專利名稱：通過rt－pcr對核酸的絕對定量的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)。更具體地，本發(fā)明涉及實(shí)時(shí)PCR方法以及基因表達(dá)的絕對定量。
背景技術(shù)：
基本PCR技術(shù)適用于擴(kuò)增目的DNA序列。在反轉(zhuǎn)錄酶PCR(RT-PCR)中，將反轉(zhuǎn)錄步驟加入PCR方案中。這采用了用于檢測并定量具體mRNA轉(zhuǎn)錄物的基本PCR方法。因此，RT-PCR適于測定并比較基因表達(dá)水平。有用比較的實(shí)例包括在單個(gè)生物體的不同組織類型中的表達(dá)，在不同生物體的相同組織類型中的表達(dá)，以及在相同組織類型中應(yīng)答于實(shí)驗(yàn)處理的表達(dá)。定量可以是相對的(即表達(dá)為樣品間的倍數(shù)差異)或絕對的(即表達(dá)為RNA的實(shí)際量)。
歷史上，在反轉(zhuǎn)錄步驟中合成cDNA以后，在擴(kuò)增步驟中使得PCR達(dá)到適宜的終點(diǎn)，隨后在分離的檢測中實(shí)施反應(yīng)產(chǎn)物的定量(即測定步驟)。在已知為“實(shí)時(shí)”PCR(或″動力學(xué)PCR″)的各種RT-PCR中，擴(kuò)增步驟與檢測步驟是結(jié)合的。PCR產(chǎn)物隨循環(huán)的增加(cycle-by-cycle increase)可進(jìn)行實(shí)時(shí)定量。這通過在擴(kuò)增反應(yīng)中包括“探針”以及常規(guī)正向和反向引物來實(shí)現(xiàn)。在擴(kuò)增的序列內(nèi)發(fā)生雜交的所述探針通常為約20-25核苷酸長?？少彽玫腡aqMan探針(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City)CA)包括位于5′末端的熒光報(bào)道物部分(染料)和位于3′末端的猝滅部分(染料)。在完整的探針中，報(bào)道物的熒光通過猝滅部分的內(nèi)部猝滅作用而受到強(qiáng)烈抑制。由于發(fā)展的Taq聚合酶的核酸外切酶作用消化經(jīng)雜交的探針，所述報(bào)道物不被猝滅，產(chǎn)生可檢測并可定量的熒光。
通過實(shí)時(shí)PCR定量mRNA可以是相對或絕對的。在每種情況下，樣品中mRNA的定量通過與適宜標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行參比來進(jìn)行。如果標(biāo)準(zhǔn)曲線用于相對定量，相對于通常稱作“校準(zhǔn)物(calibrator)”的基本樣品(basis sample)表達(dá)所述量。對于試驗(yàn)樣品，從標(biāo)準(zhǔn)曲線確定靶量并除以該校準(zhǔn)物的值。因此，所述校準(zhǔn)物成為lx樣品，且所有其它量表達(dá)為相對與該校準(zhǔn)物的n倍差異(n-fold difference)。例如，在關(guān)于藥物對基因表達(dá)的影響的研究中，未經(jīng)處理的對照可作為適宜的校準(zhǔn)物。由于用實(shí)驗(yàn)量除以校準(zhǔn)量，標(biāo)準(zhǔn)曲線單位例如熒光強(qiáng)度降低(drop out)。這表示對于相對定量而言，制備適宜的稀釋系列(dilution series)以后，任何含有靶序列的RNA或DNA來源可用于產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線。
反之，通過實(shí)時(shí)PCR的mRNA絕對定量需要標(biāo)準(zhǔn)物，其中含靶序列的RNA的絕對定量已知是獨(dú)立的。通常，含有包含靶序列的cDNA的質(zhì)粒必須獲得。含有cDNA(且沒有開放讀框)的該質(zhì)粒的限制酶切片段通過凝膠純化并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。測定產(chǎn)生的cRNA的A260，并利用所述cRNA制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。從A260以及該mRNA的分子量計(jì)算互補(bǔ)RNA拷貝數(shù)。這在一種基因或少數(shù)基因的表達(dá)被重復(fù)測定時(shí)幾乎沒有困難，例如在HIV患者的臨床病毒負(fù)荷測定時(shí)。然而，在大量不同靶必須通過實(shí)時(shí)PCR定量時(shí)，該絕對定量方法非常耗時(shí)費(fèi)力，從而變得不可行。