專利名稱：因子Ⅷ多肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及比全長因子VIII更穩(wěn)定的因子VIII多肽。本發(fā)明還涉及將因子VIII多肽給與受試者以治療血液病癥的方法。本發(fā)明進一步涉及包括編碼因子VIII多肽的DNA的核酸構(gòu)建體。本發(fā)明涉及通過將該基因構(gòu)建體給與受試者而在哺乳動物中表達因子VIII的方法。本發(fā)明進一步涉及該因子VIII多肽的特異性抗體。
一般背景和現(xiàn)有技術(shù)水平由因子VIII(FVIII)定量或定性的不足導(dǎo)致的甲型血友病使得通過血漿或重組來源的FVIII制劑的外來補充成為必需。FVIII具有A1-A2-B-A3-C1-C2的域結(jié)構(gòu)且作為具有2,351個氨基酸的280kDa單鏈糖蛋白合成(Eaton，D.J.等，1986，Biochemistry 25505-512；Toole，J.J.等，1984，Nature312342；Vehar，G.A.等，1984，Nature312337)。盡管A和C結(jié)構(gòu)域相互之間以及與凝固因子V的A和C結(jié)構(gòu)域呈現(xiàn)35-40％的氨基酸同一性，B結(jié)構(gòu)域不與任何已知蛋白同源。在細胞內(nèi)，對B結(jié)構(gòu)域中Arg-1648殘基后進行的蛋白酶解產(chǎn)生80-kDa的輕鏈(結(jié)構(gòu)域A3-C1-C2)和90-200kDa的大小不均一的重鏈(A1-A2-B)。重鏈和輕鏈通過在A1和A3結(jié)構(gòu)域之間二價金屬離子依賴的鏈接而結(jié)合為異源二聚體。血漿中，F(xiàn)VIII以與Willebrand因子(vWF)結(jié)合的非活性形式循環(huán)且需要通過凝血酶或因子Xa的蛋白酶解而活化(Eaton，D.等，1986，Biochemistry 25505-512；Girma，J.P.等，1987，Blood 70605-611；Koedam，J.A.等，1990，Eur.J.Biochem.189229-234)。Arg(R)殘基372，740和1689位后的凝血酶裂解激活FVIII的促凝劑活性，導(dǎo)致B結(jié)構(gòu)域的徹底去除。得到的FVIIIa異三聚體在A1和A3-C1-C2亞單位之間維持金屬離子依賴的鏈接，而A2通過靜電交互作用以弱親和性結(jié)合(Eaton，D.等，1986，Biochemistry 25505-512；Fay，P.J.等，1991，J.Biol.Chem.2668957-8962；Pittman，D.D.& Kaufman，R.J.1988，Proc.Natl Acad.Sci.USA 852429-2433)。
隨著對FVIII的生物合成、結(jié)構(gòu)和功能的更多的了解，研究試圖生產(chǎn)改良的FVIII分子用于患甲型血友病病人的替代治療。至今研究策略已包括FVIII序列的缺失或修飾，產(chǎn)生更有效的表達。早先對FVIII功能活性的必要條件的研究證實Ar g殘基372和1689位后的裂解對于FVIII的活化是必需的且B結(jié)構(gòu)域?qū)τ诠δ芑钚圆皇潜匦璧?Eaton，D.L.等，1986，Biochemistry 258343；Burke，R.L.等，1986，J.Biol.Chem26112574；Toole，J.J.等，1986，Proc.Natl.Acad. Sci.USA835939)。為了檢驗該假設(shè)，進行了一些方法如在對應(yīng)于結(jié)構(gòu)域B的大DNA片段的互補DNA(cDNA)中的缺失，得到較短的FVIII衍生物(Eaton，D.L.等，1986，Biochemistry 258343；Burke，R.L.等，1986，J.Biol.Chem 26112574)，且用于其凝結(jié)活性的測試。
PCT申請WO86/06101公開了在其中心區(qū)域最多缺失880個氨基酸的重組FVIII蛋白仍然表現(xiàn)出FVIII活性。另外，Eaton等，1986，Biochemistry 258343-8347，公開了其中從中心B結(jié)構(gòu)域區(qū)域缺失766個氨基酸(797到1562)的多肽也保持FVIII活性。這些B結(jié)構(gòu)域缺失的FVIII衍生物在B結(jié)構(gòu)域內(nèi)部Arg-1648殘基后保留了用于細胞內(nèi)蛋白酶解加工的位點，其導(dǎo)致包含單鏈或兩種FVIII蛋白酶解產(chǎn)物，90kDa(結(jié)構(gòu)域A1-A2)和80kDa(結(jié)構(gòu)域A3-C1-C2)多肽復(fù)合物的異源FVIII衍生物的產(chǎn)生。此外，用包含編碼這些缺失多肽的DNA的載體轉(zhuǎn)化的哺乳動物細胞具有比用包含編碼該全長多肽的DNA的載體轉(zhuǎn)化的細胞更高的產(chǎn)物水平。然而，這些B結(jié)構(gòu)域缺失的FVIII衍生物通過凝血酶比全長FVIII通過未知機制表現(xiàn)出更快和更高的激活率(Eaton等，1986，Biochemistry 258343-8347；Fay等，1986，Biochem.Biophys.Acta871268-278)。
美國專利No.5,112,950描述了一種FVIII衍生物，其中主要由氨基酸序列丙氨酸-1至天冬氨酸-770組成的人FVIII衍生物通過酪氨酸-2332與蘇氨酸-1667鏈接，其中天冬氨酸-770通過肽鍵與蘇氨酸-1667共價結(jié)合。許多研究表明346，718，719，723，1664和1680位的酪氨酸殘基對于FVIII的完全活化和促凝劑活性是必需的(Donath M.J.等，1995，Biochem.J.31249-55；Michnick D.A.等，1994，J.Biol.Chem.26920095-200102)。FVIII在血漿中的循環(huán)與vWF結(jié)合，其能穩(wěn)定FVIII；事實上，在沒有vWF時體內(nèi)FVIII的半衰期降低得很快(Brinkhous，K.M.等，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 828752-8756)。這些研究強烈提示B結(jié)構(gòu)域缺失的因子VIII類似物(尤其在美國專利No.5,112,950中描述的)，其在A3區(qū)1664-1680附近帶有結(jié)構(gòu)上的改變，由于干擾和vWF相互作用而在完全活化和體內(nèi)穩(wěn)定性方面可能存在潛在的缺點。如美國專利No.5,610,278中所述，哺乳動物細胞中重鏈和輕鏈的共表達產(chǎn)生可檢測的FVIII產(chǎn)物。然而，該兩條鏈的結(jié)合是低效率的，因此降低了分子的活性(Burke，R.L.等，1986，J.Biol.Chem.261，12574；Pavirani A.等，1987，Biochem Biophys ResCommun.145234)。動物或人中作為基因治療方法的重鏈和輕鏈共表達的策略被認為是不恰當?shù)?Burton M等，1999，Proc Natl AcadSci USA 9612725)。
美國專利No.5,422,260和5,451,521涉及FVIII的變體，其中一個或多個因子Xa、APC和凝血酶切割位點經(jīng)過了修飾以使上述位點對特異性蛋白酶解更不穩(wěn)定，例如，其中由一個或兩個氨基酸定義的切割位點，優(yōu)選至少R-740或R-1648為精氨酸殘基，被不同的氨基酸替代；并且其中描述了從S-741至R-1648氨基酸缺失的蛋白(將90kD的R-740位點融合至80kD的E-1649位點)但沒有揭示其凝結(jié)活性。用不同氨基酸在切割位點的修飾的潛在缺點為得到的蛋白將具有新的抗原表位而可能引起免疫應(yīng)答。此外，除了具有從S-741至R-1648氨基酸內(nèi)缺失的變體外，該參考文獻沒有提供R-740和R-1689之間氨基酸內(nèi)部缺失的指定變體。
最近的研究(Chiang GG等，1999，Human Gene Therapy1061-76)表明B結(jié)構(gòu)域缺失的FVIII，其通過從S-743至R-1648氨基酸的缺失產(chǎn)生(將B結(jié)構(gòu)域N末端的F-742融合至80kD的E-1649位點)，與美國專利No.5,422,260和5,451,521所述的類似，僅表現(xiàn)出～50％的生物活性和較小的比活且因此認為更不適于治療應(yīng)用。上述B結(jié)構(gòu)域缺失的FVIII具有較小生物學(xué)和比活性的原因仍是未知的。然而，已假設(shè)從S-743至R-1648氨基酸缺失的單鏈FVIII的性質(zhì)或許由于重鏈(A1-A2)和輕鏈(A3-C1-C2)間空間必要條件的缺乏或重鏈(A1-A2)和輕鏈(A3-C1-C2)間不需要的長度或組成而可能具有不同的三維構(gòu)型。
總之，上述策略，雖然提供了更有效的重組蛋白質(zhì)制造的可能性，但還沒有成功。成功的缺乏也許是由于其分子特征而導(dǎo)致，例如和全長FVIII相比，F(xiàn)VIII分子的異源數(shù)量、結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性和不同的凝血酶活化作用方面。此外，由于許多B-結(jié)構(gòu)域缺失的FVIII作為融合分子表達，有可能這些非天然的氨基酸序列(重鏈和輕鏈的結(jié)合區(qū))仍然沒有完全加工，而當給予血液中時，很可能呈現(xiàn)出新的抗原性(Esmon P.C.，等，1990，Blood 761593-1600，1990)。然而，如由上述研究(Pittman D.D.等，1993，Blood 812925)證實的那樣，不清楚是否在融合位點的非天然氨基酸序列可以是產(chǎn)生免疫性的。在這種情況下，就希望開發(fā)活化的和安全的FVIII衍生物，其具有同樣的凝血酶活化作用和提高的產(chǎn)量。
發(fā)明簡述本發(fā)明人已集中研究了FVIII衍生物的結(jié)構(gòu)功能關(guān)系以便開發(fā)人FVIII的穩(wěn)定和高效表達形式，其包含基本組分，包括重鏈、多肽間隔接頭和輕鏈。結(jié)果，一方面，我們發(fā)現(xiàn)了FVIII衍生物，其中B-結(jié)構(gòu)域的大部分缺失且重鏈(A1-A2)和輕鏈(A3-C1-C2)通過最佳組成和長度(至約源于人因子VIII天然形式的B和A3結(jié)構(gòu)域的N末端區(qū)域60個氨基酸)的多肽間隔物連接。本發(fā)明的FVIII衍生物通過B-結(jié)構(gòu)域的N末端序列與A3中Arg-1648后(beyond)的氨基酸序列融合而主要以B-結(jié)構(gòu)域缺失的FVIII單鏈表達。其中一些FVIII衍生物與全長FVIII在相同的環(huán)境下相比，具有完全的凝結(jié)活性，更高的比活和同樣的凝血酶活化作用特點。此外，為了防止在重鏈和輕鏈結(jié)合區(qū)的非天然氨基酸的新抗原表位的暴露，我們在該融合位點建立了N-糖基化識別順序(Asn-X-Ser/Thr，其中X可以是任何氨基酸)。這通過將745，757和764位的Asn與位于1651，1654和1657位Ser或Thr旁邊的1650，1653和1656位氨基酸連接而完成，其在融合部位產(chǎn)生了N-糖基化位點。此外，本發(fā)明提供了包含相對天然FVIII在739位脯氨酸修飾的B結(jié)構(gòu)域缺失的FVIII衍生物，其降低了該分子對于特定蛋白酶-催化的在740位切割位點裂解的不穩(wěn)定性。然而，本發(fā)明的FVIII衍生物仍然可通過凝血酶激活且仍然具有促凝劑活性。
基于全長人因子VIII氨基酸序列(SEQ ID NO1)，本發(fā)明涉及融合至B結(jié)構(gòu)域中從約741至782的任何氨基酸序列的，包括在1649和1688之間存在一個或多個氨基酸內(nèi)缺失的因子VIII多肽。該因子VIII多肽可包含氨基酸746至1649，746至1652，746至1655，758至1649，758至1652，758至1655，765至1649，765至1652，765至1655，748至1658，755至1658，762至1658，769至1658，776至1658或783至1658的內(nèi)缺失。該因子VIII多肽可以是單鏈。此外，在另一個實施方案中，739位的脯氨酸可由另一個氨基酸替代。
本發(fā)明的另一方面，基于全長人因子VIII氨基酸序列(SEQ IDNO1)，本發(fā)明的因子VIII多肽可插入一種三肽序列(Asn-X-Thr或Asn-X-Ser)，包含在745，757或764位的Asn氨基酸和1651，1654或1657位的Thr或Ser氨基酸間的融合位點。
本發(fā)明還涉及一種具有以下連接的結(jié)構(gòu)域的通式表示的因子VIII多肽H-S-L其中H結(jié)構(gòu)域代表基本上包括根據(jù)SEQ ID NO1人因子VIII的Ala-1至Arg-740位的多肽序列；S結(jié)構(gòu)域代表包括多達約60個氨基酸的多肽間隔接頭，其中S結(jié)構(gòu)域的N末端約為根據(jù)SEQ ID NO1人因子VIII的殘基740位，而S結(jié)構(gòu)域的C末端約為根據(jù)SEQ ID NO1人因子VIII的殘基1688位；和L結(jié)構(gòu)域代表基本上包括根據(jù)SEQ ID NO1人因子VIII的Arg-1689至Tyr-2332位的多肽序列。
本發(fā)明還涉及一種基于上述的因子VIII多肽，其中S結(jié)構(gòu)域包括氨基酸序列，其基本上類似于從約Ser-741至Asn-745，Arg-747，Lys-754，Asn-757，Ile-761，Asn-764，Lys-768，His-775或Ile-782的連續(xù)序列。在另一個實施方案中，在上述因子VIII多肽中，S結(jié)構(gòu)域包括氨基酸序列，其基本上類似于從約Glu-1649至Pro-1688的連續(xù)序列。本發(fā)明的另一個方面，S結(jié)構(gòu)域可包含氨基酸序列，其基本上類似于從約Ile-1650，Thr-1653，Gln-1656或Gln-1659至Pro-1688的連續(xù)序列。本發(fā)明的另一個方面，在S結(jié)構(gòu)域中，可缺失氨基酸746至1649，746至1652，746至1655，758至1649，758至1652，758至1655，765至1649，765至1652，765至1655，748至1658，755至1658，762至1658，769至1658，776至1658或783至1658，其中殘基編號對照SEQ ID NO1。
本發(fā)明涉及一種包括上述的因子VIII多肽和其一種藥學(xué)可接受載體的藥物組合物。本發(fā)明還涉及一種包括上述因子VIII多肽的凍干組合物。
本發(fā)明還涉及一種在受試者中凝結(jié)血液的方法，包括接觸凝結(jié)有效量的上述因子VIII多肽。本發(fā)明進一步涉及一種在患者中治療甲型血友病的方法，包括將上述因子VIII多肽的凝結(jié)有效量給予需要的個體。
本發(fā)明涉及一種編碼上述因子VIII多肽的分離核酸。更進一步地，本發(fā)明涉及一種包含編碼上述因子VIII多肽的核酸的表達載體，其與啟動子有效連接。更進一步地，本發(fā)明涉及一種包括該表達載體的宿主細胞。基于此，本發(fā)明涉及一種制造上述該因子VIII多肽的方法，包括在適于載體表達該多肽的條件下培養(yǎng)細胞和分離多肽。
本發(fā)明涉及一種在受試者中凝結(jié)血液的方法，包括a)產(chǎn)生一種包括編碼上述因子VIII多肽的核酸序列的重組病毒或質(zhì)粒載體；b)用上述重組載體體外轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的細胞群，產(chǎn)生經(jīng)轉(zhuǎn)染的細胞群；和c)將該細胞給至哺乳動物宿主，以致上述核酸序列在上述宿主中的表達引起血凝固。
本發(fā)明還涉及一種上述因子VIII多肽的純化的特異性抗體。
本發(fā)明的這些及其他目的將從以下的發(fā)明說明、在此附上的參考圖和附加的權(quán)利要求得到更充分的理解。
附圖簡述本發(fā)明將從此處以下給出的詳細說明和附圖得到更充分的理解，其通過例證的方式給出，而因此不是對本發(fā)明的限制，其中；

圖1A和1B顯示全長FVIII的氨基酸序列。
圖2顯示全長FVIII和不同的B-結(jié)構(gòu)域缺失的FVIII衍生物dB747和dBN(45-50)的圖示。
圖3顯示用于全長FVIII的cDNA構(gòu)建方案。
