專利名稱：使用含有弱化的yjgF ORF序列的腸桿菌科菌株發(fā)酵生產(chǎn)L－氨基酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用腸桿菌科(Enterobacteriaceae)菌株發(fā)酵生產(chǎn)L-氨基酸，特別是L-蘇氨酸的方法，其中稱為yigF的開放讀框(ORF)被弱化。
現(xiàn)有技術(shù)L-氨基酸，特別是L-蘇氨酸用于人類醫(yī)學(xué)和制藥工業(yè)、食品工業(yè)，并特別用于動物營養(yǎng)。
已知通過發(fā)酵腸桿菌科菌株，尤其大腸桿菌(E.coli)和粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)生產(chǎn)L-氨基酸。因為其極大的重要性，一直研究著改良該生產(chǎn)方法。方法的改良可涉及發(fā)酵措施，如攪拌和供氧，或者營養(yǎng)培養(yǎng)基的組成，如發(fā)酵期間的糖濃度，或者逐漸達到產(chǎn)物形式，例如通過離子交換層析，或者微生物自身獨特的產(chǎn)出性質(zhì)。
誘變、選擇和突變選擇的方法用于改良這些微生物的產(chǎn)出性質(zhì)。以此方式獲得對抗代謝物如蘇氨酸類似物α-氨基-β-羥戊酸(AHV)有抗性的菌株，或者對調(diào)節(jié)重要性的代謝物是營養(yǎng)缺陷型并產(chǎn)生L-氨基酸如L-蘇氨酸的菌株。
近年來重組DNA技術(shù)的方法也已經(jīng)用于生產(chǎn)L-氨基酸的腸桿菌科菌株的改良，通過擴增各個氨基酸生物合成基因并研究對生產(chǎn)的作用而進行。大對腸桿菌和沙門氏菌的細胞和分子生物學(xué)的概述信息見于Neidhardt(編輯)Escherichia coli and Salmonella，Cellular andMolecular Biology，第二版，ASM Press，Washington，D.C.，USA。
發(fā)明目的本發(fā)明的目的是提供L-氨基酸，特別是L-蘇氨酸的改良的發(fā)酵生產(chǎn)新措施。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了使用腸桿菌科微生物發(fā)酵生產(chǎn)L-氨基酸，特別是L-蘇氨酸的方法，其中所述微生物已經(jīng)生產(chǎn)L-氨基酸并且其中至少編碼yjgF ORF或其等位基因的核苷酸序列被弱化。
發(fā)明詳述當(dāng)下文提及L-氨基酸時，是指選自如下一組的一或多種氨基酸，包括其鹽L-天冬酰胺、L-蘇氨酸、L-絲氨酸、L-谷氨酸、L-甘氨酸、L-丙氨酸、L-半胱氨酸、L-纈氨酸、L-甲硫氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、L-組氨酸、L-賴氨酸、L-色氨酸和L-精氨酸。特別優(yōu)選L-蘇氨酸。
文中所用術(shù)語“弱化”是指微生物中由相應(yīng)DNA編碼的一或多種酶或蛋白質(zhì)的胞內(nèi)活性或濃度降低或消除，例如通過使用弱啟動子或編碼具有低活性的相應(yīng)酶或蛋白質(zhì)的基因或等位基因或ORF，或者失活相應(yīng)的酶或蛋白質(zhì)或基因或ORF而進行弱化，任選地組合使用這些措施。
開放讀框(ORF)是指編碼或可以編碼現(xiàn)有技術(shù)中未知功能的蛋白質(zhì)或多肽或核糖核酸的核苷酸序列片段。在確定了所述核苷酸序列片段的功能之后，其通常被稱作基因。等位基因通常是指給定基因的意義變體(meaning variant)。這些等位基因通過核苷酸序列的不同而區(qū)分。