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了獲得用于產(chǎn)生校準(zhǔn)用數(shù)據(jù)例如標(biāo)準(zhǔn)曲線的cRNA的方法，所述校準(zhǔn)用數(shù)據(jù)用于通過RT-PCR對RNA進(jìn)行絕對定量。所述方法包括以下步驟(a)提供包含擴(kuò)增子和位于該擴(kuò)增子3’的啟動子序列的合成的寡核苷酸；(b)通過該合成的寡核苷酸的體外轉(zhuǎn)錄合成互補(bǔ)RNA(cRNA)；(c)通過獨(dú)立方法定量測定所述cRNA；和(d)利用已知量的cRNA產(chǎn)生校準(zhǔn)用數(shù)據(jù)。
優(yōu)選所述啟動子序列是噬菌體啟動子序列。用于本發(fā)明的啟動子序列的實(shí)例是T7啟動子序列，例如5′CCTATAGTGAGTCGTATTA3′(SEQ IDNO1)。合成的寡核苷酸可選包括與所述擴(kuò)增子鄰接的2-20，優(yōu)選8-12個(gè)核苷酸的5’側(cè)翼序列。本發(fā)明一些實(shí)施方案中，所述5’側(cè)翼序列含有5-20個(gè)連續(xù)的胸腺嘧啶殘基，即寡d(T)區(qū)。合成的寡核苷酸可選包含位于所述擴(kuò)增子和啟動子區(qū)之間的2-20，優(yōu)選8-12個(gè)核苷酸的3′側(cè)翼序列。
所述擴(kuò)增子的長度優(yōu)選30-70個(gè)核苷酸，更優(yōu)選40-60個(gè)核苷酸。所述合成的寡核苷酸的長度優(yōu)選60-140個(gè)核苷酸，更優(yōu)選70-130個(gè)核苷酸，80-120個(gè)核苷酸或90-110個(gè)核苷酸。
本發(fā)明還說明了用于測定受試樣品中具體核酸分子例如具體的RNA轉(zhuǎn)錄物的豐度的RT-PCR法。所述方法包括以下步驟(a)提供包含擴(kuò)增子和位于該擴(kuò)增子3’的啟動子序列的合成的寡核苷酸；(b)通過該合成的寡核苷酸的體外轉(zhuǎn)錄合成互補(bǔ)cRNA；(c)利用該cRNA產(chǎn)生稀釋系列；(d)通過對該cRNA的反轉(zhuǎn)錄合成單鏈cDNA；(e)產(chǎn)生RT-PCR校準(zhǔn)用數(shù)據(jù)；(g)從受試樣品獲得RT-PCR受試樣品；以及(h)比較PC受試樣品數(shù)據(jù)與PCR校準(zhǔn)用數(shù)據(jù)。在本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案中，所述cRNA通過獨(dú)立方法例如A260定量測定，并且在合成單鏈cDNA之前與異源RNA例如酵母總RNA混合。
本文術(shù)語“擴(kuò)增子”指在PCR反應(yīng)中擴(kuò)增的具體預(yù)選出的核苷酸序列。
本文術(shù)語“側(cè)翼序列(flanking sequence)”指合成的寡核苷酸中與擴(kuò)增子鄰接的核苷酸序列。5’側(cè)翼序列位于所述擴(kuò)增子5′。3′側(cè)翼序列位于所述擴(kuò)增子的3′。
本文中“PCR校準(zhǔn)用數(shù)據(jù)”指利用已知量的、與靶序列相對應(yīng)的核苷酸序列產(chǎn)生的PCR數(shù)據(jù)，為進(jìn)行定量將比較該P(yáng)CR校準(zhǔn)用數(shù)據(jù)(calibrationdata)與受試數(shù)據(jù)。所述校準(zhǔn)用數(shù)據(jù)可以是相對或絕對的。
本文術(shù)語“標(biāo)準(zhǔn)曲線”指校準(zhǔn)用數(shù)據(jù)的曲線(通常為半-對數(shù)型)。
本文術(shù)語“合成的寡核苷酸”指含有具體核苷酸序列的核酸，其通過合成有機(jī)化學(xué)而不是酶聚合在活細(xì)胞中產(chǎn)生。
本文術(shù)語“靶序列”指待檢測的序列，例如目的基因、cDNA或RNA中的序列。
除非另有限定，本文所用所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。如果有沖突，以本發(fā)明包括定義在內(nèi)為準(zhǔn)。本文涉及的所有公開出版物，專利和其它對比文件都包含在內(nèi)作為參考。
以下所述材料，方法和實(shí)例僅為示例性的，并且不是限制性的。本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)從詳細(xì)描述和權(quán)利要求中也顯而易見。