圖4顯示在哺乳動物載體中用于FVIII衍生物的DNA構(gòu)建方案。
圖5A-5C顯示在HEK293細胞中表達的FVIII衍生物的合成，分泌和凝血酶裂解。
圖5A-穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HEK293細胞用[35S]甲硫氨酸脈沖標記30分鐘。復(fù)制標記的細胞在包含過量未標記甲硫氨酸的培養(yǎng)基中追蹤6小時，隨后收獲細胞抽提物(C)和條件培養(yǎng)基(M)。等體積的細胞提取物和條件培養(yǎng)基用抗-FVIII-特異性抗體免疫沉淀，且相等分量通過SDS/PAGE分析。所有衍生物以單鏈種類從細胞提取物(泳道3，5，7，9，11，13，15和17)和捕獲條件培養(yǎng)基(泳道4，6，8，10，12，14，16和18)中回收。HEK293表示不帶有外源DNA質(zhì)粒DNA的HEK293細胞。
圖5B-表達FVIII衍生物的HEK293細胞系在用補充有10％胎牛血清和抗生素的DMEM中生長。當單層長成約70-80％匯合時，用新鮮DMEM替換培養(yǎng)基。細胞孵育約24小時而收集培養(yǎng)上清，用Centricon50,000MWCO濃縮大約100倍，然后在-80℃儲存。使用ELISA方法測定FVIII濃度。濃縮物隨后通過SDS-PAGE分離并且通過使用單克隆抗體(ESH-8)的免疫印跡法分析。用于Western印跡法的ESH-8抗體檢測到一種主要蛋白，遷移至大約170kDa(通過箭頭指出)。
圖5C-35S-甲硫氨酸標記的FVIII衍生物從穩(wěn)定表達的HEK293細胞的捕獲條件培養(yǎng)基中免疫沉淀，并且分成相等分量而在凝血酶(1U/mL)缺乏(泳道1，3，5和7)或存在(泳道2，4，6和8)時37℃溫育30分鐘。用SDS-PAGE樣品緩沖液終止反應(yīng)并且蛋白片段通過10％SDS-PAGE分離。FVIII蛋白形式在右邊如下標明SC，單鏈；A1和A2，凝血酶裂解的重鏈片段；LC，凝血酶裂解的輕鏈。凝血酶消化后該放射性標記蛋白質(zhì)的分析表明各自對應(yīng)于凝血酶裂解的輕鏈、A1和A2的分子大小，正常出現(xiàn)73kD和50和40kD片段。每個FVIII衍生物的名稱標記在頂部。分子量標記在每個圖像的左側(cè)顯示。
圖6顯示在哺乳動物載體中用于FVIII多肽的DNA構(gòu)建方案。
圖7A和7B顯示重組人FVIII和FVIII多肽的凝血酶活化作用動力學(xué)的比較。圖7A顯示重組人FVIII(rh FVIII)，dB761，dB782，dB761-739F和dB782-739F的凝血酶活化作用動力學(xué)。圖7B顯示重組人FVIII(rhFVIII)，dBN(57-50)，dBN(45-53)，dBN(57-56)，dBN(64-50)，dBN(64-53)和dBN(64-56)的凝血酶活化作用動力學(xué)。
優(yōu)選實施方案的詳述本申請中，“一”和“一個”用指單一的和復(fù)數(shù)的對象。
本文使用的，“約”或“基本上”通常提供限于一精確數(shù)值的可容許的誤差。例如，正如上下文中所用的多肽序列的長度或位置，“約”或“基本上”表明該多肽并不限于已指出的精確敘述的數(shù)目或位置，只要達到的功能和結(jié)果相同。一些氨基酸位置可被插入，缺失或添加或刪除N-或C末端，只要歸于上述氨基酸位置的功能活性，例如凝血酶裂解和蛋白酶裂解功能仍舊維持或直到功能相關(guān)位點的不同氨基酸的缺失或突變造成功能失活。
此外，本文使用的，“基本上類似的”核酸序列或氨基酸序列指與指明的參照序列具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同源性的序列。
本文使用的，“氨基酸”指所有天然存在的L-α-氨基酸。該定義意味著包括正亮氨酸，鳥氨酸和高半胱氨酸。
本文使用的，通常，術(shù)語″氨基酸序列變體″指與參照(例如天然的因子VIII序列)多肽相比在其氨基酸序列中存在一些差異的分子。該氨基酸的改變可以是在天然氨基酸序列中的替換、插入、缺失或任何所需的上述變化的組合。
替換變體為在天然序列中至少一個氨基酸殘基被除去而在該部位的同樣位置插入一個不同的氨基酸。替換可以是單個的，其中該分子中僅一個氨基酸被替換或可以是多個的，其中同樣的分子中兩個或更多的氨基酸被替換。
序列內(nèi)氨基酸的替換可以從氨基酸所屬種類的其他的成員中選擇。例如，非極性(疏水的)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。極性中性氨基酸包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天門冬酰胺和谷氨酰胺。帶正電荷的(堿性的)氨基酸包括精氨酸、賴氨酸和組氨酸。帶負電荷的(酸性的)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。落入本發(fā)明范圍的還包括其表現(xiàn)出同樣或類似生物活性的蛋白或片段或衍生物以及其在翻譯期間或之后經(jīng)不同修飾的衍生物，例如，通過糖基化作用、蛋白裂解、連接至抗體分子或其他細胞配體，等等。
插入變體為在天然氨基酸序列中緊鄰特定位置氨基酸插入一個或多個氨基酸的變體。緊鄰氨基酸意指連接至氨基酸的α-羧基或α-氨基官能團。
缺失變體為在天然氨基酸序列中一個或多個氨基酸被除去的變體。通常，缺失變體將在該分子特定區(qū)域中存在一兩個氨基酸的缺失。
一方面，本發(fā)明的多肽變體可包含在FVIII非關(guān)鍵區(qū)任何數(shù)目的氨基酸或氨基酸的改變，包括在該多肽分子的任何其他區(qū)域中的替換和/或缺失，只要該多肽變體包括與SEQ ID NO1的約1-740和/或1689-2332多肽序列有至少約70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，且該改變的存在沒有阻礙變體FVIII的活性。
本發(fā)明使用的氨基酸符號包括如下整個申請中使用氨基酸的單個或三字母的縮寫，且可交換使用，具有以下含義A或Ala＝丙氨酸；R或Arg＝精氨酸；N或Asn＝天門冬酰胺；D或Asp＝天冬氨酸；C或Cys＝半胱氨酸；Q Gln＝谷氨酰胺；E或Glu＝谷氨酸；G或Gly＝甘氨酸；H或His＝組氨酸；I或Ile＝異亮氨酸；L或Leu＝亮氨酸；K或Lys＝賴氨酸；M或Met＝甲硫氨酸；F或Phe＝苯丙氨酸；P或Pro ＝脯氨酸；S或Ser＝絲氨酸；T或Thr＝蘇氨酸；W或Trp＝色氨酸；Y或Tyr＝酪氨酸；以及V或Val＝纈氨酸。
本文使用的，“因子VIII衍生物”，“因子VIII變體”或“因子VIII多肽”指與全長人因子VIII相比具有凝結(jié)活性，更高的比活和類似的凝血酶活化作用特點，且與由SEQ ID NO1表示的多肽序列1-740和1689-2332區(qū)域有至少約70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽。特別地，可以明確的是多種突變和保守氨基酸的變化是容許的，而且某些非-保守氨基酸的變化，只要變體因子VIII具有凝結(jié)活性，也是容許的。片段和某些糖基化作用也是允許的，且優(yōu)選的，事實上所有對因子VIII多肽的任何變化都是允許的，只要該多肽保留其比活性。
申請人首次發(fā)現(xiàn)因子VIII衍生物，其具有缺失的或經(jīng)改變的B區(qū)域，其中在740和1689位的凝血酶裂解區(qū)保持完整，但在740和1689位間的許多區(qū)域可以缺失，包括1648位，而不會對該變體因子VIII的比活性引起任何負面影響。因此，對該序列作某些改變，其保持因子VIII的比活性，應(yīng)該是在本領(lǐng)域技術(shù)人員能力范疇內(nèi)的。
本文使用的，術(shù)語″能在高嚴謹條件下雜交″指在高嚴謹條件下DNA互補鏈與目的DNA的退火。同樣地，術(shù)語″能在低嚴謹條件下雜交″指在低嚴謹條件下DNA互補鏈與目的DNA的退火。退火過程的“高嚴謹條件”可包括，例如，高溫和/或低鹽濃度，其不利于在錯配堿基對中氫鍵的接觸?！暗蛧乐敆l件”可包括比高嚴謹條件的較低的溫度和/或較高的鹽濃度。上述條件如果充分，允許兩條DNA鏈退火，不過兩條鏈之間并非是近于完全互補的，在編碼同樣蛋白的DNA鏈中由于遺傳密碼的簡并性而序列不同是常見的情況。促進DNA雜交的適當?shù)膰乐敆l件，例如，約45℃，6×SSC，隨后在50℃，2×SSC洗滌是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的或可參見Current Protocols in MolecularBiology中查得，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)，6.31-6.3.6。例如，在洗滌步驟中鹽濃度可選自低嚴謹度的約2×SSC，50℃至高嚴謹度的約0.2×SSC，50℃。此外，洗滌步驟中的溫度可從低嚴謹度的室溫下，約22℃，提高至高嚴謹度條件，約75℃。其他嚴謹度參數(shù)在Maniatis，T.，等，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring N，Y.，(1982)，pp.387-389中描述；也參見Sambrook J.等，Molecular CloningA Laboratory Manual，Second Edition，Volume 2，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring，N.Y.pp.8.46-8.47(1989)。
本文使用的，“載體”包括藥學(xué)可接受載體，賦形劑或穩(wěn)定劑，其對暴露于其所用劑量和濃度的細胞或哺乳動物是無毒性的。通常藥學(xué)可接受載體為水相的pH緩沖溶液。藥學(xué)可接受載體的實例包括非限制性的緩沖液如磷酸鹽、檸檬酸鹽，及其他有機酸類；抗氧化劑包括抗壞血酸；低分子量(小于約10殘基)多肽；蛋白，如血清清蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天門冬酰胺、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖，及其他碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑如EDTA；糖醇如甘露糖醇或山梨糖醇；鹽-形成的平衡離子如鈉；和/或非離子型表面活性劑如TWEEN、聚乙二醇(PEG)和PLURONICS。
本文使用的，“共價衍生物”包括該多肽或其片段用有機蛋白質(zhì)的或非蛋白質(zhì)的衍生劑的修飾和翻譯后修飾。通過將靶氨基酸殘基與有機衍生劑(其能與所選的側(cè)鏈或末端殘基反應(yīng))反應(yīng)，或通過在所選的重組宿主細胞中起作用的翻譯后修飾機制，可以常規(guī)地引入共價修飾。有些翻譯后修飾是重組宿主細胞對已表達多肽作用的結(jié)果。谷氨酰胺酰殘基和天冬酰胺酰殘基經(jīng)常在翻譯后脫氨基形成相應(yīng)的谷氨酰和天冬氨酰殘基?；蛘?，這些殘基可以在微酸性條件下脫氨基。該殘基的任何形式都可以存在于本發(fā)明的因子VIII多肽中。其他翻譯后修飾包括脯氨酸和賴氨酸的糖基化、羥基化，絲氨酸、酪氨酸或蘇氨酸殘基的羥基的磷酸化，賴氨酸、精氨酸的α-氨基基團和組氨酸側(cè)鏈的甲基化(T.E.Creighton，ProteinsStructure and MolecularProperties，W.H.Freeman & Co.，San Francisco，pp.79-86(1983))。
本文使用的，“有效量”為引起有利的或所需的臨床或生化結(jié)果的足夠量。有效量可一次或多次給予。對于本發(fā)明來說，抑制劑化合物的有效量為足以減輕、改善、穩(wěn)定、反轉(zhuǎn)、變慢或延遲疾病狀態(tài)發(fā)展的量。在本發(fā)明一優(yōu)選的實施方案中，“有效量”定義為能產(chǎn)生血液凝結(jié)的化合物的量。
本文使用的，“片段”指多肽的一部分，其保持有效的和能發(fā)揮功能的特點。例如，如本發(fā)明上下文所使用的，因子VIII多肽片段具有凝結(jié)血液的功能。
本文使用的，“宿主細胞”包括單個細胞或細胞培養(yǎng)物，其能夠或已成為本發(fā)明載體的受體。宿主細胞包括單個宿主細胞的子代，且該子代因正常的、隨機的或有意的突變和/或變化而不必與原母細胞完全等同(在形態(tài)學(xué)上或DNA互補性上)。宿主細胞包括用包含編碼血管生成因子的多核苷酸的載體體內(nèi)轉(zhuǎn)染或感染的細胞。
本文使用的，為了治療的“哺乳動物”指分類為哺乳動物的任何動物，包括人，家畜和農(nóng)畜和動物園的，運動的或?qū)櫸飫游铮绻?、貓、牛、馬、羊、豬等等。優(yōu)選地，哺乳動物為人。
本文使用的，“純化的”或“分離的”分子指從其天然環(huán)境中移出而隔離或分離，且與通常和其相聯(lián)系的其他組分游離的生物分子。
本文使用的，“樣品”或“生物樣品”指其廣義的含義，包括從個體獲得的任何生物樣品、體液、細胞系、組織培養(yǎng)物或其他來源，此外，從患者獲得的“生物樣品”可指“生物樣品”或“患者樣品”。
本文使用的，“序列同一性”，定義為將序列比對后并在必要時引入缺口以便實現(xiàn)最大限度的序列同一性百分比，而且不將任一保守性替換計入序列同一性時，候選序列中與天然多肽序列中氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分比。％序列同一性值通過Altschul等，(1997)″Gapped BLAST and PSI-BLASTa new generation of proteindatabase search programs″，Nucleic Acids Res.，253389-3402定義的NCBI BLAST2.0軟件生成。參數(shù)設(shè)置為缺省值，除了錯配罰分，其設(shè)為-1。
本文使用的，術(shù)語FVIII多肽的“比活性”或“比生物活性”指功能性FVIII分子用存在于總FVIII分子中的凝結(jié)活性的定量測定，其通過FVIII凝結(jié)活性與和因子VIII多肽相關(guān)的FVIII抗原量的比率表示。與全長人因子VIII相比，比活性或比生物活性受多因子的影響，如凝結(jié)活性的效力、凝血酶活化作用特點、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性以及構(gòu)型。
本文使用的，“受試者”為脊椎動物，優(yōu)選哺乳動物，更優(yōu)選人。
本文使用的，“治療“為獲得有利的或所需的臨床結(jié)果的方案。對本發(fā)明而言，有利的或所需的臨床結(jié)果包括，但不限于，癥狀的減輕、疾病程度的降低、疾病狀態(tài)的穩(wěn)定(即，不惡化)、疾病進程的延遲或變緩、疾病狀態(tài)的改善或緩和和減輕(無論是部分或總體而言)，無論是可檢測的或不可檢測的?！爸委煛边€指與未接受治療所預(yù)期的生存相比延長生存時間?！爸委煛敝讣戎委煼ㄓ种割A(yù)防法或預(yù)防措施。那些需要治療的包括已患有病癥的以及那些將預(yù)防病癥的。“減輕”疾病意指與不加治療相比，疾病狀態(tài)的程度和/或不良的臨床表現(xiàn)得到減輕和/或疾病的發(fā)展時程得到減緩或延長。
本文使用的，“載體”，“多核苷酸載體”，“構(gòu)建體”和“多核苷酸構(gòu)建體”可在此互換使用。本發(fā)明的多核苷酸載體可以是任何形式，包括但不限于，RNA、DNA、包含在反轉(zhuǎn)錄病毒外殼中的RNA、包含在腺外殼中的DNA、包裝在另一個病毒或病毒-樣形式(如單純皰疹和腺相關(guān)病毒(AAV))中的DNA、包含在脂質(zhì)體中的DNA，用聚賴氨酸復(fù)合的、用合成的聚陽離子分子復(fù)合的、用化合物如聚乙二醇(PEG)復(fù)合的DNA以免疫性地“屏蔽”該分子和/或提高半衰期或共綴合至非-病毒蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，多核苷酸為DNA。本文使用的，“DNA”不僅包括堿基A、T、C和G，也包括任何這些堿基的類似物或改良型，如甲基化核苷酸，核苷酸間修飾比如不帶電的連接和硫代酸酯，糖類似物的利用，以及修飾的和/或替換的主鏈結(jié)構(gòu)，如聚酰胺。
因子VIII多肽提供新DNA構(gòu)建體和包括生產(chǎn)具有FVIII活性多肽的宿主細胞的新組合物。具有FVIII活性的多肽包括FVIII的缺失突變體蛋白，其中中心區(qū)或″B結(jié)構(gòu)域″的大部分缺失。包括編碼具有FVIII活性的缺失多肽的DNA的質(zhì)粒構(gòu)建體用來轉(zhuǎn)化宿主細胞。轉(zhuǎn)化的宿主細胞隨后生長以表達基因。該宿主細胞可以是真核或原核細胞。人FVIII具有顯示在圖1A和1B中的序列(SEQ ID NO1)。氨基酸序列的編號以A-1開始，為19個氨基酸信號序列后的第一個氨基酸。FVIII的最后氨基酸為Y-2332。該編號方案貫穿說明書而使用。
