到白色沉淀。在試管上封蓋并在4℃儲(chǔ)存1.5小時(shí)。將溶液離心并倒出而剩下白色固體，將該白色固體再溶解到MeCN-水中。粗樣由RP-HPLC和LCMS分析。產(chǎn)品用半制備的RP-HPLC提純。組分在旋轉(zhuǎn)干燥儀上干燥。
H-Gly-Gly-Cys(CH2CONHC6H4-o-As{OH}2-OH(22)的合成將2-(2-溴乙酰鄰氨基)苯亞胂酸(160mg，0.5mmol)懸浮在脫氣H2O(1mL)中。加入NEt3(140μL，1.0mmol)，隨后加入H-Gly-Gly-Cys-OH(61mg，0.26mmol)。該溶液的pH確定為pH≥8。在N2下將白色懸浮液劇烈攪拌20小時(shí)。該反應(yīng)通過(guò)一次性的0.45μM過(guò)濾盤過(guò)濾，濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮。將殘留物轉(zhuǎn)移到塑料試管中，并加入2mL EtOH/丙酮(1∶1)，從而得到白色沉淀。在試管上封蓋并在4℃儲(chǔ)存1.5小時(shí)。將溶液離心并倒出而剩下白色固體，將該白色固體再溶解到MeCN-水中。粗樣由RP-HPLC和LCMS分析。產(chǎn)品用半制備的RP-HPLC提純。組分在旋轉(zhuǎn)干燥儀上干燥。
H-Val-Thr-Cys(CH2CONHC6H4-o-As{OH}2)-Gly-OH(23)的合成將2-(2-溴乙酰鄰氨基)苯亞胂酸(80mg，0.25mmol)懸浮在脫氣H2O(1mL)中。加入Net3(70μL，0.50mmol)，隨后加入H-Val-Thr-Cys-Gly-OH(50mg，0.13mmol)。該溶液的pH確定為pH≥8。在N2下將白色懸浮液劇烈攪拌20小時(shí)。該反應(yīng)通過(guò)一次性的0.45μM過(guò)濾盤過(guò)濾，濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮。將殘留物轉(zhuǎn)移到塑料試管中，并加入2mL EtOH/丙酮(1∶1)，從而得到白色沉淀。在試管上封蓋并在4℃儲(chǔ)存1.5小時(shí)。將溶液離心并倒出而剩下白色固體，將該白色固體再溶解到MeCN-水中。粗樣由RP-HPLC和LCMS分析。產(chǎn)品用半制備的RP-HPLC提純。組分在旋轉(zhuǎn)干燥儀上干燥。
砷濃度的分析GSAO、GSAO-B和GSAO-F的濃度通過(guò)用二巰基丙醇滴定并用5，5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(Sigma，St.Louis，MO)計(jì)算剩余的自由硫醇來(lái)測(cè)量(Donoghue等人，2000)。將合成物無(wú)菌過(guò)濾，并在使用前儲(chǔ)存于4℃的陰暗處。當(dāng)在這樣的條件下儲(chǔ)存至少一周后，砷儲(chǔ)藏液的活性濃度沒(méi)有大的損失。
實(shí)施例2GSAO通過(guò)與ANT反應(yīng)和干擾ANT而引發(fā)的MTP打開方法線粒體腫脹分析線粒體通過(guò)使用前述的差速離心法(Schnaitman & Greenawalt，1968)從～250g雄性Wistar大鼠的肝臟分離。最終的線粒體球以每毫升30mg蛋白質(zhì)的濃度，重懸浮于含有213mM甘露醇、71mM蔗糖和10mM琥珀酸鈉的3mM HEPES-KOH，pH 7.0緩沖液中。MPT的誘導(dǎo)，是通過(guò)在25℃將該肝臟線粒體以每毫升0.5mg蛋白質(zhì)的濃度懸浮于含有75mM甘露醇、250mM蔗糖、10mM琥珀酸鈉和2μM魚藤酮的3mM HEPES-KOH，pH 7.0緩沖液中，由分光光度評(píng)估的。所有緩沖液組分來(lái)自于Sigma，St.Louis，MO。將砷衍生物和GSCA溶解于含有100mM甘氨酸的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中。使用的與ANT結(jié)合的化合物是CsA、BKA和ADP(Sigma，St.Louis，MO)。試劑濃度在圖注中表示。腫脹通過(guò)使用Molecular DevicesThermomax Plus(Palo Alto，CA)酶標(biāo)儀，監(jiān)測(cè)與腫脹相關(guān)的520nm處光散射的降低來(lái)測(cè)量。
GSAO與ANT的結(jié)合大鼠肝臟線粒體在25℃以每毫升1mg蛋白質(zhì)的濃度懸浮于含有213mM甘露醇、71mM蔗糖和10mM琥珀酸鈉的3mM HEPES-KOH，pH 7.0緩沖液中，并與100μM GSAO-B一起，在沒(méi)有或有400μM 2，3-二巰基丙醇(Fluka，Buchs，SG，Switzerland)存在下，在旋轉(zhuǎn)輪上于室溫培養(yǎng)1小時(shí)。該標(biāo)記的線粒體用PBS洗滌三次，然后在0.3mL冰冷卻的25mM Tris，pH 7.4緩沖液中經(jīng)聲波處理，該緩沖液含有140mM NaCl、2.7mM KCl、0.5％ Triton X-100、0.05％ Tween-20、10μM亮抑酶肽、10μM抑酶肽、50μg.mL-14，2-(氨乙基)-苯磺酰氟和5mM EDTA。溶胞產(chǎn)物通過(guò)于4℃在18000g離心10分鐘而澄清，然后與30μL鏈霉親和素-dynabeads(Dynal，Oslo，Norway)一起于4℃在旋轉(zhuǎn)輪上培養(yǎng)60分鐘，以分離該生物素標(biāo)記的蛋白質(zhì)。該珠粒用聲波處理緩沖液洗滌5次，然后通過(guò)在30μLSDS-Laemmli緩沖液中煮沸2分鐘使生物素標(biāo)記的蛋白質(zhì)從該珠粒中釋放出來(lái)。樣本在還原條件下被8-16％梯度iGels分解，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜。蛋白質(zhì)通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法，使用1∶500山羊抗人ANT多克隆抗體稀釋液(Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)和1∶2000兔抗山羊過(guò)氧化物酶連接的抗體稀釋液(Dako，Carpinteria，California)檢測(cè)。
用曙紅-5-馬來(lái)酰亞胺標(biāo)記ANT大鼠肝臟亞線粒體顆粒根據(jù)Majima等人(1998)的方法，通過(guò)聲波處理和差速離心法制備。該顆粒以每毫升20mg蛋白質(zhì)的濃度懸浮在含有250mM蔗糖和0.2mM EDTA的10mM Tris，pH 7.2的緩沖液中，并于25℃在不存在或每毫克蛋白質(zhì)存在200nmol GSAO的條件下培養(yǎng)10分鐘，隨后于0℃在陰暗處與每毫克蛋白質(zhì)20nmol的曙紅-5-馬來(lái)酰亞胺一起培養(yǎng)1分鐘。該標(biāo)記通過(guò)以每毫克蛋白質(zhì)加入10μmol二硫蘇糖醇而終止。該蛋白質(zhì)被4-20％梯度iGels分解，并且該曙紅標(biāo)記的ANT通過(guò)UV透照法用Fluor-STMMultilmager(Bio-Rad，Hercules，CA)顯像。
結(jié)果GSAO(圖1A)引發(fā)分離的大鼠肝臟線粒體的腫脹(圖1Bi)。腫脹速度隨著GSAO濃度和培養(yǎng)時(shí)間的增加而增加。GSAO的三價(jià)砷部分是造成這種活性的原因，因?yàn)橄鄳?yīng)的五價(jià)砷(4-(N-((S-谷胱甘肽基)乙?；?氨基)苯胂酸，GSAA)或者羧酸(4-(N-((S-谷胱甘肽基)乙?；?氨基)苯甲酸，GSCA)化合物(圖1A)是沒(méi)有效果的(圖1Bii)?？状蜷_的陽(yáng)性對(duì)照是Ca2+和Pi離子(圖1Bi)和PAO(圖1Bii)。
