專利名稱：增強(qiáng)魚類抗病力的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及魚類分子生物學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及鯰魚中基因表達(dá)的調(diào)節(jié)和抗病力的提高。
背景技術(shù)：
美國(guó)鯰魚產(chǎn)業(yè)產(chǎn)值已經(jīng)超過30億美元，鯰魚產(chǎn)量占到了美國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖總產(chǎn)量的70％以上。水產(chǎn)養(yǎng)殖的鯰魚容易遭到感染。感染造成了產(chǎn)量下降，并增大了消費(fèi)者的開銷—每年超過1億美元。
脊椎動(dòng)物血液和組織流體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的免疫防衛(wèi)蛋白分為兩類抗原特異性的可誘導(dǎo)抗體(或免疫球蛋白)，抗原非特異性(或天然)的防御分子，包括抗菌肽，它們?cè)诤芏喾矫媾c廣譜抗生素類似(Marchalonis(1977)Immunity in Evolution(Harvard UniversityPress)；Hancock(1997)Peptide Antibiotics 349418-42)。硬骨魚使用這兩類防御分子抵抗感染。硬骨魚能夠?qū)Ω腥井a(chǎn)生響應(yīng)而產(chǎn)生IgM和IgD兩種類型的抗體(Wilson and Warr(1992)Ann.Rev.Fis.Dis2201-2；Warr(1995)Dev.Comp.Immunol.191-12；Wilson etal.(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA..4593-4597)。除此之外，硬骨魚能夠產(chǎn)生和分泌廣譜抗菌成分，例如抗菌肽，而不僅僅是酶，例如溶菌酶(Lemaitre et al.(1996)Eur.J.Biochem.240(1)143-149；Oren and Shai(1996)Eur.J.Biochem.237303-3)。然而，這些聯(lián)合防御機(jī)制不足以完全保護(hù)養(yǎng)殖魚類免于疾病的侵襲，從現(xiàn)代商業(yè)化漁業(yè)的實(shí)際前景來看，魚的天然免疫反應(yīng)都是不夠的。
斑點(diǎn)叉尾鮰(channel catfish，Ictalurus punctatus)是一種非常有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的物種，而且可能還是研究最為透徹的硬骨魚免疫模型動(dòng)物(Clem et al.(1991)，Phylogenesis of Immunological Functions，ed.Warr and Cohen(CRC Press，Boca Raton)，pp.1-13；Miller etal.(1994)J.Immunol.1522180-2189；Ghaffari and Lobb(1991)J.Immunol.146；1037-1046；Graves et al.(1985)J.Immunol.13475-85，Warr et al.(1991)Eur.J.Immunogenetics 18393-379；Warr(1991)Eur J.Immunogenetics 18393-379；Warr(1995)Dev.Comp.Immunol.191-2；Wilson et al.(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA..4593-4597)。鯰魚容易遭到多種細(xì)菌感染，而且這樣的感染對(duì)養(yǎng)魚場(chǎng)的魚種會(huì)造成很大的破壞。例如，腸敗血癥(由鯰魚愛德華氏菌(Edwardsiella ictaluri)引起)是現(xiàn)在鯰魚產(chǎn)業(yè)反復(fù)面臨的一個(gè)花費(fèi)很大的問題。研究人員已嘗試進(jìn)行了一些接種試驗(yàn)，希望能夠保護(hù)鯰魚免于腸敗血癥的侵襲，但是到目前為止還沒有找到真正有效的鯰魚愛德華氏菌免疫接種方案。實(shí)際上，雖然很多免疫程序在其它魚類中的應(yīng)用都已經(jīng)成功(大西洋鮭魚，鹽湖鮭魚的冷水弧菌??；參見Holm andHorgensen(1987)J.Fish Dis.1085-90)，但是總體來說免疫接種策略對(duì)許多鯰魚疾病都不是很有效。
鯰魚養(yǎng)殖漁民試圖用三種方法來避免魚類疾病。第一種方法是試圖免疫魚類。例如，美國(guó)專利4,287,179描述了把魚類浸在含有滅活的魯氏耶爾森氏菌的水中來免疫魚，使之能夠抗腸紅嘴病。第二種方法是嘗試通過施用能夠非特異性激活免疫系統(tǒng)的化合物，例如酵母細(xì)胞壁制劑，來增強(qiáng)水產(chǎn)魚類的內(nèi)在免疫力(Wang and Wang(1997)Comp.Immunol.Microbiol.Infect.Dis.20261-270)。美國(guó)專利5,593,678描述了使用蛋白磷酸酶抑制劑來預(yù)防性地保護(hù)硬骨魚(包括鯰魚)免于微生物病原體的感染。第三種方法是與能夠表達(dá)編碼抗菌肽的轉(zhuǎn)基因的鯰魚進(jìn)行育種。轉(zhuǎn)基因肽能夠在不需要外在處理的情況下向魚類賦予非特異性免疫力。
每種方法都有困難之處。對(duì)胚胎和剛孵化的小魚無法進(jìn)行有效的免疫，因?yàn)樗鼈兊拿庖呦到y(tǒng)還沒有足夠成熟，不能對(duì)疫苗有效反應(yīng)。而且，免疫是一種費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、并且昂貴的方法，如果不是采用飼喂或浸沒進(jìn)行免疫接種的話，則尤其如此。甚至是在有效的情況下，免疫系統(tǒng)的非特異性增強(qiáng)所持續(xù)的時(shí)間也會(huì)很短。發(fā)展轉(zhuǎn)基因方法需要大量的精力，而且很昂貴；但是與其它方法相比，從長(zhǎng)遠(yuǎn)看來，轉(zhuǎn)基因方法很可能是最好的，因?yàn)檗D(zhuǎn)基因魚不需要后期處理以防疾病侵襲。
文獻(xiàn)中對(duì)抗菌肽有很多的描述。抗菌肽家族的數(shù)目很龐大，而且抗菌肽很可能在各種物種中廣泛存在(Hancock(1997)PeptideAntibiotics 349418-42；Hoffmann et al.(1996)Curr.Opin.Immunol.88-13；Boman(1996)Scand.J.Immunol.43475-482；Bevins and Zasloff(1990)Annu.Rev.Biochem.591395-414；Lehreret al.(1993)Annu.Rev.Immunol.11105-128)。最早開發(fā)而且研究的很深入的抗菌肽有天蠶抗菌肽(cecropin)，它們是最初在金星梣葉槭大蠶蛾(Hyalophora cecropia)中鑒定到的陽離子性小肽(Steineret al.(1981)Nature 292246-248)。天蠶抗菌肽既具有殺菌作用，又具有抑菌作用。實(shí)際上，研究人員已經(jīng)證實(shí)天蠶抗菌肽能夠抑制或殺死其它類型的病原體，包括病毒，真菌和原生動(dòng)物。
天蠶抗菌肽有很多有可能在水產(chǎn)中加以利用的重要特點(diǎn)。這些肽類具有廣譜抗革蘭氏陰性細(xì)菌活性，包括鯰魚的主要細(xì)菌病原體中的大多數(shù)(Kelly et al.(1990)J.Fish Dis.13317-321；Thune(1993)FishMedicine，ed.Stoskopf(Saunders Co.，Philadelphia)，pp.511-520)。這些肽類對(duì)真核細(xì)胞是無毒性的(Jaynes et al.(1989)Pept.Res.2157-160)。天蠶抗菌肽已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)廣泛存在，其來源包括昆蟲和哺乳動(dòng)物，例如豬(Lee等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA869159-9162)。最后，這些肽類在文獻(xiàn)中已經(jīng)有很詳細(xì)的描述，包括它們的物理化學(xué)性質(zhì)和作用模式(Christensen et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 855072-5076)，因此不需要做試驗(yàn)，或者對(duì)試驗(yàn)的要求有所降低。
實(shí)驗(yàn)證據(jù)能夠證明天蠶抗菌肽在水產(chǎn)系統(tǒng)中的應(yīng)用價(jià)值。被動(dòng)施用的天蠶抗菌肽衍生物能夠保護(hù)魚類避免鯰魚愛德華氏菌的感染(Kellyet al.(1993)J.App.Aquaculture.325-34)，該細(xì)菌是養(yǎng)殖鯰魚的主要病原體(Thune(1993)Fish Medicine，Stoskopf編(Saunders Co.，Philadelphia)，pp.511-520)。
與常規(guī)的免疫方法相比，培育表達(dá)抗菌肽轉(zhuǎn)基因(例如天蠶抗菌肽)的鯰魚有很多潛在的優(yōu)點(diǎn)。首先，魚類在免疫系統(tǒng)遠(yuǎn)未發(fā)育成熟而對(duì)免疫接種產(chǎn)生反應(yīng)之前就已在早期發(fā)育階段表達(dá)天蠶抗菌肽。其次，天蠶抗菌肽轉(zhuǎn)基因能夠賦予魚抵抗多種病原體的免疫力，因而無需制備多種病原體特異性接種制劑和進(jìn)行各種處理。因此，天蠶抗菌肽轉(zhuǎn)基因魚能夠避免兩個(gè)主要的商業(yè)損失，一是疾病對(duì)種魚的破壞，另一是需要持續(xù)的對(duì)健康種魚進(jìn)行預(yù)防性治療或免疫。
一些轉(zhuǎn)基因魚已經(jīng)成為美國(guó)專利。例如美國(guó)專利6,207,817涉及魚胰島素樣生長(zhǎng)因子II(IGF-II)啟動(dòng)子區(qū)的DNA序列和重組IGF-II啟動(dòng)子，以及IGF-II啟動(dòng)子區(qū)和重組IGF-II啟動(dòng)子在真核細(xì)胞和魚類胚胎中的表達(dá)。
美國(guó)專利6015713涉及表達(dá)人胰島素的轉(zhuǎn)基因魚以及所述轉(zhuǎn)基因胰島素在糖尿病治療中的應(yīng)用。值得指出的是，盡管魚攜帶人源化胰島素轉(zhuǎn)基因，但并未修飾驅(qū)動(dòng)該轉(zhuǎn)基因表達(dá)的魚類胰島素調(diào)節(jié)序列。
美國(guó)專利5545808描述了表達(dá)外源鮭魚生長(zhǎng)激素的轉(zhuǎn)基因鮭魚。該專利要求保護(hù)一種提高鮭魚生長(zhǎng)速率的方法，包括如下步驟1)向鮭魚的種系中導(dǎo)入與3型抗凍蛋白啟動(dòng)子可操作性連接的編碼鮭魚生長(zhǎng)激素的基因，2)在鮭魚表達(dá)生長(zhǎng)激素基因的水平能夠使其生長(zhǎng)速率與非轉(zhuǎn)基因魚對(duì)照組相比提高至少4倍的條件下培育鮭魚。
已按照美國(guó)專利5998697中所述分離了紅大馬哈魚1型和2型生長(zhǎng)激素基因以及紅大馬哈魚組蛋白和金屬硫蛋白基因啟動(dòng)子，并進(jìn)行了測(cè)序。生長(zhǎng)激素基因的末端序列也已經(jīng)被公布。包含這些啟動(dòng)子和末端序列(以及中間序列)的載體已經(jīng)被用于轉(zhuǎn)化魚類卵細(xì)胞，然后將已轉(zhuǎn)化的魚類卵細(xì)胞培養(yǎng)為轉(zhuǎn)基因魚。
美國(guó)專利5719055描述了一種基于轉(zhuǎn)座子的載體，它能促進(jìn)DNA整合到宿主基因組，尤其是真核基因組中。這種載體已經(jīng)被用于將編碼天蠶抗菌肽B的非組成性表達(dá)的轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化入哺乳動(dòng)物和魚類細(xì)胞中。
美國(guó)專利6,156,568中公開了能夠表達(dá)外源溶菌肽的轉(zhuǎn)化動(dòng)物、轉(zhuǎn)化動(dòng)物細(xì)胞，由對(duì)急性期蛋白的誘導(dǎo)物有反應(yīng)性的外源啟動(dòng)子控制的真核細(xì)胞基因和基于轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)化載體。該專利具體地要求保護(hù)含有處于野生型天蠶抗菌肽B啟動(dòng)子控制之下的基因的體外真核細(xì)胞，其中所述啟動(dòng)子相對(duì)于該細(xì)胞來說是外源的。所記載的細(xì)胞是脊椎動(dòng)物和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
美國(guó)專利5998698要求保護(hù)具有與天然天蠶抗菌肽B啟動(dòng)子可操作性連接的天蠶抗菌肽B編碼基因的轉(zhuǎn)基因鯰魚，其中天蠶抗菌肽B啟動(dòng)子能夠發(fā)揮功能而指導(dǎo)天蠶抗菌肽B基因的表達(dá)，并且天蠶抗菌肽B的表達(dá)賦予了對(duì)病原細(xì)菌的抵抗力。該專利進(jìn)一步要求保護(hù)具有天蠶抗菌肽B編碼基因的轉(zhuǎn)基因koi和多骨魚(bony fish)。
美國(guó)專利6156568公開了一種具有與天然天蠶抗菌肽B啟動(dòng)子可操作性連接的天蠶抗菌肽B編碼基因的轉(zhuǎn)基因魚。這種轉(zhuǎn)基因魚能夠免受鯰魚愛德華氏菌的感染。
因此，已嘗試了通過飼養(yǎng)能夠表達(dá)編碼殺滅病原體的抗病原性蛋白的轉(zhuǎn)基因的魚來解決疾病感染的問題。但是，這一方案造成了另一個(gè)問題。轉(zhuǎn)基因的表達(dá)通常受到病毒啟動(dòng)子的控制，但是消費(fèi)者很可能認(rèn)為攜帶有病毒“片段”的魚是不健康或不安全的，因此，即使這種食品能夠通過FDA的批準(zhǔn)，但是消費(fèi)者還是不太可能會(huì)購(gòu)買的。因此，養(yǎng)魚主處于或者被迫承受高魚病發(fā)生率造成的損失、或者選擇養(yǎng)殖轉(zhuǎn)基因魚、但由于消費(fèi)者的偏見而無法賣出抗病魚的兩難境地中。
因此，需要有生產(chǎn)提高了抗病性、并且符合FDA和消費(fèi)者要求的轉(zhuǎn)基因魚的方法。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了可用于向魚賦予增強(qiáng)的疾病抵抗力的組合物和方法。組合物中包含新的重組構(gòu)建體，該構(gòu)建體可以誘導(dǎo)抗病原性多肽，包括天蠶抗菌肽蛋白或者其生物學(xué)活性變體在魚中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。天蠶抗菌肽蛋白或者其生物學(xué)活性變體的表達(dá)能夠賦予對(duì)病原體，例如病毒、寄生蟲和細(xì)菌的抗病性，提供對(duì)由鯰魚愛德華氏菌、柱狀黃桿菌(Flavobacterium columnare)、熒光假單胞菌(Psendomonasfluorescens)和鰻弧菌(Vibrio anguillarum)所引起疾病的抵抗力。本發(fā)明的組合物也包括具有穩(wěn)定整合到其基因組中的本發(fā)明重組構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因魚細(xì)胞、魚卵和魚，尤其是鯰魚。
在一些實(shí)施方案中，所述新型重組構(gòu)建體是包含本發(fā)明的新型合成啟動(dòng)子以及與之可操作性連接的編碼目的多肽、尤其是感興趣的抗病原性多肽的核苷酸序列的表達(dá)盒。感興趣的抗病原性多肽的實(shí)例包括成熟天蠶抗菌肽蛋白及其前天蠶抗菌肽蛋白原、天蠶抗菌肽蛋白原、前天蠶抗菌肽蛋白形式，以及這些蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性變體。所述重組構(gòu)建體可以編碼可操作性連接的前導(dǎo)序列，便于所編碼的天蠶抗菌肽蛋白或其變體的翻譯后加工。在變通的實(shí)施方案中，本發(fā)明的重組構(gòu)建體是能夠通過魚類啟動(dòng)子實(shí)現(xiàn)天蠶抗菌肽蛋白或其生物學(xué)活性變體的增強(qiáng)表達(dá)的表達(dá)盒。這樣的魚啟動(dòng)子包括、但不僅僅局限于myostatin啟動(dòng)子，α肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子，β肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子(例如FV-1和FV-2啟動(dòng)子)，肌酸激酶啟動(dòng)子，I型角蛋白啟動(dòng)子，II型角蛋白啟動(dòng)子和金屬硫蛋白啟動(dòng)子，以及它們的功能性變體。天蠶抗菌肽蛋白在本領(lǐng)域中是眾所周知的，而且實(shí)際上可以來源于任何物種，包括例如來源于蛾的天蠶抗菌肽(蛾天蠶抗菌肽B)，以及從豬中分離到的天蠶抗菌肽(豬天蠶抗菌肽P1)。
本發(fā)明的重組構(gòu)建體能夠用于驅(qū)動(dòng)感興趣多肽在魚、例如鯰魚體內(nèi)的非組織特異性表達(dá)。當(dāng)所述感興趣多肽是抗病原性多肽、例如天蠶抗菌肽蛋白或其生物學(xué)活性變體時(shí)，這種組成性表達(dá)模式能夠給全魚提供抗病性。獨(dú)有地包含魚類啟動(dòng)子以驅(qū)動(dòng)天蠶抗菌肽蛋白或其生物學(xué)活性變體表達(dá)的重組構(gòu)建體也能夠使抗病性轉(zhuǎn)基因魚在商業(yè)上更容易被認(rèn)可。
本發(fā)明還提供了在宿主細(xì)胞、例如魚細(xì)胞中表達(dá)目標(biāo)多肽的方法。該方法包括將表達(dá)盒導(dǎo)入目標(biāo)宿主細(xì)胞中，所述表達(dá)盒包含與編碼目標(biāo)多肽的核苷酸序列可操作性連接的本發(fā)明新型合成啟動(dòng)子。本發(fā)明還提供了增強(qiáng)鯰魚抗病性的方法，包括將包含與編碼天蠶抗菌肽蛋白或其生物學(xué)活性變體的核苷酸序列可操作性連接的本發(fā)明合成啟動(dòng)子或者魚類啟動(dòng)子的表達(dá)盒導(dǎo)入到鯰魚卵中，并且在適于鯰魚卵發(fā)育成鯰魚的條件下培育魚卵。這樣可以向鯰魚的不同物種，包括斑點(diǎn)叉尾鮰(channelcatfish)、藍(lán)叉尾鮰(blue catfish)，斑點(diǎn)叉尾鮰-藍(lán)叉尾鮰雜交鯰魚提供抗病性。本發(fā)明還公開了養(yǎng)殖對(duì)病原體具有增強(qiáng)的抗病性的轉(zhuǎn)基因鯰魚的方法。
附圖簡(jiǎn)述

圖1描述了構(gòu)建處于啟動(dòng)子(例如CMV增強(qiáng)子，鯉魚β肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子，或者本文中公布的合成啟動(dòng)子)的控制下表達(dá)天蠶抗菌肽的載體的一般方案。