本發(fā)明的多肽包括FVIII衍生物，即至少具有一個與人FVIII天然形式的氨基酸序列有序列相似性的氨基酸序列的化合物。該衍生物通常具有比人FVII天然形式更少的氨基酸數(shù)目。
隨著對FVIII裂解和活化作用結(jié)構(gòu)要求的更深的了解，我們設(shè)計了有功能的B結(jié)構(gòu)域缺失的FVIII，其作為單鏈多肽表達和分泌以致提高了在藥物制備過程中的回收率。我們檢驗了該假設(shè)，即B結(jié)構(gòu)域的N末端與A3-C1-C2輕鏈氨基酸序列(從Glu-1649至Pro-1688)的融合將產(chǎn)生單一多肽FVIII分子。如本發(fā)明所述，一些FVIII衍生物具有無法與野生型區(qū)別的一般凝血酶活化作用的特點和比野生型FVIII以及其他B-結(jié)構(gòu)域缺失FVIII衍生物優(yōu)越的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。此外，大多數(shù)衍生物具有在哺乳動物細胞中更高效表達的附加優(yōu)點。本發(fā)明表明缺少大部分結(jié)構(gòu)域B以及部分結(jié)構(gòu)域A3，但仍然保持相對于氨基酸740和1689位(其似乎為活化作用所必需)成熟位點的分子表現(xiàn)出正常的促凝劑活性。該分子可通過凝血酶作用于天然的人FVIII的同樣方式激活。
新的目的多肽將很大程度上具有包括N末端重鏈區(qū)，連接間隔區(qū)和C末端輕鏈區(qū)的通式。B-結(jié)構(gòu)域缺失的FVIII衍生物的圖示在圖2中呈現(xiàn)。N末端重鏈區(qū)表征為具有和基于全長人FVIII氨基酸序列A-1至R-740的連續(xù)序列對應(yīng)的氨基酸序列。
連接間隔多肽由基本上與帶有氨基酸746至1649，746至1652，746至1655，758至1649，758至1652，758至1655，765至1649，765至1652，765至1655，748至1658，755至1658，762至1658，769至1658，776至1658或783至1658內(nèi)缺失的結(jié)構(gòu)域B和A3-結(jié)構(gòu)域序列(從S-741至P-1688)對應(yīng)的氨基酸序列的短連接基團組成。
C末端輕鏈表征為具有和基于FVIII序列R-1689至Y-2332的連續(xù)序列類似的氨基酸序列。本發(fā)明的變體，其包含相對于天然FVIII分子的內(nèi)缺失，優(yōu)選包含(i)上述內(nèi)缺失；或(ii)在(i)中特定區(qū)域內(nèi)較少氨基酸的缺失。本發(fā)明包含內(nèi)缺失的其他變體可包括在R-1649和P-1688間一個或多個氨基酸的缺失以將任何氨基酸序列融合入A1，A2和B結(jié)構(gòu)域。圖2顯示dB747和dBN(45-50)FVIII衍生物的例證性的代表，其與人FVIII相比分別具有氨基酸748至1658和746至1649的內(nèi)缺失。
該B結(jié)構(gòu)域缺失的FVIII衍生物沒有保持用于胞內(nèi)蛋白酶解加工的位點，如殘基Arg-1648，其導(dǎo)致包括單鏈多肽為主的均一FVIII衍生物的產(chǎn)生。80kDa切割位點的去除(R-1648)沒有降低在條件培養(yǎng)基中產(chǎn)生的因子VIII的活性。此外，本發(fā)明的一些衍生物這里沒有顯示在凝血酶活化作用倍數(shù)上的顯著變化。該結(jié)果在此證實R-1648的去除沒有影響FVIII衍生物從細胞的合成或分泌。此外，產(chǎn)生的主要FVIII種類為大約170kDa的單鏈分子，這是80kD位置處胞內(nèi)加工位點喪失的結(jié)果。該單鏈FVIII變體在這一點上是有利的，即它們可以均一的形式產(chǎn)生并且相對于天然的人或其他的重組FVIII可具有改善的藥物動力學(xué)特點。
全長FVIII中，Arg殘基372，740和1689后的凝血酶裂解激活FVIII的促凝劑活性。這與由A1亞單位與凝血酶-裂解A3-C1-C2輕鏈以二價-金屬-離子-依賴的結(jié)合和游離的A2亞單位與A1結(jié)構(gòu)域通過離子相互作用的結(jié)合組成的FVIIIa異三聚體是一致的。全長FVIII中，Arg-1689后的裂解除去了從R-1648至R-1689的酸性氨基酸富集區(qū)，且是FVIIIa從vWF的解離而使得FVIIIa與磷脂有效的相互作用所必需的。本發(fā)明放射標記的FVIII衍生物蛋白質(zhì)在凝血酶消化后的分析顯示73kD和50和40kD片段的正常出現(xiàn)(參見圖5C)。該結(jié)果證實已公開的FVIII衍生物可通過凝血酶以和完整的天然分子同樣的方式激活。如本發(fā)明所證實的，這些FVIII衍生物表現(xiàn)出與Arg-372，Arg-740和Arg-1689后裂解相應(yīng)的特有的凝血酶活化作用，其產(chǎn)生無法與野生型FVIII區(qū)分的激活的FVIII異三聚體，并且也通過A2結(jié)構(gòu)域亞單位的解離而經(jīng)受快速的失活(參見圖7)。
本發(fā)明的一個方面涉及變體，其中通過將B結(jié)構(gòu)域中的Asn氨基酸融合至A3結(jié)構(gòu)域中的X-蘇氨酸或X-絲氨酸氨基酸序列且同時帶有如上所述的內(nèi)序列缺失而產(chǎn)生人工的N-糖基化位點?；蛘撸谠撊诤衔稽c的N-糖基化識別序列的三肽序列(Asn-X-Ser/Thr，其中X可以是任何氨基酸)可通過將分別緊接于745，757和764位Asn氨基酸的746，758和765位的氨基酸直接連接至1651，1654和1657位的Ser或Thr氨基酸而產(chǎn)生。這些FVIII變體與人FVIII相比將帶有氨基酸747至1650，747至1653，747至1656，759至1650，759至1653，759至1656，766至1650，766至1653或766至1656的內(nèi)缺失。共有序列N-糖基化位點包括通式天門冬酰胺-X-蘇氨酸或天門冬酰胺-X-絲氨酸的三肽序列，其中X通常可以是任何氨基酸。尤其是，在本發(fā)明的一個方面中，X可以是脯氨酸除外的任何氨基酸。本發(fā)明這方面的包括基因工程化N-糖基化位點位于B和A3結(jié)構(gòu)域間融合位點的變體可防止該融合位點的潛在新抗原表位序列暴露于免疫系統(tǒng)。
本發(fā)明的另一方面涉及衍生物，其中一個或多個因子Xa，APC和凝血酶切割位點被修飾以使得上述位點對特異性蛋白酶解更穩(wěn)定。目前特定目的衍生物的一個亞組包括那些包含在P-739位修飾的，其中優(yōu)選苯丙氨酸，但可用不同的氨基酸替換或缺失。本發(fā)明中帶有739位氨基酸修飾的FVIII衍生物的合成和分泌不受影響。這些變體通過凝血酶比全長FVIII以及其他本發(fā)明的FVIII衍生物表現(xiàn)出更高的激活率(參見圖7)。提高的活性可歸因于在顯色測定中對通過因子Xa裂解的失活的抗性。因此，這些改變看起來產(chǎn)生了具有活性提高額外優(yōu)點的FVIII的更穩(wěn)定形態(tài)。然而，根據(jù)美國專利No.5,422,260和5,451,521，發(fā)現(xiàn)在740位具有精氨酸至異亮氨酸突變的B-結(jié)構(gòu)域缺失的FVIII衍生物在突變后具有較小的活性。
盡管假定通過B結(jié)構(gòu)域的N末端區(qū)與A3-C1-C2輕鏈的氨基酸序列(從Glu-1649至Pro-1688)的融合產(chǎn)生的所有多肽FVIII分子將產(chǎn)生類似的促凝劑活性特點，在本發(fā)明中仍發(fā)現(xiàn)具有獨特凝血酶活化作用特點和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的單個B-結(jié)構(gòu)域缺失的FVIII衍生物。因此，本發(fā)明中我們詳細表征了單個B-結(jié)構(gòu)域缺失的FVIII衍生物的分子特征以得到有活性的，安全的單鏈B-結(jié)構(gòu)域缺失的FVIII衍生物，其具有凝血酶活化作用和生產(chǎn)率提高的類似特點。
編碼因子VIII多肽的核酸通過“分離的”多核苷酸序列，其試圖包含核酸分子，DNA或RNA，其已從天然環(huán)境中移出。這些包括編碼本發(fā)明FVIII多肽的DNA片段，且可進一步包含異源序列如載體序列或其他外源DNA。例如，包含在載體中的重組DNA分子被認為是用于本發(fā)明目的而分離的，其可以是部分或基本上得到純化的。
此外，本發(fā)明分離的核酸分子包括DNA分子，其包含基本上不同于上述那些分子的序列，但由于遺傳密碼的簡并性或其他可變性，仍然編碼本發(fā)明的FVIII多肽。因此，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言產(chǎn)生上述變體是很常規(guī)的，例如，優(yōu)化適于特定宿主的密碼子表達或一般功能。
在另一個方面，本發(fā)明提供分離的核酸分子，其包括在嚴謹雜交條件下與本發(fā)明上述的核酸分子中的多核苷酸一部分雜交的多核苷酸。如上所述，雜交的多核苷酸可用作探針和引物。與FVIII多肽編碼序列雜交的多核苷酸部分可通過5′和3′堿基的位置或如上所述的核苷酸堿基數(shù)值而精密表示或以同樣的方式精密排除。同樣地，與FVIII多肽雜交的多核苷酸部分也可用作探針和引物。本發(fā)明優(yōu)選的雜交多核苷酸為那些，當被標記而用于現(xiàn)有技術(shù)已知的雜交檢測時(例如Southern和Northern印跡分析)，即使其他異源序列以等摩爾量存在，其顯示最大的信號強度。
在選擇適于本發(fā)明載體轉(zhuǎn)染的優(yōu)選的宿主細胞時，載體包含編碼FVIII衍生物和例如，二氫葉酸還原酶(DHFR)蛋白的DNA序列，根據(jù)所用DHFR蛋白的類型選擇宿主是恰當?shù)?。如果?yīng)用野生型DHFR蛋白，優(yōu)先選擇DHFR缺陷的宿主細胞，由此允許DHFR編碼序列作為在缺乏次黃嘌呤，甘氨酸和胸苷的選擇培養(yǎng)基中成功轉(zhuǎn)染的標記的應(yīng)用。
另一方面如果，如果對氨甲喋呤(MTX)具有弱結(jié)合親合力的DHFR蛋白用作調(diào)節(jié)序列，則就不必使用DHFR抗性細胞。突變DHFR對MTX有抗性，因此，包含MTX的培養(yǎng)基可用作如果宿主細胞自身對MTX敏感的選擇工具?；蛘?，野生型DHFR基因可在不缺乏DHFR的宿主細胞中用作擴增標記，如果使用另外的藥物篩選標記，如潮霉素抗性。所述實例描述了抗MTX的CHO細胞(CHO-DBX11細胞)作為宿主細胞以及使用CMV和SV40啟動子作為調(diào)節(jié)序列以分別驅(qū)動FVIII衍生物和DHFR表達的表達載體的使用。
變體和突變多核苷酸所述核酸變體包括通過核苷酸替換，缺失或添加產(chǎn)生的核酸。替換，缺失或添加可包括一個或多個核苷酸。氨基酸序列的改變可產(chǎn)生保守的或非-保守的氨基酸替換、缺失或添加。其中特別優(yōu)選沉默替換、添加和缺失，其沒有改變本發(fā)明多肽或其部分的性質(zhì)和活性。這方面還優(yōu)選的為保守替換。
本發(fā)明涉及序列在表達載體中的使用，以及用于轉(zhuǎn)染宿主細胞和細胞系，其為原核或真核細胞。本發(fā)明還涉及從表達載體表達的多肽的純化。該表達載體可包含用于便利純化的不同分子標簽。隨后獲得的表達構(gòu)建體可轉(zhuǎn)化入任何可選的宿主細胞。宿主細胞的細胞裂解物通過本領(lǐng)域熟知的已建立的方法分離。
變體和突變多肽可利用氨基酸工程改善或改變本發(fā)明FVIII多肽的特性。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的重組DNA技術(shù)可用于創(chuàng)建新的包括單個或多個氨基酸替換、缺失、添加的突變多肽或融合蛋白。上述修飾的多肽可表現(xiàn)出，例如，提高的/降低的活性或提高的/降低的穩(wěn)定性。此外，至少在某些純化和儲藏條件下，其可比相應(yīng)的天然多肽以更高的產(chǎn)率純化且表現(xiàn)出更好的可溶性。
抗體在一實施方案中，本發(fā)明涉及使用多種檢測方法檢測FVIII多肽的存在。檢測因子VIII多肽的一種方法是標記特異性結(jié)合FVIII多肽的配體。上述配體可以是抗體。
純化的FVIII多肽可用于生產(chǎn)單克隆或多克隆抗體。因子VIII多肽的片段也可用于生產(chǎn)單克隆或多克隆抗體。隨后獲得的單克隆或多克隆抗體可用于在不同的樣品包括細胞，組織和體液如但不限于血液，血清，血漿和尿中確定FVIII多肽的存在。FVIII多肽可使用多種分子生物學(xué)方法測定，其包括但不限于原位雜交，免疫沉淀反應(yīng)，免疫熒光染色，Western印跡分析等等。我們可以通過使用針對FVIII多肽的單克隆抗體進行ELISA以確定生物樣品中FVIIII多肽的量，生物樣品包括被認為患有血凝結(jié)病癥，如血友病的受試者的體液。
本發(fā)明的抗體包括，但不限于，多克隆的、單克隆的、多特異性的、人的、人源化的或嵌合的抗體、單鏈抗體、Fab片段、F(ab′)片段、通過Fab表達文庫產(chǎn)生的片段、抗-特異型(抗-Id)抗體(包括，例如，抗-Id抗體至本發(fā)明的抗體)和所有上述的抗原表位-結(jié)合片段。本文使用的術(shù)語″抗體″，指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活化部分，即，包含免疫特異性結(jié)合抗原的抗原結(jié)合部位的分子。本發(fā)明的免疫球蛋白分子可以是任何類型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)，種類(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或免疫球蛋白分子的亞類。
本發(fā)明的抗體可以是單特異性的，雙特異性的，三特異性的或更多的多特異性的。多特異性抗體可特異于本發(fā)明多肽的不同表位或可特異于本發(fā)明多肽以及異源表位，如異源多肽或固相支持材料。
本發(fā)明的抗體可依據(jù)本發(fā)明多肽的表位或部分描述或說明，其由抗體識別或特異性結(jié)合。抗原表位或多肽部分可如此處所述的，例如，通過糖基化位點，N末端和C末端位置或通過連續(xù)氨基酸殘基的大小而說明。
本發(fā)明的抗體可用于例如，但不限于，純化、檢測和本發(fā)明多肽的靶向，包括體外和體內(nèi)的診斷和治療方法。例如，抗體用于對生物樣品中定性和定量測定本發(fā)明FVIII多肽水平的免疫測定。
如以下更詳細的論述，本發(fā)明的抗體可單獨使用或與其他組合物聯(lián)合使用?？贵w可進一步重組融合至異源多肽N-或C-末端或化學(xué)綴合(包括共價和非-共價綴合)至多肽或其他組合物。例如，本發(fā)明的抗體可重組融合或綴合至在檢測測定中用作標記的分子和效應(yīng)分子如異源多肽，藥物，放射性核素或毒素。
本發(fā)明的抗體可通過任何本領(lǐng)域已知的合適方法產(chǎn)生。目的抗原的多克隆抗體可通過本領(lǐng)域熟知的各種方法生產(chǎn)。例如，本發(fā)明的多肽可給予不同的宿主動物包括但不限于，兔、小鼠、大鼠等等以誘導(dǎo)包含特異于抗原的多克隆抗體的血清的產(chǎn)生。各種佐劑可用來提高取決于宿主種類的免疫應(yīng)答，包括但不限于，弗氏(完全的和不完全的)、礦物凝膠如氫氧化鋁，表面活性物質(zhì)如溶血卵磷脂、復(fù)合多元醇、聚陰離子、肽、油乳化液、鑰孔血藍素、二硝基酚和可能有用的人佐劑如卡介苗(bacille Calmette-Guerin)和小棒狀桿菌。上述佐劑也在本領(lǐng)域中熟知。
單克隆抗體可使用本領(lǐng)域已知的多種技術(shù)準備，包括雜交瘤、重組體和噬菌體展示技術(shù)或其聯(lián)合的使用。例如，可使用包括本領(lǐng)域已知的那些雜交瘤技術(shù)生產(chǎn)單克隆抗體。本文使用的術(shù)語“單克隆抗體”并不限于通過雜交瘤技術(shù)生產(chǎn)的抗體。術(shù)語“單克隆抗體”指來源于單一克隆的抗體，包括任何真核的，原核的或噬菌體克隆，而不是生產(chǎn)其的方法。