ANT的活性通過(guò)與Ca2+、親環(huán)蛋白D和腺嘌呤核苷酸的結(jié)合來(lái)控制。親環(huán)蛋白D(Crompton等人，1988)和腺嘌呤核苷酸(Haworth & Hunter，1979a，b)與ANT的基質(zhì)一側(cè)結(jié)合，而對(duì)Ca2+的相互作用點(diǎn)還未確定。主要引發(fā)MPTP打開的是基質(zhì)中Ca2+濃度的升高。Ca2+與EGTA的螯合作用阻礙了孔的打開。Ca2+引發(fā)點(diǎn)的特異性似乎是絕對(duì)的，因?yàn)槔鏜g2+的其它二價(jià)金屬離子起到抑制劑作用(Haworth &Hunter，1979a)。在亞毫摩爾Ca2+濃度時(shí)，使親環(huán)蛋白D與ANT結(jié)合對(duì)于孔的打開是必要的(Halestrap等人，2002)。環(huán)孢霉素A(CsA)通過(guò)與親環(huán)蛋白D結(jié)合并且將其從ANT置換而阻礙孔的打開(Crompton等人，1988)?；|(zhì)ADP也是孔打開的重要的調(diào)節(jié)劑，它與ANT結(jié)合并且降低了引發(fā)點(diǎn)對(duì)于Ca2+的敏感性(Haworth &Hunter，1979a，b)。米酵菌酸(Bonkrekic acid，BKA)也與ANT相互作用并且降低其對(duì)于Ca2+的敏感性(Hunter & Haworth，1979)。
Mg2+、EGTA、CsA、ADP和BKA都阻礙了GSAO對(duì)于孔打開的效果(圖1Biii)。這些結(jié)果與GSAO對(duì)于孔打開的特異影響是一致的，并支持了ANT作為其目標(biāo)。
GSAO引起的線粒體腫脹的半衰期通過(guò)加入Ca2+而降低(圖1C)。這個(gè)結(jié)果與GSAO交聯(lián)ANT上突向線粒體基質(zhì)的三個(gè)半胱氨酸殘基中的兩個(gè)是一致的。
ANT與生物素標(biāo)記的GSAO(4-(4-(S-(S-(6-((6-((生物素?；?氨基)己?；?氨基)己酰基)谷胱甘肽基)乙?；?氨基)苯基氧化砷，GSAO-B)的直接相互作用，顯示在圖1D中。用GSAO-B標(biāo)記ANT是特效的，因?yàn)樗c四倍摩爾過(guò)量的小分子合成二硫酚、二巰基丙醇競(jìng)爭(zhēng)。曙紅-馬來(lái)酰亞胺在ANT中使Cys160烷基化(Majima等人，1998)，并阻礙ADP的結(jié)合(Halestrap等人，1997)。GSAO與曙紅-馬來(lái)酰亞胺對(duì)ANT的Cys160的烷基化作用相競(jìng)爭(zhēng)(圖1E)，這意味著GSAO交聯(lián)Cys160和Cys257。
實(shí)施例3GSAO在活細(xì)胞線粒體中集中方法細(xì)胞培養(yǎng)牛主動(dòng)脈線粒體(BAE)細(xì)胞(ATCC，Rockville，MD)在補(bǔ)充了10％胎牛血清(FCS)、2mM L-谷氨酰胺、和5 U.mL-1青霉素/鏈霉素(Gibco，Galthersburg，MD)的DMEM中培養(yǎng)。人微血管內(nèi)皮細(xì)胞系HMEC-1(Ades等人，1992)，在補(bǔ)充了10％FCS、2mM L-谷氨酰胺、和5U.mL-1青霉素/鏈霉素、10ng.mL-1表皮生長(zhǎng)因子(Sigma，St.Louis，MO)和1μg.mL-1氫化可的松(Sigma)的MCDB131培養(yǎng)基(Gibco)中培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)塑料皿購(gòu)自Corning Costar(Coming，NY)。胰蛋白酶/EDTA溶液來(lái)自Gibco。
免疫細(xì)胞化學(xué)和共焦顯微術(shù)BAE細(xì)胞以每孔104細(xì)胞的密度植入8孔的Labtek玻璃小室載玻片(Nunc，Naperville，1L)并帖壁過(guò)夜。將細(xì)胞洗滌一次，然后用Hanks平衡鹽溶液(HBSS)(Gibco)替換培養(yǎng)基。隨后將該細(xì)胞與50μM GSAO-F、50μM GSAO-F和250μM二巰基丙醇、或50μM GSAA-F一起培養(yǎng)1小時(shí)。所有的細(xì)胞用100nMMitotrackerTMRed CMXRos(Molecular Probe，Eugene，OR)對(duì)染。然后用HBSS將該細(xì)胞洗滌三次，用80％丙酮和20％甲醇固著10分鐘，再用HBSS洗滌三次。將載玻片安放于VectaShield抗衰減劑(Vector Laboratories，Burlingame，CA)中，并用指甲油密封。圖像通過(guò)使用Leica DM IRB倒置顯微鏡和共焦系統(tǒng)，應(yīng)用Leica共焦軟件記錄。
結(jié)果GSAO的一個(gè)顯著特征是它快速地定位到活的牛大動(dòng)脈(BAE)(圖2)和人真皮微脈管(HMEC-1)(數(shù)據(jù)未顯示)內(nèi)皮細(xì)胞的線粒體上。將GSAO接合到熒光素(GSAO-F)，而其亞細(xì)胞定位通過(guò)共焦熒光顯微術(shù)確定。線粒體染色通過(guò)GSAO-F與紅熒光素Mitotracker探針的共存而確認(rèn)，并聚集在活性呼吸細(xì)胞線粒體上(圖2ii、iv和vi)。GSAO-F線粒體的聚集對(duì)于GSAO的二硫酚反應(yīng)性是特效的，它在五倍摩爾過(guò)量的小分子合成二硫酚，二巰基丙醇的存在下消除(圖2iii)，而且相應(yīng)的五價(jià)砷GSAA-F不對(duì)細(xì)胞染色(圖2v)。線粒體定位同樣在與GSAO-B一起培養(yǎng)然后用鏈霉親和素-Alexa Fluor 488染色的BAE細(xì)胞中可見(jiàn)(數(shù)據(jù)未顯示)。
在線粒體內(nèi)膜中富有ANT。GSAO在ANT基質(zhì)面上的多價(jià)螯合作用，使其熵有利于推動(dòng)GSAO進(jìn)入基質(zhì)。與GSAO實(shí)際上具有相同電荷和大小的GSAA，不與ANT反應(yīng)或在線粒體上聚集，這一發(fā)現(xiàn)使這個(gè)機(jī)理得到了支持。
實(shí)施例4GSAO抑制ATP產(chǎn)生，增加過(guò)氧化物含量，并在增殖細(xì)胞中而不在非生長(zhǎng)休眠、內(nèi)皮細(xì)胞中引發(fā)線粒體去極和凋亡方法ATP分析將6孔培養(yǎng)板中的BAE細(xì)胞在0.5％血清或在10％血清中保留24小時(shí)，然后用0、60或150μM GSAO處理24小時(shí)。將該細(xì)胞洗滌一次，然后重懸浮于含有0.3％牛血清白蛋白的0.4mL PBS中。將50μL的細(xì)胞樣品與50μL水和100μL ATP釋放劑(Sigma)混合，并且ATP的濃度用熒光素/熒光素酶ATP分析混合物(Sigma)測(cè)量。通過(guò)使用ATP標(biāo)準(zhǔn)液代替50μL水，將光亮度單位轉(zhuǎn)化成ATP濃度。細(xì)胞數(shù)量使用Beckman粒子計(jì)數(shù)器計(jì)量，ATP的摩爾數(shù)表達(dá)為每百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞。
細(xì)胞增殖分析BAE或HMEC-1細(xì)胞以每孔104細(xì)胞的密度植入96孔板中，并帖壁過(guò)夜，然后如指示的處理。關(guān)于涉及在0.25％血清中抑制細(xì)胞增殖的試驗(yàn)，將該細(xì)胞植入含有10％血清的培養(yǎng)基中，使其帖壁過(guò)夜，然后用PBS洗滌，再于含有0.25％血清的培養(yǎng)基中保留24小時(shí)。處理后剩余的附著細(xì)胞用亞甲藍(lán)測(cè)量(Oliver等人，1989)。過(guò)氧化物、線粒體膜電位、線粒體質(zhì)量和凋亡分析為了用二氫乙叉基測(cè)量過(guò)氧化物含量、用JC-1測(cè)量線粒體膜電位、用壬基吖啶橙測(cè)量線粒體質(zhì)量、用膜聯(lián)蛋白V測(cè)量凋亡，增殖或生長(zhǎng)休眠BAE細(xì)胞用GSAO在6孔培養(yǎng)板中處理24小時(shí)或48小時(shí)，然后用胰蛋白酶/EDTA分離，洗滌一次，并以每毫升2×106細(xì)胞重懸浮于無(wú)血清的培養(yǎng)基中。然后將細(xì)胞與二氫乙叉基(5μM，Molecular Probes)一起在室溫培養(yǎng)15分鐘，或與JC-1(0.5μg.mL-1，MolecularProbes)、膜聯(lián)蛋白V-FITC(50μl.mL-1)(Pharmingen，La Jolla，CA，USA)、或吖啶橙10-壬基溴(5μM，Molecular Probes)一起在室溫培養(yǎng)30分鐘。然后將細(xì)胞洗滌一次，重懸浮于0.5mL無(wú)血清的培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)移到冰中，熒光直接通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)定量。