圖2描述了用于生產(chǎn)抗病性增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因魚的天蠶抗菌肽B表達(dá)載體中包含的相關(guān)核苷酸編碼序列。所編碼的多肽的相應(yīng)氨基酸序列列在各編碼序列的下面。使用的是單字母氨基酸符號(hào)。斜線代表所表達(dá)肽的已知或預(yù)計(jì)的加工位置。信號(hào)肽酶的潛在切割位點(diǎn)用“\”表示，二肽基肽酶的潛在切割位點(diǎn)用“/”表示。SEQ ID NO12和SEQ ID NO11分別表示前天蠶抗菌肽原B(preprocecropin B)的編碼序列和氨基酸序列。SEQ ID NO21和SEQ ID NO22分別表示鯰魚Ig Vh前導(dǎo)序列/天蠶抗菌肽原B(procecropin B)的編碼序列和氨基酸序列。SEQ IDNO23和SEQ ID NO24分別顯示了鯰魚Ig Vh前導(dǎo)序列/天蠶抗菌肽B的編碼序列和氨基酸序列。
圖3描述了用于生產(chǎn)抗病性增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因魚的天蠶抗菌肽P1表達(dá)載體中包含的相關(guān)編碼核苷酸序列(SEQ ID NO27)。所編碼多肽的相應(yīng)氨基酸序列列在編碼序列下面(SEQ ID NO28)，用單字母氨基酸碼表示。粗體顯示的氨基酸序列是所表達(dá)的肽在被前導(dǎo)肽酶加工后的預(yù)計(jì)成熟氨基酸序列。
圖4描述了編碼前天蠶抗菌肽原B并且由SEQ ID NO3所示的合成啟動(dòng)子序列驅(qū)動(dòng)表達(dá)的構(gòu)建體的核苷酸序列(SEQ ID NO13)和預(yù)計(jì)的編碼氨基酸序列(SEQ ID NO11)。
圖5描述了處于SEQ ID NO8所示的合成啟動(dòng)子序列控制下編碼前原天蠶抗菌肽B的構(gòu)建體的核苷酸序列(SEQ ID NO14)和預(yù)計(jì)的編碼氨基酸序列(SEQ ID NO11)。
圖6描述了處于鯉魚β肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子(SEQ ID NO29)控制下的編碼前原天蠶抗菌肽B的構(gòu)建體的核苷酸序列(SEQ ID NO35)和編碼的氨基酸序列(SEQ ID NO11)。
發(fā)明詳述下文中將參照附圖對(duì)本發(fā)明作更完整的描述，其中給出了本發(fā)明的一些、但并非全部實(shí)施方案。事實(shí)上，本發(fā)明可能會(huì)有很多具體的形式，而不應(yīng)理解為僅僅局限于本文中所提到的實(shí)施方案。提供這些實(shí)施方案只是為了使公開內(nèi)容能夠滿足專利申請(qǐng)的法律要求。
這項(xiàng)發(fā)明涉及不在轉(zhuǎn)基因中應(yīng)用病毒核苷酸序列而向魚提供轉(zhuǎn)基因抗病性的方法和組合物。因此，本發(fā)明具有增強(qiáng)魚、尤其是鯰魚對(duì)疾病的抵抗力，而且也不會(huì)引起消費(fèi)者的潛在抵觸的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明的方法中采用了天然“全魚”啟動(dòng)子，或者在合成啟動(dòng)子中排布的“全魚”啟動(dòng)子元件。這兩種啟動(dòng)子都可以驅(qū)動(dòng)魚、例如鯰魚中抗病基因的表達(dá)。而且，這些啟動(dòng)子能夠啟動(dòng)感興趣的轉(zhuǎn)基因、例如抗病原性基因的組成性、非組織特異性的表達(dá)，并且不需要病毒核苷酸序列。這些啟動(dòng)子特性是很有用的，因?yàn)轸~類在整個(gè)體內(nèi)表達(dá)抗病原性蛋白，從而病原體不能輕易進(jìn)入魚組織內(nèi)或在其中任何地方增殖。更為有利的是，這種保護(hù)作用無需誘導(dǎo)性刺激即可提供。
本發(fā)明所公開的合成“全魚”啟動(dòng)子除了可用于增強(qiáng)魚的抗病性之外還有其它優(yōu)點(diǎn)。當(dāng)摻入到表達(dá)盒中時(shí)，這些新型合成啟動(dòng)子能夠代替天然魚類啟動(dòng)子用于驅(qū)動(dòng)可操作性連接的感興趣核苷酸序列在魚中的表達(dá)。因此，這些新型啟動(dòng)子能夠用于驅(qū)動(dòng)幾乎任何感興趣核苷酸序列的表達(dá)，同時(shí)使轉(zhuǎn)基因魚更能為消費(fèi)者所接受，從而具有商業(yè)價(jià)值。此外，這些合成啟動(dòng)子保留了組成性、即以非組織特異性的方式表達(dá)轉(zhuǎn)基因的有利特性。
“啟動(dòng)子”是指能夠啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄的DNA序列。通常啟動(dòng)子是包含TATA盒的DNA調(diào)控區(qū)，能夠指導(dǎo)RNA聚合酶II在特定編碼序列的合適轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)起始RNA的合成。一般來說，啟動(dòng)子位于基因的5’區(qū)，接近編碼序列的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。啟動(dòng)子還可以包含一般位于TATA盒5，端或上游的其它啟動(dòng)子和增強(qiáng)子識(shí)別序列，被稱為上游啟動(dòng)子和增強(qiáng)子元件，它們能夠影響轉(zhuǎn)錄起始速率。
合成啟動(dòng)子是人工制成的核苷酸序列，它并不是天然產(chǎn)生的，而是人為設(shè)計(jì)的，必須被導(dǎo)入到有機(jī)體中或有機(jī)體的始祖中以便控制與之可操作性連接的核苷酸序列的表達(dá)?！翱刹僮鬟B接”是指啟動(dòng)子與另一序列的功能性連接，其中該啟動(dòng)子序列能夠起始和介導(dǎo)對(duì)應(yīng)于該第二序列的DNA序列的轉(zhuǎn)錄。一般來說，可操作連接指所連接的核酸序列是相互毗鄰的，而在需要連接兩個(gè)蛋白質(zhì)編碼區(qū)時(shí)，則指的是它們相互毗鄰并且處于相同閱讀框內(nèi)。
本發(fā)明的合成啟動(dòng)子至少包括如下所述的核心啟動(dòng)子。另外，所述啟動(dòng)子還可包括至少一個(gè)上游元件。這些元件包括上游激活區(qū)域(UAR)，并可選地包括可以影響結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄的其它DNA序列，例如合成性上游元件或其它增強(qiáng)子元件。上游激活區(qū)域通常是位置或方向依賴型元件，主要指導(dǎo)組織、細(xì)胞類型或者受調(diào)控的表達(dá)。增強(qiáng)子是能夠與增強(qiáng)子相對(duì)于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的距離或方向無關(guān)地提高轉(zhuǎn)錄效率的DNA調(diào)控元件。
“核心啟動(dòng)子”或者“最小啟動(dòng)子”含有表達(dá)可操作性連接的編碼序列所需的基本核苷酸序列，包括TATA盒和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。根據(jù)這個(gè)定義，核心啟動(dòng)子可以在缺乏能夠提高活性或賦予組織特異性活性的特異序列的情況下具有或不具有可檢測(cè)的活性。本發(fā)明中的合成啟動(dòng)子包含SEQ ID NO1所示的金魚最小啟動(dòng)子(Wilson et al.，Mol.Immunol.28449)作為其核心啟動(dòng)子區(qū)，提供啟動(dòng)子的功能。核心啟動(dòng)子區(qū)可與增強(qiáng)子、上游元件和/或來自可表達(dá)基因5’側(cè)翼區(qū)的激活序列組合使用。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述合成啟動(dòng)子包含含有在5’端偶聯(lián)了上游元件的TATA盒基元(SEQ ID NO1)的金魚最小啟動(dòng)子。該上游元件包含至少三個(gè)魚類Sp1結(jié)合基元(CGGGGCGGGG；SEQ ID NO2；參閱例如Baudler et al.1997.J.Biol.Chem.272131-137)以及新型間插性連接序列。在一個(gè)這樣的實(shí)施方案中，所述合成啟動(dòng)子包含SEQID NO3所示的序列。當(dāng)該合成啟動(dòng)子序列與目的核苷酸序列、例如蛋白質(zhì)編碼序列可操作性連接時(shí)，它能夠驅(qū)動(dòng)編碼產(chǎn)物在靶宿主細(xì)胞例如鯰魚細(xì)胞中的組成性表達(dá)?！敖M成性”是指在整個(gè)宿主體內(nèi)，例如魚中，在大部分時(shí)間和大多數(shù)組織內(nèi)發(fā)生表達(dá)。在向魚提供增強(qiáng)的抗病性、例如通過表達(dá)抗病原性蛋白(例如天蠶抗菌肽多肽)而實(shí)現(xiàn)此目的時(shí)，非組織特異性的高度表達(dá)是非常有用的。這些蛋白對(duì)魚的生長(zhǎng)和發(fā)育是無害的，而限制性組織表達(dá)會(huì)使病原體有一些其它的入侵途徑。例如，驅(qū)動(dòng)抗病原性蛋白只在皮膚中表達(dá)的轉(zhuǎn)錄控制元件不能保護(hù)宿主免于受到通過胃腸或者刺傷部位進(jìn)入體內(nèi)的細(xì)菌的感染。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含含有與上游元件相偶聯(lián)的TATA盒基元(SEQ ID NO1)的金魚最小啟動(dòng)子的合成啟動(dòng)子，該上游元件包含以5’到3’方向裝配的下列元件以及間插性的接頭序列至少一個(gè)魚類Sp1結(jié)合基元(CGGGGCGGGG；SEQ ID NO2)可操作地連接至少一個(gè)魚類C/EBPα基元(ATAATGTTTCATCACACTT；SEQ ID NO4；參見例如Chan et al.(1997)Eur.J.Biochem.24744-51)可操作地連接至少一個(gè)魚類Oct基元(ATGTAAAT；SEQ ID NO5；參見例如Magoret al.(1997)Immunogenetics 46192-198)可操作地連接至少一個(gè)魚類NF-κB基元(GGGACGTCCC；SEQ ID NO6)可操作地連接至少一個(gè)魚類AP-1結(jié)合基元(ATGACTCAG；SEQ ID NO7)。在一個(gè)這樣的實(shí)施方案中，該合成啟動(dòng)子包含SEQ ID NO8中所示的序列。所述合成啟動(dòng)子也可用于增強(qiáng)可操作性連接的核苷酸序列在宿主生物體細(xì)胞、例如魚類細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄水平。
這里描述的上游元件能夠通過本領(lǐng)域眾所周知的任何常規(guī)方法與金魚最小啟動(dòng)子和/或其他上游元件(包括UARs)相連接，只要構(gòu)建出了有效的元件或啟動(dòng)子即可。這些上游元件一般與金魚最小啟動(dòng)子的5’末端可操作性連接。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述上游元件以非?？拷痿~最小啟動(dòng)子的方式與之相連接。這里的“非常靠近”指的是在約1～50個(gè)核苷酸范圍內(nèi)。然而，應(yīng)當(dāng)承認(rèn)，大于50個(gè)核苷酸的距離可能會(huì)將單個(gè)的上游元件和金魚最小啟動(dòng)子分隔開。
可以將一個(gè)或多個(gè)拷貝的上游元件與金魚最小啟動(dòng)子一起使用。當(dāng)使用多拷貝時(shí)，它們可以是一個(gè)基元的串聯(lián)重復(fù)，也可以是幾個(gè)基元的組合。這樣，可通過啟動(dòng)子構(gòu)建體中存在的基元數(shù)目來控制可操作性連接的感興趣核苷酸序列的表達(dá)水平。因此，可以用多拷貝結(jié)合基元來增強(qiáng)可操作性連接的金魚最小啟動(dòng)子的活性。
本文公開的合成啟動(dòng)子序列的生物學(xué)活性變體也可用于本文所描述的表達(dá)盒中。這樣的變體序列將具有如下所述不會(huì)破壞該合成啟動(dòng)子的啟動(dòng)子活性的微小變化。優(yōu)選地，所述變化發(fā)生在對(duì)應(yīng)于核心金魚最小啟動(dòng)子的區(qū)域之外以及對(duì)應(yīng)于本發(fā)明合成啟動(dòng)子中存在的特定上游元件的區(qū)域之外，例如，這種變異發(fā)生在將核心啟動(dòng)子和特定上游啟動(dòng)子元件(即Sp1結(jié)合基元、C/EBPα基元、Oct基元、NF-κB基元和AP-1結(jié)合基元)連接在一起的間插性序列內(nèi)。不過，我們意識(shí)到，只要變體啟動(dòng)子序列是功能性的啟動(dòng)子，則該微小的變化也可發(fā)生在核心啟動(dòng)子內(nèi)，一個(gè)或者多個(gè)上游元件內(nèi)(即Sp1結(jié)合基元、C/EBPα基元、Oct基元、NF-κB基元和AP-1結(jié)合基元內(nèi))，或者既在核心啟動(dòng)子內(nèi)又在一個(gè)或多個(gè)上游元件內(nèi)。
“功能性啟動(dòng)子”意指該啟動(dòng)子能起始或增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員十分清楚，可通過測(cè)定可操作性連接的核苷酸序列在該啟動(dòng)子存在的情況下是否轉(zhuǎn)錄而容易地確定啟動(dòng)子的功能性。確定轉(zhuǎn)錄和翻譯是否發(fā)生的方法在本領(lǐng)域廣為人知，這些方法包括檢測(cè)在將目標(biāo)蛋白的編碼序列置于啟動(dòng)子控制之下時(shí)生成的mRNA或蛋白質(zhì)的產(chǎn)量。不能誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄或翻譯的啟動(dòng)子序列一定是非功能性的。本發(fā)明的有用之處在于其中描述了能夠驅(qū)動(dòng)可操作性連接的編碼序列的轉(zhuǎn)錄以及所編碼蛋白的翻譯的功能性合成啟動(dòng)子。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠認(rèn)識(shí)到，本發(fā)明公開的合成啟動(dòng)子的功能性變體也可用于驅(qū)動(dòng)可操作性連接的目的核酸序列的表達(dá)。這里“表達(dá)”一詞意為編碼產(chǎn)物的生物合成。表達(dá)包括編碼序列轉(zhuǎn)錄為mRNA以及mRNA進(jìn)一步翻譯為一種或多種功能性蛋白質(zhì)或多肽?！肮δ苄缘鞍踪|(zhì)”或“功能性多肽”指所述蛋白質(zhì)或多肽發(fā)揮其預(yù)定的用途。例如，功能性抗病原性蛋白或抗病原性多肽將殺死或抑制病原體的生長(zhǎng)。
啟動(dòng)子活性可由以下技術(shù)檢測(cè)例如Northern印跡雜交、轉(zhuǎn)錄融合體的報(bào)告子活性檢測(cè)，諸如此類。參閱例如，Sambrook et al(1989)Molecular CloningA Laboratory Manual(2nded.，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)，將此文獻(xiàn)在此引用作為參考?；蛘撸梢詼y(cè)定在啟動(dòng)子片段或變體啟動(dòng)子序列控制下生成的報(bào)告基因諸如綠色熒光蛋白(GFP)、螢光素酶、β-半乳糖苷酶(LacZ)，氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)等的表達(dá)水平。參見例如，Astola et al(2003)Gen.Comp.Endocrinol.13457-61；Hwanget al(2003)Biochem.Biophys.Acta 162511-18；Kim et al.(2000)Gene 252173-181；Volckaert et al.(1994)Mol.Mar.Biol.Biotechnol.357-69；這些文獻(xiàn)在此引用作為參考。
因此，本發(fā)明公開的合成啟動(dòng)子的生物學(xué)活性變體預(yù)計(jì)也可用于本發(fā)明的組合物和方法中。這樣的生物學(xué)活性變體將具有功能性啟動(dòng)子活性，并且與作為參照分子的合成啟動(dòng)子(即SEQ ID NO3或8的合成啟動(dòng)子)有至少大約70％的序列同一性，一般至少大約75％、80％、85％的序列同一性，優(yōu)選至少大約90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％的序列同一性，更優(yōu)選至少大約98％、99％或更高序列同一性。變體啟動(dòng)子不必具有與參照合成啟動(dòng)子相同的啟動(dòng)子活性。只要變體啟動(dòng)子具有功能就足夠了，換言之，變體啟動(dòng)子具有驅(qū)動(dòng)可操作性連接的核苷酸序列表達(dá)的能力。
比對(duì)序列以進(jìn)行比較的方法在本領(lǐng)域廣為人知。序列比對(duì)最佳方法可以通過使用以下算法進(jìn)行Myers和Miller(1988)(CABIOS 411-17)的算法；Smith et al.(1981)Adv.Appl.Math.2482的局部同源性算法；Needleman and Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48443-453的同源性比對(duì)算法；Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.852444-2448的相似性搜索算法；Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264的算法，在Karlin andAltschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905873-5877中作了改進(jìn)?？赏ㄟ^計(jì)算機(jī)執(zhí)行這些數(shù)學(xué)算法來比較序列，以確定它們的序列同一性。這些執(zhí)行程序包括但不局限于PC/Gene程序中的CLUSTAL(可獲自Intelligenetics，Mountain View，California)；ALIGN程序(第二版)和GAP，BESTFIT，BLAST，F(xiàn)ASTA以及TFASTA(GCG威斯康星遺傳學(xué)軟件包，第十版，可獲自Accelrys Inc.9685 ScrantonRoad，San Diego，California，USA)?？梢允褂媚J(rèn)參數(shù)進(jìn)行這些程序的比對(duì)。比對(duì)常常也可通過檢查和人工比對(duì)完成。
為了本發(fā)明目的，使用GAP(版本10或更新版本)及默認(rèn)參數(shù)來確定任何兩個(gè)核苷酸序列(例如SEQ ID NO3或SEQ ID NO8的合成啟動(dòng)子與作為它們中任一序列的功能性變體的啟動(dòng)子序列之間)的序列同一性百分比。GAP使用了Needleman和Wunsch(1970)，J.Mol.Biol.48443-453的算法，以確定兩個(gè)完整序列之間的比對(duì)，使它們之間的匹配數(shù)最大，缺口數(shù)最少。GAP會(huì)考慮所有可能的比對(duì)和缺口的位置，并建立具有最多匹配堿基數(shù)和最少缺口的比對(duì)。在Wisconsin GeneticsPackage版本10中，對(duì)蛋白質(zhì)序列的默認(rèn)缺口產(chǎn)生罰分值和缺口延伸罰分值分別是8和2。對(duì)于核苷酸序列而言，默認(rèn)的缺口產(chǎn)生罰分值和缺口延伸罰分值則分別是50和3。