使用雜交瘤技術(shù)以生產(chǎn)和篩選特定抗體的方法屬于常規(guī)的且在本領(lǐng)域熟知。在一非限制性實施例中，可用因子VIII多肽或表達上述單位的細胞免疫小鼠。一旦檢測到免疫應(yīng)答，例如，在小鼠血清中檢測到特異于抗原的抗體，則收獲小鼠脾臟且分離脾細胞。該脾細胞隨后通過熟知的技術(shù)融合至任何合適的骨髓瘤細胞，例如源于從ATCC可獲得的細胞系SP20的細胞。通過極限稀釋選擇和克隆雜交瘤。為了獲得分泌能結(jié)合本發(fā)明多肽的抗體的細胞或其結(jié)合配偶體的復(fù)合物，雜交瘤克隆隨后通過本領(lǐng)域已知的方法測定。腹水，其通常包含高水平的抗體，可通過用陽性雜交瘤克隆免疫小鼠而產(chǎn)生。
抗體還可附著于固相支持體上，其對靶抗原的免疫測定或純化尤其有用。上述固相支持體包括，但不限于，玻璃、纖維素、聚丙烯酰胺、尼龍、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。
用于抗體結(jié)合的測定法本發(fā)明的抗體可通過本領(lǐng)域已知的任何方法用于免疫特異性結(jié)合的測定?？捎玫拿庖邷y定包括但不限于使用不一一列舉的，如Western印跡、放射免疫測定、ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定)、″夾層″免疫測定、免疫沉淀反應(yīng)測定、沉淀素反應(yīng)、凝膠擴散沉淀素反應(yīng)、免疫擴散測定、凝集測定、補體-固定測定、免疫放射測定法、熒光免疫測定、蛋白A免疫測定技術(shù)的競爭性和非-競爭性測定體系。上述測定法是常規(guī)的且在本領(lǐng)域熟知的(參見，例如，Ausubel等，eds，1994，CurrentProtocols in Molecular Biology，Vol.1，John Wiley & Sons，Inc.，New York，此處作為參考整體引入)。以下簡要描述例證性的免疫測定法，但并不試圖作為限制。
免疫沉淀法方案通常包括在裂解緩沖液如補充蛋白質(zhì)磷酸酶和/或蛋白酶抑制劑(例如，EDTA，PMSF，抑肽酶，釩酸鈉)的RIPA緩沖液中(1％NP-40或Triton X-100，1％脫氧膽酸鹽鈉，0.1％SDS，0.15M NaCl，0.01M磷酸鈉，pH7.2，1％抑肽酶)裂解細胞群，將目的抗體加入該細胞裂解物，4℃孵育一段時間(例如，1-4小時)，將A蛋白和/或G蛋白瓊脂糖凝膠磁珠加入該細胞裂解物，4℃孵育約一小時或以上，在裂解緩沖液中洗滌磁珠且將珠重懸入SDS/樣品緩沖液中。目的抗體免疫沉淀特定抗原的能力可通過例如，Western印跡分析而評定。本領(lǐng)域的技術(shù)人員知曉可以修改參數(shù)以增強抗體與抗原的結(jié)合并且降低背景(例如，用瓊脂糖凝膠珠預(yù)先-凈化細胞裂解物)。對于免疫沉淀法方案的更進一步討論可參見，例如，Ausubel等，eds，1994，CurreintProtocols in Molecular Biology，Vol.1，John Wiley & Sons，Inc.，New York，10.16.1。
Western印跡分析通常包括制備蛋白樣品，蛋白樣品在聚丙烯酰胺凝膠(例如，8％-20％SDS-PAGE，取決于抗原分子量)中的電泳，將蛋白樣品從聚丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)移至膜如硝酸纖維素、PVDF或尼龍膜，在封閉緩沖液中(例如，含3％BSA的PBS或脫脂奶粉)封閉膜，在洗滌緩沖液中(例如，PBS-Tween20)洗滌膜，用稀釋在封閉緩沖液中的一抗(目的抗體)封閉膜，在洗滌緩沖液中洗滌膜，用稀釋在封閉緩沖液中的綴合到酶作用底物(例如，辣根過氧化酶或堿性磷酸酶)或放射性的分子(例如，32P或125I)的二抗(其識別一抗，例如抗-人抗體)封閉膜，在洗滌緩沖液中洗滌膜，然后檢測抗原的存在。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉可以修改參數(shù)以增強檢測的信號且降低背景噪音。對于Western印跡方案的更進一步討論可參見，例如，Ausubel等，eds，1994，CurrentProtocols in Molecular Biology，Vol.1，John Wiley & Sons，Inc.，New York，10.8.1。
ELISA包括制備抗原，其可包括包含因子VIII多肽的樣品，用該抗原包被96孔微量滴定板的孔，將綴合至可檢測化合物如酶作用底物(例如，辣根過氧化酶或堿性磷酸酶)的目的抗體加入孔然后孵育一段時間，隨后檢測抗原的存在。ELISA中目的抗體并非必須綴合至可檢測化合物；而是綴合至可檢測化合物的二抗(其識別目的抗體)加入孔中。更進一步地，抗體可包被孔而不是用抗原來包被。在這種情況下，綴合至可檢測化合物的二抗可同時或跟隨目的抗原的加入而加入包被的孔。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉可以修改參數(shù)以增強檢測的信號以及本領(lǐng)域已知的ELISA的其他改變。對于ELISA的更進一步討論可參見，例如，Ausubel等，eds，1994，Current Protocols in Molecular Biology，Vol.1，John Wiley & Sons，Inc.，New York at 11.2.1。
基因治療在一具體的實施方案中，通過基因治療的方法，包括編碼因子VIII多肽序列的核酸被給予以治療，抑制或防止疾病或與本發(fā)明多肽的和/或活性異常表達相關(guān)的病癥。基因治療指通過將表達的或可表達的核酸給予患者而進行的治療。在本發(fā)明的實施方案中，核酸產(chǎn)生其編碼的蛋白以介導(dǎo)治療效果。
根據(jù)本發(fā)明，可使用本領(lǐng)域中任何有效的用于基因治療的方法。例證性的方法描述如下。
對于基因治療方法的一般綜述，參見Goldspiel等，ClinicalPharmacy12488-505(1993)；Wu和Wu，Biotherapy387-95(1991)；Tolstoshev，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32573-596(1993)；Mulligan，Science 260926-932(1993)；以及Morgan和Anderson，Ann.Rev.Biochem.62191-217(1993)；May，TIBTECH11(5)155-215(1993)。Ausubel等(ed s.)，Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley & Sons，NY(1993)；以及Kriegler，Gene Transferand Expression，A Laboratory Manua l，Stockton Press，NY(1990)中描述了可用的本領(lǐng)域中通常已知的重組DNA技術(shù)的方法。
在一優(yōu)選的方面，核酸序列可編碼因子VIII多肽，其中該核酸序列為在合適的宿主中表達多肽的表達載體的一部分。尤其是，上述核酸序列具有與多肽編碼區(qū)有效連接的啟動子，所述啟動子為誘導(dǎo)型的或組成型的，并且，選擇性地，為組織特異性的。在另一個具體的實施方案中，使用核酸分子，其中多肽編碼序列和任何其他所需序列位于在基因組中所需位點促進源重組的區(qū)域的側(cè)翼，由此提供了該抗體編碼核酸的染色體內(nèi)表達(Koller和Smithies，Proc.Natl.Acad.Sci.USA868932-8935(1989)；Zijlstra等，Nature342435-438(1989)。
核酸傳遞入患者可以是直接的，而在這樣情況下患者直接暴露于核酸或核酸-傳送載體或是間接的，在這樣情況下，首先體外核酸轉(zhuǎn)化細胞，隨后移植入患者中。這兩種方法分別作為體內(nèi)或離體的基因治療是已知的。
在一具體的實施方案中，核酸序列直接體內(nèi)給予，其中其表達產(chǎn)生編碼產(chǎn)物。這可通過本領(lǐng)域已知的多種方法完成，例如，通過將其構(gòu)建為合適核酸表達載體的一部分且給藥以使得其成為胞內(nèi)的，例如通過使用缺陷型或減毒型反轉(zhuǎn)錄病毒或其他病毒載體感染或通過裸DNA的直接注射或用脂質(zhì)體或細胞表面受體或轉(zhuǎn)染試劑包被，包裹在脂質(zhì)體，微粒或微囊中或通過將其連接至已知入核的多肽而給藥，通過將其連接至經(jīng)受受體介導(dǎo)的胞吞作用的配體而給藥(參見，例如，Wu和Wu，J.Biol.Chem.2624429-4432(1987))(其可用于特異表達該受體的靶細胞類型)等等。在另一實施方案中，可形成核酸-配體復(fù)合物，其中配體含有fusogenic病毒肽以破壞內(nèi)體，使核酸避免溶酶體的降解。還是在另一個實施例中，核酸可通過靶向特異受體而在體內(nèi)被靶向用于細胞特異的攝取和表達?；蛘?，核酸可通過同源重組(Koller和Smithies，Proc.Natl.Acad.Sci.USA868932-8935(1989)；Zijlstra等，Nature342435-438(1989))而導(dǎo)入胞內(nèi)并且整合入宿主細胞DNA用于表達。
在一具體的實施方案中，使用包含編碼該多肽的核酸序列的病毒載體。用于基因治療的編碼該多肽的核酸序列克隆入一個或多個載體，其促進基因向患者的傳遞。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，腺病毒載體和腺相關(guān)病毒為可用的病毒載體的實例。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包含病毒基因組正確包裝所需的組分并且整合進宿主細胞DNA。
另一個基因治療的方法包括通過這樣的方法如電穿孔法，脂轉(zhuǎn)染，磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染或病毒感染將基因傳遞至組織培養(yǎng)過程中的細胞。通常，該傳遞方法包括篩選標記傳遞至細胞。細胞隨后進行選擇以分離那些已吸收并且表達所傳遞基因的細胞。那些細胞隨后投遞至患者。
在這實施方案中，核酸在體內(nèi)給藥前導(dǎo)入細胞而得到重組細胞。上述導(dǎo)入可通過本領(lǐng)域已知的任何方法進行，包括但不限于轉(zhuǎn)染，電穿孔法，顯微注射，用包含該核酸序列的病毒或噬菌體載體傳染，細胞融合，染色體-介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移，微細胞-介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移，原生質(zhì)球融合等等。用于外源基因?qū)爰毎亩喾N技術(shù)為本領(lǐng)域已知的并且可根據(jù)本發(fā)明而使用，只要該受體細胞的必要發(fā)育和生理機能不被破壞。該技術(shù)將提供核酸至細胞的穩(wěn)定傳遞，以使該核酸為可通過該細胞表達的且優(yōu)選可通過其細胞子代遺傳的和表達的。
用于基因治療的可導(dǎo)入核酸的細胞涵蓋任何所需的，可得到的細胞類型，且包括但不限于上皮細胞、內(nèi)皮細胞、角化細胞、成纖維細胞、肌細胞、肝細胞；血細胞如T-淋巴細胞、B-淋巴細胞、單核細胞、巨噬細胞、嗜中性白細胞、嗜酸性粒細胞、巨核細胞、粒細胞；各種干或祖細胞，尤其是造血干或祖細胞，例如，如從骨髓、臍帶血、外周血、胎兒的肝臟等等中獲得的。
在一優(yōu)選的實施方案中，用于基因治療的細胞為患者自體的。
在一實施方案中，其中重組細胞用于基因治療，編碼該多肽的核酸序列導(dǎo)入細胞使得它們?yōu)榭赏ㄟ^細胞或其子代表達的，并且該重組細胞隨后用于治療作用而給予體內(nèi)。在一具體的實施方案中，使用干或祖細胞。任何可在體外分離和維持的干和/或祖細胞可根據(jù)本發(fā)明的實施方案而使用。
在一具體的實施方案中，用于基因治療而導(dǎo)入的核酸包括與編碼區(qū)有效連接的誘導(dǎo)型啟動子，使得核酸的表達可通過控制適當?shù)霓D(zhuǎn)錄本誘導(dǎo)物的存在或缺乏而控制。
治療組合物在一實施方案中，本發(fā)明涉及血凝結(jié)疾病的治療。在此，本發(fā)明的治療化合物可通過提供刺激血液凝固的化合物而給予那些患有或易患疾病的病人。具體地，疾病可以是血友病，尤其是甲型血友病。
治療化合物配方通常是本領(lǐng)域已知的且可方便參照Remington′sPharmaceutical Sciences，17th ed.，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.，USA。例如，可從每公斤體重每天約0.05μg至約20mg給藥。劑量范圍可調(diào)節(jié)以提供最優(yōu)的治療應(yīng)答。例如，可每天給予若干分批的劑量或劑量可根據(jù)治療情況的緊急性而相應(yīng)減少?；钚晕镔|(zhì)可以便利的形式給予，如通過口服、靜脈內(nèi)的(其中為水溶性的)、肌內(nèi)的、皮下的、鼻內(nèi)的、皮內(nèi)的或栓劑方式或植入(例如通過腹腔內(nèi)途徑或通過使用細胞例如體外致敏的以及繼承性地轉(zhuǎn)入受體的單核細胞或樹突細胞而使用緩釋分子)?；诮o藥途徑，肽需要包被在材料中以保護其不受酶，酸類及其他自然條件的作用，其可滅活所述成分。
例如，肽的低親脂性將使其在胃腸道中通過能裂解肽鍵的酶以及在胃中通過酸解而被破壞。為了除腸胃外投藥法外給予肽，其可由防止其失活的材料包被或與防止其失活的材料一起給藥。例如，肽可在輔助劑中給藥，與酶抑制劑一起給藥或在脂質(zhì)體中給藥。此處涉及的輔助劑包括間苯二酚，非-離子型表面活性劑如聚氧化乙烯油基醚和正十六烷基聚乙烯醚。酶抑制劑包括胰腺胰蛋白酶抑制劑、二異丙基氟磷(DEP)和trasylol。脂質(zhì)體包括水包油CGF乳劑以及常規(guī)的脂質(zhì)體。
活性物質(zhì)還可腸胃外或經(jīng)腹膜內(nèi)給藥?？稍诟视鸵后w聚乙二醇和其混合物以及油劑中制備分散體。在通常的儲存和使用條件下，制劑包含防腐劑以防止微生物的生長。
適于注射用途的藥物形式包括無菌水溶液(水溶性的)或分散體和用于臨時制備無菌注射溶液或分散體的無菌粉末。在所有情況下，藥物形式必須是無菌的且必須是易于注射的流體。在生產(chǎn)和貯存條件下其必須是穩(wěn)定的且必須加以保護以抗微生物如細菌和真菌的污染。載體可以是一種溶劑或分散介質(zhì)，含有如水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇和液態(tài)聚乙二醇等)及其合適的混合物和植物油。適當?shù)牧鲃有钥赏ㄟ^如使用包衣如卵磷脂，保持分散體所需合適粒徑，及使用superfactant來加以保持。防止微生物的作用可使用各種抗細菌及抗真菌制劑如氯代丁醇、苯酚、山梨酸、theomersal等等。在許多情況下，優(yōu)選包括等滲劑如糖或氯化鈉。延長注射用組合物的吸收可通過在組合物中使用延緩吸收制劑如單硬脂酸鋁和明膠來進行。
無菌注射溶液的制備是將所需量的活性化合物與上述列舉的所需的各種其它成分在適當溶劑中混合然后經(jīng)過濾滅菌。通常制備分散體是將各種無菌活性成分混入含有基本分散介質(zhì)和上述列舉的所需的其它成分的無菌賦形劑中。至于用于制備無菌注射溶液的無菌粉末，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥技術(shù)，其從前述無菌過濾的溶液中生產(chǎn)出活性成分加上任何其它所需成分的粉末。
當肽被如上述方法適當保護，如使用惰性稀釋劑或一種可吸收食用載體或被包含入硬或軟殼膠囊中或被壓縮成藥片或直接與患者食物混合時，該活性化合物可經(jīng)口服給予。在口服治療給藥時，活性化合物可與賦形劑混合并以可咽下的片劑、含片、錠劑、膠囊、酏劑、懸膠體、糖漿、干膠片等類型使用。所述組合物及制劑需含至少1％重量計的活性化合物。該組合物及制劑的百分比是可變化的，較適于在每單位大約5-80％重量之間。在這種治療有用的組合物中活性化合物的量是能得到合適劑量的量。制備本發(fā)明的優(yōu)選組合物或制劑以使每口服劑量單位形式含有大約0.1μg至2000mg的活性化合物。
片劑、丸劑、膠囊等也可含有以下物質(zhì)粘合劑如黃蓍膠、金合歡膠、玉米淀粉或明膠；賦形劑如磷酸二鈣；分解劑如玉米淀粉、土豆淀粉、藻酸等；潤滑劑如硬脂酸鎂；增甜劑如蔗糖、乳糖或糖精或調(diào)味劑如薄荷、冬青油或櫻桃調(diào)味品。當劑量單位形式是膠囊時，其除了上述各類物質(zhì)外還可含有一種液體載體。有許多物質(zhì)可作為劑量單位的包衣或改變其物理結(jié)構(gòu)。例如，片劑、丸劑或膠囊可用蟲膠、糖或兩者一起包被。糖漿或酏劑可包含活性化合物，作為增甜劑的蔗糖、作為防腐劑的對羥苯甲酸甲酯和丙酯，染料及調(diào)味劑如櫻桃或桔味調(diào)味劑。當然，用于制備任何劑量單位形式的任何物質(zhì)必須是藥物純的并且在使用量內(nèi)是確實無毒的。另外，可將活性化合物混入緩釋的制備物或配制物中。