圖1是本發(fā)明所用的合成的寡核苷酸的總體結(jié)構(gòu)示意圖。圖1所示結(jié)果包括可選的5′和3′側(cè)翼序列。
圖2用于通過RT-PCR對mRNA進(jìn)行絕對定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。純化的cRNA經(jīng)過六次連續(xù)1∶10逐級稀釋，并隨后置于(“加入到(spike)”)酵母總RNA背景中。cRNA的每個(gè)稀釋度都用于合成cDNA，其可用作RT-PCR的起始模板。以一式四份進(jìn)行RT-PCR(R2＝.9980)。Ct值(循環(huán)閾值(cyclethreshold))是RT-PCR實(shí)驗(yàn)的輸出(output)。Ct是當(dāng)反應(yīng)變?yōu)橹笖?shù)型(exponential)時(shí)的循環(huán)數(shù)。當(dāng)出現(xiàn)這種情況時(shí)，該等式為真正的(true)Ct＝2初始量。產(chǎn)生未知樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的Ct。未知樣品的Ct值隨后與Ct標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較。
圖3是柱圖，顯示本發(fā)明mRNA絕對定量的結(jié)果?；趫D2所示的標(biāo)準(zhǔn)曲線，在來自大鼠肺、肝、腎、心、脾、胸腺、胚胎和腦的組織中確定信使RNA的拷貝數(shù)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明中，已知元件或步驟的新組合已經(jīng)被集合成簡化的方法用于獲得cRNA，所述cRNA用于產(chǎn)生通過RT-PCR對RNA進(jìn)行絕對定量所用的PCR校準(zhǔn)用數(shù)據(jù)。該方法的提高的效率使得其適于在涉及多種不同靶序列的高處理量(high throughput)情況下通過實(shí)時(shí)RT-PCR對mRNA進(jìn)行絕對定量。因此，該方法可用于諸如基本生物研究和藥物發(fā)現(xiàn)程序的情況。
本發(fā)明優(yōu)選避免了任何獲得含有包含所述靶序列的cDNA的質(zhì)粒的需要。此外，本發(fā)明避免了產(chǎn)生并純化含有所述cDNA(并且沒有其它可讀框)的質(zhì)粒的限制酶切片段的需要。該擴(kuò)增是聯(lián)合利用合成的寡核苷酸與體外轉(zhuǎn)錄步驟的結(jié)果。體外轉(zhuǎn)錄步驟以后，可在修飾后或不加修飾地使用傳統(tǒng)的實(shí)時(shí)PCR法。對于體外轉(zhuǎn)錄步驟以后的各個(gè)步驟的各個(gè)方面的詳述，通常見PCR Protocols in Molecular Toxicology，1997，CRC Press.See also，Sambrook等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，1989，Cold SpringHarbor Press。
如果通過體外轉(zhuǎn)錄獲得的RNA將用于產(chǎn)生用于RNA的絕對定量的PCR校準(zhǔn)用數(shù)據(jù)，對在體外轉(zhuǎn)錄步驟中獲得的樣品RNA進(jìn)行定量測定。這可例如通過測定RNA溶液在260nm的吸收(A260)來進(jìn)行。A260值可轉(zhuǎn)化成RNA濃度值，所述濃度值可基于計(jì)算的所涉及RNA分子的分子量轉(zhuǎn)化成拷貝數(shù)。
合成的寡核苷酸的設(shè)計(jì)是本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。通常，所述合成的寡核苷酸含有擴(kuò)增子，啟動子序列以及可選的擴(kuò)增子-側(cè)翼序列(圖1)。合成的寡核苷酸的核苷酸序列有賴于這樣的考慮，包括擴(kuò)增子序列、靶序列中該擴(kuò)增子的側(cè)翼序列以及啟動子序列選擇。
所述擴(kuò)增子的長度不重要。優(yōu)選所述擴(kuò)增子的長度為30-70個(gè)核苷酸。更優(yōu)選，所述長度為40-60個(gè)核苷酸。具體擴(kuò)增子在PCR系統(tǒng)中的擴(kuò)增通過設(shè)計(jì)并合成適宜的正向引物和適宜的反向引物來實(shí)現(xiàn)。PCR引物的設(shè)計(jì)和合成是本領(lǐng)域已知的，引物設(shè)計(jì)軟件，試劑和工具都是可購得的。這種商業(yè)化軟件的實(shí)例是PrimerExpress(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)。