為了提供可操作性連接的目的核苷酸序列的組成性表達(dá)，可將本發(fā)明的合成啟動(dòng)子構(gòu)建在表達(dá)盒內(nèi)。表達(dá)盒可以置于質(zhì)?；虿《据d體中，以便于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，比如魚類細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明中公開的合成啟動(dòng)子序列可以用于實(shí)現(xiàn)可操作性連接的目標(biāo)核苷酸序列所編碼的產(chǎn)物的非組織特異性、組成性表達(dá)。在一個(gè)這樣的實(shí)施方案中，可以將SEQ ID NO3或SEQ ID NO8中所示的合成啟動(dòng)子插入到表達(dá)盒內(nèi)，實(shí)現(xiàn)任何目標(biāo)蛋白的高水平表達(dá)。
當(dāng)本發(fā)明的合成啟動(dòng)子序列裝配在DNA構(gòu)建體、即表達(dá)盒中，使啟動(dòng)子與目標(biāo)核苷酸序列可操作性連接時(shí)，即會(huì)驅(qū)動(dòng)該可操作性連接的核苷酸序列在被該DNA構(gòu)建體穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的魚類細(xì)胞中的表達(dá)。該目標(biāo)核苷酸序列可以與待用該構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的宿主魚同源(天然的或異源(即外來的或非天然存在的))。
表達(dá)盒包括(按轉(zhuǎn)錄的5’到3’方向)本發(fā)明的合成啟動(dòng)子(例如SEQ ID NO3，SEQ ID NO8或其具有啟動(dòng)子活性的變體)，目標(biāo)核苷酸序列，在魚類中有功能的轉(zhuǎn)錄與翻譯終止區(qū)域(即終止區(qū))。普遍認(rèn)為，若所述核苷酸序列是編碼序列，則將它加工到表達(dá)盒內(nèi)，使得該編碼序列包含起始密碼子。若表達(dá)產(chǎn)物是融合蛋白，例如下文所述的鯰魚免疫球蛋白重鏈可變區(qū)(immunoglobulin variable heavy chain，IgVh)前導(dǎo)序列/天蠶抗菌肽B多肽時(shí)，即將編碼所述融合蛋白的序列加工到表達(dá)盒內(nèi)，使之包含處于鯰魚免疫球蛋白重鏈可變區(qū)(Ig Vh)前導(dǎo)序列N末端的編碼序列前的起始密碼子。
終止區(qū)對(duì)于該目標(biāo)核苷酸序列而言可以是天然的，或者可以來自其他來源。表達(dá)盒還可以包含處于終止密碼子下游的3’增強(qiáng)子和/或聚腺苷酸化信號(hào)序列。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)盒包含處于終止密碼子下游的牛生長(zhǎng)激素3’非翻譯區(qū)序列，以增強(qiáng)蛋白質(zhì)表達(dá)水平。在一個(gè)這樣的實(shí)施方案中，表達(dá)盒包含可操作性連接的含有SEQ ID NO9所示核苷酸序列的牛生長(zhǎng)激素基因3’非翻譯區(qū)，其中包含含有AATAAA基元(SEQ ID NO9中的核苷酸145-150)的聚腺苷酸化信號(hào)序列。參見例如U.S.Patent No.5,122,458；Higgs et al.(1983)Nature306398-400)；Woychik et al.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA813944-3948；將這些文獻(xiàn)引入本文作為參考。
在這樣的表達(dá)盒中提供一系列的限制性位點(diǎn)，以插入目標(biāo)核苷酸序列，使之處于調(diào)控區(qū)、即本發(fā)明中公開的合成啟動(dòng)子序列的轉(zhuǎn)錄調(diào)控之下。表達(dá)盒中還可以含有選擇標(biāo)記基因，便于篩選含有表達(dá)盒的細(xì)胞和/或生物體，優(yōu)選地，這樣的表達(dá)盒穩(wěn)定地整合到所述細(xì)胞或生物體的基因組中。
目標(biāo)核苷酸序列可以包含編碼蛋白質(zhì)、多肽或肽的任何序列，所述蛋白質(zhì)、多肽或肽能夠給表達(dá)該目標(biāo)編碼序列的魚類細(xì)胞或宿主魚賦予有用的特性。為了本發(fā)明的目的，術(shù)語“多肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”可以互換使用，指的是氨基酸殘基的聚合物。這些術(shù)語適用于其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基是相應(yīng)的天然氨基酸的人工化學(xué)類似物的氨基酸聚合物，以及天然氨基酸的聚合物。編碼目標(biāo)蛋白的序列可以單獨(dú)使用，或者和編碼其他蛋白或藥劑以向魚類細(xì)胞或宿主魚賦予有用特性的序列組合使用。這些有用的特性包括、但是不局限于促進(jìn)生長(zhǎng)，改良風(fēng)味、顏色和質(zhì)地，抗寒，抗病和不育。例如，目標(biāo)核苷酸序列可編碼魚類生長(zhǎng)激素，魚類生長(zhǎng)激素釋放因子，美洲擬鰈(winter flounder)抗凍蛋白，抗病原性蛋白(包括抗體和天蠶抗菌肽)，或者編碼可以改變魚類性別或倍性的蛋白質(zhì)的序列。
或者，和本發(fā)明中公開的合成啟動(dòng)子之一可操作性連接的目標(biāo)核苷酸序列可以是被靶向基因的反義序列?！胺戳xDNA核苷酸序列”指處于與該核苷酸序列的正常5’到3’方向相反的方向的序列。當(dāng)它們被遞送入魚類細(xì)胞后，反義DNA序列的表達(dá)可以阻止被靶向基因的DNA核苷酸序列的正常表達(dá)。反義核苷酸序列編碼的RNA轉(zhuǎn)錄物與被靶向基因的DNA核苷酸序列轉(zhuǎn)錄所產(chǎn)生的內(nèi)源信使RNA(mRNA)互補(bǔ)，并且可以雜交。在這種情況下，被靶向基因所編碼的天然蛋白的產(chǎn)生受到抑制，得到期望的表型反應(yīng)。這樣，可將本發(fā)明中公開的合成啟動(dòng)子序列與反義DNA序列可操作連接，以減弱或者抑制魚類中蛋白質(zhì)(例如促性腺激素釋放激素(GnRH)，myostatin和病毒蛋白)的表達(dá)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)盒使用本發(fā)明的合成啟動(dòng)子，以驅(qū)動(dòng)抗病原性多肽的表達(dá)，從而向魚提供抗病性。本領(lǐng)域中已知有許多抗病原性多肽，它們包括天蠶抗菌肽，爪蟾抗菌肽(magainins)，防衛(wèi)素(defensin)和麻蠅毒素(sarcotoxin)。由于這些多肽都是兩親性的，它們可以破壞病原體的細(xì)胞膜或細(xì)胞壁，從而殺死或抑制病原體的生長(zhǎng)?？共≡远嚯倪€可以通過破壞病毒感染細(xì)胞的細(xì)胞膜而間接發(fā)揮作用。下文所述的抗病原性多肽對(duì)表達(dá)它們的魚類細(xì)胞或具有這樣的細(xì)胞的宿主魚沒有毒性或毒性很小。
抗病原性多肽特別可用于提供抗病性，同時(shí)不會(huì)損害或延遲轉(zhuǎn)基因魚類的生長(zhǎng)。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知有許多類蛋白都可以提供抗病性，本文中以舉例的方式描述了這樣的具體蛋白，但并不局限于此。本領(lǐng)域技術(shù)人員也能認(rèn)識(shí)到，可通過下文所示的抗病原性活性測(cè)試方法鑒定出抗病原性多肽。
“抗病性”指抗病原性多肽的表達(dá)避免了由于魚-病原體相互作用引起的疾病癥狀。就是說，病原體不能導(dǎo)致魚類疾病并產(chǎn)生相關(guān)的疾病癥狀。若本發(fā)明的表達(dá)盒包含與抗病原性多肽的編碼序列可操作連接的本發(fā)明合成啟動(dòng)子，將該表達(dá)盒導(dǎo)入魚中后將可以保護(hù)所得到的轉(zhuǎn)基因魚免于疾病，尤其是由魚類病原體導(dǎo)致的那些疾病。“抗病原性”多肽指的是那些具有抗病原活性、因此能夠抑制、控制并/或殺滅入侵性病原生物體的蛋白質(zhì)。相對(duì)于在具有類似遺傳成分、但不能表達(dá)可比水平的抗病原性多肽的野生型魚中觀察到的疾病癥狀而言，抗病原性多肽能夠?qū)⒂刹≡w刺激引起的疾病癥狀減少至少大約5％-50％，至少大約10％-60％，至少大約30％-70％，至少大約40％-80％，或者至少大約50％-90％，甚或更高。因此，本發(fā)明的方法可以用來保護(hù)魚類免遭疾病，尤其是由魚類病原體引起的疾病。
檢測(cè)抗病原性活性的方法和量化魚類在病原體感染后的抗病力的方法在本領(lǐng)域中均廣為人知。參閱例如美國(guó)專利號(hào)5998698，在此將其全文引入作為參考。這些技術(shù)包括、但不局限于檢測(cè)接種病原體的魚類隨時(shí)間發(fā)生的死亡率，以及檢測(cè)在有該抗病原性多肽存在時(shí)對(duì)病原體生長(zhǎng)的抑制作用隨時(shí)間的情況。例如，可以用病原體接種由于遺傳改變而表達(dá)抗病原性多肽、或者表達(dá)更高水平的抗病原性多肽的魚，并將死亡率對(duì)時(shí)間作圖。可以將這些結(jié)果和對(duì)照組的死亡率進(jìn)行比較。所述對(duì)照組的魚即是有著相同的遺傳背景、但是沒有進(jìn)行遺傳改變而表達(dá)所述抗病原性多肽或者以更高水平表達(dá)該抗病原性多肽的接種過的野生型魚。絕對(duì)死亡率或者致死的平均時(shí)間與對(duì)照組相比的相對(duì)降低說明了該抗病原性多肽可以賦予對(duì)該病原體的抗性?；蛘撸梢栽谟锌共≡远嚯幕蛘哂斜磉_(dá)該抗病原性多肽的細(xì)胞存在的情況下體外培養(yǎng)病原體。病原體培養(yǎng)物的生存力與未經(jīng)處理的對(duì)照組相比顯示降低則表明了該抗病原性多肽的抗病原體效果。
盡管下述實(shí)施方案針對(duì)的是使用本發(fā)明的合成啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)一類特定的抗病原性多肽的表達(dá)，從而在魚類中增強(qiáng)抗病力，應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，本發(fā)明的合成啟動(dòng)子也可以用于驅(qū)動(dòng)任何目的抗病原性多肽(包括防衛(wèi)素、爪蟾抗菌肽和麻蠅毒素)的表達(dá)，以實(shí)現(xiàn)增強(qiáng)魚中抗病力的目的。關(guān)于抗病原性多肽的綜述，參見例如Boman(2003)J.Intern.Med.254197-215；Zhang et al.(2000)Vet.Res.31277-296，Moore et al.(1996)Antimicrob.Chemother.371077-1089；Merrifield et al.(1994)Ciba Found.Symp 1865-20，及20-26中的討論；以及美國(guó)專利號(hào)5166321；在此將它們?nèi)囊胱鳛閰⒖肌?br> 因此，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的合成啟動(dòng)子被用于驅(qū)動(dòng)下文所述的天蠶抗菌肽多肽或其生物學(xué)活性變體的表達(dá)。天蠶抗菌肽是30到40個(gè)氨基酸殘基組成的兩親性小肽，具有廣譜抗病原性活性(參閱例如，Andra et al.(2001)Med.Microbiol.Immunol(Berl.)189(3)169-173；Baoman(2003)J.Intern.Med.254(3)197-215；Moore etal.(1996)Antimicrob.Chemother.371077-1089)。成熟的天蠶抗菌肽多肽在天然昆蟲細(xì)胞中經(jīng)歷兩階段加工。天蠶抗菌肽最初作為前原天蠶抗菌肽(即所述多肽的前原形式)定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，切除前導(dǎo)肽產(chǎn)生原天蠶抗菌肽(即所述多肽的原形式)之后，通過二肽基肽酶除去四個(gè)氨基末端殘基，產(chǎn)生成熟天蠶抗菌肽多肽。現(xiàn)有技術(shù)中已知多種成熟天蠶抗菌肽，它們的前原和原形式，以及它們的相應(yīng)編碼序列，包括、但是不局限于天蠶抗菌肽A(Qu et al.(1982)Euro.J.Biochem.127219-224；Lidholm et al.(1987)FEBS Lett.2268-12；來自Hyalophora cecropia的GenBank錄入號(hào)P01507，由GenBank錄入號(hào)X06672所編碼；來自Bombyx mori的GenBank錄入號(hào)BAA04217，由GenBank錄入號(hào)D17394所編碼)和天蠶抗菌肽-melittin雜合肽(Boman et al.(1989)FEBS lett.2599(1)103-106)；天蠶抗菌肽B(Qu et al.(1982)Euro.J.Biochem. 127219-224；van Hofsten etal.(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82(8)2240-2243；Taniai etal(1992)Biochim.Biophys.Acta 1132(2)203-206；Kato et al.(1993)Insect.Biochem.Mol.Biol.23(2)285-2990)；Taniai et al.(1995)Gene 163(2)215-219；Yamono et al.(1994)Biosci.Biotechnol.Biochem.581476-1478；來自Hyalophora cecropia的GenBank錄入號(hào)P01508，由GenBank錄入號(hào)M10309所編碼；來自Bombyxmori的Genbank錄入號(hào)P04142，由GenBank錄入號(hào)D11113所編碼；來自Antheraeapernyi的GenBank錄入號(hào)P01509)及其類似物天蠶抗菌肽B1和B3(Wang et al.(1998)J.Biol.Chem.273(42)27438-27448)，天蠶抗菌肽D(Qu et al.Euro.J.Biochem.127219-224；Hultmark et al.(1982)Euro.J.Biochem.(127207-217；Lidholm et al.(1987)FEBS lett.2268-12來自Hyalophoracecropia的GenBank錄入號(hào)P01510，由GenBank錄入號(hào)X06673所編碼)，天蠶抗菌肽P1(Lee et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86(23)9159-9162)；以及具有各種C末端修飾的天蠶抗菌肽多肽(美國(guó)專利號(hào)5166321)。所提及的所有文獻(xiàn)均全文引入本文作為參考。
這些天蠶抗菌肽具有共同的結(jié)構(gòu)，即包括帶電的N末端區(qū)(殘基1-21)及隨后的一段相當(dāng)保守的長(zhǎng)疏水性區(qū)域(殘基22-32)(參見例如美國(guó)專利號(hào)5166321)。這些α螺旋分子通過穿透微生物病原體例如細(xì)菌等的膜而表現(xiàn)出它們的活性(參見例如Steiner et al(1981)Nature 292246-248；Moore et al(1996).J.Antimicrob.Chemother.37(6)1077-1089；Zhang et al.(2000)Vet.Res.31(3)277-296；Chen et al.(2003)Eur.J.Biochem.270(5)911-920)。
根據(jù)本發(fā)明的組合物和方法，編碼感興趣的天蠶抗菌肽的核苷酸序列可以被裝配到DNA構(gòu)建體、即表達(dá)盒，從而該天蠶抗菌肽多肽的編碼序列和本發(fā)明的合成啟動(dòng)子可操作性連接起來，驅(qū)動(dòng)天蠶抗菌肽編碼序列在魚類細(xì)胞中的表達(dá)。
在其基因組中穩(wěn)定整合了這種構(gòu)建體的魚類將組成性表達(dá)所述感興趣的天蠶抗菌肽多肽，由此增強(qiáng)它們對(duì)許多病原體的抗病力。這樣的病原體包括、但是不局限于真菌、細(xì)菌、原生動(dòng)物和病毒。在一個(gè)實(shí)施方案中，按本文所述方式表達(dá)天蠶抗菌肽的鯰魚在暴露于病原體后將顯示出抗病性，所述病原體包括例如鯰魚愛德華氏菌(Edwardsiellaictaluri)，遲鈍愛德華氏菌(Edwardsiella tardi)，柱狀黃桿菌(Flavobacterium columnare)，熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)，殺鮭氣單胞菌(Aeromonas salmonicida)，嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)和鰻弧菌(Vibrio anguillarum)等。然而，在本領(lǐng)域中眾所周知，天蠶抗菌肽具有廣譜抗病原活性，能夠提供針對(duì)其他一些疾病的保護(hù)作用，例如Saprolegnia真菌和斑點(diǎn)叉尾鮰病毒性疾病。
任何功能性天蠶抗菌肽多肽或者其生物學(xué)活性變體都可以應(yīng)用于本發(fā)明。因此，功能性天蠶抗菌肽多肽可以是完全成熟的天蠶抗菌肽多肽(即已除去了信號(hào)肽和前導(dǎo)肽)，前體形式的天蠶抗菌肽多肽(即信號(hào)肽加上成熟天蠶抗菌肽多肽序列)，原體形式的天蠶抗菌肽多肽(即前導(dǎo)肽加上成熟天蠶抗菌肽多肽序列)，或者前原體形式的天蠶抗菌肽多肽(即信號(hào)肽加上前導(dǎo)肽并加上成熟天蠶抗菌肽多肽序列)。細(xì)胞內(nèi)加工可以去除一些或者所有的前體或者原體氨基酸序列，形成成熟天蠶抗菌肽多肽，并且不會(huì)對(duì)該多肽的功能造成不利影響。天蠶抗菌肽多肽可以是來源于任何物種的天然多肽，包括從豬、蛾和魚類中分離的天蠶抗菌肽。此外，如下文中所述，預(yù)計(jì)可以取代本文所述盒內(nèi)的天然天蠶抗菌肽多肽的生物學(xué)活性變體，得到相同的結(jié)果，即在魚類中提供對(duì)許多病原體的抗病性。
已知的成熟天蠶抗菌肽多肽以及天蠶抗菌肽多肽的前體、原體、前原體形式的生物學(xué)活性變體均可以用于本發(fā)明的組合物和方法中。合適的生物學(xué)活性變體可以是內(nèi)源或天然天蠶抗菌肽多肽的片段、類似物和衍生物?！捌巍敝傅氖莾H僅由完整天蠶抗菌肽多肽序列的一部分組成的多肽。這些片段可以是C末端缺失或者N末端缺失的天蠶抗菌肽多肽?！邦愃莆铩敝傅氖怯猩飳W(xué)活性的全長(zhǎng)多肽(包括前天蠶抗菌肽、天蠶抗菌肽原、前天蠶抗菌肽原或者是成熟天蠶抗菌肽多肽)或者其片段的類似物，其中包括天然序列和具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸替代、插入或缺失的結(jié)構(gòu))?！邦愃莆铩币舶ň哂幸粋€(gè)或多個(gè)擬肽(肽模擬物)的肽(參閱International Publication No.WO 91/04282)?！把苌铩敝傅氖翘烊欢嚯幕蚱淦蔚娜魏魏线m的修飾形式，或者它們的相應(yīng)類似物，諸如糖基化產(chǎn)物，磷酸化產(chǎn)物或添加外來成分的其他產(chǎn)物，只要保留了活性即可。