本文所用的“藥學(xué)可接受載體和/或稀釋劑”包括任何及所有溶劑，分散介質(zhì)、包衣、抗細菌及抗真菌制劑、等滲劑及延緩吸收制劑等。本領(lǐng)域人員已熟知這些介質(zhì)和制劑在藥用活性物質(zhì)中的使用。除了目前一些常規(guī)介質(zhì)或制劑不能與活性成分相容之外，將其用在治療組合物中是可行的。補加的活性成分也可混入到組合物中。
配制非腸道的劑量單位形式的組合物對便于服用及劑量的均勻是很有益處的。本文中所用的劑量單位形式指的是適于作為被治療哺乳動物實驗對象的單位劑量的物理分離的單位，每單位含有預(yù)定量的計算上與所需藥用載體結(jié)合能產(chǎn)生所需治療效果的活性物質(zhì)。本發(fā)明的劑量單位形式的用量規(guī)格按照并直接根據(jù)(a)該活性物質(zhì)的獨特特點及需獲得的特定治療效果，(b)本領(lǐng)域中復(fù)合該活性物質(zhì)以治療損害身體健康的的活體的疾病的限制因素而定。
主要活性成分以有效量與適當藥用載體復(fù)合成單位劑量形式，以方便并有效地給藥。單位劑量形式可含有0.5μg至2000mg的主要活性化合物。以比例表示，活性化合物一般在每毫升載體中為約0.5μg。組合物含有增補的活性成分時，劑量的確定則參考通常劑量及所述成分的給藥方式。
傳遞系統(tǒng)各種傳遞系統(tǒng)是已知的且可用于本發(fā)明化合物的給藥，例如，包裹在脂質(zhì)體、微粒、微囊中，能表達該化合物重組細胞，受體介導(dǎo)的胞吞作用，將核酸構(gòu)建為逆轉(zhuǎn)錄病毒或其它載體的一部分等等。導(dǎo)入的方法包括但不限于皮內(nèi)的、肌內(nèi)的、腹膜內(nèi)的、靜脈內(nèi)的、皮下的、鼻內(nèi)的、硬膜外的和口服途徑?；衔锘蚪M合物可通過任何方便的途徑給予，例如通過輸注或大丸劑(bolus)注射，通過經(jīng)上皮的或粘膜與皮膚途徑(例如，口腔粘膜，直腸和腸粘膜，等等)的吸收并且可與其他生物活性劑一起給予。給藥可為全身的或局部的。另外，可能希望通過任何合適路徑將本發(fā)明的藥物化合物或組合物導(dǎo)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，包括室內(nèi)(intraventricular)和鞘內(nèi)注射；可通過例如附著于貯器(諸如Ommaya貯器)的室內(nèi)導(dǎo)管來便于室內(nèi)注射。還可通過例如使用吸入器或噴霧器以及含氣霧劑的制劑來進行肺部給藥。
在一具體的實施方案中，可能希望將本發(fā)明的藥物化合物或組合物局部給藥于需要治療的區(qū)域；這可通過例如，而非限于，外科手術(shù)過程中的局部輸注、局部應(yīng)用，如聯(lián)合手術(shù)后的創(chuàng)傷敷料、通過注射、通過導(dǎo)管、通過栓劑、或通過植入物，所述植入物是多孔的、非多孔的、或凝膠狀材料，包括膜，諸如sialastic膜或纖維來實現(xiàn)。優(yōu)選地，在給予蛋白質(zhì)，包括本發(fā)明的抗體或肽時，必須注意使用蛋白質(zhì)不吸附其上的材料。在另一實施方案中，可在載體內(nèi)遞送化合物或組合物，特別是脂質(zhì)體。在還有一個實施方案中，可在受控釋放系統(tǒng)中遞送化合物或組合物。在一實施方案中，可使用泵。在另一實施方案中，可使用聚合材料。在還有一個實施方案中，受控釋放系統(tǒng)可置于治療靶，即腦的附近，因而只需要全身劑量的一小部分。
如果組合物的給藥是受體動物可以忍耐的，則該組合物認為是″藥學(xué)或生理學(xué)可接受的″以及適于給藥于那些動物。如果給予量為生理學(xué)顯著的話，則所述制劑認為是以“治療有效量”給予的。如果制劑的存在引起受體患者生理學(xué)的可檢測變化，則其為生理學(xué)顯著的。
哺乳動物細胞的培養(yǎng)為表達外源DNA以產(chǎn)生本發(fā)明公開的功能性人FVIII衍生物的優(yōu)選方法。尤其是，常見的用于重組蛋白生產(chǎn)的哺乳動物細胞，如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系，新生兒倉鼠腎(BHK)細胞系，COS細胞系，以及Madin Darby狗腎(MDCK)細胞系為目的細胞系。用于上述細胞的表達載體通常包括(如有必要)復(fù)制起始位點，位于表達基因前面的啟動子，以及任何必要的核糖體結(jié)合位點，RNA剪接位點，聚腺苷酸化位點和轉(zhuǎn)錄終止序列。
供哺乳動物細胞之用，對表達載體的調(diào)節(jié)功能可由病毒材料提供。例如，通常使用的啟動子源于延伸因子-1(EF-1)，猿猴病毒40(SV40)和特別是巨細胞病毒(CMV)。此外，利用與所需基因序列正常連接的啟動子或調(diào)節(jié)序列也是可能的且經(jīng)常是所需的，條件是上述調(diào)節(jié)序列可與宿主細胞系統(tǒng)相容。
本發(fā)明并不限于此處描述的具體實施方案的范圍。事實上，除此處所述的那些外，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言根據(jù)上述描述和附圖的本發(fā)明的各種改變將是顯而易見的。所述改變也落入附加的權(quán)利要求范圍內(nèi)。以下的實施例提供作為本發(fā)明的例證，而不是作為限制。
實施例實施例1-全長FVIIIcDNA的克隆使用覆蓋已公開序列(GenBank登錄號NM00132)的核苷酸7237-7258的基因特異性引物(F8B10，5’AGCACAAAGGTAGAAGGCAAGC3’(SEQ ID NO2))進行反轉(zhuǎn)錄。簡言之，50μg人肝臟mRNA，1μl 10X反轉(zhuǎn)錄緩沖液，1μM F8B10引物，4mM dNTPs，1單位的核糖核酸酶抑制劑和10單位的逆轉(zhuǎn)錄酶加入9.5μl總體積反應(yīng)混合物中。反應(yīng)隨后在42℃孵育90分鐘。合成的cDNA通過使用pfu聚合酶和三套基因-特異性引物的標準PCR方案擴增。第一套引物覆蓋已公開序列(GenBank登錄號NM00132)的核苷酸133-1997F8FD(FW，5’CCTTTTGCTTCTCCAGTTGAAC3’(SEQ ID NO3))和F8BD(BW，5’TTCTCTGTGAGGTACCAGCTTC3’(SEQ ID NO4))。第二和第三套引物分別覆蓋核苷酸1810-4295和4044-7320F8FC(FW 5’TGCCTGACCCGCTATTACTCTA3’(SEQ ID NO5))和F8BB(BW，5’TCTATCTGTGTGAGGGTGCTCG 3’(SEQ I D NO6))；F8FA(FW 5’GGAGGAAGAAAACTTGGAAGGC3’(SEQ ID NO7))和F8B10(參見圖3)。PCR在以下條件進行95℃變性1’30”的一個循環(huán)，擴增45個循環(huán)(95℃30秒，56℃30秒和68℃6分鐘)以及一個循環(huán)的68℃延伸10分鐘。
如圖3中圖解描述的，擴增的片段亞克隆入pCR2.1TOPO載體中。三個亞克隆片段隨后使用KpnI和NsiI作為唯一的限制性位點連接入pCR2.1TOPO載體。連接三個片段后，F(xiàn)VIII編碼區(qū)的內(nèi)部KpnI位點通過同義突變除去，且位于pCR2.1TOPO多克隆位點的NsiI位點用ClaI替代以用KpnI和ClaI消化而除去連接的全長FVIII cDNA。為了進一步克隆的目的，兩個限制性內(nèi)切酶位點XbaI和NotI從pCR2.1載體主鏈除去。修飾的載體稱為pCR2.1-全長FVIII。
實施例2-攜帶已在對應(yīng)于B和A3結(jié)構(gòu)域區(qū)域缺失的FVIII衍生物cDNA的質(zhì)粒的構(gòu)建實施例2A-用于B-結(jié)構(gòu)域缺失的FVIII衍生物的質(zhì)粒的構(gòu)建，衍生物帶有各種大小的連接重鏈羧基端和輕鏈氨基端的間隔物起始質(zhì)粒pCR2.1-全長FVIII，包含全長因子VIII的cDNA，核苷酸133至7320位。pCR2.1-全長FVIII用EcoNI消化以從全長FVIII刪除核苷酸2783至4804。EcoNI-消化的載體的粘性末端用DNA聚合酶I Klenow片段補平用于連接反應(yīng)。連接的載體命名為pCR2.1-deltaEcoNI_FVIII且用作另外精確的缺失誘變的模板。
設(shè)計寡核苷酸引物以得到一系列精確的讀框缺失。每個引物都與所刪片段兩邊的側(cè)翼序列相匹配。Delta-747，delta-754，delta-761，delta-768，delta-775和delta-782引物產(chǎn)生Arg747-Gln1659，Lys754-Gln1659，Ile761-Gln1659，Lys768-Gln1659，His775-Gln1659和Ile782-Gln1659的融合位點，其分別為(delta-7475’-CTTCTCCCAGAATTCAAGACAAGAGGAAATTGACTATG-3’(SEQ IDNO8))；(delta-7545’-CCTAGCACTAGGCAAAAGCAAGAGGAAATTGACTATG-3’(SEQ IDNO9))；(delta-7615’-CAATTTAATGCCACCACAATTCAAGAGGAAATTGACTATG-3’(SEQ IDNO10))；(delta-7685’-CAGAAAATGACATAGAGAAGCAAGAGGAAATTGACTATG-3’(SEQ IDNO11))；(delta-7755’-GACCCTTGGTTTGCACACCAAGAGGAAATTGACTATG-3’(SEQ IDNO12))；(delta-7825’GCACACAGAACACCTATGCCTAAAATACAAGAGGAAATTGACTATGATGATACC-3’(SEQ ID NO13)).
除了上述突變的引物外，以質(zhì)粒pCR2.1-deltaEcoNI_FVIII作為模板，將起始唯一的NcoI位點變?yōu)镾alI的選擇引物(5’-CGTGATCCATGTCGACGCCTGCTTGCC-3’(SEQ ID NO14))被用于定點誘變。進行限制性消化以選擇陽性克隆，其通過測序進一步驗證。最終確定的克隆分別命名為dB747，dB754，dB761，dB768，dB775和dB782。
實施例2B-在融合位點包含新N-聚糖序列的質(zhì)粒的產(chǎn)生為了防止重鏈和輕鏈連接區(qū)非天然氨基酸序列的新抗原表位的暴露，我們通過將B-結(jié)構(gòu)域的745，757和764位的Asn連接至緊接于1651，1654和1657位Ser或Thr氨基酸的1650，1653和1656位的氨基酸而在該融合位點創(chuàng)建N-糖基化識別序列(Asn-X-Ser/Thr，其中X可以是任何氨基酸)，其在融合位點產(chǎn)生了N-糖基化位點。設(shè)計寡核苷酸引物以得到一系列精確的讀框缺失。pCR2.1-deltaEcoNI_FVIII用作模板用于進一步精確的缺失誘變。每個引物都與所刪片段兩邊的側(cè)翼序列相匹配。N-745-1650，N-745-1653，N-745-1656，N-757-1650，N-757-1653，N-757-1656，N-764-1650，N-764-1653和N-764-1656引物產(chǎn)生了Asn745-Ile1650，Asn745-Thr1653，Asn745-Gln1656，Asn757-Ile1650，Asn757-Thr1653，Asn757-Gln1656，Asn764-Ile1650，Asn764-Thr1653和Asn764-Gln1656的融合位點。寡核苷酸引物的核苷酸序列如下(N-745-16505’-CAAGAAGCTTCTCCCAGAAAATAACTCGTACTACTCTTC-3’(SEQ IDNO15))；(N-745-16535’-CAAGAAGCTTCTCCCAGAAAACTACTCTTCAGTCAGTC-3’(SEQ IDNO16))；(N-745-16565’-CAAGAAGCTTCTCCCAGAAACAGTCAGATCAAGAGGAAATTG-3’(SEQ ID NO17))；(N757-16505’-CTAGGCAAAAGCAATTTAATATAACTCGTACTACTCTTC-3’(SEQ IDNO18))；(N-757-15635’-CTAGGCAAAAGCAATTTAATACTACTCTTCAGTCAGTC-3’(SEQ IDNO19))；(N-757-16565’-CTAGGCAAAAGCAATTTAATCAGTCAGATCAAGAGGAAATTG-3’(SEQ ID NO20))；(N-764-16505’-CACCACAATTCCAGAAAATATAACTCGTACTACTCTTC-3’(SEQ IDNO21))；(N-764-16535’-CACCACAATTCCAGAAAATACTACTCTTCAGTCAGTC-3’(SEQ IDNO22))；(N-764-16565’-CACCACAATTCCAGAAAATCAGTCAGATCAAGAGGAAATTG-3’(SEQID NO23)).
除了上述突變的引物外，以質(zhì)粒pCR2.1-deltaEcoNI_FVIII作為模板，將起始唯一的NcoI位點變?yōu)镾alI的選擇引物(5’-CGTGATCCATGTCGACGCCTGCTTGCC-3’(SEQ ID NO24))被使用于定點誘變。進行限制性消化以選擇陽性克隆，其通過測序進一步驗證。最終確定的克隆分別命名為dBN(45-50)，dBN(45-53)，dBN(45-56)，dBN(57-50)，dBN(57-53)，dBN(57-56)，dBN(64-50)，dBN(64-53)和dBN(64-56)。
實施例3-FVIII衍生物在哺乳動物細胞中的表達實施例3A-哺乳動物表達載體的構(gòu)建從質(zhì)粒dB747，dB754，dB761，dB768，dB775，dB782，dB761-739F，dB783-739F，dBN(45-50)，dBN(45-53)，dBN(45-56)，dBN(57-50)，dBN(57-53)，dBN(57-56)，dBN(64-50)，dBN(64-53)和dBN(64-56)切下因子VIII衍生物的cDNA序列，平末端化且克隆在巨細胞病毒(CMV)啟動子和牛生長素聚腺苷酸序列(bGHpA)之間。所有構(gòu)建體中，插入方向通過限制性內(nèi)切酶消化和測序驗證。
實施例3B-哺乳動物表達構(gòu)建體在BHK21細胞中的瞬時轉(zhuǎn)染BHK21細胞從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)獲得，且在補充10％胎牛血清的EMEM中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前一天，細胞以使得到轉(zhuǎn)染時細胞達到70-80％匯合度的密度接種在六-孔組織培養(yǎng)皿上。轉(zhuǎn)染使用基于脂質(zhì)體的試劑。每個轉(zhuǎn)染使用1μg FVIII衍生物表達構(gòu)建體DNA和30ng內(nèi)部對照質(zhì)粒pSV β-半乳糖苷酶(Promega，Madison，WI，USA)進行。轉(zhuǎn)染后四小時，轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基通過吸出而除去，加入2ml完全培養(yǎng)基且平皿放回培養(yǎng)箱。在轉(zhuǎn)染后24h，除去培養(yǎng)基，刮下，在-80℃冷凍。制備細胞裂解物且使用Galacto-Light Plus Kit(Tropix，MA，USA)根據(jù)廠家說明書測定細胞裂解物中β-半乳糖苷酶的活性。由內(nèi)部對照質(zhì)粒pSV β-半乳糖苷酶表達的β-半乳糖苷酶活性提供了監(jiān)測轉(zhuǎn)染效率的內(nèi)部對照。基于每個孔中β-半乳糖苷酶活性校準FVIII活性。使用ELISA測定法來確定存在于培養(yǎng)基樣品中的FVIII抗原水平(一式三份)。因子VIII(FVIIIC)的促凝劑活性通過使用FVIII Coatest顯色測定法(Chromogenix，Molndal，Sweden)在培養(yǎng)基中定量(一式三份)。
結(jié)果列于表1和2中。
表1
a通過FVIIIC值除以FVIIIAg值計算表2