5′側(cè)翼序列和/或3′側(cè)翼序列可以以與所述擴(kuò)增子相鄰的方式被包括。優(yōu)選，所述側(cè)翼序列都被包括。所述側(cè)翼序列如果存在，其序列和長度不同?？蛇x側(cè)翼序列的長度不重要。優(yōu)選每種側(cè)翼序列為2-20個(gè)核苷酸，更優(yōu)選8-12個(gè)核苷酸。側(cè)翼序列的核苷酸序列不重要。例如，其可設(shè)計(jì)為與靶基因雜交，但這種互補(bǔ)性不是必要的。在本發(fā)明一些實(shí)施方案中，所述合成的寡核苷酸中的5’側(cè)翼序列包括聚T尾(poly T tail)或由聚T尾組成。這導(dǎo)致隨后產(chǎn)生的cRNA中的相應(yīng)聚A尾，其可用于引發(fā)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。適宜聚T(聚A)尾的長度為5-20個(gè)核苷酸，優(yōu)選約16個(gè)核苷酸。
啟動子序列被摻入合成的寡核苷酸。任何在體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中所用反應(yīng)條件下有效起作用的啟動子序列可使用。噬菌體啟動子序列通常用于體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。用于本發(fā)明的啟動子的具體實(shí)例是T7，SP6和T3啟動子。優(yōu)選的T7啟動子序列是T7啟動子序列，例如5′CCTATAGTGAGTCGTATTA3′(SEQ ID NO1)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到啟動子末端不總是清楚地限定，且天然存在的啟動子序列中可出現(xiàn)較小改變并同時(shí)通?？杀Ａ?或甚至改進(jìn))啟動子功能。適宜的啟動子序列的選擇和摻入可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員在適當(dāng)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行。適合用于本發(fā)明的啟動子序列通?？少彽谩?br> 合成的寡核苷酸的總長度(即包含擴(kuò)增子，啟動子，以及可選擴(kuò)增子側(cè)翼序列)必須足夠短以允許化學(xué)合成并足夠長以允許體外轉(zhuǎn)錄。在大多數(shù)情況下，所述長度為60-140個(gè)核苷酸。優(yōu)選所述長度為70-130個(gè)，80-120個(gè)或90-110個(gè)核苷酸。
合成的寡核苷酸的確切序列根據(jù)在上述亞序列組分方面進(jìn)行的具體選擇來設(shè)計(jì)。一旦設(shè)計(jì)出，合成的寡核苷酸可通過本領(lǐng)于技術(shù)人員利用已知方法，材料和儀器來合成。適用于本發(fā)明的合成寡核苷可購得，例如購自Biosearch Technologies，Inc.(Novato，CA和Invitrogen，Inc.(Carlsbad，CA)。
應(yīng)理解本發(fā)明涉及通?？捎玫姆治龇?。因此，本發(fā)明并非對任何具體靶序列，擴(kuò)增子或合成的寡核苷酸特異。
用于本發(fā)明的合成的寡核苷酸可通過任何適宜合成法獲得。用于合成具有超過100個(gè)核苷酸的預(yù)定序列的寡核苷酸的方法、材料和儀器是本領(lǐng)域已知的。見例如Cheng等，2002，Nucleic Acids Research 30(18)e93。用于本發(fā)明的常規(guī)合成的(custom-synthesized)寡核苷酸可購得，例如購自Biosearch Technologies Inc.(Novato，CA)；Invitrogen(Carlsbad，CA)。所述合成的寡核苷酸的純化可利用常規(guī)技術(shù)獲得，例如反相HPLC。合成的寡核苷酸的序列可通過標(biāo)準(zhǔn)測序技術(shù)確定。