優(yōu)選地，天蠶抗菌肽多肽的天然或非天然變體具有與參照天蠶抗菌肽多肽(例如，內(nèi)源或天然天蠶抗菌肽A，天蠶抗菌肽B，D或P1)或者該參照天蠶抗菌肽多肽的短片段的氨基酸序列至少約70％，75％和80％，優(yōu)選至少約85％，90％，91％，92％，93％，94％或95％相同的氨基酸序列。更優(yōu)選的是，該變體多肽與所述參照天蠶抗菌肽多肽至少96％，97％，98％或至少99％相同。
為了本發(fā)明的目的，任意兩個(gè)多肽序列之間(例如，SEQ ID NO11所示序列的內(nèi)源或天然前原天蠶抗菌肽B與該多肽的變體之間)的序列相同性百分比可用GAP程序(第10版或更新版本)借助缺省參數(shù)確定。如前面提到的，GAP利用Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Blol.48443-453中的算法來尋求兩個(gè)完整序列之間能使匹配數(shù)最大化和缺口數(shù)最小化的比對(duì)。對(duì)于蛋白質(zhì)序列而言，Wisconsin Genetics軟件包中默認(rèn)缺口產(chǎn)生罰分值和缺口延伸罰分值分別是8和2。例如，變體多肽和天蠶抗菌肽參照多肽有1-10個(gè)氨基酸殘基的差異，如6-10個(gè)，少至5，4，3，2、甚或1個(gè)氨基酸殘基的不同。
至于兩個(gè)氨基酸序列的最佳比對(duì)，變體氨基酸序列和參照氨基酸序列相比其連續(xù)區(qū)段中可以具有多余氨基酸殘基或缺失氨基酸殘基。與參照氨基酸序列相比較的毗鄰序列區(qū)段至少包括20個(gè)連續(xù)的氨基酸殘基，可以是30，40，50或者更多氨基酸殘基。也可進(jìn)行與保守氨基酸替代或缺口相關(guān)的序列相同性校正(參閱GAP程序)。
如下面進(jìn)一步討論的，本領(lǐng)域有關(guān)于這樣的變體的制備和使用的實(shí)質(zhì)性教導(dǎo)。天蠶抗菌肽多肽的片段一般包括全長(zhǎng)天蠶抗菌肽多肽的至少約10個(gè)連續(xù)氨基酸殘基(可以是成熟天蠶抗菌肽序列，或者經(jīng)歷成熟天蠶抗菌肽多肽翻譯后加工的前原天蠶抗菌肽、前天蠶抗菌肽、原天蠶抗菌肽序列)，或者，優(yōu)選地包括全長(zhǎng)天蠶抗菌肽多肽的約15-25個(gè)連續(xù)氨基酸殘基，最優(yōu)選包括全長(zhǎng)天蠶抗菌肽多肽的約20-30個(gè)或更多個(gè)連續(xù)氨基酸殘基。
例如，可以在一個(gè)或多個(gè)預(yù)計(jì)的、優(yōu)選非必需的氨基酸殘基處進(jìn)行保守氨基酸替代。“非必需的”氨基酸殘基指天蠶抗菌肽(例如天蠶抗菌肽A，B，D或P1)的野生型序列中可以發(fā)生改變、但其生物學(xué)活性并不發(fā)生改變的殘基，而“必需的”氨基酸是其生物學(xué)活性所必需的?！氨Ｊ匦园被崛〈笔前被釟埢痪哂邢嗨苽?cè)鏈的氨基酸殘基所取代的類型?，F(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)確定了具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基家族。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈的氨基酸(如賴氨酸，精氨酸和組氨酸)，具有酸性側(cè)鏈的氨基酸(如天冬氨酸和谷氨酸)，具有不帶電荷的極性側(cè)鏈的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)，具有非極性側(cè)鏈的氨基酸(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸及色氨酸)，具有β-分支化側(cè)鏈的氨基酸(例如蘇氨酸、纈氨酸及異亮氨酸)和具有芳香族側(cè)鏈的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸及組氨酸)。對(duì)于保守的氨基酸殘基或者位于保守基元內(nèi)的氨基酸殘基不應(yīng)進(jìn)行這樣的替代。
或者，變體天蠶抗菌肽編碼核苷酸序列可通過沿著天蠶抗菌肽編碼序列的所有或部分序列隨機(jī)引進(jìn)突變來制備，例如通過飽和誘變法來制備，并對(duì)所得的突變體篩選天蠶抗菌肽抗病原性生物學(xué)活性，以鑒定出保留活性的突變體。在誘變之后，重組表達(dá)所編碼的蛋白質(zhì)并通過本文所述的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定技術(shù)測(cè)定該蛋白質(zhì)的抗病原性活性。
在構(gòu)建本發(fā)明的表達(dá)盒時(shí)，目標(biāo)核苷酸序列可以是目標(biāo)天蠶抗菌肽多肽的天然編碼序列，也可以是天然編碼序列的變體。例如，當(dāng)目標(biāo)天蠶抗菌肽多肽為SEQ ID NO11的前天蠶抗菌肽原B時(shí)，SEQ ID NO10所示的天然或內(nèi)源編碼序列可用在表達(dá)盒中。作為另一種選擇，該編碼序列的變體，如SEQ ID NO12所示序列，可用在表達(dá)盒中。目標(biāo)核苷酸序列的變體與編碼天蠶抗菌肽的參照核苷酸序列，或者與編碼天蠶抗菌肽的參照序列的更短部分具有至少大約70％、75％、80％，優(yōu)選至少大約85％、90％、91％、92％、93％、94％或95％的同一性，編碼天蠶抗菌肽的參照核苷酸序列例如為天蠶抗菌肽A、天蠶抗菌肽B、天蠶抗菌肽D或天蠶抗菌肽P1的內(nèi)源或天然編碼序列。更優(yōu)選地，變體核苷酸序列與編碼天蠶抗菌肽的參照核苷酸序列具有至少有96％、97％、98％或至少99％的同一性。
為了本發(fā)明的目的，我們用GAP程序(第10版或更新的版本)、借助缺省參數(shù)確定任意兩個(gè)目標(biāo)核苷酸序列(例如，SEQ ID NO10所示的天然或內(nèi)源前天蠶抗菌肽原B編碼序列和該編碼序列的變體)之間的序列同一性百分比。對(duì)于核苷酸序列而言，Wisconsin Genetics軟件包第10版中的默認(rèn)缺口形成罰分值和缺口延伸罰分值分別是50和3。
在希望可操作性連接的核苷酸序列的表達(dá)產(chǎn)物導(dǎo)向特殊細(xì)胞器如線粒體，或者分泌在細(xì)胞表面上或分泌到細(xì)胞外的情況下，表達(dá)盒可進(jìn)一步包括轉(zhuǎn)運(yùn)肽的編碼序列。在這些情況下，來自異源蛋白的前導(dǎo)序列，即信號(hào)肽，可用來產(chǎn)生定位天蠶抗菌肽多肽到特異細(xì)胞器以進(jìn)一步加工成成熟天蠶抗菌肽多肽的嵌合體或融合體。在這項(xiàng)發(fā)明的一些實(shí)施方案中，天蠶抗菌肽與細(xì)胞內(nèi)靶向分子的融合蛋白也具體涵蓋在內(nèi)。這樣，來自斑點(diǎn)叉尾鮰的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)(Ig Vh)前導(dǎo)序列或該前導(dǎo)序列的片段與目標(biāo)天蠶抗菌肽多肽的N末端相連。所編碼的多肽的表達(dá)和隨后的翻譯后加工導(dǎo)致產(chǎn)生成熟的天蠶抗菌肽多肽。靶向細(xì)胞器的前導(dǎo)序列是本領(lǐng)域熟知的。因此，使用斑點(diǎn)叉尾鮰Ig Vh前導(dǎo)序列或其片段來將天蠶抗菌肽靶向到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)只是一個(gè)例子，而不是局限于此。
在一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)盒包含本發(fā)明的合成啟動(dòng)子(例如，SEQ IDNO3、SEQ ID NO8或者其具有啟動(dòng)子活性的變體)，該啟動(dòng)子可操作性連接至編碼來自金星梣葉槭大蠶蛾(Hyalophora cecropia)的前天蠶抗菌肽原B的核苷酸序列(cecropia moth，Genbank AccessionNo.P01508，SEQ ID NO11所示)，例如可操作性連接至SEQ ID NO10(Genbank Accession No.M10309)所示的核苷酸序列或者如SEQ IDNO12所示的該編碼序列的變體。在一個(gè)這樣的實(shí)施方案中，表達(dá)盒包含圖4中所列的序列(SEQ ID NO13)。作為另一種選擇，表達(dá)盒包含圖5中所列的序列(SEQ ID NO14)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)盒包含本發(fā)明的合成啟動(dòng)子(例如，SEQID NO3、SEQ ID NO8、或者其具有啟動(dòng)子活性的變體)，該啟動(dòng)子可操作性連接至編碼來自金星梣葉槭大蠶蛾(Hyalophora cecropia)的天蠶抗菌肽原B的核苷酸序列(SEQ ID NO16)，例如可操作性連接至SEQ ID NO15所示的核苷酸序列或者如SEQ ID NO17所示的該編碼序列的變體。作為另一種選擇，表達(dá)盒包含本發(fā)明的合成啟動(dòng)子(例如，SEQ ID NO3、SEQ ID NO8或者其具有啟動(dòng)子活性的變體)，該啟動(dòng)子可操作性連接至編碼來自金星梣葉槭大蠶蛾(Hyalophora cecropia)的成熟天蠶抗菌肽B的核苷酸序列(SEQ ID NO19)，例如，可操作性連接至SEQ ID NO18所示的序列或如SEQ ID NO20所示的該編碼序列的變體。
在可選擇的實(shí)施方案中，前天蠶抗菌肽原B、天蠶抗菌肽原B、前天蠶抗菌肽B或成熟天蠶抗菌肽B的編碼序列可包含密碼子的改變，從而表達(dá)盒編碼前天蠶抗菌肽原B、天蠶抗菌肽原B、前天蠶抗菌肽B或者成熟天蠶抗菌肽B多肽的生物學(xué)活性變體，這些生物學(xué)活性變體符合上面定義的功能和結(jié)構(gòu)的標(biāo)準(zhǔn)(即抗病原性活性和與參照多肽至少70％的序列同一性。)在其他實(shí)施方案中，表達(dá)盒包括本發(fā)明的合成啟動(dòng)子(例如，SEQID NO3、SEQ ID NO8或者其具有啟動(dòng)子活性的變體)，該啟動(dòng)子可操作性連接至編碼包含與來自金星梣葉槭大蠶蛾(Hyalophoracecropia)的天蠶抗菌肽原B或天蠶抗菌肽B閱讀框一致地連接的鯰魚免疫球蛋白重鏈可變區(qū)(Ig Vh)前導(dǎo)序列的多肽的核苷酸序列。在一個(gè)這樣的實(shí)施方案中，表達(dá)盒編碼SEQ ID NO22所示的多肽(鯰魚IgVh前導(dǎo)序列/天蠶抗菌肽原B)，并包含編碼此多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO21所示的核苷酸序列。在一個(gè)可選擇的實(shí)施方案中，表達(dá)盒編碼SEQ ID NO24所示的多肽(鯰魚Ig前導(dǎo)序列/天蠶抗菌肽B)，并包含編碼此多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO23所示的核苷酸序列。在其他實(shí)施方案，該融合多肽的鯰魚Ig Vh前導(dǎo)序列部分的編碼序列和/或該融合多肽的天蠶抗菌肽原B或天蠶抗菌肽B部分的編碼序列可以包含密碼子的改變，從而表達(dá)盒編碼鯰魚Ig前導(dǎo)序列/天蠶抗菌肽原B或者鯰魚Ig前導(dǎo)序列/天蠶抗菌肽B的生物學(xué)活性變體，這些生物學(xué)活性變體符合上面定義的功能和結(jié)構(gòu)的標(biāo)準(zhǔn)(即抗病原性活性和與參照多肽至少70％的序列同一性)。當(dāng)表達(dá)時(shí)，編碼的融合多肽的翻譯后加工導(dǎo)致產(chǎn)生成熟的天蠶抗菌肽B，或者在適用時(shí)是具有抗病原活性的成熟天蠶抗菌肽蛋白B的變體。
在本發(fā)明的其他實(shí)施方案中，表達(dá)盒包括本發(fā)明的合成啟動(dòng)子(例如，SEQ ID NO3、SEQ ID NO8或者其具有啟動(dòng)子活性的變體)，該啟動(dòng)子可操作性連接至編碼天蠶抗菌肽P1的核苷酸序列(在豬腸組織中鑒定到的；Genbank Accession No.P14661；SEQ ID NO26所示)，例如可操作性連接至序列SEQ ID NO25所示的核苷酸序列。在可選擇的實(shí)施方案中，表達(dá)盒包括本發(fā)明的合成啟動(dòng)子(例如，SEQ ID NO3、SEQ ID NO8或者其具有啟動(dòng)子功能的變體)，該啟動(dòng)子可操作性連接至編碼包含與天蠶抗菌肽P1閱讀框一致地連接的鯰魚Ig Vh前導(dǎo)序列的多肽的核苷酸序列。在一個(gè)這樣的實(shí)施方案中，表達(dá)盒編碼SEQ IDNO28所示的多肽(鯰魚Ig Vh前導(dǎo)序列/天蠶抗菌肽P1)，并包含編碼該多肽的核苷酸序列，例如SEQ ID NO27所示的核苷酸序列。在其他實(shí)施方案中，天蠶抗菌肽P1或鯰魚Ig Vh前導(dǎo)序列/天蠶抗菌肽P1多肽的編碼序列可以在密碼子上有所改變，從而這種表達(dá)盒編碼天蠶抗菌肽P1多肽或鯰魚Ig Vh前導(dǎo)序列/天蠶抗菌肽P1融合多肽的生物學(xué)活性變體，其中生物學(xué)活性變體符合上面定義的功能和結(jié)構(gòu)的標(biāo)準(zhǔn)(即抗病原活性或與參照多肽至少70％的序列同一性)。當(dāng)構(gòu)建體編碼鯰魚IgVh前導(dǎo)序列/天蠶抗菌肽P1多肽時(shí)，它的表達(dá)和翻譯后加工導(dǎo)致產(chǎn)生成熟的天蠶抗菌肽P1或其生物學(xué)活性變異體。
總之，本發(fā)明的合成啟動(dòng)子可構(gòu)建在表達(dá)盒之中，以便以非組織特異性方式驅(qū)動(dòng)任何可操作性連接的目標(biāo)核苷酸序列的表達(dá)。此盒還可以含有至少一個(gè)額外的與轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控區(qū)域可操作性連接的目標(biāo)核苷酸序列，從而該額外序列也被導(dǎo)入到宿主生物的基因組中，例如一種魚的基因組中。其他目標(biāo)序列包括能夠方便轉(zhuǎn)基因生物體的篩選的選擇標(biāo)記，但不僅限于此。作為另一種選擇，該額外目標(biāo)核苷酸序列和相應(yīng)的調(diào)控區(qū)域可以提供在一個(gè)或多個(gè)額外的表達(dá)盒上。
待導(dǎo)入選定宿主生物(例如魚)中的目標(biāo)核苷酸序列可以含有一些能增加在特定細(xì)胞宿主中表達(dá)的修飾。這種修飾包括去除編碼假的聚腺苷酸化信號(hào)、外顯子-內(nèi)含子剪接位點(diǎn)信號(hào)、轉(zhuǎn)座子樣重復(fù)序列的序列，以及其他一些經(jīng)很好表征的可能對(duì)于基因表達(dá)有害的序列。另外，通過參考在宿主細(xì)胞中表達(dá)的已知基因而進(jìn)行計(jì)算，可以將序列的G-C含量調(diào)節(jié)至指定的細(xì)胞宿主的平均水平。在有可能的情況下，序列可以進(jìn)行修飾，以避免在二級(jí)mRNA結(jié)構(gòu)中產(chǎn)生可預(yù)知的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。
在表達(dá)盒的構(gòu)建過程中，可以對(duì)各種DNA片段進(jìn)行操縱，以便以正確的方向以及適當(dāng)時(shí)以正確的讀框提供DNA序列。為了達(dá)到這個(gè)目的，可以利用銜接子或接頭連接DNA片段，或者采用其它的操作來提供方便的限制酶切位點(diǎn)、去除多余的DNA、去除限制酶切位點(diǎn)等。為實(shí)現(xiàn)上述目的，可采用體外誘變，引物修補(bǔ)，限制性內(nèi)切酶酶切，退火，再置換(如轉(zhuǎn)換和顛換)。
這里公開的合成啟動(dòng)子可用于魚類遺傳工程，以表達(dá)任何可操作性連接的核苷酸序列，這些核苷酸序列所編碼的產(chǎn)物可以賦予想要的表型，包括用前述的天蠶抗菌肽編碼序列來獲得具有增強(qiáng)的抗病性表型。作為另一種選擇，獲得可被消費(fèi)者接受的抗病魚的這一同樣的目標(biāo)，可以通過可操作性連接天然魚類啟動(dòng)子序列與編碼前述天蠶抗菌肽多肽或天蠶抗菌肽融合多肽的核苷酸序列來達(dá)到。以這樣的方式，含有在魚類啟動(dòng)子調(diào)控下的天蠶抗菌肽編碼序列的表達(dá)盒可用于提高魚類如鯰魚的抗病能力，以及提高消費(fèi)者的接受度。
因此，在本發(fā)明的可選擇的實(shí)施方案中，采用天然魚類啟動(dòng)子或其生物學(xué)活性變體代替合成啟動(dòng)子，以在目標(biāo)魚類中表達(dá)天蠶抗菌肽多肽?！疤烊弧濒~類啟動(dòng)子是在魚類中以天然調(diào)控序列而存在的啟動(dòng)子序列。在這些實(shí)施方案中，將表達(dá)盒設(shè)計(jì)為含有天然魚類啟動(dòng)子，其與上述編碼目標(biāo)天蠶抗菌肽多肽(包括前述的天蠶抗菌肽多肽和鯰魚Ig前導(dǎo)序列-天蠶抗菌肽多肽)的核苷酸序列可操作性連接。
感興趣的天然魚類啟動(dòng)子包括、但不僅限于鯉魚β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子(如SEQ ID NO29中所示的啟動(dòng)子)、斑點(diǎn)叉尾鮰myostatin啟動(dòng)子(SEQ ID NO30)、斑點(diǎn)叉尾鮰α-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子(SEQ ID NO31)、斑點(diǎn)叉尾鮰肌酸激酶啟動(dòng)子(SEQ ID NO32)、鮭魚金屬硫蛋白啟動(dòng)子(SEQ ID NO33)、鮭魚組蛋白H3啟動(dòng)子(SEQ ID NO34)、斑點(diǎn)叉尾鮰I型角蛋白啟動(dòng)子和斑點(diǎn)叉尾鮰II型角蛋白啟動(dòng)子。
本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)意識(shí)到，在公開了本文所述的天然魚類啟動(dòng)子區(qū)的核苷酸序列后，分離和鑒定在此處鑒定的特殊啟動(dòng)子區(qū)域上游的5’非翻譯區(qū)之中的其他調(diào)控元件屬于現(xiàn)有技術(shù)。因此，當(dāng)表達(dá)盒包含此處公開的天然啟動(dòng)子區(qū)或其生物學(xué)活性變體時(shí)，該表達(dá)盒可以進(jìn)一步包含上游調(diào)控元件，這些上游調(diào)控元件使得能夠組成型表達(dá)與所公開的啟動(dòng)子序列之一可操作性連接的任何異源核苷酸序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員還會(huì)意識(shí)到，此處公開的區(qū)域、片段和完整的啟動(dòng)子可以單獨(dú)或聯(lián)合使用，以驅(qū)動(dòng)可操作性連接的天蠶抗菌肽編碼序列的表達(dá)。
天然魚類啟動(dòng)子序列的生物學(xué)活性變體也可用在本發(fā)明的表達(dá)盒中，以在魚類細(xì)胞或整條魚中驅(qū)動(dòng)可操作性連接的天蠶抗菌肽編碼序列的表達(dá)。這樣的變體包括這些天然魚類啟動(dòng)子的片段?！捌巍笔侵竼?dòng)子核苷酸序列的一部分。啟動(dòng)子核苷酸序列的片段可以仍然保留其調(diào)控活性。因此，例如，少于此處公開的整個(gè)天然啟動(dòng)子序列的序列可用于驅(qū)動(dòng)可操作性連接的目標(biāo)核苷酸序列，如編碼天蠶抗菌肽多肽的核苷酸序列的表達(dá)。確定這樣的片段是否降低表達(dá)水平或改變表達(dá)特性即組成型表達(dá)或誘導(dǎo)型表達(dá)在本領(lǐng)域的技術(shù)范圍之內(nèi)。