結(jié)果表明經(jīng)缺失的FVIII衍生物在凝血試驗中具有生物學(xué)活性的且與用全長FVIII相比用FVIII衍生物構(gòu)建體獲得更高的蛋白水平。此外，對于本發(fā)明的衍生物FVIIIC與FVIIIAg的比率比全長FVIII的更高，表明FVIII衍生物在分泌入培養(yǎng)基后可能更穩(wěn)定。如表3所示，與重組全長FVIII相比，重組FVIII衍生物FVIII活性(FVIIIC)的提高在孵育后所有時間都更高。
實施例4-739位Pro用Phe的取代在FVIII B-結(jié)構(gòu)域刪除的上述變體中Pro739用定點誘變的方法改變。寡核苷酸引物(5’-AACAATGCCATTGAATTCAGAAGCTTCTCCCAG-3’(SEQ ID NO25))設(shè)計為能在739位導(dǎo)入Pro用Phe的替換。整個突變過程與上述實施例2一樣。每個B-結(jié)構(gòu)域缺失的FVIII衍生物中具有Pro 739Phe替換的載體分別命名為dB747-739F，dB754-739F，dB761-739F，dB768-739F，dB775-739F，dB782-739F，dBN(45-50)-739F，dBN(45-53)-739F，dBN(45-56)-739F，dBN(57-50)-739F，dBN(57-53)-739F，dBN(57-56)-739F，dBN(64-50)-739F，dBN(64-53)-739F和dBN(64-56)-739F。得到的DNA克隆入哺乳動物表達載體，制備，轉(zhuǎn)染而得到如上的待測樣品。如表4所示，發(fā)現(xiàn)dB761-739F和dB782-739F分別產(chǎn)生比dB761和dB782更強的活性，在739位脯氨酸至苯基丙氨酸的突變后提高了活性。
表3
表4
實施例5-表達FVIII衍生物的HEK293細胞系的確立實施例5A-用于產(chǎn)生穩(wěn)定表達FVIII衍生物哺乳動物細胞的質(zhì)粒的構(gòu)建如圖4所示，用于實施例的哺乳動物表達質(zhì)粒為pI2G-Hygro，其包含順時針方向順序的巨細胞病毒啟動子，多接頭和牛生長素聚腺苷酸化信號序列，后面是由SV40啟動子驅(qū)動的潮霉素抗性表達盒和編碼氨芐青霉素抗性的基因。質(zhì)粒pI2G-Hygro的多接頭用Kpn1和XhoI切開。該載體中連接約4.5kb的包含F(xiàn)VIII衍生物編碼序列的Kpn1和XhoI片段，其是從實施例2，3和4描述的質(zhì)粒中切下的。每個具有單一因子VIII衍生物編碼序列的pI2G-Hygro載體稱為pI2G-Hygro-“以每個FVIII衍生物cDNA命名的質(zhì)粒”(參見實施例2，3和4)。例如，包含dB747和dBN(45-50)(實施例2和3中)編碼序列的哺乳動物表達載體分別稱為pI2G-Hygro-dB47和pI2G-Hygro-dBN(45-50)。
實施例5B-HEK293細胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染包含每個FVIII轉(zhuǎn)錄單位的pI2G-hygro質(zhì)粒用MfeI線性化且用苯酚-氯仿和乙醇沉淀以用于HEK293細胞轉(zhuǎn)染的制備。HEK293細胞通過基于脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染方法用包括FVIII衍生物編碼序列的線性化pI2G-Hygro質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染。每個轉(zhuǎn)染用每10cm直徑培養(yǎng)皿2μgDNA進行。轉(zhuǎn)染后48h，除去培養(yǎng)基，細胞經(jīng)胰蛋白酶消化，在包含潮霉素(500μg/ml)和10％胎牛血清的DMEM選擇培養(yǎng)基中稀釋和培養(yǎng)。兩星期后，分離抗選擇培養(yǎng)基的單一克隆且在選擇培養(yǎng)基中進一步擴增隨后冷凍用于進一步的研究。通過測定FVIII衍生物作為輔因子作用于因子IXa-依賴的因子X向因子Xa的轉(zhuǎn)化的能力而檢測FVIII衍生物的分泌，其使用針對因子Xa的顯色底物(Coatest Factor VIII，Chromogenix，Sweden)。
實施例5C-單鏈FVIII在HEK293細胞中表達的證實為了證實FVIII衍生物以單鏈多肽分泌入培養(yǎng)基，在補充有35S-甲硫氨酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HEK293細胞6小時。隨后制備條件培養(yǎng)基和細胞提取物用于通過免疫沉淀法和SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(圖5A)的分析。顯示來自細胞提取物(C)和條件培養(yǎng)基(M)的FVIII衍生物的遷移。每個FVIII衍生物的名稱標記在頂部。結(jié)果證實通過A1，A2和B結(jié)構(gòu)域至A3結(jié)構(gòu)域中Arg-1648(胞內(nèi)加工位點)后(beyond)的融合產(chǎn)生的FVIII衍生物并不影響FVIII衍生物從細胞的合成或分泌。產(chǎn)生的主要FVIII種類為約170kDa的單鏈分子。對于FVIII抗原的免疫印跡，包含重組因子VIII衍生物dB782和dBN(45-50)的培養(yǎng)基以及正常HEK293對照細胞培養(yǎng)基用Centricon 30，000MWCO在收獲的當天濃縮約100倍。
使用ELISA方法測定FVIII濃度。濃縮物隨后通過SDS-PAGE分離并且通過使用單克隆抗體(ESH-8)的免疫印跡法分析。如圖5B所示，用于Western印跡法的ESH-8抗體檢測到一主要的蛋白，遷移至約170kDa處，其與圖5A中代謝標記試驗的結(jié)果相似。
結(jié)果表明本發(fā)明的FVIII衍生物主要以未加工的，單鏈形式的FVIII分子存在于培養(yǎng)基中。圖5C描述了FVIII衍生物的凝血酶活化作用。35S-甲硫氨酸標記的FVIII衍生物從穩(wěn)定表達的HEK293細胞捕獲條件培養(yǎng)基免疫沉淀且分成等分而在凝血酶(1U/mL)缺乏(泳道1，3，5和7)或存在(泳道2，4，6和8)時37℃孵育30分鐘。用SDS-PAGE樣品緩沖液終止反應(yīng)并且蛋白片段通過10％SDS-PAGE分離。FVIII蛋白形式在右邊如下標明SC，單鏈；A1和A2，凝血酶裂解的重鏈片段；LC，凝血酶裂解的輕鏈。每個FVIII衍生物的名稱標記在頂部。凝血酶消化后該放射性標記蛋白質(zhì)的分析表明分別對應(yīng)于凝血酶裂解的輕鏈，A1和A2結(jié)構(gòu)域的分子大小，正常出現(xiàn)73kD和50和40kD片段。結(jié)果證實單鏈FVIII衍生物以與天然或全長FVIII蛋白類似的模式被裂解隨后被激活。該單鏈FVIII衍生物在這一點上是有利的，即它們可以均一的形式產(chǎn)生并且相對于天然的人或其他的重組FVIII具有改善的穩(wěn)定性特點。
實施例6-表達FVIII衍生物的CHO細胞系的確立實施例6A-質(zhì)粒的構(gòu)建用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO細胞系建立的質(zhì)粒通過將包括SV40啟動子序列，編碼DHFR選擇標記的基因和SV40晚期聚腺苷酸化信號序列的稱為pI2G-DHFR的表達盒插入實施例3中所述哺乳動物表達載體的單個MfeI位點而構(gòu)建。通過MfeI消化游離的末端通過DNA聚合酶I的Klenow片段的處理變平。該亞克隆化過程在圖6中描述。
實施例6B-CHO細胞用質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染CHO細胞通過基于脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染方法用包含dB782編碼序列的質(zhì)粒pI2G-DHFR的線性化DNA轉(zhuǎn)染，每10cm直徑的培養(yǎng)皿用1或2μgDNA。轉(zhuǎn)染后48小時，細胞用胰蛋白酶消化，在包含10％透析的胎牛血清無次黃嘌呤，胸苷和黃嘌呤的IMDM選擇培養(yǎng)基中稀釋和孵育。兩星期后，抗選擇培養(yǎng)基的克隆傳代培養(yǎng)至1-ml隨后至2-ml的杯中。當細胞達到70％匯合度時，除去培養(yǎng)基，洗滌細胞菌苔且用包含5％滅活血清(避免在凝固試驗中的高背景)的新鮮培養(yǎng)基補足。24小時后，收獲培養(yǎng)基且分析FVIII的促凝劑活性。生物學(xué)活化的人FVIII通過用前述的FVIII-缺陷血漿(Veldkamp等.，Thromb.Diath.Haemorrh.1968，19279)的標準凝血或凝結(jié)測定法(所謂的活化部分凝血活酶時間)在培養(yǎng)物上清樣品中定量?？?jié)舛忍岣叩腗TX的細胞中因子VIII活性結(jié)果在表5中呈現(xiàn)。
表5
實施例7-重組全長FVIII和FVIII衍生物通過凝血酶的活化作用重組全長FVIII和FVIII衍生物對通過凝血酶活化作用的動力學(xué)研究作一比較。在催化量凝血酶存在下孵育后用經(jīng)典的凝固試驗(APTT)測定活化作用。
圖7A和7B顯示重組人FVIII(rH FVIII)和FVIII衍生物的凝血酶活化作用動力學(xué)比較。與凝血酶孵育5分鐘后，一些FVIII衍生物以7倍提高量被更強地激活。兩個FVIII衍生物dBN(64-53)和dBN(64-56)以與rhFVIII同樣的方式激活。雖然一些FVIII衍生物具有更高的活化作用倍數(shù)，它們并不比其他衍生物或全長FVIII更快地被激活，由此表明FVIII衍生物不是預(yù)先激活的。這對其治療用途很重要。
一些衍生物經(jīng)凝血酶的更高的活化倍數(shù)可由其更低的活化閾值解釋。在血管損傷位點產(chǎn)生的少量凝血酶可引起FVIII衍生物增強的活化作用，使該衍生物與其他具有FVIII活性的衍生物相比能以增強的效率充當促凝劑分子。換言之，除dBN(64-53)和dBN(64-56)外的FVIII衍生物可在血液凝固事件的早期被激活。因此，具有更高活化作用倍數(shù)的FVIII衍生物能以比其他具有FVIII活性的分子更低的劑量以及減少的次數(shù)而給藥于甲型血友病病人。此顯著降低了病人中抑制性的抗體產(chǎn)生的風險。此外，此還進一步降低了生產(chǎn)和藥物治療的成本。
此處引用的所有參考文獻作為參考整體應(yīng)用。
* * * * *僅僅使用常規(guī)試驗，本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識到或能確定許多此處詳細描述的本發(fā)明具體技術(shù)方案的等價形式。上述等價形式也包含在權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
序列表<110>IN2GEN Co.，LTD<120>因子VIII多肽<130>59258-03USA<150>US10/353,753<151>2003-01-28<160>25<170>KopatentIn 1.71<210>1<211>2332<212>PRT<213>人<400>1Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser Trp Asp Tyr1 5 10 15Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg Phe Pro Pro20 25 30Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val Tyr Lys Lys35 40 45Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Val His Leu Phe Asn Ile Ala Lys Pro50 55 60Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln Ala Glu Val65 70 75 80Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser His Pro Val85 90 95Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser Glu Gly Ala100 105 110Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp Asp Lys Val115 120 125Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu Lys Glu Asn130 135 140Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser Tyr Leu Ser145 150 155 160His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile Gly Ala Leu
165 170 175Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr Gln Thr Leu180 185 190His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly Lys Ser Trp195 200 205His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp Ala Ala Ser210 215 220Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr Val Asn Arg225 230 235 240Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val Tyr Trp His245 250 255Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile Phe Leu Glu260 265 270Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser Leu Glu Ile275 280 285Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met Asp Leu Gly290 295 300Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His Asp Gly Met305 310 315 320Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro Gln Leu Arg325 330 335Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp Leu Thr Asp340 345 350Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser Pro Ser Phe355 360 365Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr Trp Val His370 375 380Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro Leu Val Leu385 390 395 400Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn Asn Gly Pro405 410 415Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met Ala Tyr Thr420 425 430Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu Ser Gly Ile435 440 445
Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu Leu Ile Ile450 455 460Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro His Gly Ile465 470 475 480Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys Gly Val Lys485 490 495His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe Lys Tyr Lys500 505 510Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp Pro Arg Cys515 520 525Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg Asp Leu Ala530 535 540Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu Ser Val Asp545 550 555 560Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val Ile Leu Phe565 570 575Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu Asn Ile Gln580 585 590Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp Pro Glu Phe595 600 605Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val Phe Asp Ser610 615 620Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp Tyr Ile Leu625 630 635 640Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe Ser Gly Tyr645 650 655Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr Leu Phe Pro660 665 670Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro Gly Leu Trp675 680 685Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly Met Thr Ala690 695 700Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Glu705 710 715 720
Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys Asn Asn Ala725 730 735Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Ser Arg His Pro Ser Thr Arg740 745 750Gln Lys Gln Phe Asn Ala Thr Thr Ile Pro Glu Asn Asp Ile Glu Lys755 760 765Thr Asp Pro Trp Phe Ala His Arg Thr Pro Met Pro Lys Ile Gln Asn770 775 780Val Ser Ser Ser Asp Leu Leu Met Leu Leu Arg Gln Ser Pro Thr Pro785 790 795 800His Gly Leu Ser Leu Ser Asp Leu Gln Glu Ala Lys Tyr Glu Thr Phe805 810 815Ser Asp Asp Pro Ser Pro Gly Ala Ile Asp Ser Asn Asn Ser Leu Ser820 825 830Glu Mel Thr His Phe Arg Pro Gln Leu His His Ser Gly Asp Mel Val835 840 845Phe Thr Pro Glu Ser Gly Leu Gln Leu Arg Leu Asn Glu Lys Leu Gly850 855 860Thr Thr Ala Ala Thr Glu Leu Lys Lys Leu Asp Phe Lys Val Ser Ser865 870 875 880Thr Ser Asn Asn Leu Ile Ser Thr Ile Pro Ser Asp Asn Leu Ala Ala885 890 895Gly Thr Asp Asn Thr Ser Ser Leu Gly Pro Pro Ser Met Pro Val His900 905 910Tyr Asp Ser Gln Leu Asp Thr Thr Leu Phe Gly Lys Lys Ser Ser Pro915 920 925Leu Thr Glu Ser Gly Gly Pro Leu Ser Leu Ser Glu Glu Asn Asn Asp930 935 940Ser Lys Leu Leu Glu Ser Gly Leu Met Asn Ser Gln Glu Ser Ser Trp945 950 955 960Gly Lys Asn Val Ser Ser Thr Glu Ser Gly Arg Leu Phe Lys Gly Lys965 970 975Arg Ala His Gly Pro Ala Leu Leu Thr Lys Asp Asn Ala Leu Phe Lys980 985 990Val Ser Ile Ser Leu Leu Lys Thr Asn Lys Thr Ser Asn Asn Ser Ala
99510001005Thr Asn Arg Lys Thr His Ile Asp Gly Pro Ser Leu Leu Ile Glu Asn101010151020Ser Pro Ser Val Trp Gln Asn Ile Leu Glu Ser Asp Thr Glu Phe Lys1025 103010351040Lys Val Thr Pro Leu Ile His Asp Arg Met Leu Met Asp Lys Asn Ala104510501055Thr Ala Leu Arg Leu Asn His Met Ser Asn Lys Thr Thr Ser Ser Lys106010651070Asn Met Glu Met Val Gln Gln Lys Lys Glu Gly Pro Ile Pro Pro Asp107510801085Ala Gln Asn Pro Asp Met Ser Phe Phe Lys Met Leu Phe Leu Pro Glu109010951100Ser Ala Arg Trp Ile Gln Arg Thr His Gly Lys Asn Ser Leu Asn Ser1105 111011151120Gly Gln Gly Pro Ser Pro Lys Gln Leu Val Ser Leu Gly Pro Glu Lys112511301135Ser Val Glu Gly Gln Asn Phe Leu Ser Glu Lys Asn Lys Val Val Val114011451150Gly Lys Gly Glu Phe Thr Lys Asp Val Gly Leu Lys Glu Met Val Phe115511601165Pro Ser Ser Arg Asn Leu Phe Leu Thr Asn Leu Asp Asn Leu His Glu117011751180Asn Asn Thr His Asn Gln Glu Lys Lys Ile Gln Glu Glu Ile Glu Lys1185 119011951200Lys Glu Thr Leu Ile Gln Glu Asn Val Val Leu Pro Gln Ile His Thr120512101215Val Thr Gly Thr Lys Asn Phe Met Lys Asn Leu Phe Leu Leu Ser Thr122012251230Arg Gln Asn Val Glu Gly Ser Tyr Glu Gly Ala Tyr Ala Pro Val Leu123512401245Gln Asp Phe Arg Ser Leu Asn Asp Ser Thr Asn Arg Thr Lys Lys His125012551260Thr Ala His Phe Ser Lys Lys Gly Glu Glu Glu Asn Leu Glu Gly Leu1265 127012751280
Gly Asn Gln Thr Lys Gln Ile Val Glu Lys Tyr Ala Cys Thr Thr Arg128512901295Ile Ser Pro Asn Thr Ser Gln Gln Asn Phe Val Thr Gln Arg Ser Lys130013051310Arg Ala Leu Lys Gln Phe Arg Leu Pro Leu Glu Glu Thr Glu Leu Glu131513201325Lys Arg Ile Ile Val Asp Asp Thr Ser Thr Gln Trp Ser Lys Asn Met133013351340Lys His Leu Thr Pro Ser Thr Leu Thr Gln Ile Asp Tyr Asn Glu Lys1345 135013551360Glu Lys Gly Ala Ile Thr Gln Ser Pro Leu Ser Asp Cys Leu Thr Arg136513701375Ser His Ser Ile Pro Gln Ala Asn Arg Ser Pro Leu Pro Ile Ala Lys138013851390Val Ser Ser Phe Pro Ser Ile Arg Pro Ile Tyr Leu Thr Arg Val Leu139514001405Phe Gln Asp Asn Ser Ser His Leu Pro Ala Ala Ser Tyr Arg Lys Lys141014151420Asp Ser Gly Val Gln Glu Ser Ser His Phe Leu Gln Gly Ala Lys Lys1425 143014351440Asn Asn Leu Ser Leu Ala Ile Leu Thr Leu Glu Met Thr Gly Asp Gln144514501455Arg Glu Val Gly Ser Leu Gly Thr Ser Ala Thr Asn Ser Val Thr Tyr146014651470Lys Lys Val Glu Asn Thr Val Leu Pro Lys Pro Asp Leu Pro Lys Thr147514801485Ser Gly Lys Val Glu Leu Leu Pro Lys Val His Ile Tyr Gln Lys Asp149014951500Leu Phe Pro Thr Glu Thr Ser Asn Gly Ser Pro Gly His Leu Asp Leu1505 151015151520Val Glu Gly Ser Leu Leu Gln Gly Thr Glu Gly Ala Ile Lys Trp Asn152515301535Glu Ala Asn Arg Pro Gly Lys Val Pro Phe Leu Arg Val Ala Thr Glu154015451550
Ser Ser Ala Lys Thr Pro Ser Lys Leu Leu Asp Pro Leu Ala Trp Asp155515601565Asn His Tyr Gly Thr Gln Ile Pro Lys Glu Glu Trp Lys Ser Gln Glu157015751580Lys Ser Pro Glu Lys Thr Ala Phe Lys Lys Lys Asp Thr Ile Leu Ser1585 159015951600Len Asn Ala Cys Glu Ser Asn His Ala Ile Ala Ala Ile Asn Glu Gly160516101615Gln Asn Lys Pro Glu Ile Glu Val Thr Trp Ala Lys Gln Gly Arg Thr162016251630Glu Arg Leu Cys Ser Gln Asn Pro Pro Val Leu Lys Arg His Gln Arg163516401645Glu Ile Thr Arg Thr Thr Leu Gln Ser Asp Gln Glu Glu Ile Asp Tyr165016551660Asp Asp Thr Ile Ser Val Glu Met Lys Lys Glu Asp Phe Asp Ile Tyr1665 167016751680Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser Pro Arg Ser Phe Gln Lys Lys Thr Arg168516901695His Tyr Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp Asp Tyr Gly Met Ser1700 17051710Ser Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg Ala Gln Ser Gly Ser Val Pro171517201725Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln Glu Phe Thr Asp Gly Ser Phe Thr173017351740Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu His Leu Gly Leu Leu Gly1745 175017551760Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn Ile Met Val Thr Phe Arg176517701775Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser Ser Leu Ile Ser Tyr178017851790Glu Glu Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu Pro Arg Lys Asn Phe Val Lys179518001805Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr Phe Trp Lys Val Gln His His Met Ala181018151820Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys Ala Trp Ala Tyr Phe Ser Asp
1825 183018351840Val Asp Leu Glu Lys Asp Val His Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu184518501855Val Cys His Thr Asn Thr Leu Asn Pro Ala His Gly Arg Gln Val Thr186018651870Val Gln Glu Phe Ala Leu Phe Phe Thr Ile Phe Asp Glu Thr Lys Ser187518801885Trp Tyr Phe Thr Glu Asn Met Glu Arg Asn Cys Arg Ala Pro Cys Asn189018951900Ile Gln Met Glu Asp Pro Thr Phe Lys Glu Asn Tyr Arg Phe His Ala1905 191019151920Ile Asn Gly Tyr Ile Met Asp Thr Leu Pro Gly Leu Val Met Ala Gln192519301935Asp Gln Arg Ile Arg Trp Tyr Leu Leu Ser Met Gly Ser Asn Glu Asn194019451950Ile His Ser Ile His Phe Ser Gly His Val Phe Thr Val Arg Lys Lys195519601965Glu Glu Tyr Lys Met Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr Pro Gly Val Phe Glu197019751980Thr Val Glu Met Leu Pro Ser Lys Ala Gly Ile Trp Arg Val Glu Cys1985 199019952000Leu Ile Gly Glu His Leu His Ala Gly Met Ser Thr Leu Phe Leu Val200520102015Tyr Ser Asn Lys Cys Gln Thr Pro Leu Gly Met Ala Ser Gly His Ile202020252030Arg Asp Phe Gln Ile Thr Ala Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Trp Ala Pro203520402045Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser Ile Asn Ala Trp Ser Thr205020552060Lys Glu Pro Phe Ser Trp Ile Lys Val Asp Leu Leu Ala Pro Met Ile2065 207020752080Ile His Gly Ile Lys Thr Gln Gly Ala Arg Gln Lys Phe Ser Ser Leu208520902095Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu Asp Gly Lys Lys Trp210021052110