本發(fā)明的體外轉(zhuǎn)錄步驟可利用已知方法和材料進(jìn)行。所需產(chǎn)量的獲得可包括優(yōu)化的反應(yīng)條件，所述條件用于在存在高核苷以及聚合酶濃度時(shí)的RNA合成。用于實(shí)施體外轉(zhuǎn)錄步驟的試劑以及試劑盒時(shí)可購得的。適宜的商業(yè)化試劑盒為MEGAshortscript T7試劑盒(Ambion，Inc.，Austin，TX；cat.#1354)。部分單鏈模板可用于體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。例如，與T7啟動子互補(bǔ)的引物可用于產(chǎn)生短的雙鏈區(qū)，T7聚合酶可與該區(qū)結(jié)合并啟動轉(zhuǎn)錄?？蛇x，雙鏈模板可使用。例如，可使得引物與合成的寡核苷酸的啟動子區(qū)退火并用DNA聚合酶例如Klenow片段延長它。隨后純化產(chǎn)生的雙鏈模板并用于體外轉(zhuǎn)錄。在不同的雙鏈模板法中，與合成的寡核苷酸互補(bǔ)的完整的第二條鏈可被合成并發(fā)生退火。cRNA產(chǎn)物可作為單個(gè)種類獲得。這可通過例如凝膠電泳證實(shí)。
cRNA的正確連續(xù)稀釋是產(chǎn)生可信的標(biāo)準(zhǔn)曲線所需的。制備和定性RNA標(biāo)準(zhǔn)品通常參見Collins等，1995，Analytical Biochemistry 226120-129。優(yōu)選的載體RNA是濃度約25ng/ml的酵母總RNA(Ambion，Inc.，Austin，TX；cat.#7118)。
在根據(jù)本發(fā)明的方法中，cDNA的合成可在傳統(tǒng)的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中實(shí)現(xiàn)。用于反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的方法和材料是本領(lǐng)域已知的。見Sambrook等(上述)。用于反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的試劑盒可得自各商業(yè)渠道，例如High Capacity cDNAArchive Kit(Applied Biosystems，Inc.，F(xiàn)oster City，CA)。
本發(fā)明還通過以下實(shí)施例說明。所述實(shí)施例完全為舉例目的。它們不限制本發(fā)明的范圍和內(nèi)容。
實(shí)施例引物，探針設(shè)計(jì)和寡核苷酸模板Taqman正向和反向引物以及5′FAM標(biāo)記的MGB探針利用PrimerExpress(Applied Biosystems)從Affymetrix共有序列設(shè)計(jì)。用于體外轉(zhuǎn)錄的寡核苷酸模板可如下構(gòu)建向所述擴(kuò)增子的5′和3′末端添加基因特異性序列的10個(gè)堿基對，然后將T7啟動子區(qū)加入3’10堿基對的外部，所述T7啟動子由5′CCTATAGTGAGTCGTATTA 3′(SEQ ID NO1)組成。
利用合成的寡核苷酸的體外轉(zhuǎn)錄利用部分單鏈寡核苷酸模板的體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)是利用可購得的試劑盒(T7-MEGAshortscript Kit，Ambion Inc.，Austin，TX)實(shí)施的。部分單鏈模板通過使T7引物(5′AATTTAATACGACTCACTATAGG 3′)，其僅與等摩爾量(20uM)的合成的寡核苷酸模板中的T7啟動子區(qū)(在10mMTris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA，0.1 MNaCl)中)互補(bǔ)，加熱至95℃、5分鐘并冷卻至室溫。部分單鏈模板(1.5反應(yīng)濃度)用于根據(jù)生產(chǎn)商(Ambion Inc.，Austin，TX)的方案，在37℃進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)4小時(shí)。寡核苷酸模板DNA通過在37C加入2U無RNase DNase 1(Ambion Inc.，Austin，TX)并保持15分鐘而去除。通過加入20μl甲酰胺(50％v/v)、渦旋并在95C加熱3分鐘終止反應(yīng)。體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)通過利用可購得的試劑盒根據(jù)售出商(vendor)推薦的方案進(jìn)行純化(MEGAclear KitTM，Ambion)。
cRNA的濃度通過測定260nm的uv吸收確定。cRNA的質(zhì)量通過使150ng等分試樣在10％TBEurea聚丙烯酰胺(BioRad，Inc.，Hercules，CA)上進(jìn)行電泳來評估。