結(jié)果GSAO在活細(xì)胞的線粒體中聚集，并干擾線粒體功能和細(xì)胞成活力。增殖細(xì)胞比生長(zhǎng)休眠細(xì)胞具有更大的線粒體質(zhì)量和呼吸作用。為了檢測(cè)GSAO是否對(duì)增殖細(xì)胞具有選擇性的影響，將增殖或生長(zhǎng)休眠BAE細(xì)胞與濃度增加的GSAO一起培養(yǎng)48小時(shí)。
降低增殖BAE細(xì)胞成活力的GSAO IC50是～75μM(圖3Ai)，而該化合物對(duì)生長(zhǎng)休眠細(xì)胞幾乎無(wú)影響。對(duì)照化合物GSAA和GSCA，在濃度高達(dá)1.0mM時(shí)，對(duì)于增殖BAE細(xì)胞沒(méi)有明顯的影響(數(shù)據(jù)未顯示)。GSAO對(duì)于增殖細(xì)胞成活力的影響是隨時(shí)間變化的。當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間從48小時(shí)增長(zhǎng)到72小時(shí)，GSAO IC50從～75μM降低到～25μM(數(shù)據(jù)未顯示)。相反，PAO對(duì)于增殖和生長(zhǎng)休眠BAE細(xì)胞具有同等毒性，其IC50是～200nM(圖3A(ii))。用HMEC-1細(xì)胞也觀察到相同的結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。GSAO對(duì)增殖內(nèi)皮細(xì)胞成活力的影響，是與線粒體跨膜電位的損失和凋亡緊密相關(guān)的(圖3B)。這些參數(shù)分別用JC-1染料和FITC-接合的膜聯(lián)蛋白V測(cè)量。JC-1在細(xì)胞溶質(zhì)(綠熒光)和線粒體(紅熒光)的分布比例，反映了線粒體跨膜電位(Smiley等人，1991)，而結(jié)合到磷脂酰絲氨酸的膜聯(lián)蛋白V暴露在凋亡細(xì)胞的表面。
在增殖內(nèi)皮細(xì)胞中GSAO與ANT的結(jié)合影響ATP的產(chǎn)生。增殖BAE細(xì)胞的ATP含量大約是生長(zhǎng)休眠細(xì)胞的兩倍，而與GSAO一起培養(yǎng)24小時(shí)使增殖細(xì)胞中ATP的含量降低到生長(zhǎng)休眠細(xì)胞的水平(圖4ai)。這個(gè)結(jié)果反映了GSAO對(duì)增殖細(xì)胞成活力的選擇性影響(圖4ai)。為了證實(shí)細(xì)胞ATP的降低是由于GSAO對(duì)線粒體ATP合成的影響而不是因?yàn)榫€粒體生物起因，用壬基吖啶橙測(cè)量線粒體質(zhì)量。該染料在線粒體膜中結(jié)合到心磷脂(Petit等人，1992)。增殖細(xì)胞的線粒體質(zhì)量大約是生長(zhǎng)休眠細(xì)胞的兩倍，該質(zhì)量經(jīng)過(guò)GSAO處理是不變的(圖4aii)。
在高濃度時(shí)，例如過(guò)氧化陰離子(O2-)的反應(yīng)性氧物種能夠抑制細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)凋亡。為了測(cè)試GSAO對(duì)O2-細(xì)胞水平的影響，將BAE細(xì)胞用GSAO處理24小時(shí)，而O2-和H2O2的細(xì)胞水平分別用二氫溴乙非啶和CM-H2-DCFDA染料測(cè)量。在增殖的，但非生長(zhǎng)休眠的BAE細(xì)胞中，O2-細(xì)胞水平隨著GSAO濃度線性地增加(圖4b)。GSAO的這一影響不是由于抑制SOD活性，因?yàn)镠2O2水平僅有很小的降低(圖4c)。例如，用120μM GSAO處理24小時(shí)導(dǎo)致H2O2降低30％，但是O2-水平增加100％。這一發(fā)現(xiàn)通過(guò)使用雙通道流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞O2-和H2O2水平而證實(shí)。O2-水平在大多數(shù)細(xì)胞中增加，而H2O2沒(méi)有相應(yīng)的降低(數(shù)據(jù)未顯示)。相反，GSAA對(duì)O2-或H2O2水平?jīng)]有影響。O2-水平隨著GSAO處理而線性地增加，與線粒體完整性的破壞相一致。
實(shí)施例5
GSAO引發(fā)細(xì)胞色素C從線粒體中釋放為了辨別GSAO的抗增殖與促凋亡效果，處理細(xì)胞用碘化丙錠(PI)染色以檢測(cè)凋亡晚期或死細(xì)胞。用GSAO處理48小時(shí)后，細(xì)胞的總數(shù)量和PI-陽(yáng)性的細(xì)胞比例通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量。
BAE(圖5a)或者原代人真皮微脈管內(nèi)皮(圖5b)細(xì)胞的增殖抑制的IC50分別是～10μM和～15μM。成活性的損失的IC50分別是～75μM和～35μM，這意味著相比于誘導(dǎo)調(diào)亡所需濃度，GSAO在較低的濃度下抑制增殖。牛血管平滑肌細(xì)胞的增殖抑制的IC50是～30μM。相反，所有測(cè)試的腫瘤細(xì)胞更耐GSAO(圖5c-g)。腫瘤細(xì)胞中導(dǎo)致增長(zhǎng)抑制的GSAO濃度，是內(nèi)皮細(xì)胞中的3至＞32倍，腫瘤細(xì)胞中導(dǎo)致成活力損失的GSAO濃度，是內(nèi)皮細(xì)胞中的2至9倍(表1)。GSAO處理引起Lewis肺癌細(xì)胞解聚，這是此腫瘤系細(xì)胞數(shù)量明顯增加的原因(圖5e)。
表1.GSAO對(duì)于內(nèi)皮和腫瘤細(xì)胞增殖和成活力的影響。
細(xì)胞類型 增殖抑制IC50，μM 成活力損失IC50，μMBAE(牛大動(dòng)脈內(nèi)皮)10 75HDMVE(人真皮內(nèi)皮)15 35BxPC-3(人胰腺癌) ＞320 ＞320HT1080(人纖維肉瘤) 95 130LLC(鼠肺癌) 未確定1140A549(人肺癌) 80 150HL60(人紅細(xì)胞白血病) 50 1401未確定。LLC細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)聚集，GSAO處理引起細(xì)胞解聚，這令總細(xì)胞數(shù)量的估算折中。
實(shí)施例6GSAO引發(fā)細(xì)胞色素C從線粒體中釋放方法將大鼠肝臟線粒體于25℃以每毫升1mg蛋白質(zhì)的濃度，懸浮在含有75mM甘露醇、250mM蔗糖、10mM琥珀酸鈉、和2μM魚藤酮的3mM HEPES，pH7.0緩沖液中，并用ANT結(jié)合化合物處理0至60分鐘。試劑濃度在圖注中表示。0.25mL反應(yīng)中的線粒體，通過(guò)以8000g離心5分鐘壓成球，上層清液通過(guò)MicroconYM-3膜(Millipore，Bedford，MA)超濾而濃縮10倍。濃縮的上層清液在非還原條件下由Gradipore公司(Sydney，Australia)的8-16％梯度iGels分解，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜。蛋白質(zhì)通過(guò)使用抗人細(xì)胞色素c多克隆抗體(Product 556433，BD Pharmingen)和抗兔過(guò)氧化物酶接合的抗體(Dako，Carpinteria，California)進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡而檢測(cè)?；瘜W(xué)發(fā)光膜使用GS-700 Imaging Densitometer和Multi-Analyst軟件(Bio-Rad，Hercules，California)分析。
結(jié)果將分離的線粒體與GSAO一起培養(yǎng)，引發(fā)細(xì)胞色素C釋放進(jìn)入培養(yǎng)基，該釋放是隨時(shí)間變化的(圖6A)。ANT配體、環(huán)孢菌素A部分地抑制這種釋放(圖6B)。
實(shí)施例7GSAO在雞胚胎尿絨毛膜(CAM)中抑制血管生成方法將受精的3日齡白色Leghorn雞蛋(Spafas，Norwich，CT)打裂，將含有完整蛋黃的晶胚放置在20×100mm培養(yǎng)盤中，并在37℃和3％ CO2條件下培養(yǎng)3天(Folkman，1985)。隨后將含有5、10或50μg GSAA或GSAO的甲基纖維素(FisherScientific，F(xiàn)air Lawn，NJ)盤應(yīng)用于個(gè)體晶胚的CAM，并在37℃和3％ CO2條件下培養(yǎng)48小時(shí)。該盤通過(guò)使10μl 0.45％甲基纖維素中的GSAA或GSAO在聚四氟乙烯棒上干燥制得。用立體顯微鏡觀測(cè)CAMs，并劃分為無(wú)明顯影響的或者定義為無(wú)血管區(qū)的對(duì)CAM血管生成抑制的區(qū)域。在一些情況下，將墨汁注入CAM血管并照相。