Gln Thr Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly Thr Leu Met Val Phe Phe Gly211521202125Asn Val Asp Ser Ser Gly Ile Lys His Asn Ile Phe Asn Pro Pro Ile213021352140Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser2145 215021552160Thr Leu Arg Met Glu Leu Met Gly Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met216521702175Pro Leu Gly Met Glu Ser Lys Ala Ile Ser Asp Ala Gln Ile Thr Ala218021852190Ser Ser Tyr Phe Thr Asn Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser Lys Ala219522002205Arg Leu His Leu Gln Gly Arg Ser Asn Ala Trp Arg Pro Gln Val Asn221022152220Asn Pro Lys Glu Trp Leu Gln Val Asp Phe Gln Lys Thr Met Lys Val2225 223022352240Thr Gly Val Thr Thr Gln Gly Val Lys Ser Leu Leu Thr Ser Met Tyr224522502255Val Lys Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser Gln Asp Gly His Gln Trp Thr226022652270Leu Phe Phe Gln Asn Gly Lys Val Lys Val Phe Gln Gly Asn Gln Asp227522802285Ser Phe Thr Pro Val Val Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu Leu Thr Arg229022952300Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp Val His Gln Ile Ala Leu Arg2305 231023152320Met Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala Gln Asp Leu Tyr23252330<210>2<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>FVIII特異引物
<400>2agcacaaagg tagaaggcaa gc 22<210>3<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>FVIII特異引物<400>3ccttttgctt ctccagttga ac 22<210>4<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>FVIII特異引物<400>4ttctctgtga ggtaccagct tc 22<210>5<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>FVIII特異引物<400>5tgcctgaccc gctattactc ta 22<210>6<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>FVIII特異引物
<400>6tctatctgtg tgagggtgct cg 22<210>7<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>FVIII特異引物<400>7ggaggaagaa aacttggaag gc 22<210>8<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>FVIII缺失引物<400>8cttctcccag aattcaagac aagaggaaat tgactatg 38<210>9<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>FVIII缺失引物<400>9cctagcacta ggcaaaagca agaggaaatt gactatg 37<210>10<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>FVIII缺失引物
<400>10caatttaatg ccaccacaat tcaagaggaa at tgactatg 40<210>11<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>FVIII缺失引物<400>11cagaaaatga catagagaag caagaggaaa ttgactatg 39<210>12<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>FVIII缺失引物<400>12gacccttggt ttgcacacca agaggaaatt gactatg 37<210>13<211>54<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>FVIII缺失引物<400>13gcacacagaa cacctatgcc taaaatacaa gaggaaattg actatgatga tacc54<210>14<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>FVIII突變引物
<400>14cgtgatccat gtcgacgcct gcttgcc 27<210>15<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>FVIII突變引物<400>15caagaagctt ctcccagaaa ataactcgta ctactcttc 39<210>16<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>FVIII突變引物<400>16caagaagctt ctcccagaaa actactcttc agtcagtc 38<210>17<211>42<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>FVIII突變引物<400>17caagaagctt ctcccagaaa cagtcagatc aagaggaaat tg 42<210>18<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>FVIII突變引物
<400>18ctaggcaaaa gcaatttaat ataactcgta ctactcttc 39<210>19<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>FVIII突變引物<400>19ctaggcaaaa gcaatttaat actactcttc agtcagtc 38<210>20<211>42<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>FVIII突變引物<400>20ctaggcaaaa gcaatttaat cagtcagatc aagaggaaat tg 42<210>21<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>FVIII突變引物<400>21caccacaatt ccagaaaata taactcgtac tactcttc 38<210>22<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>FVIII突變引物
<400>22caccacaatt ccagaaaata ctactcttca gtcagtc 37<210>23<211>41<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>FVIII突變引物<400>23caccacaatt ccagaaaatc agtcagatca agaggaaatt g 41<210>24<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>FVIII突變引物<400>24cgtgatccat gtcgacgcct gcttgcc 27<210>25<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>FVIII突變引物<400>25aacaatgcca ttgaattcag aagcttctcc cag 3權(quán)利要求
1.因子VIII多肽，其和全長人因子VIII氨基酸序列(SEQ ID NO1)相比包括融合至從約741至782的B結(jié)構(gòu)域中任何氨基酸序列，在1649和1688之間存在一個或多個氨基酸內(nèi)部缺失。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的因子VIII多肽，其中內(nèi)部缺失為氨基酸746至1649，746至1652，746至1655，758至1649，758至1652，758至1655，765至1649，765至1652，765至1655，748至1658，755至1658，762至1658，769至1658，776至1658或783至1658。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的因子VIII多肽，其為單鏈。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的因子VIII多肽，其中739位的脯氨酸由另一氨基酸替代。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的因子VIII多肽，基于全長人因子VIII氨基酸序列(SEQ ID NO1)，包括包含在745、757或764位的Asn氨基酸和1651、1654或1657位的Thr或Ser氨基酸間的融合位點的三肽序列(Asn-X-Thr或Asn-X-Ser)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的因子VIII多肽，由帶有以下連接的結(jié)構(gòu)域的通式表示H-S-L其中(i)H結(jié)構(gòu)域代表基本上包括根據(jù)SEQ ID NO1人因子VIII的Ala-1至Arg-740的多肽序列；(ii)S結(jié)構(gòu)域代表包括不超過約60個氨基酸的多肽間隔接頭，其中S結(jié)構(gòu)域的N末端約為根據(jù)SEQ ID NO1人因子VIII的殘基740位，而S結(jié)構(gòu)域的C末端約為殘基1688位；和(iii)L結(jié)構(gòu)域代表多肽序列，其基本上包括根據(jù)SEQ ID NO1人因子VIII的Arg-1689至Tyr-2332位。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的因子VIII多肽，其中S結(jié)構(gòu)域包括基本上類似于從約Ser-741至Asn-745，Arg-747，Lys-754，Asn-757，Ile-761，Asn-764，Lys-768，His-775或Ile-782的連續(xù)序列的氨基酸序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求6的因子VIII多肽，其中S結(jié)構(gòu)域包括基本上類似于從約Glu-1649至Pro-1688的連續(xù)序列的氨基酸序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的因子VIII多肽，其中S結(jié)構(gòu)域包括基本上類似于從約Ile-1650，Thr-1653，Gln-1656或Gln-1659至Pro-1688的連續(xù)序列的氨基酸序列。
10.根據(jù)權(quán)利要求6的因子VIII多肽，其中在S結(jié)構(gòu)域中，氨基酸746至1649，746至1652，746至1655，758至1649，758至1652，758至1655，765至1649，765至1652，765至1655，748至1658，755至1658，762至1658，769至1658，776至1658或783至1658缺失，其中殘基編號基于SEQ ID NO1。
11.包含權(quán)利要求1的因子VIII多肽和其一種藥學(xué)可接受載體的藥物組合物。
12.包括權(quán)利要求1的因子VIII多肽的凍干組合物。
13.在受試者中凝結(jié)血液的方法，包括將凝結(jié)有效量的權(quán)利要求1的因子VIII多肽接觸血液。
14.在患者中治療甲型血友病的方法，包括將凝結(jié)有效量的權(quán)利要求1的因子VIII多肽給與需要的患者。
15.編碼根據(jù)權(quán)利要求1所述因子VIII多肽的分離的核酸。
16.包括權(quán)利要求15的核酸的表達載體，所述核酸與啟動子有效連接。
17.包括權(quán)利要求16的表達載體的宿主細胞。
18.制備權(quán)利要求1所述的因子VIII多肽的方法，包括在適于載體表達多肽的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求17的細胞和分離多肽。
19.在受試者中凝結(jié)血液的方法，包括a)產(chǎn)生包括權(quán)利要求16的核酸序列的重組病毒或質(zhì)粒載體；b)用所述重組載體體外轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的細胞群，產(chǎn)生經(jīng)轉(zhuǎn)染的細胞群；知c)將該細胞給至哺乳動物宿主，以致所述核酸序列在上述宿主中的表達引起血凝固。
20.特異于權(quán)利要求1所述因子VIII多肽的純化的抗體。
全文摘要
本申請公開了在殘基741至1689區(qū)域內(nèi)包含氨基酸內(nèi)缺失的因子VIII多肽，與人因子VIII相比，其中存在約741和約1689位的凝血酶切割位點，而不存在約1648位的位點。
文檔編號C12N5/00GK1745100SQ200380109331
公開日2006年3月8日 申請日期2003年10月27日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月28日
發(fā)明者金薰?jié)? 宋寅瑛, 崔宰元, 張鎮(zhèn)旭, 金龍局, 李鎬順, 方英株, 金大起 申請人:引頭基因組有限公司