作為啟動(dòng)子核苷酸序列片段的核酸分子含有至少15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、325、350、375、400、425、450、500、550、600、650、700、800或900個(gè)核苷酸，或者是多達(dá)此處公開的全長(zhǎng)啟動(dòng)子核苷酸序列中存在的核苷酸數(shù)目(即對(duì)于SEQ ID NO29、30、31、32、33或34分別為1571、1586、1208、1799、272和470)。
保留其調(diào)控活性的啟動(dòng)子序列片段含有此處公開的具體啟動(dòng)子核苷酸序列的至少30、35、40個(gè)連續(xù)的核苷酸，優(yōu)選至少50個(gè)連續(xù)的核苷酸，更優(yōu)選至少75個(gè)連續(xù)的核苷酸，更加優(yōu)選至少100個(gè)連續(xù)的核苷酸。優(yōu)選的片段長(zhǎng)度取決于具體對(duì)象，也依特定啟動(dòng)子序列而變化。
這樣的片段的核苷酸序列通常含有該具體啟動(dòng)子序列的TATA識(shí)別序列。這樣的片段可以通過對(duì)此處公開的天然啟動(dòng)子核苷酸序列進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切來獲得；通過從啟動(dòng)子DNA序列的天然序列合成核苷酸序列來獲得；或通過使用PCR技術(shù)來獲得。具體參見Mullis等人，(1987)，Methods Enzymol.155335-350，和Erlich主編的PCRTechnology(Stockton Press，New York)(1989)。
這些天然魚類啟動(dòng)子的生物學(xué)活性變體還可以包括那些天然變體。先前鑒定的天然魚類啟動(dòng)子的天然變體可以通過使用眾所周知的分子生物學(xué)技術(shù)而鑒定，例如使用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和雜交技術(shù)。變體啟動(dòng)子序列還包括合成衍生的核苷酸序列，例如通過定點(diǎn)誘變獲得的序列。誘變和核苷酸序列改變方法在本領(lǐng)域中是眾所周知的。參見例如Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82488-492；Kunkel等人(1987)Methods in Enzymol.154367-382；U.S.PatentNo.4,873,192；Walker和Gaasta，eds.(1983)Techniques inMolecular Biology(MacMillan Publishing Company，New York)，以及其中所引用的其他參照文獻(xiàn)。
一般地，天然魚類啟動(dòng)子(例如SEQ ID NO29、30、31、32、33、34、35中所示的天然魚類啟動(dòng)子序列)的變體，與作為參考分子的天然魚類啟動(dòng)子具有至少大約70％，通常至少75％、80％、85％，優(yōu)選至少大約90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％，更優(yōu)選至少大約98％、99％或更高的序列同一性。核苷酸序列的同一性百分比可用GAP第10版(或更新版本)來確定，相關(guān)參數(shù)為上文中對(duì)于本發(fā)明的合成啟動(dòng)子而提及的默認(rèn)參數(shù)。對(duì)于核苷酸序列而言，默認(rèn)的缺口形成罰分為50，默認(rèn)的缺口延伸罰分為3。
生物學(xué)活性變體例如包括具有一個(gè)或多個(gè)核苷酸置換、缺失或插入的天然魚類啟動(dòng)子序列。這些變體啟動(dòng)子序列通常含有該具體天然魚類啟動(dòng)子序列的TATA識(shí)別序列。啟動(dòng)子活性可以通過使用上文中關(guān)于本發(fā)明的合成啟動(dòng)子而確定的技術(shù)來測(cè)量，包括監(jiān)測(cè)上述可操作性連接的報(bào)告基因的表達(dá)水平。
在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，表達(dá)盒含有天然魚類啟動(dòng)子(如SEQID NO29、30、31、32、33、34或35所示的啟動(dòng)子)，或其生物學(xué)活性變體，它們與選自下列的編碼天蠶抗菌肽多肽的核苷酸序列可操作性連接SEQ ID NO11(前天蠶抗菌肽原B)，SEQ ID NO16(天蠶抗菌肽原B)，SEQ ID NO19(成熟天蠶抗菌肽B)，SEQ ID NO22(鯰魚Ig前導(dǎo)序列-天蠶抗菌肽原B融合多肽)，SEQ ID NO24(鯰魚Ig前導(dǎo)序列-天蠶抗菌肽B融合多肽)，SEQ ID NO26(天蠶抗菌肽P1)，和SEQ ID NO28(鯰魚Ig前導(dǎo)序列-天蠶抗菌肽P1融合多肽)，或者符合前述功能和結(jié)構(gòu)標(biāo)準(zhǔn)的天蠶抗菌肽多肽生物學(xué)活性變體(即抗病原活性和與各自的參照序列有至少70％的序列同一性)。在這樣的實(shí)施方案中，表達(dá)盒可以包含SEQ ID NO10或SEQ ID NO12(編碼SEQ ID NO11)，SEQ ID NO15或SEQ ID NO17(編碼SEQ ID NO16)，SEQ ID NO18或SEQ ID NO20(編碼SEQ ID NO19)，SEQID NO21(編碼SEQ ID NO22)，SEQ ID NO23(編碼SEQ ID NO24)，SEQ ID NO25(編碼SEQ ID NO26)所示的序列，或者SEQ IDNO27(編碼SEQ ID NO28)所示的序列，作為可操作性連接的天蠶抗菌肽編碼序列。也可參見圖6和SEQ ID NO35中所示的構(gòu)建體。
對(duì)于所有包含上面公開的天然魚類啟動(dòng)子的實(shí)施方案，表達(dá)盒中可包含額外的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子元件，以提高目標(biāo)天蠶抗菌肽多肽的轉(zhuǎn)錄水平。這些元件可以是合成的，或來自魚類。這樣的元件包括摻入到此處公開的合成啟動(dòng)子的核心金魚最小啟動(dòng)子序列上游的額外啟動(dòng)子和增強(qiáng)子元件，但不僅限于此。
此處所述的表達(dá)盒可以構(gòu)建或者插入到任何合適的轉(zhuǎn)化載體中，以便隨后導(dǎo)入到目標(biāo)宿主魚中。合適的轉(zhuǎn)化載體的選擇取決于將轉(zhuǎn)化載體導(dǎo)入目標(biāo)宿主細(xì)胞的方法。對(duì)于轉(zhuǎn)化魚類細(xì)胞，可采用多種本領(lǐng)域已知的方法，包括轉(zhuǎn)座子載體(參見例如美國(guó)專利號(hào)5,719,055；在此引用其全文作為參考)。在一個(gè)實(shí)施方案中，將攜帶此處描述的表達(dá)盒的質(zhì)粒載體在細(xì)菌中生長(zhǎng)至高拷貝數(shù)。對(duì)這些載體進(jìn)行純化，線性化，并注入魚卵中。將這些魚卵用合適水產(chǎn)養(yǎng)殖的方法培養(yǎng)成魚苗，將高水平表達(dá)導(dǎo)入的目標(biāo)核苷酸序列的成熟魚交配以穩(wěn)定這些導(dǎo)入序列的表達(dá)。
導(dǎo)入目標(biāo)核苷酸序列和其可操作性連接的調(diào)控元件以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因魚的方法是本領(lǐng)域熟知的。這些方法包括將線性化的重組構(gòu)建體(例如此處描述的表達(dá)盒)顯微注射入受精卵中、顯微注射入卵母細(xì)胞中和電穿孔，但不限于此。參見例如Inoue(1992)Mol.Mar.Biol.Biotechnol.1(4-5)266-270，和Dunham，R.A.等人，“Enhanced bacterialdisease resistance of transgenic channel catfish，Ictlauruspunctatus，possessing cecropin genes”.Marine Biotechnology4338-344(2002)。
可將含有與目標(biāo)核苷酸序列可操作性連接的本文所述合成啟動(dòng)子的表達(dá)盒導(dǎo)入到任何一種目標(biāo)魚類中，以獲得有用的蛋白在所得轉(zhuǎn)基因魚中的表達(dá)。當(dāng)目標(biāo)核苷酸序列編碼抗病原性多肽、如此處描述的天蠶抗菌肽多肽時(shí)，編碼產(chǎn)物的表達(dá)可以在如前述的合成啟動(dòng)子或天然魚類啟動(dòng)子的調(diào)控下。此種表達(dá)盒在導(dǎo)入任何一種目標(biāo)魚類中時(shí)具有更高市場(chǎng)接受度這一優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)檎{(diào)控元件是源自魚類的。
目標(biāo)魚類包括鯉魚、koi，金魚、鮭魚，羅非魚和鯰魚科成員(斑點(diǎn)叉尾鮰、藍(lán)叉尾鮰及斑點(diǎn)叉尾鮰-藍(lán)叉尾鮰雜交品種)，但不僅限于此。鯰魚可以為下列屬和種Ictalurus punctatus，Ictalurusfurcatus，Ictaluru clarias，Ictalurus silurus，Ictaluruspangasius，Ictalurus rafinesque，Ictalurus，balsanus，Ictalurusbrunneus，Ictalurus catus，Ictalurus dugesi，Ictalurus lupus，Ictalurus melas，Ictalurus meridionalis，Ictalurus natalis，Ictalurus natalis erebennus，Ictalurus nebulosus，Pimelodusnebulosus，Ameiurusus nebulos，Ictalurus nebulosus catulus，Ictalurus nebulosus marmoratus，Ictalurus platycephalus，Ictalurus pricei，Ictalurus punctatu，Ameurus punctatus，Ictalurus robustus，Ictalurus simpsoni，Pimelodus argentinus，Pimelodus argystus，Pimelodus caerulescens，Pimeloduscaudafurcatus，Pimelodus furcifer，Pimelodus gracilis，Pimelodus graciosuss，Pimelodus hammondi，Pimelodus houghi，Pimelodus maculates，Pimelodus megalops，Pimelodus nolatus，Pimelodus pallidus，Pimelodus vulpes，Synechoglanis beadleipunctatus，Silurus punctatus，Ictalurus serracanthus，和這些魚的雜交后代。
通過聯(lián)合本公開內(nèi)容的教導(dǎo)和各種本領(lǐng)域已知的技術(shù)和手段，可以產(chǎn)生在此處描述的調(diào)控元件的控制之下表達(dá)基因的、經(jīng)遺傳修飾的魚細(xì)胞和整條魚。在大多數(shù)情況下，對(duì)于整個(gè)過程的每個(gè)階段都存在可供選擇的辦法。辦法的選擇取決于變化的因素，例如選用于克隆及導(dǎo)入重組DNA分子的質(zhì)粒載體系統(tǒng)，待修飾的魚種類，以及所使用的具體的基因、啟動(dòng)子元件和上游元件。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠選擇和使用合適的可選技術(shù)方案來達(dá)成預(yù)期的效果。本領(lǐng)域中還已知，許多魚種類是可轉(zhuǎn)化的，因而可獲得含有和表達(dá)在本發(fā)明合成啟動(dòng)子分子的調(diào)控之下的所需基因的整條魚。截短的啟動(dòng)子的選擇和可操作性連接的基因的選擇是其他的參數(shù)，它們可以進(jìn)行優(yōu)化以在宿主魚內(nèi)獲得所需的表達(dá)模式，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并在此處有教導(dǎo)。
可以理解，在摻入此處所描述的表達(dá)盒中的核苷酸序列內(nèi)可能存在微小的序列變化?？梢詫?shí)現(xiàn)微小變化，而對(duì)于啟動(dòng)子序列的功能或由可操作性連接的核苷酸序列所編碼的蛋白質(zhì)的功能沒有負(fù)面影響。微小變化可能發(fā)生在啟動(dòng)子核苷酸序列中，發(fā)生在可操作性連接的核苷酸序列中，或同時(shí)發(fā)生在啟動(dòng)子核苷酸序列和可操作性連接的核苷酸序列中。當(dāng)可操作性連接的核苷酸序列為目標(biāo)蛋白的編碼序列時(shí)，由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性而在編碼序列中存在的微小變化會(huì)導(dǎo)致表達(dá)出同樣的蛋白。作為另一種選擇，發(fā)生在編碼序列中的微小變化也可能導(dǎo)致表達(dá)出與參照分子相比具有置換、插入和/或缺失的蛋白質(zhì)。“微小變化”是指變體序列與參照分子的序列同一性至少為70％、75％、80％、85％，優(yōu)選至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％，或者甚至至少99％，其中序列同一性是通過如前所述的測(cè)定方法測(cè)定的。
“參照分子”是指用作序列比較基礎(chǔ)的確定的序列。參照序列可以是特定序列的一部分或全部；例如，全長(zhǎng)合成或天然啟動(dòng)子序列的片段，或者全長(zhǎng)合成或天然啟動(dòng)子；或者全長(zhǎng)編碼序列的片段，或完整的編碼序列。
當(dāng)這些微小變化發(fā)生在此處公開的合成啟動(dòng)子中時(shí)，它們可通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)測(cè)定，這些方法將使得本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠操作和使用對(duì)于驅(qū)動(dòng)可操作性連接的核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄起始所必需的啟動(dòng)子元件功能單元。
因而，只要改變的啟動(dòng)子序列能夠起始可操作性連接的核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄，本發(fā)明表達(dá)盒中所使用的合成啟動(dòng)子序列或天然魚類啟動(dòng)子可以含有相對(duì)于參照分子的微小變化。同樣地，目標(biāo)蛋白(如天蠶抗菌肽多肽)的編碼核苷酸序列可以是天然編碼序列，也可以是由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性而有所不同的序列，這些不同的序列可以是天然的或是經(jīng)人為干涉而產(chǎn)生的(例如，用定點(diǎn)誘變)。此外，用此處公開的表達(dá)盒表達(dá)的天蠶抗菌肽多肽包括成熟天蠶抗菌肽多肽，以及其前天蠶抗菌肽、天蠶抗菌肽原和前天蠶抗菌肽原的形式，以及上述多肽的生物學(xué)活性變體。這樣的蛋白質(zhì)變體會(huì)具有所希望的抗病原性防御蛋白質(zhì)活性。顯然，發(fā)生在編碼變體蛋白的DNA序列中的突變一定不能將序列置于閱讀框之外，優(yōu)選地不會(huì)形成能夠產(chǎn)生二級(jí)mRNA結(jié)構(gòu)的互補(bǔ)區(qū)域。
提供以下實(shí)施例以用于說明，但不是加以限制。
實(shí)驗(yàn)在商業(yè)魚市場(chǎng)上存在兩個(gè)重要的問題。第一個(gè)問題是魚病每年給養(yǎng)魚場(chǎng)造成了數(shù)億美元的損失。為了解決此問題，研究者嘗試培育具有商業(yè)上所希望的表型的轉(zhuǎn)基因魚。然而，培育轉(zhuǎn)基因魚本身帶來了第二個(gè)問題，因?yàn)檗D(zhuǎn)基因通常都是在病毒啟動(dòng)子下進(jìn)行表達(dá)的。消費(fèi)者很可能會(huì)認(rèn)為帶有病毒“片段”的鯰魚是不健康的或不安全的，因此不太可能購(gòu)買。所以必須找到解決辦法，以處理制備既具有所希望的表型又能被消費(fèi)者接受的轉(zhuǎn)基因魚這一困境。
本發(fā)明通過公開具有在轉(zhuǎn)基因中不使用病毒核苷酸序列而在魚中進(jìn)行轉(zhuǎn)基因表達(dá)的優(yōu)點(diǎn)的方法和組合物而解決了此困境。因此，此處描述的轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)減少了消費(fèi)者對(duì)于使用此處公開的組合物和方法培育的魚的可能抵觸性。在此發(fā)明中描述了兩種可選擇的用來培育在商業(yè)上可接受的魚的方法。第一，通過使用在表達(dá)盒中與目標(biāo)核苷酸序列可操作性連接的本發(fā)明所述合成啟動(dòng)子，可以賦予魚以任何有價(jià)值的表型。因?yàn)檫@些合成啟動(dòng)子僅含有來源于魚的元件，所以這些魚應(yīng)能被消費(fèi)者所接受。第二，鯰魚的抗病性可以通過將天然魚啟動(dòng)子放置在編碼天蠶抗菌肽蛋白和其生物學(xué)活性變體的核苷酸序列上游而獲得。因?yàn)閱?dòng)子(或啟動(dòng)子的功能性變體)完全來源于魚，所以這些鯰魚應(yīng)能被消費(fèi)者所接受。
已預(yù)先合成了成熟天蠶抗菌肽B(SEQ ID NO18)和成熟天蠶抗菌肽P1(SEQ ID NO25)的肽，經(jīng)高壓液相色譜進(jìn)行純化，并對(duì)它們的體外活性進(jìn)行測(cè)試。測(cè)試結(jié)果表明，這些多肽具有預(yù)期的針對(duì)鯰魚愛德華氏細(xì)菌和殺鮭氣單胞菌(Aeromonas salmonicida)的殺菌活性，這些細(xì)菌是在斑點(diǎn)叉尾鮰中引起疾病的原因。見Kjull等人(1999)J.FishDis.22387-394。
天蠶抗菌肽B和天蠶抗菌肽P1對(duì)鯰魚細(xì)胞的毒性在體外通過將多肽對(duì)克隆的鯰魚B類淋巴母細(xì)胞細(xì)胞系1B10進(jìn)行滴定來進(jìn)行測(cè)試(Miller等人(1994)J.Immunol.1522180-2189)。當(dāng)在3μg/ml直至100μg/ml的天蠶抗菌肽濃度下培養(yǎng)5天時(shí)，這2種天蠶抗菌肽對(duì)于該細(xì)胞系都未表現(xiàn)出任何明顯的毒性效應(yīng)(數(shù)據(jù)未顯示)。由于能夠產(chǎn)生具有表達(dá)這些肽的構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因鯰魚，這也證明了天蠶抗菌肽B和天蠶抗菌肽P1對(duì)于鯰魚沒有毒性(見下)。
實(shí)施例1用于在轉(zhuǎn)基因鯰魚中提高抗病能力的含有CMV的構(gòu)建體構(gòu)建轉(zhuǎn)基因鯰魚，以證明天蠶抗菌肽表達(dá)向鯰魚賦予了抗病性。培育了2個(gè)品系的轉(zhuǎn)基因魚。一個(gè)品系的魚經(jīng)工程改造成表達(dá)SEQ IDNO19所示的成熟天蠶抗菌肽B蛋白，另一品系的鯰魚經(jīng)工程改造成表達(dá)SEQ ID NO11所示的前天蠶抗菌肽原B。