結(jié)果由于GSAO在體外能夠選擇性地殺死增殖細(xì)胞，而非生長(zhǎng)休眠、內(nèi)皮細(xì)胞，測(cè)試GSAO以確定它是否是體內(nèi)血管生成的有效抑制劑。
雞胚胎尿絨毛膜(CAM)分析已經(jīng)被用于抑制血管生成的檢測(cè)和分析(Nguyen等人，1994)。GSAO以一種依賴濃度的方式抑制CAM血管生成(圖7A)。對(duì)血管生成抑制的定義是，在6日齡的CAM上植入含有GSAO的甲基纖維素球48小時(shí)后的無(wú)血管區(qū)(圖7Ai)。高達(dá)每個(gè)球50μg的GSAA對(duì)CAM血管生成沒(méi)有影響。
實(shí)施例8GSAO抑制小鼠腫瘤血管生成和腫瘤生長(zhǎng)方法原發(fā)腫瘤生長(zhǎng)分析使用7至9周齡的雌性SCID或C57BI6/J小鼠(Massachusetts General Hosptial，Boston，MA)。小鼠在12小時(shí)日夜周期分成3至5組，并隨意給予動(dòng)物食物和水。通過(guò)吸入異氟烷使SCID或C57BI6/J小鼠麻醉，刮掉背部皮并用乙醇清洗，將2.5×106BxPC-3、HT1080或LLC細(xì)胞的0.2mL PBS懸浮液，或LLC細(xì)胞的鹽水在中心線附近注入。LLC細(xì)胞根據(jù)O’Reilly等人的方法(1997)制備。腫瘤體積用關(guān)系式a.b2.0.52計(jì)算，其中a是最長(zhǎng)直徑，b是最短直徑。
免疫組織化學(xué)將腫瘤固定于Buffered Formalde-Fresh(Fisher Scientific，F(xiàn)air Lawn，NJ)中，插入石蠟，并切下5μm厚的切片放置在載玻片上。切片用蘇木精和曙紅對(duì)CD31、PCNA(Holmgren等人，1995)或片斷DNA(Gavrielli等人，1992)染色。微脈管從對(duì)照和治療組的3個(gè)腫瘤中計(jì)算，包括最小的和最大的，并且根據(jù)Weidner等人(1991)在新血管生成最活性的區(qū)域?qū)⒚芏确旨?jí)。增殖指數(shù)通過(guò)在400倍放大下，計(jì)算細(xì)胞百分?jǐn)?shù)來(lái)估計(jì)。在兩個(gè)獨(dú)立的切片中計(jì)算最少1000個(gè)細(xì)胞。凋亡指數(shù)通過(guò)在400倍放大下，計(jì)算細(xì)胞百分?jǐn)?shù)來(lái)估計(jì)。在兩個(gè)獨(dú)立的切片中計(jì)算最少1500個(gè)細(xì)胞。
結(jié)果人和鼠原發(fā)腫瘤在免疫損害和免疫活性的小鼠中的生長(zhǎng)，通過(guò)GSAO的系統(tǒng)給藥，都分別顯著地受到抑制。對(duì)承受BxPC-3(圖7C)或HT1080(圖7D)腫瘤的SCID小鼠，或者承受LLC腫瘤(圖7E)的C57BI6/J小鼠的治療，通過(guò)在遠(yuǎn)離腫瘤點(diǎn)的皮下施用10mg/kg/day GSAO，導(dǎo)致腫瘤生長(zhǎng)速度分別被抑制＞90％、～70％和～50％。與僅施用賦形劑相比(數(shù)據(jù)未顯示)，對(duì)照的GSAA給藥在所有試驗(yàn)中引起腫瘤增長(zhǎng)速度被抑制＜20％。對(duì)SCID或C57BI6/J小鼠施用GSAO或GSAA沒(méi)有明顯的不利的影響。試驗(yàn)過(guò)程中GSAO與GSAA治療組的平均小鼠重量是相同的，而且GSAO或GSAA處理的小鼠的心臟、肺、肝臟、腎和脾沒(méi)有明顯肉眼可見(jiàn)的不同且沒(méi)有形態(tài)上的變化(數(shù)據(jù)未顯示)。
圖7C說(shuō)明的試驗(yàn)中對(duì)腫瘤的免疫組織化學(xué)分析顯示，在GSAO處理的腫瘤中血管密度的明顯降低(p＜0.001)(圖7F)。GSAA和GSAO處理的腫瘤的增殖指數(shù)是相同的，而相對(duì)于GSAA處理的腫瘤，GSAO處理的腫瘤的凋亡指數(shù)明顯增加(p＝0.05)(圖6F)。對(duì)腫瘤血管生成的抑制一直與腫瘤細(xì)胞凋亡的增加相關(guān)(O’Reilly等人，1997)。我們認(rèn)為高速凋亡平衡了腫瘤細(xì)胞的高增殖速度，并導(dǎo)致腫瘤尺寸無(wú)凈增加(Holmgren等人，1995)。
GSAO對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響，與對(duì)腫瘤血管生成的抑制相一致。GSAO在體內(nèi)抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，但是在高于30倍的濃度下對(duì)BxPC-3增殖沒(méi)有影響(表1)，GSAO的系統(tǒng)給藥顯著地降低體內(nèi)腫瘤血管分布，但是對(duì)BxPC-3腫瘤細(xì)胞的增殖指數(shù)沒(méi)有影響(圖7F)。
實(shí)施例9GSAO和相關(guān)類似物對(duì)BAE細(xì)胞的抗增殖活性的比較方法化合物1-11、12-15和20-23在96孔板中經(jīng)過(guò)72小時(shí)，并在第1天以1000細(xì)胞/孔在DMEM 10％ FBS中篩選。在第2天細(xì)胞用不同濃度的化合物處理。細(xì)胞生長(zhǎng)在第4天用MTT顯示(MTT revelation)(于550nm讀數(shù))測(cè)定，并與未處理的細(xì)胞比較。測(cè)定IC50值，并且相比于GSAO活性的增加計(jì)算如下增加的活性因子＝IC50(GSAO)/IC50(GSAO類似物)結(jié)果列于表2和圖8中。
表2GSAO和相關(guān)類似物對(duì)BAE細(xì)胞增殖的活性

所有IC50值是從至少2個(gè)不同的試驗(yàn)中得到的，除了化合物9是一次測(cè)定的。
結(jié)果表2所示結(jié)果說(shuō)明氧化砷基團(tuán)在鄰位(相對(duì)于亞苯基環(huán)上連接基團(tuán)的位置)的化合物，比氧化砷基團(tuán)在對(duì)位的類似化合物更具活性。例如，化合物1(“o-GSAO”)比GSAO的活性高53.2倍。相似地，“鄰位氧化砷”化合物4比相應(yīng)的對(duì)位氧化砷類似物(化合物3)活性大約高140倍；化合物22比相應(yīng)的對(duì)位氧化砷化合物7的活性高大約106倍；而化合物23比相應(yīng)的對(duì)位氧化砷化合物8的活性高大約20倍。這些結(jié)果是完全沒(méi)有預(yù)料到的，因?yàn)橄嘈艑⑸椴糠种糜卩徫粫?huì)在空間上阻礙砷殘基與二硫酚的相互作用。
鄰氧化砷和對(duì)氧化砷化合物對(duì)BAE細(xì)胞抗增殖活性影響的比較見(jiàn)圖9。
不同分子量的化合物對(duì)BAE細(xì)胞抗增殖活性影響的比較見(jiàn)圖10。
不同化合物L(fēng)og P值對(duì)BAE細(xì)胞坑增殖活性影響的比較見(jiàn)圖11。
實(shí)施例10GSAO和相關(guān)類似物誘導(dǎo)線粒體孔轉(zhuǎn)換的效果方法使用大鼠肝臟線粒體，在分離后于-80℃冷凍1或2天進(jìn)行篩選。線粒體腫脹通過(guò)使用酶標(biāo)儀監(jiān)測(cè)520nm處光散射的降低來(lái)測(cè)量。
在所有的試驗(yàn)中，測(cè)定每個(gè)化合物半最大腫脹所需的時(shí)間。然后，計(jì)算腫脹速度，并與GSAO比較。相比于GSAO的腫脹速度的增加計(jì)算如下
增加的腫脹因子＝腫脹速度(GSAO類似物)/腫脹速度(GSAO)其結(jié)果見(jiàn)表3和圖12。
表3GSAO和相關(guān)類似物對(duì)MPTP誘導(dǎo)的效果

所有化合物的MPTP誘導(dǎo)性能都在不同的線粒體制劑中至少測(cè)試2次，除了化合物15僅測(cè)試一次。
結(jié)果所有被測(cè)試的化合物顯示出與GSAO相似的或更好的誘導(dǎo)活性。最具活性的化合物是1、4、22和23，它們的活性相對(duì)于GSAO增加了5.4至16.3倍(表3；圖12)。對(duì)于MPTP的誘導(dǎo)，關(guān)于對(duì)BAE細(xì)胞的抗增殖活性，鄰氧化砷化合物(1、4、22和23)相對(duì)于相應(yīng)的對(duì)氧化砷化合物(分別是GSAO、3、7和8)具有增加的活性。