合成用于標(biāo)準(zhǔn)曲線的cDNA在大小分級凝膠(sizing gel)上產(chǎn)生正確大小的單個(gè)帶的RNA制備物被加入(添加入(spike))酵母的經(jīng)剪切的RNA。首先，對cRNA進(jìn)行8次連續(xù)1∶10的逐級稀釋。每個(gè)稀釋度的等分試樣被加入酵母的經(jīng)剪切的RNA(1μg/μL)(Ambionlnc.，Austin，TX)背景。在8個(gè)相應(yīng)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(100pL)中產(chǎn)生的互補(bǔ)DNA利用10μg加入的酵母總(sheared)RNA作為模板。該反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)利用可購得的試劑盒根據(jù)售出商(High-CapacitycDNA Archive Kit，Applied Biosystems)推薦的方案進(jìn)行。
從試驗(yàn)樣品合成cDNA來自肺、肝、腎、心、脾、胸腺、胚胎和腦的大鼠總RNA(10Rg)(Ambion，Inc.)用作cDNA合成反應(yīng)的模板，所述反應(yīng)利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒根據(jù)試劑盒售出商(High CapacitycDNA Archive Kit，Applied Biosystems)提供的方案進(jìn)行。來自每種cDNA合成反應(yīng)的1μl等分試樣(100ng總RNA起始模板)用作每個(gè)定量RT-PCR反應(yīng)的試驗(yàn)樣品。
Taqman熱循環(huán)一式四份的PCR反應(yīng)(用于標(biāo)準(zhǔn)和試驗(yàn)樣品)在96孔板中混合，轉(zhuǎn)入384-孔光板(optical plate)(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)。實(shí)時(shí)反應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)7900HT熱循環(huán)儀(model 7900HT thermal cycler)(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)中循環(huán)。熱循環(huán)儀的條件為50℃、2分鐘(尿嘧啶N-去糖基酶消化)；95℃、10分鐘(Taq熱穩(wěn)定聚合物酶的活化)；以及利用900nM正向和反向引物，200nM Taqman MGB探針以及1X Universal master mix(Applied Biosystems)在95℃ 15秒、60℃ 60秒進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。在每個(gè)反應(yīng)孔中，在整個(gè)反應(yīng)過程中每7秒鐘測定熒光發(fā)射。從利用所述標(biāo)準(zhǔn)品獲得的PCR數(shù)據(jù)產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2)。
利用序列檢測軟件(Sequence Detection Software)(Applied Biosystems)，通過與cRNA標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，測定每個(gè)實(shí)驗(yàn)樣品的轉(zhuǎn)錄物量。多種實(shí)驗(yàn)樣品的拷貝數(shù)通過比較實(shí)驗(yàn)樣品PCR數(shù)據(jù)與標(biāo)準(zhǔn)曲線而獲得。拷貝數(shù)結(jié)果在圖3中總結(jié)。
其它實(shí)施方案見權(quán)利要求。
序列表<110>Allaire，Normand比奧根艾迪克MA公司(BIOGEN IDEC MA INC.)<120>通過RT-PCR對核酸的絕對定最<130>2159.034PC01<140>PCT/US2003/036522<141>2003-11-14<150>10/294,781<151>2002-11-14<160>1<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成<223>合成<400>1cctatagtga gtcgtatta 19
權(quán)利要求