首先，設(shè)計(jì)了一系列的構(gòu)建體，這些構(gòu)建體能夠在魚細(xì)胞中在巨細(xì)胞病毒(CMV)增強(qiáng)子的調(diào)控之下表達(dá)成熟天蠶抗菌肽B(SEQ ID NO19)、前天蠶抗菌肽原B(SEQ ID NO11)或成熟天蠶抗菌肽P1(SEQ ID NO26)。這樣，巨細(xì)胞病毒(CMV)增強(qiáng)子和編碼目標(biāo)天蠶抗菌肽的核苷酸序列可操作性連接。之所以選擇CMV增強(qiáng)子是因?yàn)槠淠軌虼龠M(jìn)轉(zhuǎn)基因在魚類細(xì)胞中強(qiáng)且非組織特異性的表達(dá)。在此增強(qiáng)子調(diào)控下的構(gòu)建體在培養(yǎng)的鯰魚T細(xì)胞和B細(xì)胞系中良好地表達(dá)(Ross等人(1998)J.Immunol.1603874-3882)。這些構(gòu)建體和在下面其他實(shí)施例中描述的構(gòu)建體的一般設(shè)計(jì)流程見圖1。
對(duì)于天蠶抗菌肽B構(gòu)建體，有2點(diǎn)是必需的，首先，要將表達(dá)的天蠶抗菌肽導(dǎo)向分泌途徑，其次，誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中天蠶抗菌肽的N-末端加工。已知天蠶抗菌肽在天然昆蟲細(xì)胞中經(jīng)過兩階段加工。首先天蠶抗菌肽以前天蠶抗菌肽原的形式被導(dǎo)向到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，在切割掉前導(dǎo)肽而產(chǎn)生天蠶抗菌肽原后，由二肽基肽酶去除4個(gè)氨基末端殘基，產(chǎn)生成熟的天蠶抗菌肽。
將第一個(gè)構(gòu)建體(CMV∷前天蠶抗菌肽原B)設(shè)計(jì)為表達(dá)SEQ IDNO11所示的天然前天蠶抗菌肽原B多肽(由SEQ ID NO12編碼)。將第二個(gè)構(gòu)建體(CMV∷鯰魚Ig Vh前導(dǎo)序列/天蠶抗菌肽原B)設(shè)計(jì)為表達(dá)SEQ ID NO22所示的鯰魚免疫球蛋白重鏈可變區(qū)前導(dǎo)序列(Ig Vh)和天蠶抗菌肽原B的融合多肽(由SEQ ID NO21編碼)。將第三個(gè)構(gòu)建體(CMV∷鯰魚Ig Vh前導(dǎo)序列/任意序列/天蠶抗菌肽B)設(shè)計(jì)為表達(dá)SEQ ID NO24所示的鯰魚Ig Vh前導(dǎo)序列和成熟天蠶抗菌肽B的融合多肽，該融合多肽具有間插入其間的由克隆策略決定的任意氨基酸序列(由SEQ ID NO23編碼)。將第四個(gè)構(gòu)建體(CMV∷鯰魚Ig Vh前導(dǎo)序列/天蠶抗菌肽P1)設(shè)計(jì)為表達(dá)SEQ ID NO28所示的鯰魚Ig Vh前導(dǎo)序列和天蠶抗菌肽P1的融合多肽(由SEQ ID NO27編碼)。將每個(gè)構(gòu)建體克隆在5′HindIII和3′Xba1限制性位點(diǎn)之間。構(gòu)建體的細(xì)節(jié)以及在構(gòu)建體中出現(xiàn)的天蠶抗菌肽序列見圖2和3。由這些構(gòu)建體中的每一個(gè)所編碼的天蠶抗菌肽產(chǎn)物的表達(dá)都處于CMV增強(qiáng)子的控制下。包含這些構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因魚能夠免于病原體的攻擊(見下面實(shí)施例4)。
實(shí)施例2驅(qū)動(dòng)目標(biāo)基因產(chǎn)物表達(dá)的合成啟動(dòng)子的設(shè)計(jì)盡管實(shí)施例1中的構(gòu)建體能夠保護(hù)轉(zhuǎn)基因鯰魚不受病原體的攻擊，但CMV調(diào)控元件來源于一種人類病毒，由于消費(fèi)者購(gòu)買的抵觸性而對(duì)于農(nóng)業(yè)使用來說是不能接受的。因此，我們從魚的調(diào)控序列中設(shè)計(jì)完全合成的啟動(dòng)子。這個(gè)合成啟動(dòng)子包含了5′端與上游元件連接的、含有TATA盒基元的金魚最小啟動(dòng)子(SEQ ID NO1 Wilson等人(1991)，Mol.Immunol.28449)。該上游元件包含3個(gè)魚類Sp1結(jié)合基元(CGGGGCGGGG；SEQ ID NO2；見Baudler等人(1997)Biol.Chem.272131-137)以及新型間插序列。該最小啟動(dòng)子含有對(duì)于可操作性連接的編碼序列的表達(dá)所必需的核苷酸序列，包括TATA盒和轉(zhuǎn)錄起始序列。將該合成啟動(dòng)子序列置于前天蠶抗菌肽原B編碼序列(SEQ ID NO12所示)的5′端，以便驅(qū)動(dòng)該蛋白在魚細(xì)胞中的非組織特異性的組成型表達(dá)。與前天蠶抗菌肽原B編碼序列可操作性連接的合成啟動(dòng)子顯示在SEQ ID NO13所示的序列中。也可見圖4。
然后將上述含有與前天蠶抗菌肽原B編碼序列可操作性連接的該合成啟動(dòng)子的構(gòu)建體克隆進(jìn)質(zhì)粒(pBS，Stratagene，11011N.TorreyPines Road，La Jolla，CA92037)。位于pBS的多接頭位點(diǎn)兩側(cè)的限制性位點(diǎn)(即Not1和Kpn1)使得能夠在使用編碼序列來產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因魚之前去除載體序列。因此，該表達(dá)盒含有以高水平和以非組織特異性方式驅(qū)動(dòng)基因表達(dá)的合成調(diào)控元件。通過設(shè)計(jì)具有與編碼特定目標(biāo)基因產(chǎn)物的序列可操作性連接的合成啟動(dòng)子序列的構(gòu)建體，該合成啟動(dòng)子還可用來驅(qū)動(dòng)任何目標(biāo)基因產(chǎn)物的高水平、非組織特異性表達(dá)。
實(shí)施例3另一驅(qū)動(dòng)目標(biāo)基因產(chǎn)物表達(dá)的合成啟動(dòng)子的設(shè)計(jì)另一個(gè)與編碼前天蠶抗菌肽原B的核苷酸序列可操作性連接的人工啟動(dòng)子的序列和結(jié)構(gòu)見圖5。用于設(shè)計(jì)此啟動(dòng)子的調(diào)控元件來自MT基因(Devlin等人(1994)Nature 371209-210)或FV-1和FV-2肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子(Liu等人(1990)Biotechnology S1268-1272)。FV-2是一種強(qiáng)的啟動(dòng)子，而FV-1則是一種中等強(qiáng)的啟動(dòng)子(Liu等人(1990)，如上)。
將根據(jù)它們驅(qū)動(dòng)高水平和非組織特異性基因表達(dá)的能力而挑選出來的一系列轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合基元放置在包含TATA盒的金魚最小啟動(dòng)子的上游，從而形成了另一人工啟動(dòng)子。具體地，表達(dá)盒包括包含含有TATA框基元(SEQ ID NO1；Wilson等人(1991)，Mol.Immunol.28449)的金魚最小啟動(dòng)子的合成啟動(dòng)子，該合成啟動(dòng)子與上游元件連接，此上游元件包含下列以5′-3′方向與間插性接頭序列裝配在一起的元件魚類SP1結(jié)合基元(CGGGGCGGGG；SEQ ID NO2)，可操作性連接至魚類C/EBPα基元(ATAATGTTTCATCACACTT；SEQ ID NO4，見例如Chan等人(1997)Eur J.Biochem.24744-51)，可操作性連接至魚類Oct基元(ATGTAAAT；SEQ ID NO5；見例如Magor等人(1997)Immunogenetics46192-198)，可操作性連接至魚類NF-κB基元(GGGACGTCCC；SEQ IDNO6)，可操作性連接至魚類AP-1結(jié)合基元(ATGACTCAG；SEQ ID NO7)。該啟動(dòng)子(SEQ ID NO8所示)和編碼前天蠶抗菌肽原B的核苷酸序列(例如見SEQ ID NO12)5′端可操作性連接。該啟動(dòng)子和編碼序列還顯示于圖5中(也可見SEQ ID NO14)。
然后，如前所述將具有與前天蠶抗菌肽原編碼序列可操作性連接的此可選合成啟動(dòng)子的構(gòu)建體(見SEQ ID NO14)克隆到質(zhì)粒(pBS，Stratagene，11011N.Torrey Pines Road，La Jolla，CA92037)中。位于pBS的多接頭位點(diǎn)兩側(cè)的限制性位點(diǎn)(即Not1和Kpn1)使得能夠在使用編碼序列來產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因魚之前去除載體序列。因此，該表達(dá)盒含有以高水平和以非組織特異性方式驅(qū)動(dòng)基因表達(dá)的合成調(diào)控元件。通過設(shè)計(jì)具有與編碼特定目標(biāo)基因產(chǎn)物的序列可操作性連接的合成啟動(dòng)子序列的構(gòu)建體，該合成啟動(dòng)子還可用來驅(qū)動(dòng)任何目標(biāo)基因產(chǎn)物的高水平、非組織特異性表達(dá)。
實(shí)施例4具有穩(wěn)定整合的天蠶抗菌肽轉(zhuǎn)基因的鯰魚對(duì)疾病攻擊的抗性將實(shí)施例1的構(gòu)建體導(dǎo)入處于單細(xì)胞階段的鯰魚受精卵中，培育所得到的魚苗，并篩選含有轉(zhuǎn)基因的魚苗。含有CMV∷前天蠶抗菌肽原B構(gòu)建體的親本系(P1)轉(zhuǎn)基因鯰魚和含有CMV∷天蠶抗菌肽B構(gòu)建體的P1轉(zhuǎn)基因鯰魚產(chǎn)卵，從而將各自的轉(zhuǎn)基因通過交配繁殖傳遞給子代(F1)。
特別指出的是，在水溫為26～27℃的活水養(yǎng)魚池中，斑點(diǎn)叉尾鮰通過使用鯉魚垂體提取物(CPE)的誘導(dǎo)而進(jìn)行人工產(chǎn)卵。雌魚注射2mg/kg體重的CPE，并在12小時(shí)后給予8mg/kg的解決劑量，以誘導(dǎo)排卵。把卵從產(chǎn)卵的雌魚上剝離，并放入培養(yǎng)皿。加入魚精液和水，并輕微攪拌，以完成受精和分散的過程。
用Baekon 2000電穿孔裝置進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移。300個(gè)斑點(diǎn)叉尾鮰的魚卵在50mm的培養(yǎng)皿中同時(shí)一次處理，培養(yǎng)皿中有1.5ml緩沖液(TE，0.88mM NaCI)和50μg/ml包含天蠶抗菌肽序列的質(zhì)粒DNA。使用非接觸型的電穿孔，其電穿孔參數(shù)設(shè)置如下6kV，108猝發(fā)，4個(gè)循環(huán)，27個(gè)脈沖，及160微秒/脈沖。
這些P1魚被放養(yǎng)在帶有經(jīng)過USDA批準(zhǔn)的轉(zhuǎn)基因魚限制裝置的泥池中。每一對(duì)假定的轉(zhuǎn)基因魚在養(yǎng)魚池里產(chǎn)卵。將單獨(dú)的魚卵團(tuán)塊在孵化槽里孵育，通過PCR點(diǎn)印跡分析進(jìn)行篩選(見Dunham等人(1992)“Transfer，expression and inheritance of salmonid growthhormone genes in channel catfish，Ictalurus punctatus，andeffectson performance traits，”Mol.Mar.Biol.and Biotech.1380-389)，以確保天蠶抗菌肽基因的遺傳。孵化陽性卵，魚苗首先養(yǎng)在孵化槽中，然后放養(yǎng)在0.04公頃的帶限制裝置的泥池中。隨意飼喂魚，捕獲，并在6個(gè)月魚齡時(shí)進(jìn)行病原體攻擊。
疾病攻擊在培養(yǎng)箱中，將鯰魚愛德華氏菌在BHI培養(yǎng)基中于26℃生長(zhǎng)24小時(shí)。魚被統(tǒng)一放置在容積為500升的養(yǎng)魚池中進(jìn)行病原體攻擊。池中灌入濃度為108細(xì)胞/ml的鯰魚愛德華氏菌，在溫度25℃下將魚靜止地浸放1小時(shí)。此后，重新恢復(fù)水(25℃)流。監(jiān)測(cè)魚受鯰魚愛德華氏菌感染的臨床癥狀及死亡率計(jì)14天。對(duì)收集的死魚進(jìn)行尸體解剖以確定死因和感染，并嘗試從這些魚中重新分離出鯰魚愛德華氏菌。通過自然家畜流行病進(jìn)行Columnaris攻擊。在從泥池中收獲之前暴發(fā)了嚴(yán)重的Columnaris。收集活魚和死魚以進(jìn)行DNA分析(見Dunham等人(1992)，如上)和尸體解剖。尸體解剖證實(shí)了死亡和感染來自于柱狀黃桿菌(Flavobacterium columnare)。
在第一次病原體攻擊中，具有CMV∷天蠶抗菌肽B構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因鯰魚和非轉(zhuǎn)基因完全同胞在水池中都被鯰魚愛德華氏菌所攻擊。雖然轉(zhuǎn)基因魚和非轉(zhuǎn)基因魚都會(huì)有死亡，但轉(zhuǎn)基因個(gè)體的存活率是對(duì)照的2倍。(見表1)在第二次病原體攻擊中，具有CMV∷前天蠶抗菌肽原B構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因鯰魚和非轉(zhuǎn)基因完全同胞對(duì)照都被柱狀黃桿菌所攻擊。對(duì)照的死亡率為約63％，而轉(zhuǎn)基因魚的死亡率為0％(見表1)。因此，轉(zhuǎn)基因賦予轉(zhuǎn)基因魚以完全的抗性。所有試驗(yàn)中，未觀察到對(duì)生長(zhǎng)的多效應(yīng)。
表1在家畜流行病和人工水池攻擊中，含有編碼天蠶抗菌肽的構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因斑點(diǎn)叉尾鯰魚對(duì)于細(xì)菌性疾病有增強(qiáng)的抗性
以上數(shù)據(jù)表明，具有天蠶抗菌肽構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因魚對(duì)于非自然及自然的病原細(xì)菌攻擊具有增強(qiáng)的抵抗力。然而，具有病毒DNA序列的轉(zhuǎn)基因魚在商業(yè)上不被接受，因此必需去除CMV啟動(dòng)子并換用合成啟動(dòng)子或者“全魚啟動(dòng)子”，如下面的實(shí)施例5所描述的。
實(shí)施例5具有穩(wěn)定整合的在合成啟動(dòng)子調(diào)控之下的天蠶抗菌肽轉(zhuǎn)基因的鯰魚對(duì)疾病攻擊的抗性如以上所討論的，與天蠶抗菌肽基因可操作性連接的合成魚類啟動(dòng)子可用于形成既具有抗病性又在商業(yè)上可被消費(fèi)者接受的轉(zhuǎn)基因魚。為測(cè)定SEQ ID NO3和8的合成啟動(dòng)子的有效性，將這些合成啟動(dòng)子序列在表達(dá)盒中與前天蠶抗菌肽原編碼序列的5′端可操作性連接，詳見以上實(shí)施例2和3。這樣，構(gòu)建了包含SEQ ID NO13(以SEQ ID NO3的合成啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)前天蠶抗菌肽原的表達(dá))或SEQ ID NO14(以SEQ IDNO8的合成啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)前天蠶抗菌肽原的表達(dá))的表達(dá)盒。
利用實(shí)施例4所述的方法，用包含SEQ ID NO13的表達(dá)盒轉(zhuǎn)化鯰魚卵。使轉(zhuǎn)基因魚苗在適宜的條件下生長(zhǎng)成熟。將P1系交配繁殖，獲得F1系。
在第二組試驗(yàn)中，用包含SEQ ID NO14的表達(dá)盒轉(zhuǎn)化鯰魚卵。使轉(zhuǎn)基因魚苗在適宜的條件下生長(zhǎng)成熟。將P1系交配繁殖，獲得F1系。
使用實(shí)施例4所述的相同方法，測(cè)定F1代鯰魚對(duì)目標(biāo)病原體的抗病性。與實(shí)施例4中的轉(zhuǎn)基因鯰魚不同，這些鯰魚沒有轉(zhuǎn)入任何病毒DNA。因此，這些鯰魚在商業(yè)上是可接受的，而且還不受疾病侵襲。實(shí)施例6具有穩(wěn)定整合的在天然“全魚啟動(dòng)子”調(diào)控之下的天蠶抗菌肽轉(zhuǎn)基因的鯰魚對(duì)疾病攻擊的抗性如以上所討論的，與編碼天蠶抗菌肽的序列可操作性連接的天然魚類啟動(dòng)子也可用于形成既具有抗病性又在商業(yè)上可被消費(fèi)者接受的轉(zhuǎn)基因鯰魚。使用實(shí)施例1所述的方法，構(gòu)建表達(dá)盒，使之包含SEQ IDNO29、30、31、32、33、34或35的啟動(dòng)子序列，該啟動(dòng)子序列與編碼天蠶抗菌肽的核苷酸序列的5′端可操作性連接，所述核苷酸序列例如是SEQ ID NO10或12所示的編碼序列(編碼前天蠶抗菌肽原B，SEQ IDNO11)，SEQ ID NO15或17所示的編碼序列(編碼天蠶抗菌肽原B，SEQ ID NO16)，SEQ ID NO18或20所示的編碼序列(編碼成熟天蠶抗菌肽B，SEQ ID NO19)，或者SEQ ID NO25所示的編碼序列(編碼成熟天蠶抗菌肽P1，SEQ ID NO26).另一種可選擇的方式是，構(gòu)建表達(dá)盒，使之包含SEQ ID NO29、30、31、32、33、34或35的魚類啟動(dòng)子序列，該啟動(dòng)子序列與鯰魚Ig Vh前導(dǎo)序列-天蠶抗菌肽原融合多肽的編碼序列5′端可操作性連接，所述編碼序列例如是SEQ ID NO21所示的編碼序列(編碼鯰魚Ig Vh前導(dǎo)序列-天蠶抗菌肽原B融合多肽，SEQ ID NO22)，或者與鯰魚Ig Vh前導(dǎo)序列-天蠶抗菌肽融合多肽的編碼序列5′端可操作性連接，所述編碼序列例如是SEQ IDNO23所示的編碼序列(編碼鯰魚Ig Vh前導(dǎo)序列-天蠶抗菌肽B融合多肽，SEQ ID NO24)或SEQ ID NO27所示的編碼序列(編碼鯰魚Ig Vh前導(dǎo)序列-天蠶抗菌肽P1融合多肽，SEQ ID NO28)。參見例如圖6所示的構(gòu)建體(SEQ ID NO35)，其中SEQ ID NO11的前天蠶抗菌肽原B多肽的表達(dá)由鯉魚β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子(SEQ ID NO29)調(diào)控。
采用實(shí)施例4所述的方法，用本實(shí)施例中所述的構(gòu)建體之一轉(zhuǎn)染鯰魚卵。使轉(zhuǎn)基因魚苗在適宜的條件下生長(zhǎng)成熟。將P1系進(jìn)行雜交繁殖，以產(chǎn)生F1系。使用實(shí)施例4所述的相同方法，測(cè)定F1代鯰魚對(duì)目標(biāo)病原體的抗病性。由于不含病毒DNA，使用這些構(gòu)建體制作的鯰魚在商業(yè)上也是可接受的。
本說明書中所提及的所有出版物和專利申請(qǐng)表明了本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員的技術(shù)水平。此處以同樣的程度引入所有的出版物和專利申請(qǐng)作為參考，這些出版物或?qū)＠暾?qǐng)是具體并單獨(dú)地全文引入本文作為參考的。
雖然為了能夠清楚地理解，已經(jīng)通過圖解和舉例的方式對(duì)前面所述的發(fā)明進(jìn)行了較為詳盡的闡述，然而，顯然可以在本發(fā)明的范圍內(nèi)作出某些改變和修飾。
序列表<110>Dunham，Rex A.