不同分子量的化合物對(duì)MPTP誘導(dǎo)的比較見(jiàn)圖13。
不同化合物測(cè)試的Log P值對(duì)MPTP誘導(dǎo)的比較見(jiàn)圖14。
GSAO和相關(guān)類似物的抗增殖活性與這些化合物誘導(dǎo)MPT的能力相比較。這些結(jié)果顯示在圖15。在兩個(gè)試驗(yàn)中顯示出相比于GSAO活性增加的化合物，是鄰氧化砷化合物1、4、22和23。
實(shí)施例10鄰位和對(duì)位取代的氧化砷化合物對(duì)于硫醇親和性的比較為了測(cè)定氧化砷部分在亞苯基環(huán)的鄰位或?qū)ξ皇欠駱O大地影響該化合物結(jié)合二硫酚的能力，將GSAO(對(duì)氧化砷)和化合物1(鄰氧化砷)用DTT滴定。
如圖16所示，GSAO和化合物1的砷反應(yīng)性沒(méi)有明顯的不同。
實(shí)施例11GSAO和o-GSAO的比較—線粒體腫脹分析方法線粒體用前述的差速離心法從～250g雄性Wistar大鼠的肝臟中分離(Don等人，2003)。最終的線粒體球以每毫升30mg蛋白質(zhì)的濃度再懸浮于含有213mM甘露醇、71mM蔗糖和10mM琥珀酸鈉的3mM HEPES-KOH，pH 7.0緩沖液中。對(duì)線粒體通透性轉(zhuǎn)換的誘導(dǎo)，通過(guò)在25℃將該肝臟線粒體以每毫升0.5mg蛋白質(zhì)的濃度懸浮于含有75mM甘露醇、250mM蔗糖、10mM琥珀酸鈉、和2mM魚藤酮的3mM HEPES-KOH，pH 7.0緩沖液中，從而分光光度地確定。腫脹通過(guò)使用酶標(biāo)儀監(jiān)測(cè)伴隨的520nm處光散射的降低來(lái)測(cè)量。
結(jié)果分離線粒體的最大腫脹的半衰期，在使用特定濃度的o-GSAO時(shí)比GSAO要快3-5倍(圖17)。實(shí)際上，o-GSAO在誘導(dǎo)線粒體通透性轉(zhuǎn)換上幾乎與親脂性PAO一樣有效(圖17D)。
ANT孔的形成，受生理?xiàng)l件下的Ca2+、親環(huán)蛋白D和腺嘌呤核苷酸結(jié)合的控制。對(duì)于線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔打開的首要引發(fā)是基質(zhì)Ca2+濃度的提高。Ca2+與EGTA的螯合作用阻礙了孔打開，例如Mg2+的其它二價(jià)金屬離子的過(guò)量同樣阻礙了孔打開。EGTA和Mg2+都阻礙了依賴GSAO的腫脹(圖18)。親環(huán)蛋白D與ANT的結(jié)合，在亞毫摩爾Ca2+濃度時(shí)對(duì)于孔打開是必需的。環(huán)孢菌素A(CsA)通過(guò)與親環(huán)蛋白D結(jié)合并且將其從ANT中替換而阻礙孔的打開。此外，ADP通過(guò)與ANT結(jié)合并降低引發(fā)點(diǎn)對(duì)Ca2+的敏感性而抑制孔的打開。CsA和ADP阻礙了o-GSAO對(duì)孔打開的效果(圖19)。
實(shí)施例12GSAO和o-GSAO的比較—細(xì)胞增殖和成活力分析BAE或人胰腺癌BxPC-3細(xì)胞在含有10％胎牛血清的DMEM中，以每孔103細(xì)胞的密度植入96孔板，并帖壁24小時(shí)。將細(xì)胞洗滌，并與含有10％胎牛血清的DMEM和GSAO或o-GSAO一起進(jìn)一步培養(yǎng)48小時(shí)。一些BAE細(xì)胞在含有0.25％血清的培養(yǎng)基中保持24小時(shí)，并在GSAO或o-GSAO的存在下，在含有0.25％或10％血清的培養(yǎng)基中進(jìn)一步培養(yǎng)48小時(shí)?；畹母街?xì)胞用MTT測(cè)定。
結(jié)果o-GSAO在抑制BAE細(xì)胞增殖方面，比GSAO更有效～50倍。GSAO和o-GSAO對(duì)BAE細(xì)胞增殖抑制的IC50分別是8.3±2.1μM和0.16±0.03μM(圖20A)。與GSAO一樣，相比于對(duì)BxPC-3細(xì)胞增殖的抑制作用，o-GSAO是BAE的選擇性抑制劑。GSAO和GSAO對(duì)BxPC-3細(xì)胞增殖抑制的IC50分別是＞300μM和～2μM(圖20B)。然而，與GSAO相反，o-GSAO對(duì)于增殖的(血管由來(lái)的)內(nèi)皮細(xì)胞沒(méi)有選擇性(圖21)。o-GSAO同等地降低了增殖的和生長(zhǎng)休眠內(nèi)皮細(xì)胞的成活力。在這一試驗(yàn)中，對(duì)o-GSAO的反應(yīng)與PAO非常相似(見(jiàn)Don等人，2003)。
實(shí)施例13aGSAO和o-GSAO的比較-原發(fā)腫瘤生長(zhǎng)分析方法使用雌性7至9周齡的Balb C裸鼠(UNSW Biological Resource Centre)。小鼠在12小時(shí)日夜周期分成3至5組，并隨意給予動(dòng)物食物和水。在中心線附近由皮下注射2.5×106BxPC-3細(xì)胞在0.2mL PBS中的懸浮液。在將腫瘤隨機(jī)地分成4組后，將其安置并生長(zhǎng)到～40mm3的大小。腫瘤體積用關(guān)系式a.b2.0.52計(jì)算，其中a是最長(zhǎng)直徑，而b是最短直徑。動(dòng)物用0.1mL PBS中的GSAO或o-GSAO，以1或10mg/kg/day的劑量處理。化合物在遠(yuǎn)離腫瘤處皮下給藥。腫瘤體積和動(dòng)物重量每2或3天測(cè)量一次。
結(jié)果雖然沒(méi)有觀察到重量損失，但是對(duì)Balb C小鼠施用o-GSAO有短期的行為副作用。結(jié)果列于表3和圖22。
表3.o-GSAO給藥的副作用

a注射后10～25分鐘表現(xiàn)出的行為征候并持續(xù)5-10分鐘。
b注射后10～15分鐘表現(xiàn)出的行為征候并持續(xù)5-10分鐘。
實(shí)施例13b
GSAO和o-GSAO的比較-抗腫瘤功效方法將承受～40mm3BxPC-3腫瘤的Balb-C裸鼠隨機(jī)地分成4組(每組n＝10或11)，并且用在0.1mL PBS中的GSAO(部分A)或者o-GSAO(部分B)以1或10mg/kg/day皮下處理。部分C和部分D是各個(gè)組的小鼠重量，箭頭表示處理開始。數(shù)據(jù)點(diǎn)是腫瘤體積或小鼠重量的平均±SE。由于11只小鼠中的7只在注射點(diǎn)壞死和發(fā)炎(3/11是嚴(yán)重潰瘍，4/11是中度潰瘍)，用10mg/kg o-GSAO(部分B)的處理在第14天停止。在這組中也有一些重量的損失(部分D)。
結(jié)果在對(duì)Blab C小鼠施用o-GSAO后觀察到短期的行為副作用，同時(shí)隨著在相同的地方重復(fù)注射，皮膚變厚并偶爾發(fā)生壞死。在Balb C裸鼠的腫瘤試驗(yàn)中沒(méi)有觀察到行為副作用(實(shí)施例13a)，盡管在這些小鼠中皮膚壞死更嚴(yán)重。實(shí)際上，由于11只動(dòng)物中的7只在注射點(diǎn)嚴(yán)重壞死和發(fā)炎，用10mg/kg o-GSAO的處理在第14天停止。在小鼠系中觀察到的僅有的重量損失是在這組中。這些副作用沒(méi)有在GSAO給藥中觀察到(圖23)。
總之，o-GSAO在體外比GSAO更有效，但是具有副作用，該副作用在GSAO給藥中不明顯。與GSAO不同，相對(duì)于生長(zhǎng)休眠內(nèi)皮細(xì)胞，o-GSAO對(duì)于增殖細(xì)胞沒(méi)有選擇性。
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權(quán)利要求
1.一種識(shí)別在增殖細(xì)胞中誘導(dǎo)線粒體通透性轉(zhuǎn)換(MPT)的化合物的方法，其中所述方法包括將化合物與細(xì)胞或細(xì)胞提取物接觸，測(cè)定該化合物是否與腺嘌呤核苷酸易位體(ANT)結(jié)合，并且測(cè)定該化合物是否選擇性地在增殖細(xì)胞中誘導(dǎo)MPT。
2.一種篩選多個(gè)化合物以識(shí)別在增殖細(xì)胞中誘導(dǎo)MPT的化合物的方法，其中所述方法包括將多個(gè)化合物與細(xì)胞或細(xì)胞提取物接觸，測(cè)定這些化合物中任意一個(gè)是否與ANT結(jié)合，如果是，分開測(cè)定多個(gè)化合物中的每一個(gè)是否選擇性地在增殖細(xì)胞中誘導(dǎo)MPT。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中對(duì)增殖細(xì)胞的選擇性通過(guò)比較被識(shí)別為與ANT結(jié)合的化合物對(duì)增殖細(xì)胞中MPT的影響與其對(duì)非增殖或生長(zhǎng)休眠細(xì)胞中MPT的影響來(lái)測(cè)定。