1.產(chǎn)生用于通過RT-PCR對RNA進(jìn)行絕對定量的校準(zhǔn)用數(shù)據(jù)的方法，所述方法包括(a)提供合成的寡核苷酸，其包含擴(kuò)增子和位于該擴(kuò)增子3’的啟動子序列；(b)通過該合成的寡核苷酸的體外轉(zhuǎn)錄合成互補(bǔ)RNA(cRNA)；(c)通過獨(dú)立方法定量測定所述cRNA；以及(d)利用已知量的cRNA產(chǎn)生校準(zhǔn)用數(shù)據(jù)。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述啟動子序列是噬菌體啟動子序列。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述噬菌體啟動子序列是T7啟動子序列。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述T7啟動子序列主要由5′CCTATAGTGAGTCGTATTA 3′(SEQ ID NO1)組成。
5.權(quán)利要求1的方法，還包含5’側(cè)翼序列，所述5’側(cè)翼序列由與所述擴(kuò)增子鄰接的2-20個(gè)核苷酸組成。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述5’側(cè)翼序列由8-12個(gè)核苷酸組成。
7.權(quán)利要求5的方法，其中所述5’側(cè)翼序列包含聚T尾。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述合成的寡核苷酸還包含3′側(cè)翼序列，所述3’側(cè)翼序列由在所述擴(kuò)增子和所述啟動子之間的2-20個(gè)核苷酸組成。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述3′側(cè)翼序列由8-12個(gè)核苷酸組成。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述擴(kuò)增子的長度為30-70個(gè)核苷酸。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述擴(kuò)增子的長度為40-60個(gè)核苷酸。
12.權(quán)利要求1的方法，其中所述合成的寡核苷酸的長度為60-140個(gè)核苷酸。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述合成的寡核苷酸的長度為70-130個(gè)核苷酸。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述合成的寡核苷酸的長度為80-120個(gè)核苷酸。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述合成的寡核苷酸的長度為90-110個(gè)核苷酸。
16.測定受試樣品中核酸分子的豐度的方法，所述核酸分子包含擴(kuò)增子，所述方法包括(a)提供合成的寡核苷酸，其包含擴(kuò)增子和位于該擴(kuò)增子3’的啟動子序列；(b)通過該合成的寡核苷酸的體外轉(zhuǎn)錄合成cRNA；(c)利用該cRNA產(chǎn)生稀釋系列；(d)通過該cRNA的反轉(zhuǎn)錄合成單鏈cDNA；(e)產(chǎn)生RT-PCR校準(zhǔn)用數(shù)據(jù)；(g)從受試樣品獲得RT-PCR受試樣品；以及(h)比較PCR受試樣品數(shù)據(jù)與PCR校準(zhǔn)用數(shù)據(jù)。
17.權(quán)利要求16的方法，還包括對所述cRNA進(jìn)行定量。
18.權(quán)利要求17的方法，還包括在合成所述單鏈cDNA以前將所述cRNA與異源RNA進(jìn)行混合。
全文摘要
公開了獲得用于產(chǎn)生校準(zhǔn)用數(shù)據(jù)例如標(biāo)準(zhǔn)曲線的cRNA的方法，所述校準(zhǔn)用數(shù)據(jù)用于通過RT－PCR對RNA進(jìn)行絕對定量。所述方法包括以下步驟提供包含擴(kuò)增子、位于該擴(kuò)增子3’的啟動子序列的合成的寡核苷酸；通過該合成的寡核苷酸的體外轉(zhuǎn)錄合成互補(bǔ)RNA(cRNA)；通過獨(dú)立方法定量測定所述cRNA；以及利用已知量的cRNA產(chǎn)生校準(zhǔn)用數(shù)據(jù)。
文檔編號C12P19/34GK1759190SQ200380107504
公開日2006年4月12日 申請日期2003年11月14日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月14日
發(fā)明者諾曼德·E·阿萊爾 申請人:比奧根艾迪克Ma公司