Liu，ZhanjiangWarr ，Gregory W.
<120>增強(qiáng)魚類抗病性的組合物和方法<130>035721/271295<150>60/424，329<151>2002-11-06<160>35<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>82<212>DNA<213>Carassius auratus<220>
<221>misc_feature<222>(0)...(0)<223>金魚最小啟動(dòng)子<400>1actgtgttat aaactggttc ctcagtcagt gtttgtgttc tgctgctgtg cagtttcttt 60tcctttgact gtttttggat cc82<210>2<211>10<212>DNA<213>魚<220>
<221>misc_feature<222>(0)...(0)<223>魚Sp1結(jié)合基元<400>2cggggcgggg 10<210>3<211>161<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成啟動(dòng)子<400>3gaattcctgc agaacggggc ggggatctcg agttcggggc ggggataggc gtttcggggc 60ggggaactgc aggactgtgt tataaactgg ttcctcagtc agtgtttgtg ttctgctgct 120gtgcagtttc ttttcctttg actgtttttg gatccggcac c 161<210>4<211>19<212>DNA<213>魚<220>
<221>misc_feature<222>(0)...(0)
<223>魚C/EBPα基元<400>4ataatgtttc atcacactt 19<210>5<211>8<212>DNA<213>魚<220>
<221>misc_feature<222>(0)...(0)<223>Oct基元<400>5atgtaaat 8<210>6<211>10<212>DNA<213>魚<220>
<221>misc_feature<222>(0)...(0)<223>NF-κB基元<400>6gggacgtccc10<210>7<211>9<212>DNA<213>魚<220>
<221>misc_feature<222>(0)...(0)<223>AP-1結(jié)合基元<400>7atgactcag 9<210>8<211>207<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成啟動(dòng)子<400>8gaattcctgc agaacggggc ggggatctcg agttataatg tttcatcaca cttatacgcg 60tttatgtaaa tatctcgagt tgggacgtcc catctcgagt tatgactcag aactgcagga 120ctgtgttata aactggttcc tcagtcagtg tttgtgttct gctgctgtgc agtttctttt 180cctttgactg tttttggatc cggcacc 207<210>9<211>222<212>DNA<213>Bos taurus<220>
<221>misc_feature<222>(0)...(0)
<223>牛生長(zhǎng)激素3’非翻譯區(qū)<400>9agggccctat tctatagtgt cacctaaatg ctagagctcg ctgatcagcc tcgactgtgc 60cttctagttg ccagccatct gttgtttgcc cctcccccgt gccttccttg accctggaag 12Ogtgccactcc cactgtcctt tcctaataaa atgaggaaat tgcatcgcat tgtctgagta 180ggtgtcattc tattctgggg gactagttct agagcggccg cc222<210>10<211>189<212>DNA<213>Hyalophora cecropia<220>
<221>misc_feature<222>(0)...(0)<223>天蠶抗菌肽81前體<400>10atgaaittct caaggatatt tttcttcgtg ttcgctttgg ttctggcttt gtcaacagtt 60tcggctgcac cggagccgaa atggaaagtc ttcaagaaaa ttgaaaaaat gggtcgcaac 120attcgaaacg gtattgtcaa ggctggacca gcgatcgcgg ttttaggcga agccaaagcg 180ctaggataa 189<210)11<211>62<212>PRT<213>Hyalophora cecropia<400>11Met Asn Phe Ser Arg Ile phe phe Phe Val Phe Ala Leu Val Leu Ala1 5 10 15Leu Ser Thr Val Ser Ala Ala Pro Glu Pro Lys Trp Lys Val Phe Lys20 25 30Lys Ile Glu Lys Met Gly Arg Asn Ile Arg Asn Gly Ile Val Lys Ala35 40 45Gly pro Ala Ile Ala Val Leu Gly Glu Ala Lys Ala Leu Gly50 55 60<210>12<211>186<212>DNA<213>Hyalophora cecropia<220>
<221>misc_feature<222>(0)...(0)<223>前天蠶抗菌肽原DNA<400>12atgaatttca gcagaatctt cttcttcgtg ttcgccctcg tgctcgccct ctctaccgtg 60agcgccgccc cagaaccaaa atggaaagtg ttcaaaaaaa tcgagaaaat gggaagaaat 120atcagaaatg gaatcgtgaa agccggacca gccatcgctg tgctcggaga agccaaagcc 180ctctag186<210>13<211>569<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成啟動(dòng)子<400>13gaattcctgc agaacggggc ggggatctcg agttcggggc ggggataggc gtttcggggc 60
ggggaactgc aggactgtgt tataaactgg ttcctcagtc agtgtttgtg ttctgctgct 120gtgcagtttc ttttcctttg actgtttttg gatccggcac catgaatttc agcagaatct 180tcttcttcgt gttcgccctc gtgctcgccc tctctaccgt gagcgccgcc ccagaaccaa 240aatggaaagt gttcaaaaaa atcgagaaaa tgggaagaaa tatcagaaat ggaatcgtga 300aagccggacc agccatcgct gtgctcggag aagccaaagc cctctagagg gccctattct 360atagtgtcac ctaaatgcta gagctcgctg atcagcctcg actgtgcctt ctagttgcca 420gccatctgtt gtttgcccct cccccgtgcc ttccttgacc ctggaaggtg ccactcccac 480tgtcctttcc taataaaatg aggaaattgc atcgcattgt ctgagtaggt gtcattctat 540tctgggggac tagttctaga gcggccgcc 569<210>14<211>615<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成啟動(dòng)子<400>14gaattcctgc agaacggggc ggggatctcg agttataatg tttcatcaca cttatacgcg 60tttatgtaaa tatctcgagt tgggacgtcc catctcgagt tatgactcag aactgcagga 120ctgtgttata aactggttcc tcagtcagtg tttgtgttct gctgctgtgc agtttctttt 180cctttgactg tttttggatc cggcaccatg aatttcagca gaatcttctt cttcgtgttc 240gccctcgtgc tcgccctctc taccgtgagc gccgccccag aaccaaaatg gaaagtgttc 300aaaaaaatcg agaaaatggg aagaaatatc agaaatggaa tcgtgaaagc cggaccagcc 360atcgctgtgc tcggagaagc caaagccctc tagagggccc tattctatag tgtcacctaa 420atgctagagc tcgctgatca gcctcgactg tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt 480gcccctcccc cgtgccttcc ttgaccctgg aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat 540aaaatgagga aattgcatcg cattgtctga gtaggtgtca ttctattctg ggggactagt 600tctagagcgg ccgcc 615<210>15<211>123<212>DNA<213>Hyalophora cecropia<220>
<221>misc_feature<222>(0)...(0)<223>天蠶抗菌肽原B DNA<400>15gcaccggagc cgaaatggaa agtcttcaag aaaattgaaa aaatgggtcg caacattcga 60aacggtattg tcaaggctgg accagcgatc gcggttttag gcgaagccaa agcgctagga 120taa 123<210>16<211>40<212>PRT<213>Hyalophora cecropia<400>16Ala Pro Glu Pro Lys Trp Lys Val Phe Lys Lys Ile Glu Lys Met Gly1 5 10 15Arg Asn Ile Arg Asn Gly Ile Val Lys Ala Gly Pro Ala Ile Ala Val20 25 30Leu Gly Glu Ala Lys Ala Leu Gly35 40<210>17<211>120<212>DNA<213>Hyalophora cecropia<220>
<221>misc_feature<222>(0)...(0)<223>天蠶抗菌肽原B DNA變體<400>17gccccagaac caaaatggaa agtgttcaaa aaaatcgaga aaatgggaag aaatatcaga 60aatggaatcg tgaaagccgg accagccatc gctgtgctcg gagaagccaa agccctctag 120<210>18<211>111<212>DNA<213>Hyalophora cecropia<220>
<221>misc_feature<222>(0)...(0)<223>成熟天蠶抗菌肽DNA<400>18aaatggaaag tcttcaagaa aattgaaaaa atgggtcgca acattcgaaa cggtattgtc 60aaggctggac cagcgatcgc ggttttaggc gaagccaaag cgctaggata a 111<210>19<211>36<212>PRT<213>Hyalophora cecropia<400>19Lys Trp Lys Val Phe Lys Lys Ile Glu Lys Met Gly Arg Asn Ile Arg1 5 10 15Asn Gly Ile Val Lys Ala Gly Pro Ala Ile Ala Val Leu Gly Glu Ala20 25 30Lys Ala Leu Gly35<210>20<211>108<212>DNA<213>Hyalophora cecropia<220>
<221>misc_feature<222>(0)...(0)<223>成熟天蠶抗菌肽DNA變體<400>20aaatggaaag tgttcaaaaa aatcgagaaa atgggaagaa atatcagaaa tggaatcgtg 60aaagccggac cagccatcgc tgtgctcgga gaagccaaag ccctctag 108<210>21<211>174<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>鯰魚Ig Vh前導(dǎo)序列/天蠶抗菌肽原B編碼序列<400>21atgctctcta ccagcctgct cctgctcctc gccctgctct cttatgtgca tggcgcccca 60gaaccaaaat ggaaagtgtt caaaaaaatc gagaaaatgg gaagaaatat cagaaacgga 120atcgtgaaag ccggaccagc catcgctgtg ctcggagaag ccaaagccct ctag 174<210>22<211>58
<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>鯰魚Ig Vh前導(dǎo)序列/天蠶抗菌肽原B<400>22Met Leu Ser Thr Ser Leu Leu Leu Leu Leu Ala Leu Leu Ser Tyr Val15 10 15His Gly Ala Pro Glu Pro Glu Lys Trp Lys Val Phe Lys Lys Ile Glu20 25 30Lys Met Gly Arg Asn Ile Arg Asn Gly Ile Val Lys Ala Gly Pro Ala35 40 45Ile Ala Val Leu Gly Glu Ala Lys Ala Leu50 55<210>23<211>180<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>鯰魚Ig Vh前導(dǎo)序列/天蠶抗菌肽B編碼序列<400>23atgttatcta catctctact gctcctgctg gcagctgctt cctatgtgca tggtcaggga 60ctgactctag agaaatggaa agtgttcaaa aaaatcgaga aaatgggcag aaacatcaga 120aacggaatcg tgaaagccgg accagccatc gccgtgctcg gagaagccaa agccctctag 180<210>24<211>59<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>鯰魚Ig Vh前導(dǎo)序列/天蠶抗菌肽B<400>24Met Leu Ser Thr Ser Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ala Ala Ser Tyr Val15 10 15His Gly Gln Gly Leu Thr Leu Glu Lys Trp Lys Val Phe Lys Lys Ile20 25 30Glu Lys Met Gly Arg Asn Ile Arg Asn Gly Ile Val Lys Ala Gly Pro35 40 45Ala Ile Ala Val Leu Gly Glu Ala Lys Ala Leu50 55<210>25<211>96<212>DNA<213>Sus scrofa<220>
<221>misc_feature<222>(0)...(0)<223>豬天蠶抗菌肽P1編碼序列<400>25agctggctct ctaaaaccgc caaaaagctg gaaaatagcg ccaaaaaaag aatctctgag 60ggcatcgcca tcgccatcca gggaggccca agatag 96<210>26<211>31
<212>PRT<213>Sus scrofa<400>26Ser Trp Leu Ser Lys Thr Ala Lys Lys Leu Glu Asn Ser Ala Lys Lys15 10 15Arg Ile Ser Glu Gly Ile Ala Ile Ala Ile Gln Gly Gly Pro Arg20 25 30<210>27<211>150<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>鯰魚Ig Vh前導(dǎo)序列/天蠶抗菌肽P1編碼序列<400>27atgctctcta ccagcctgct cctgctcctc gccctgctct cttacgtgca tggcagctgg 60ctctctaaaa ccgccaaaaa gctggaaaat agcgccaaaa aaagaatctc tgagggcatc 120gccatcgcca tccagggagg cccaagatag 150<210>28<211>49<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>鯰魚Ig Vh前導(dǎo)序列/天蠶抗菌肽P1<400>28Met Leu Ser Thr Ser Leu Leu Leu Leu Leu Ala Leu Leu Ser Tyr Val15 10 15His Gly Ser Trp Leu Ser Lys Thr Ala Lys Lys Leu Glu Asn Ser Ala20 25 30Lys Lys Arg Ile Ser Glu Gly Ile Ala Ile Ala Ile Gln Gly Gly Pro35 40 45Arg<210>29<211>1571<212>DNA<213>Cyprinos carpio<220>
<221>misc_feature<222>(0)...(0)<223>鯉魚β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子<400>29tttgatgaaa atcgcttagg ccttgctctt caaacaatcc agcttctcct tctttcactc 60tcaagttgca agaagcaagt gtagcaatgt gcacgcgaca gccgggtgtg tgacgctgga 120ccaatcagag cgcagagctc cgaaagttta ccttttatgg ctagagccgg catctgccgt 180catataaaag agcgcgccca gcgtctcagc ctcactttga gctcctccac acgcagctag 240tgcggaatat catctgcctg taacccattc tctaaagtcg acaaaccccc ccaaacctaa 300ggtgagttga tctttaagct ttttacattt tcagctcgca tatatcaatt cgaacgttta 360attagaatgt ttaaataaag ctagattaaa tgattaggct cagttaccgg tctttttttt 420ctcatttacg tgcgaactct gcttaaactc tagttattct ttattaatat gtggttattt 480ttatatatgt atgttatcat aactgtactg gctatgtcag gtggtaatga ctgtaacgtt 540acgttactcg ttgtaggcac gacattgaat gggccggtgt tgaaataagt cttcaacccc 600ttttaacctc aaaatgtgct ctggttaaca aggattttaa cagctatcag tatgactgtg 660cggttttaaa gccgttagtg aggcacgttg cacacttgat ggatggccgg aatgggaagt 720tctttatgca ggcagtgctg cagcagggtg tgacctactt tagctaacgt tagccggcta 780
accagcattc atctgccggt aacttgagtc taatattctc tatgtgatat cgaagtgatc 840aaagacacgt ctgttagctc actttaacca actgtagtga aaaatagcgc agtgtgcagc 900ccttcaagtc tttcatttag gctgattatt caatcatttt attaactatt aacgcgttac 960taaacgtaag gtaacgtagt cagtttttaa taactggtga aaagtactgg ttgggtttaa 1020atggtgactt ataattgtgt tggaggggga aacctttttg ataaaggcta tataatctca 1080aatgaatggg ctgaggatgg tgttcacagg tgctttagtg aagtccgctc gtgaagagtc 1140gctgaagtga ctgcagatct gtagcgcatg cgttttggca gacggccgtt gaaattcggt 1200tgagtaattg ataccaggtg aggctagagg atgtagaaat tcatttgtgt agaatttagg 1260gagtggcctg gcgtgatgaa tgtcgaaatc cgttcctttt tactgaaccc tatgtctctg 1320ctgagtgcca caccgccggc acaaagcgtc tcaaaccatt gccttttatg gtaataatga 1380gaatgcagag ggacttcctt tgtctggcac atctgaggcg cgcattgtca cactagcacc 1440cactagcggt cagactgcag acaaacagga agctgactcc acatggtcac atgctcactg 1500aagtgttgac ttccctgaca gctgtgcact ttctaaaccg gttttctcat tcatttacag 1560ttcagccaag g 1571<210>30<211>1586<212>DNA<213>Ictalurus punctatus<220>
<221>misc_feature<222>(0)...(0)<223>斑點(diǎn)叉尾鮰myostatin啟動(dòng)子<400>30cccaatattc ccagcaggtg atcagcagag agagagacac acaggagaga tagcgagaca 60gacagagaga aattgagaga cagacaacag agagatatag agacagagac agagagagag 120agatatagag agacagacag agagagagag atagtagtga gacagagaga gatagagaga 180cacagagaga gacagagaga gacatagaga gagacagaca gagagagtgt ctctcatatg 240tcaacatatg tgtagggcat atgttgggtt tttttctgtg tgtgtgtgtg aggtaatgca 300gaatgccaac agcaggatat attgtgggtt tggattaaac atgctcttta atttctttga 360atacatgtta actattctat gaaacactgg agcggtagtg tagtggtagt tgcagtgtag 420gtggtagtgg tagtggagcg gtagttgtat gtagtggcag tgttattggg agtgtagtgg 480gagtggtagt gtagtggagc tgtagtggag tgtagtggta gtggagtata gtggtagtgt 540agttggagtg cgtagtgtaa tgtagtggta gtgtaatatg gtgtagtggt agtgtaatgt 600agtggtagtg gagtggtaat gtagtgtagt ggtagtggag tggtagtgta atgtagtgta 660gtggtagtgt agtggtagtt gagcggtagt gtaatgtagt gtagtggtag tgtaatgtag 720tgtagtggag cggtagtgta gtggtagtgg agcggtagtg taatgtagtg gagtggtagt 780ggagcggtag tgtaatgtag tggagtggta gtggagcggt agtgtagtgg tagtggagcg 840gtagtgtaat gtagtggagt ggtagtgtag tggtagtgta gtggtagtgg agcggtagtg 900taatgtagtg tagtggtagt ggagcgggta gtgtagtgga gtggtagtgg agtggtagtg 960gagtggtagt gtaatgtagt gtagttggta gtggagcggt agtgtaatgt agtggagttg 1020gtagtggtta cggtggtagt ggagcggtag tgttaatgta gtggagtggt agtgtaatgt 1080aggtggtagt ggtagtggag tggtagtgta atgtagtgga gtggtagtgg tagtggtagt 1140ggagcggtag gtgtaatgta gtggagtggt agtgtaatgt agtggtagtg gtagtggagt 1200ggtagtgtaa tgtagtggag tggtagtgga gtggtagtgt aatgtagtgg agtggtagtg 1260tagtggtagt gtaatgtagt gtagtggaga aagttgtggg tctgtctctt taaggtttca 1320gcgctggaaa gggaggaaaa aaatccggac tgaagtccac ctctgattta ttgttgctcc 1380gagtagccaa tcatagattt cgacgccaga gcctaaataa gagcggcgga ataatttggc 1440ggtataaaaa ggcttttggg cgaattgaag catgacatct cgcgctacct gtccggtgtg 1500catggcgcac ggtgttcctg ttactgctgc cacacagaaa acacaaccgc gcgcgcactc 1560ctctctgaga cctgacctgg ctgatc 1586<210>31<211>1208<212>DNA<213>Ictalurus punctatus<220>