4.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述對(duì)MPT誘導(dǎo)的測(cè)定涉及測(cè)量細(xì)胞色素C釋放的變化。
5.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述對(duì)MPT誘導(dǎo)的測(cè)定涉及測(cè)量細(xì)胞過(guò)氧化物濃度的變化。
6.一種在脊椎動(dòng)物中誘導(dǎo)MPT的方法，其中所述方法包括對(duì)脊椎動(dòng)物施用有療效量的至少一種根據(jù)權(quán)利要求1至5中任何一種方法識(shí)別的化合物，或者施用有療效量的包括至少一種所述化合物和藥學(xué)可接受的載體、佐藥和/或稀釋劑的藥物組合物。
7.一種在增殖哺乳動(dòng)物細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡的方法，所述方法包括對(duì)哺乳動(dòng)物施用凋亡誘導(dǎo)量的根據(jù)權(quán)利要求1至5中任何一種方法識(shí)別的化合物，或者施用有療效量的包括至少一種所述化合物和藥學(xué)可接受的載體、佐藥和/或稀釋劑的藥物組合物。
8.一種在哺乳動(dòng)物中抑制血管生成的方法，所述方法包括對(duì)哺乳動(dòng)物施用血管生成抑制量的根據(jù)權(quán)利要求1至5中任何一種方法識(shí)別的化合物，或者施用有療效量的包括至少一種所述化合物和藥學(xué)可接受的載體、佐藥和/或稀釋劑的藥物組合物。
9.如權(quán)利要求1至8中所述的任何一種方法，其中所述化合物是二硫酚反應(yīng)性化合物。
10.如權(quán)利要求1至8中所述的任何一種方法，其中所述化合物具有氧化砷(或氧化砷等效物)部分。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述化合物由通式(I)表示A-[(XBX′)nB′-Y]p(I)其中A包括至少一個(gè)側(cè)基；(XBX′)nB′包括一個(gè)合適的連接基團(tuán)，其中X選自-NR、-S(O)-、-S(O)O-、-S(O)2-、-S(O)2O-、-C(O)-、-C(S)-、-C(O)O-、-C(S)O-、-C(S)S-、-P(O)(R1)-、和-P(O)(R1)O-、或者不存在；B選自C1-C10亞烷基、C2-C10亞烯基、C2-C10亞炔基、C3-C10環(huán)亞烷基、C5-C10環(huán)亞烯基、C3-C10雜環(huán)亞烷基、C5-C10雜環(huán)亞烯基、C6-C12亞芳基、雜亞芳基和C2-C10?；籜′選自-NR-、-O-、-S-、-Se-、-S-S-、S(O)-、-OS(O)-、OS(O)O-、-OS(O)2、-OS(O)2O-、-S(O)O-、-S(O)2-、-S(O)2O-、-OP(O)(R1)-、-OP(O)(R1)O-、-OP(O)(R1)OP(O)(R1)O-、-C(O)-、-C(S)-、-C(O)O-、C(S)O-、-C(S)S-、-P(O)(R1)-、-P(O)(R1)O-、和 或者不存在；其中E是O、S、Se、NR或者N(R)2+；B′選自C1-C10亞烷基、C2-C10亞烯基、C2-C10亞炔基、C3-C10環(huán)亞烷基、C5-C10環(huán)亞烯基、C3-C10雜環(huán)亞烷基、C5-C10雜環(huán)亞烯基、C6-C12亞芳基、和雜亞芳基或者不存在；并且其中每個(gè)R獨(dú)立地選自氫、C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基、C3-C10環(huán)烷基、C5-C10環(huán)烯基、C3-C10雜環(huán)烷基、C5-C10雜環(huán)烯基、C6-C12芳基、雜芳基、OR2和C2-C10酰基；R′與R相同或兩個(gè)R′可以與連接其的氮原子一起形成5或6員飽和或不飽和雜環(huán)；每個(gè)R1獨(dú)立地選自氫、C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基、C3-C10環(huán)烷基、C5-C10環(huán)烯基、C3-C10雜環(huán)烷基、C5-C10雜環(huán)烯基、C6-C12芳基、雜芳基、鹵代、OR2和N(R)2；每個(gè)R2獨(dú)立地選自氫、C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基、C3-C10環(huán)烷基、C5-C10環(huán)烯基、C3-C10雜環(huán)烷基、C5-C10雜環(huán)烯基、C6-C12芳基、雜芳基和-C(O)R5；每個(gè)R5獨(dú)立地選自氫、C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基、C3-C10環(huán)烷基、C5-C10環(huán)烯基、C3-C10雜環(huán)烷基、C5-C10雜環(huán)烯基、C6-C12芳基、雜芳基、C1-C10烷氧基、C3-C10烯氧基、C3-C10炔氧基、C3-C10環(huán)烷氧基、C5-C10環(huán)烯氧基、C3-C10雜環(huán)烷氧基、C5-C10雜環(huán)烯氧基、C6-C12芳氧基、雜芳氧基、C1-C10烷基硫代、C3-C10烯基硫代、C3-C10炔基硫代、C3-C10環(huán)烷基硫代、C5-C10環(huán)烯基硫代、C3-C10雜環(huán)烷基硫代、C5-C10雜環(huán)烯基硫代、C6-C12芳基硫代、雜芳基硫代、OH、SH和N(R)2；其中對(duì)于每個(gè)B和/或B′是亞芳基的例子，直接連接在各個(gè)亞芳基環(huán)上的取代基(包括氧化砷或者氧化砷等效物)可以在對(duì)、間或鄰位；并且其中每個(gè)亞烷基、亞烯基、亞炔基、環(huán)亞烷基、環(huán)亞烯基、雜環(huán)亞烷基、雜環(huán)亞烯基、亞芳基、雜亞芳基和?；梢元?dú)立地被氫、C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基、C3-C10環(huán)烷基、C5-C10環(huán)烯基、C3-C10雜環(huán)烷基、C5-C10雜環(huán)烯基、C6-C12芳基、雜芳基、氰基、氰酸酯、異氰酸酯、OR2a、SR6、硝基、氧化砷、-S(O)R3、-OS(O)R3、-S(O)2R3、-OS(O)2R3、-P(O)R4R4、-OP(O)R4R4、-N(R″)2、-NRC(O)(CH2)mQ、-C(O)R5； 或者 取代；其中R、R1和R5如上所定義；并且R2a選自氫、C1-C5烷基、C2-C5烯基、C2-C5炔基、C3-C10環(huán)烷基、C5-C10環(huán)烯基、C6-C12芳基、-S(O)R3、-S(O)2R3、-P(O)(R4)2、N(R)2和-C(O)R5；每個(gè)R3獨(dú)立地選自氫、C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基、C3-C10環(huán)烷基、C5-C10環(huán)烯基、C3-C10雜環(huán)烷基、C5-C10雜環(huán)烯基、C6-C12芳基、雜芳基、C1-C10烷氧基、C3-C10烯氧基、C3-C10炔氧基、C3-C10環(huán)烷氧基、C5-C10環(huán)烯氧基、C3-C10雜環(huán)烷氧基、C5-C10雜環(huán)烯氧基、C6-C12芳氧基、雜芳氧基、C1-C10烷基硫代、C3-C10烯基硫代、C3-C10炔基硫代、C3-C10環(huán)烷基硫代、C5-C10環(huán)烯基硫代、C3-C10雜環(huán)烷基硫代、C5-C10雜環(huán)烯基硫代、C6-C12芳基硫代、雜芳基硫代、和N(R)2；每個(gè)R4獨(dú)立地選自氫、C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基、C3-C10環(huán)烷基、C5-C10環(huán)烯基、C3-C10雜環(huán)烷基、C5-C10雜環(huán)烯基、C6-C12芳基、雜芳基、C1-C10烷氧基、C3-C10烯氧基、C3-C10炔氧基、C3-C10環(huán)烷氧基、C5-C10環(huán)烯氧基、C3-C10雜環(huán)烷氧基、C5-C10雜環(huán)烯氧基、C6-C12芳氧基、雜芳氧基、C1-C10烷基硫代、C3-C10烯基硫代、C3-C10炔基硫代、C3-C10環(huán)烷基硫代、C5-C10環(huán)烯基硫代、C3-C10雜環(huán)烷基硫代、C5-C10雜環(huán)烯基硫代、C6-C12芳基硫代、雜芳基硫代、鹵代和N(R)2；R6選自C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基、C3-C10環(huán)烷基、C5-C10環(huán)烯基、C3-C10雜環(huán)烷基、C5-C10雜環(huán)烯基、C6-C12芳基、雜芳基、C1-C10烷基硫代、C3-C10烯基硫代、C3-C10炔基硫代、C3-C10環(huán)烷基硫代、C5-C10環(huán)烯基硫代、C3-C10雜環(huán)烷基硫代、C5-C10雜環(huán)烯基硫代、C6-C12芳基硫代、雜芳基硫代、-S(O)R3、-S(O)2R3和-C(O)R5，R″與R相同或者兩個(gè)R″與連接其的N原子一起，可以形成飽和的、不飽和的或者芳香的雜環(huán)體系；Q選自鹵素和-OS(O)2Q1；其中Q1選自C1-C4烷基、C1-C4全氟烷基、苯基、對(duì)甲基苯基；并且m是1至5，n是0至20的整數(shù)Y包括至少一個(gè)氧化砷或者氧化砷等效物；P是1至10的整數(shù)，其中通式(I)的化合物具有多于6個(gè)的碳原子。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中A選自天然、非天然和合成的氨基酸、親水胺、肽、多肽、糖殘基、寡糖、和含有硫醇的蛋白質(zhì)、小酸殘基、含有羥基的殘基、或其組合。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述親水胺選自伯烷基胺、伯芳基胺、伯芳烷基胺、仲烷基胺、仲芳基胺、仲芳烷基胺、叔烷基胺、叔芳基胺和叔芳烷基胺、和雜環(huán)胺。
14.如權(quán)利要求12或13所述的方法，其中A選自二肽、三肽、四肽、五肽、谷胱甘肽、葡糖胺、糖類、二糖、寡糖，其中每個(gè)含硫的殘基的硫原子可以任選地氧化而形成亞砜或砜。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其中A選自半胱氨酰甘氨酸、磺基丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸、和精氨酸；葡萄糖、果糖、甘露糖、木糖、來(lái)蘇糖、半乳糖、己糖、蔗糖、山梨糖、半乳糖-蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇。
16.如權(quán)利要求11至15中所述的任何一種方法，其中X選自-C(O)-、-C(S)-、-C(O)O-、C(S)O-、和-C(S)S-、或者不存在；B選自C1-C5亞烷基、C2-C5亞烯基、C2-C5亞炔基、C3-C10環(huán)亞烷基、C5-C10環(huán)亞烯基、C6-C12亞芳基和C2-C5?；籜′選自-O-、-S-、-NR-、-S-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-P(O)(R1)-、-OP(O)(R1)-、-OP(O)(R1)O-、-OP(O)(R1)OP(O)(R1)O-、-C(O)-、-C(S)-、-C(O)O-、C(S)O-、-C(S)S-、-Se-、 或者不存在；其中E是O、S或者N(R)2+；n是0、1或2；并且B′是選自亞烷基的C1-C5、C2-C5亞烯基、C2-C5亞炔烯、C3-C10環(huán)亞烷基、C5-C10環(huán)亞烯基、和C6-C12亞芳基、或者不存在；并且其中每個(gè)R獨(dú)立地選自氫、C1-C5烷基、C2-C5烯基、C2-C5炔基、C3-C10環(huán)烷基、C5-C10環(huán)烯基、C6-C12芳基、OR2和C2-C10?；?；R′與R相同；每個(gè)R1獨(dú)立地選自氫、C1-C5烷基、C2-C5烯基、C2-C5炔基、C3-C10環(huán)烷基、C5-C10環(huán)烯基、C6-C12芳基、鹵代、OR2和N(R)2；每個(gè)R2獨(dú)立地選自氫、C1-C5烷基、C2-C5烯基、C2-C5炔基、C3-C10環(huán)烷基、C5-C10環(huán)烯基、C6-C12芳基、和-C(O)R5；每個(gè)R5獨(dú)立地選自氫、C1-C5烷基、C2-C5烯基、C2-C5炔基、C3-C10環(huán)烷基、C5-C10環(huán)烯基、C6-C12芳基、C1-C5烷氧基、C3-C5烯氧基、C3-C5炔氧基、C3-C10環(huán)烷氧基、C5-C10環(huán)烯氧基、C6-C12芳氧基、C1-C5烷基硫代、C3-C5烯基硫代、C3-C5炔基硫代、C3-C10環(huán)烷基硫代、C5-C10環(huán)烯基硫代、C6-C12芳基硫代、OH、SH和N(R)2；其中對(duì)于每個(gè)B和/或B′是亞芳基的例子，直接連接在各個(gè)亞芳基環(huán)上的取代基(包括氧化砷或者氧化砷等效物)可以在對(duì)、間或鄰位，并且其中每個(gè)亞烷基、亞烯基、亞炔基、環(huán)亞烷基、環(huán)亞烯基、亞芳基、和酰基可以獨(dú)立地被氫、C1-C5烷基、C2-C5烯基、C2-C5炔基、C3-C10環(huán)烷基、C5-C10環(huán)烯基、C6-C12芳基、氰基、鹵代、氰酸酯、異氰酸酯、OR2a、SR6、硝基、氧化砷、-S(O)R3、-OS(O)R3、-S(O)2R3、-OS(O)2R3、-P(O)R4R4、-OP(O)R4R4、-N(R″)2、-NRC(O)(CH2)mQ、-C(O)R5、 或者 取代；其中R、R1和R5如上所定義；并且R2a選自氫、C1-C5烷基、C2-C5烯基、C2-C5炔基、C3-C10環(huán)烷基、C5-C10環(huán)烯基、C6-C12芳基、-S(O)R3、-S(O)2R3、-P(O)(R4)2、N(R)2和-C(O)R5；每個(gè)R3獨(dú)立地選自氫、C1-C5烷基、C2-C5烯基、C2-C5炔基、C3-C10環(huán)烷基、C5-C10環(huán)烯基、C6-C12芳基、C1-C5烷氧基、C3-C5烯氧基、C3-C5炔氧基、C3-C10環(huán)烷氧基、C5-C10環(huán)烯氧基、C6-C12芳氧基、C1-C5烷基硫代、C3-C5烯基硫代、C3-C5炔基硫代、C3-C10環(huán)烷基硫代、C5-C10環(huán)烯基硫代、C6-C12芳基硫代和N(R)2；每個(gè)R4獨(dú)立地選自氫、C1-C5烷基、C2-C5烯基、C2-C5炔基、C3-C10環(huán)烷基、C5-C10環(huán)烯基、C6-C12芳基、C1-C5烷氧基、C3-C5烯氧基、C3-C5炔氧基、C3-C10環(huán)烷氧基、C5-C10環(huán)烯氧基、C6-C12芳氧基、C1-C5烷基硫代、C3-C5烯基硫代、C3-C5炔基硫代、C3-C5環(huán)烷基硫代、C5-C5環(huán)烯基硫代、C6-C12芳基硫代、鹵代和N(R)2；R6獨(dú)立地選自C1-C5烷基、C2-C5烯基、C2-C5炔基、C3-C10環(huán)烷基、C5-C10環(huán)烯基、C6-C12芳基、C1-C5烷基硫代、C3-C5烯基硫代、C3-C5炔基硫代、C3-C10環(huán)烷基硫代、C5-C10環(huán)烯基硫代、C6-C12芳基硫代、-S(O)R3、-S(O)2R3和-C(O)R5，R″與R相同；Q選自鹵素和-OS(O)2Q1；其中Q1選自C1-C4烷基、C1-C4全氟烷基、苯基、對(duì)甲基苯基；m是1至5。