<221>misc_feature<222>(0)...(0)<223>斑點(diǎn)叉尾鮰α-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子<400>31ttctttaata aagactcgaa catctataaa atatgtattt acgtatcaat aattaataca 60
taatttaaat accaaaaata gaatatatct ccccttcctc cgcggacgag ccaagcaaac 120cctatgtatt cctttacatc tacatatgtc aaattttatg atgctactat gactgatacg 180ctcgcatgat ccttgtggtg tggtgacgtg tctgctctct tcactttgct taactataag 240ggaaaaccgc ctgcgtgtta acacggtttt cggggtgaaa cttttctaca acggtgcgtc 300ctccggtttc cttgttgtcc agaaaagctg acaagactcg cgcagccgca gacaggagac 360gccaaattgt cgtggaaatt agacaacgct cgcagactcg tcctctgaag gtaaaaaagg 420ttttattaca gaaagccggt ttaatacagg agaggaatta aagcagggag agaataatga 480gagcgctctg aagtgcctcg tgctgaaccg ctactataga tatgaaacgc agagcacgac 540atacttctgt atacccataa gaagcggttt gaggcagttc aaacagtttt aggatcttgg 600aagatgttta gacgaacctc gaacagaaga acatgtttgt gtctgtacgc agataaacat 660tctgtacgga tctcagtgac atgacatggc cctctcaggc gttatcctca gatgaacatg 720aacaaacttc tctacacggt gtgcggtctc gggagttttg cagaattgtt cagtcatgtg 780cactcgtgaa atccaccctg cagtacagac gatgctgagt gctgcccctt cacttataca 840cacgtaaact gctcgtcgtg tccattagct tctttgcttg catcccattg tctctactaa 900ctggcgtgat gaacacgtgt aatcgtaaat agaattacga tgagaaaaag tcaaatcgtt 960gaaacccaac ctttcacgcg tgtgcttaac tatgaatgaa gtgacggtga tgccttactg 1020agcaccttgt tctttccaca tttcaaaaaa cataacagga ggagaatttt ttttttttat 1080ggactaaaat atatgcactt ttaatgtagt cccagtaggc ataggttaga atacacactt 1140aggtgtattg tgtgtgtgtg tgtgtttcat tcctcatcgt gtgcttctat atcaggaacc 1200cattcaac1208<210>32<211>1799<212>DNA<213>Ictalurus punctatus<220>
<221>misc_feature<222>(0)...(0)<223>斑點(diǎn)叉尾鮰肌酸激酶啟動(dòng)子<400>32tgtgtgtgtg tgtgtaagag tgagagatat atattaacag ctgttttgat ttggtacata 60ttctagactg ccatggcagc tgccccagta tcagctgacc atctcttagc ctggcagatt 120gatgcgaatg catccctacc ctgtttttcc atctccatct cccgctctct ttctcaccag 180cacttagctg aagtcatcat ctccaatagc aagcaaagta aacattcctc tcatatcctg 240ttcactactt agcactactc agttgagtta aaccagacct tctctttcga tgtaatatca 300attttaaggt aacaattaac attttgaagg taatataaaa tagtgcaaaa gtgagaaaat 360tgaaaacggc actgttatat acactagtct atggaataat atacttctcg ctagcagcac 420tatggtatta atatcaaaaa agctttccaa gcatcctctg tccaagtgtg tctcttcagc 480caggtagaca aaaacagtct tcccgagctg ccttctttct atttatttat ttatttgaag 540aaaaaaaaaa atctttatcc ttttttggcc tctgaataaa aactaaatgt tagcaacacg 600aacaaaccta aaaaaaaaaa aaaaagcagt atcaaggctg gctagttacc gtagctagtt 660aacatttgtt ttaaaataac aacaacaata aaatcatgaa cagaatccat gagtgtcttc 720atagtgatgt caactggaga tgctagttga gaagttaaaa ctacagagct ccaaaccttg 780gcagcctcgt agctagttcg agccattctc ttgtcaccaa ataatgcctc acttccagct 840attgttccct attttgaatc acataatgtg ctcaattaaa gttttgcatt aaaaatgatc 900ttgagccaga gcaagatgac tcaggcctat agcatgaatg cccagacgaa tgtctcgaac 960acatgcagtt tttaagaaaa gtagaaatcc gagttattca atttttttag aagcccttag 1020gactcgacat tagatttttg cacaaaaaaa acacaaaaaa aacaggaata tggacatttt 1080ttctcacatt tcagcagaat ctgcttcatc agctttcagt tttaggatct tcaaggatgg 1140atgaccttac agatttataa ccatatgcct gtgcaatata aatcaagtga aatacaccct 1200cctcctcctc ctcaaagtac ttgcatacac acacactgtg gttagcacac cttcacaatc 1260ctatacatct tcagaaatat gctgtttttt ttacagaacg ctatgtttaa tgtattaata 1320tatgattttt tttttccatc caaatgttcc acaatgtaca attcaagagt ttcatttcat 1380tttaatatac aaaaattcca ttgagaagat aatgcagtga taggctcagt tcattctttt 1440tcaaggtctt tgctggacgt gagcgctgct gcgttccctg gcacacatgg caaaactctc 1500actcagcctt tttagccttc ataacccccc accccccgac ccccctaact ttcaatcctc 1560caggcttata tggagaccta tatatggggg aggaggaggg gtctacgaga gagggccagg 1620ccacagctgc caccccatct cagatgacgg aaatgtaaat gcaggacctg tttcgtaagc 1680taaactgggt atcagagatg tgccctgtcc aatcgcagtc catcacgctc taaaatggac 1740ctctggagta agcagtatat aaagctgaac tgaacccttc tccgctggtg acccctatt 1799<210>33<211>272<212>DNA
<213>Oncohynus nerka<220>
<221>misc_feature<222>(0)...(0)<223>鮭魚金屬硫蛋白啟動(dòng)子<400>33taaataaata taggtgtagc cttaattaat cgatgatcaa cgtggtaatc aggtttatgt 60aacaggctat ggaatttgga aacaatagga aactcttcct tgattatttt cgcgcagtat 120aatgaaataa cccgggtgca aaccctgatc gtctgaacgc gagactgttt tgcacacggc 180acccgtctgt ccctgacgct ataaaaacgg tcttcgccaa agagaaattt aaagcttaca 240actcacaagt gaaattgagc tgaaatactt ca 272<210>34<211>470<212>DNA<213>Oncorhynus nerka<220>
<221>misc_feature<222>(0)...(0)<223>鮭魚組蛋白H3啟動(dòng)子<400>34gtaaaatcgc tggtgcggct gcaacttgac tactcaaccc ccaaaggctc ttttaagagc 60caaccacctg gctcagccaa aaaagcagtg tcctctctct ctatggctgg ccaactattt 120ggcgtgtttg ttaaatacac acacatatac acggcacagt atcaagtgcc cacatgaggc 180ctacatgaag aataacaact actaggctaa aatgaagaga agcgttattg cccgtaaagt 240gtaacgttgc tcgcggccct aacaaaagaa ccaagcagcg cctcggcgag ggatgggggt 300tgcattttgg ggcgtcacgg agaggtccga gcctcccgtc caatgggcgg aggaggcctc 360cgcaacgggc caatcagggc ggtgcggaga tggtgaccaa tcagcagacg ccgctgccgg 420ctttataaac ttcacatagg catttggagg ctatactccg actgtgaaag470<210>35<211>1997<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>鯉魚β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子連接前天蠶抗菌肽原B編碼序列<400>35ggtaccgggc cccccctcga ggtcgacggt atcgataagc ttgatatcga attgggtttg 60atgaaaatcg cttaggcctt gctcttcaaa caatccagct tctccttctt tcactctcaa 120gttgcaagaa gcaagtgtag caatgtgcac gcgacagccg ggtgtgtgac gctggaccaa 180tcagagcgca gagctccgaa agtttacctt ttatggctag agccggcatc tgccgtcata 240taaaagagcg cgcccagcgt ctcagcctca ctttgagctc ctccacacgc agctagtgcg 300gaatatcatc tgcctgtaac ccattctcta aagtcgacaa acccccccaa acctaaggtg 360agttgatctt taagcttttt acattttcag ctcgcatata tcaattcgaa cgtttaatta 420gaatgtttaa ataaagctag attaaatgat taggctcagt taccggtctt ttttttctca 480tttacgtgcg aactctgctt aaactctagt tattctttat taatatgtgg ttatttttat 540atatgtatgt tatcataact gtactggcta tgtcaggtgg taatgactgt aacgttacgt 600tactcgttgt aggcacgaca ttgaatgggc cggtgttgaa ataagtcttc aacccctttt 660aacctcaaaa tgtgctctgg ttaacaagga ttttaacagc tatcagtatg actgtgcggt 720tttaaagccg ttagtgaggc acgttgcaca cttgatggat ggccggaatg ggaagttctt 780tatgcaggca gtgctgcgca gggtgtgacc tactttagct aacgttagcc ggctaaccag 840cattcatctg ccggtaactt gagtctaata ttctctatgt gatatcgaag tgatcaaaga 900cacgtctgtt agctcacttt aaccaactgt agtgaaaaat agcgcagtgt gcagcccttc 960aagtctttca tttaggcttt attcaatcat tttattaact attaacgcgt tactaaacgt 1020aaggtaacgt agtcagtttt taataactgg tgaaaagtac tggttgggtt taaatggtga 1080cttataattg tgttggaggg ggaaaccttt ttgataaagg ctatataatc tcaaatgaat 1140gggctgagga tggtgttcac aggtgcttta gtgaagtccg ctcgtgaaga gtcgctgaag 1200tgactgcaga tctgtagcgc atgcgttttg gcagacggcc gttgaaattc ggttgagtaa 1260ttgataccag gtgaggctag aggatgtaga aattcatttg tgtagaattt agggagtggc 1320
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1.在魚類細(xì)胞中具有功能的合成啟動(dòng)子，其中所述合成啟動(dòng)子包含選自下組的核苷酸序列a)SEQ ID NO3或SEQ ID NO8中所示的核苷酸序列；b)與SEQ ID NO3或SEQ ID NO8中所示的核苷酸序列具有至少70％序列同一性的核苷酸序列；c)與SEQ ID NO3或SEQ ID NO8中所示的核苷酸序列具有至少80％序列同一性的核苷酸序列；和d)與SEQ ID NO3或SEQ ID NO8中所示的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列。
2.一種表達(dá)盒，其包含以合適的閱讀框與感興趣的核苷酸序列可操作性連接的權(quán)利要求1所述合成啟動(dòng)子。
3.一種載體，其中包含權(quán)利要求2所述的表達(dá)盒。
4.一種宿主細(xì)胞，在其基因組中穩(wěn)定摻入了權(quán)利要求2所述的表達(dá)盒。
5.一種魚卵，在其基因組中穩(wěn)定摻入了權(quán)利要求2所述的表達(dá)盒。
6.一種轉(zhuǎn)基因魚，在其基因組中穩(wěn)定摻入了權(quán)利要求2所述的表達(dá)盒。
7.權(quán)利要求6所述的轉(zhuǎn)基因魚，其中所述魚是選自下組的鯰魚斑點(diǎn)叉尾鮰、藍(lán)叉尾鮰或斑點(diǎn)叉尾鮰-藍(lán)叉尾鮰雜交鯰魚。
8.一種表達(dá)盒，其中包含在魚類細(xì)胞中有功能的啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子選自下組中a)權(quán)利要求1所述的合成啟動(dòng)子；b)包含SEQ ID NO29所示核苷酸序列的鯉魚β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子；c)包含SEQ ID NO30所示核苷酸序列的斑點(diǎn)叉尾鮰myostatin啟動(dòng)子；d)包含SEQ ID NO31所示核苷酸序列的斑點(diǎn)叉尾鮰α-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子；e)包含SEQ ID NO32所示核苷酸序列的斑點(diǎn)叉尾鮰肌酸激酶啟動(dòng)子；f)包含SEQ ID NO33所示核苷酸序列的鮭魚金屬硫蛋白啟動(dòng)子；g)包含SEQ ID NO34所示核苷酸序列的鮭魚組蛋白H 3啟動(dòng)子；h)包含與SEQ ID NO29、30、31、32、33或34中所示核苷酸序列具有至少70％序列同一性的核苷酸序列的啟動(dòng)子，其中所述啟動(dòng)子以合適的閱讀框與編碼感興趣的抗病原性多肽的核苷酸序列可操作性連接在一起，所述感興趣的抗病原性多肽選自下述組中i)天蠶抗菌肽多肽的成熟形式；j)所述天蠶抗菌肽多肽的前原形式；k)所述天蠶抗菌肽多肽的原體形式；l)包含鯰魚免疫球蛋白重鏈可變區(qū)(Ig Vh)前導(dǎo)序列與所述天蠶抗菌肽多肽的原體形式的融合多肽；m)包含鯰魚免疫球蛋白重鏈可變區(qū)(Ig Vh)前導(dǎo)序列與所述天蠶抗菌肽多肽的成熟形式的融合多肽；n)具有抗病原性活性、并與i)、j)、k)、l)或m)中所述多肽具有至少70％序列同一性的多肽。
9.權(quán)利要求8的表達(dá)盒，其中所述天蠶抗菌肽多肽是天蠶抗菌肽B多肽或天蠶抗菌肽P1多肽。
10.權(quán)利要求9的表達(dá)盒，其中所述天蠶抗菌肽B多肽的成熟形式具有SEQ ID NO19所示的氨基酸序列。
11.權(quán)利要求10的表達(dá)盒，其中所述抗病原性多肽是由選自下組的核苷酸序列所編碼的a)包含SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO15、SEQ ID NO17、SEQ ID NO18、SEQ ID NO20、SEQ ID NO21或SEQ ID NO23中所示序列的核苷酸序列；以及b)與SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO15、SEQ ID NO17、SEQ ID NO18、SEQ ID NO20、SEQ ID NO21或SEQ ID NO23中所示核苷酸序列具有至少70％序列同一性的核苷酸序列。
12.權(quán)利要求9的表達(dá)盒，其中所述天蠶抗菌肽P1多肽的成熟形式具有SEQ ID NO26所示的序列。
13.權(quán)利要求12的表達(dá)盒，其中所述抗病原性多肽是由選自下組的核苷酸序列所編碼的a)包含SEQ ID NO25或SEQ ID NO27中所示序列的核苷酸序列；以及b)與SEQ ID NO25或SEQ ID NO27中所示核苷酸序列具有至少70％序列同一性的核苷酸序列.
14.權(quán)利要求8的表達(dá)盒，其中1)中所述融合多肽包含SEQ IDNO22所示的氨基酸序列。
15.權(quán)利要求8的表達(dá)盒，其中m)中所述融合多肽包含SEQ IDNO24或SEQ ID NO28所示的氨基酸序列。
16.一種載體，其中包含權(quán)利要求8所述的表達(dá)盒。
17.一種宿主細(xì)胞，在其基因組中穩(wěn)定摻入了權(quán)利要求8所述的表達(dá)盒。
18.一種魚卵，在其基因組中穩(wěn)定摻入了權(quán)利要求8所述的表達(dá)盒。
19.一種轉(zhuǎn)基因魚，在其基因組中摻入了權(quán)利要求8所述的表達(dá)盒。
20.權(quán)利要求19所述的轉(zhuǎn)基因魚，它是選自下組的鯰魚斑點(diǎn)叉尾鮰、藍(lán)叉尾鮰或斑點(diǎn)叉尾鮰-藍(lán)叉尾鮰雜交鯰魚。
21.一種在魚類宿主細(xì)胞中表達(dá)感興趣多肽的方法，所述方法包括向該魚類宿主細(xì)胞中導(dǎo)入表達(dá)盒，所述表達(dá)盒包含以適當(dāng)?shù)拈喿x框與編碼所述感興趣多肽的核苷酸序列可操作性連接的功能性合成啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子包含選自下組的核苷酸序列a)SEQ ID NO3或SEQ ID NO8所示的核苷酸序列；b)與SEQ ID NO3或SEQ ID NO8所示核苷酸序列具有至少70％序列同一性的核苷酸序列；c)與SEQ ID NO3或SEQ ID NO8所示核苷酸序列具有至少80％序列同一性的核苷酸序列；和d)與SEQ ID NO3或SEQ ID NO8所示核苷酸序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列。
22.權(quán)利要求21所述的方法，其中所述感興趣多肽是抗病原性多肽，所述魚類宿主細(xì)胞是鯰魚細(xì)胞。
23.一種增強(qiáng)鯰魚抗病力的方法，該方法包括將權(quán)利要求8所述的表達(dá)盒導(dǎo)入鯰魚卵中，然后在適于所述鯰魚卵成熟和發(fā)育或鯰魚的條件下培養(yǎng)該鯰魚卵。
24.權(quán)利要求23所述的方法，其中所述鯰魚選自下組中斑點(diǎn)叉尾鮰、藍(lán)叉尾鮰或斑點(diǎn)叉尾鮰-藍(lán)叉尾鮰雜交鯰魚。
25.一種轉(zhuǎn)基因鯰魚的養(yǎng)殖方法，包括將按照權(quán)利要求23所述方法獲得的鯰魚進(jìn)行雜交而產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因后代的步驟。
全文摘要
本發(fā)明涉及向魚類提供增強(qiáng)的抗病性的組合物和方法。所述組合物包含新型重組構(gòu)建體，其可誘導(dǎo)天蠶抗菌肽蛋白或其生物學(xué)活性變體等抗病原性多肽在魚體中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)，所述抗病原性多肽的表達(dá)受新型合成啟動(dòng)子、天然存在的魚類啟動(dòng)子或其生物學(xué)活性變體的調(diào)控。本發(fā)明的組合物還包含在其基因組中穩(wěn)定摻入了重組構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因魚類細(xì)胞、魚卵和魚，特別是鯰魚。本發(fā)明還提供了在宿主細(xì)胞中表達(dá)目的多肽的方法，其中目的多肽的表達(dá)處于本發(fā)明的合成啟動(dòng)子的控制之下。
文檔編號(hào)C12N15/00GK1735688SQ200380108357
公開日2006年2月15日 申請(qǐng)日期2003年11月6日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月6日
發(fā)明者R·A·頓哈姆, 劉占江, G·W·瓦爾 申請(qǐng)人:奧本大學(xué), Musc研究發(fā)展基金會(huì)