17.如權(quán)利要求11至16中所述的任何一種方法，其中X不存在；B選自C1-C5亞烷基、C6-C12亞芳基和C2-C5?；籜′選自-O-、-S-、-NR-、-S-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-P(O)(R1)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(O)O-、C(S)O-、-Se-、和 或者不存在；其中E是O、S或者N(R)2+；n是0、1或2；并且B′是C1-C5亞烷基、C6-C12亞芳基或者不存在；其中每個(gè)R獨(dú)立地選自氫、C1-C5烷基、C3-C10環(huán)烷基、C6-C12芳基、OR2和C2-C5?；?；R′與R相同；每個(gè)R1獨(dú)立地選自氫、C1-C5烷基、C3-C10環(huán)烷基、C6-C12芳基、鹵代、OR2和N(R)2；每個(gè)R2獨(dú)立地選自氫、C1-C5烷基、C3-C10環(huán)烷基、C6-C12芳基和-C(O)R5；每個(gè)R5獨(dú)立地選自氫、C1-C5烷基、C2-C5烯基、C3-C10環(huán)烷基、C5-C10環(huán)烯基、C6-C12芳基、C1-C5烷氧基、C3-C5烯氧基、C3-C10環(huán)烷氧基、C5-C10環(huán)烯氧基、C6-C12芳氧基、C1-C5烷基硫代、C3-C5烯基硫代、C3-C10環(huán)烷基硫代、C5-C10環(huán)烯基硫代、C6-C12芳基硫代、OH、SH和N(R)2；其中對(duì)于每個(gè)B和/或B′是亞芳基的例子，直接連接在各個(gè)亞芳基環(huán)上的取代基(包括氧化砷或者氧化砷等效物)可以在對(duì)、間或鄰位，并且其中每個(gè)亞烷基、亞烯基、亞炔基、環(huán)亞烷基、環(huán)亞烯基、亞芳基、和?；梢元?dú)立地被氫、C1-C5烷基、C2-C5烯基、C2-C5炔基、C3-C10環(huán)烷基、C5-C10環(huán)烯基、C6-C12芳基、鹵代、氰基、氰酸酯、異氰酸酯、OR2a、SR6、硝基、氧化砷、-S(O)R3、-OS(O)R3、-S(O)2R3、-OS(O)2R3、-P(O)R4R4、-OP(O)R4R4、-N(R″)2、-NRC(O)(CH2)mQ、-C(O)R5、 或者 取代；其中R、R1和R5如上所定義；并且R2a選自氫、C1-C5烷基、C3-C10環(huán)烷基、C6-C12芳基、-S(O)R3、-S(O)2R3、-P(O)(R4)2和-C(O)R5；每個(gè)R3獨(dú)立地選自氫、C1-C5烷基、C3-C10環(huán)烷基、C6-C12芳基、C1-C5烷氧基、C3-C10環(huán)烷氧基、C6-C12芳氧基、C1-C5烷基硫代、C3-C10環(huán)烷基硫代、C6-C12芳基硫代和N(R)2；每個(gè)R4獨(dú)立地選自氫、C1-C5烷基、C3-C10環(huán)烷基、C6-C12芳基、C1-C5烷氧基、C3-C10環(huán)烷氧基、C6-C12芳氧基、鹵代和N(R)2；R6選自C1-C5烷基、C3-C10環(huán)烷基、C6-C12芳基、C1-C5烷基硫代、C3-C10環(huán)烷基硫代、C6-C12芳基硫代、-S(O)R3、-S(O)2R3和-C(O)R5。R″與R相同；Q選自鹵素和-OS(O)2Q1；其中Q1選自C1-C4烷基、C1-C4全氟烷基、苯基、對(duì)甲基苯基；并且m是1至5。
18.如權(quán)利要求11至17中所述的任何一種方法，其中X不存在；B選自C1-C5亞烷基、C6-C12亞芳基和C2-C5?；?；X′選自-O-、-S-、-NR-、-C(O)-、和-C(O)O-、或者不存在；n是1；并且B′是C1-C5亞烷基、C6-C12亞芳基或者不存在；并且R選自氫、C1-C5烷基、C6-C12芳基和C2-C5?；?；其中對(duì)于每個(gè)B和/或B′是亞芳基的例子，直接連接在各個(gè)亞芳基環(huán)上的取代基(包括氧化砷或者氧化砷等效物)可以在對(duì)、間或鄰位，并且其中每個(gè)亞烷基、亞芳基、和?；梢元?dú)立地被氫、C1-C5烷基、C2-C5烯基、C2-C5炔基、C3-C10環(huán)烷基、C5-C10環(huán)烯基、C6-C12芳基、鹵代、氰基、氰酸酯、異氰酸酯、OR2a、SR6、硝基、氧化砷、-S(O)R3、-S(O)2R3、-P(O)R4R4、-N(R″)2、-NRC(O)(CH2)mQ、-C(O)R5、 或者 取代；其中每個(gè)R獨(dú)立地選自氫、C1-C5烷基、C6-C12芳基和C2-C5?；?；R2a選自氫、C1-C5烷基、C6-C12芳基、-S(O)R3、-S(O)2R3、-P(O)(R4)2和-C(O)R5；每個(gè)R3獨(dú)立地選自氫、C1-C5烷基、C6-C12芳基、C1-C5烷氧基、C6-C12芳氧基、C1-C5烷基硫代、和C6-C12芳基硫代；每個(gè)R4獨(dú)立地選自氫、C1-C5烷基、C6-C12芳基、C1-C5烷氧基、C6-C12芳氧基、C1-C5烷基硫代、C6-C12芳基硫代、鹵代和N(R)2；每個(gè)R5獨(dú)立地選自氫、C1-C5烷基、C6-C12芳基、C1-C5烷氧基、C6-C12芳氧基、C1-C5烷基硫代、C6-C12芳基硫代、OH、SH和N(R)2；R6選自C1-C5烷基、C6-C12芳基、C1-C5烷基硫代、C6-C12芳基硫代、-S(O)R3、-S(O)2R3和-C(O)R5，R″與以上R相同；Q選自鹵素和-OS(O)2Q1；其中Q1選自C1-C4烷基、C1-C4全氟烷基、苯基、對(duì)甲基苯基；并且m是1、2、3、4或者5。
19.如權(quán)利要求11至18中所述的任何一種方法，其中X不存在；B是C2-C5?；?；X′是NR；n是1；B′是亞苯基；并且R是H；其中直接連在亞苯基環(huán)上的取代基可以在對(duì)、間或鄰位。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述化合物是 其中R7至R10獨(dú)立地選自氫、C1-C5烷基、C6-C12芳基、鹵素、羥基、氨基、硝基、羧基、C1-C5烷氧基、-OS(O)2R3和-NHC(O)CH2Q，其中Q是鹵素、-OS(O)2CH3、-OS(O)2C6H5和-OS(O)2-對(duì)甲苯基；并且其中當(dāng)R7至R10的任何一個(gè)是C1-C5烷基、C6-C12芳基、C1-C5烷氧基、-OS(O)2R3時(shí)，能夠與亞苯基形成稠環(huán)；而且進(jìn)一步的，其中R7至R10的至少一個(gè)是C1-C5烷基、C6-C12芳基、C1-C5烷氧基、或者-OS(O)2R3，與R7至R10中的其它至少任何一個(gè)結(jié)合，能夠與亞苯基形成稠環(huán)。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其中R7至R10獨(dú)立地選自氫、鹵素、羥基、氨基、硝基、氰基、羧基、C1-C5烷氧基、甲基、乙基、異丙基、叔丁基、苯基和-NHC(O)CH2Q，其中Q是鹵素、-OS(O)2CH3、-OS(O)2C6H5和-OS(O)2-對(duì)甲苯基。
22.如權(quán)利要求19或20所述的方法，其中氧化砷(-As＝O)基團(tuán)在亞苯基環(huán)的4位。
23.如權(quán)利要求1至22中所述的任何一種方法，其中所述化合物選自 和
24.如權(quán)利要求1至19中所述的任何一種方法，其中所述化合物由通式VII表示 其中G選自氫、鹵素、羥基、氨基、硝基、羧基、C1-C5烷氧基、C1-C5烷基和C6-C12芳基和-NHC(O)CH2Q，其中Q是鹵素、-OS(O)2CH3、-OS(O)2C6H5或-OS(O)2-對(duì)甲苯基。
25.如權(quán)利要求24所述的方法，其中G選自氫、鹵素、羥基、氨基、硝基、羧基、C1-C5烷氧基、甲基、乙基、異丙基、叔丁基、苯基、和-NHC(O)CH2Q，其中Q是鹵素、-OS(O)2CH3、-OS(O)2C6H5或-OS(O)2-對(duì)甲苯基。
26.如權(quán)利要求24或25所述的方法，其中G選自羥基、氟、氨基、和硝基。
27.如權(quán)利要求1至26中所述的任何一種方法，其中所述氧化砷基團(tuán)(-As＝O)由本文所定義的氧化砷等效物替代。
28.如權(quán)利要求27所述的方法，其中所述氧化砷等效物是任何顯示出基本與-As＝O相同的對(duì)二硫酚親和性的二硫酚反應(yīng)性物種。
全文摘要
本發(fā)明涉及識(shí)別在增殖細(xì)胞中誘導(dǎo)線粒體通透性轉(zhuǎn)換(MPT)的化合物的方法，其中所述方法包括將化合物與細(xì)胞或細(xì)胞提取物接觸，測(cè)定該化合物是否與腺嘌呤核苷酸易位體(ANT)結(jié)合，并且測(cè)定該化合物是否選擇性地在增殖細(xì)胞中誘導(dǎo)MPT。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1742100SQ200380107322
公開日2006年3月1日 申請(qǐng)日期2003年11月7日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月7日
發(fā)明者P·J·霍格 申請(qǐng)人:單檢索有限公司