由一個核苷酸序列即ORF、基因或等位基因編碼的蛋白質(zhì)，或者所編碼的核糖核酸通常稱作基因產(chǎn)物。
通過弱化措施，本發(fā)明的相應(yīng)蛋白質(zhì)或現(xiàn)有技術(shù)的蛋白質(zhì)的活性或濃度通常降低為野生型蛋白質(zhì)的活性或濃度或者起始微生物中蛋白質(zhì)的活性或濃度的0-75％、0-50％、0-25％、0-10％或0-5％。起始微生物是指進行本發(fā)明措施的微生物。
所述方法特征在于進行如下步驟a)發(fā)酵產(chǎn)生所需L-氨基酸的腸桿菌科微生物，其中所述微生物的yjgF ORF或編碼其的核苷酸序列被弱化，b)濃縮培養(yǎng)基或腸桿菌科微生物的細胞中相應(yīng)的L-氨基酸，及任選地c)分離所需L-氨基酸，任選地，發(fā)酵肉湯和/或生物量的組分全部或部分(＞0-100％)保留在產(chǎn)物中。
本發(fā)明提供的微生物，尤其是重組微生物可以從葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、糖蜜、任選地淀粉、任選地纖維素或從甘油和乙醇中產(chǎn)生L-氨基酸。它們是選自如下腸桿菌科的代表性菌株埃希氏菌屬(Escherichia)、歐文氏菌屬(Erwinia)、普羅威登斯菌屬(Providencia)和沙雷氏菌屬(Serratia)。優(yōu)選埃希氏菌屬和沙雷氏菌屬。可提及的是埃希氏菌屬，特別是大腸桿菌菌種及沙雷氏菌屬，特別是粘質(zhì)沙雷氏菌菌種。
生產(chǎn)L-蘇氨酸的合適菌株，特別是埃希氏菌屬，尤其是大腸桿菌菌種的菌株例子為-大腸桿菌H4581(EP0 301 572)-大腸桿菌KY10935(Bioscience Biotechnology and Biochemistry61(11)1877-1882(1997)-大腸桿菌VNIIgenetika MG442(US-A-4278,765)-大腸桿菌VNIIgenetika M1(US-A-4.321.325)-大腸桿菌VNIIgenetika 472T23(US-A-5,631,157)
-大腸桿菌BKIIM B-3996(US-A-5.175.107)-大腸桿菌kat13(WO98/04715)-大腸桿菌KCCM-10132(WO00/09660)合適的生產(chǎn)L-蘇氨酸的沙雷氏菌屬，特別是粘質(zhì)沙雷氏菌菌種的例子為-粘質(zhì)沙雷氏菌HNr21(Applied and Environmental Microbiology38(6)1045-1051(1979))-粘質(zhì)沙雷氏菌TLr156(Gene 57(2-3)151-158(1987))-粘質(zhì)沙雷氏菌T-2000(Applied Biochemistry and Biotechnology37(3)255-265(1992))生產(chǎn)L-蘇氨酸的腸桿菌科菌株優(yōu)選具有選自如下一組的一或多種遺傳或表型特征α-氨基β-羥戊酸抗性、硫賴氨酸(thialysine)抗性、乙硫氨酸抗性、α-甲基絲氨酸抗性、二氨基琥珀酸抗性、α-氨基丁酸抗性、疏螺旋體素抗性、環(huán)戊烷-羧酸抗性、利福平抗性、纈氨酸類似物例如纈氨酸氧肟酸抗性、嘌呤類似物例如6-二甲基氨基嘌呤抗性、需要L-甲硫氨酸、任選地部分且可補償?shù)匦枰狶-異亮氨酸、需要間二氨基庚二酸、對于含蘇氨酸二肽為營養(yǎng)缺陷型、L-蘇氨酸抗性、蘇氨酸萃余液(raffinate)抗性、L-高絲氨酸抗性、L-賴氨酸抗性、L-甲硫氨酸抗性、L-谷氨酸抗性、L-天冬氨酸抗性、L-亮氨酸抗性、L-苯丙氨酸抗性、L-絲氨酸抗性、L-半胱氨酸抗性、L-纈氨酸抗性、氟丙酮酸敏感性、缺陷的蘇氨酸脫氫酶、任選地有蔗糖利用能力、蘇氨酸操縱子的增強、高絲氨酸脫氫酶I-天冬氨酸激酶I的增強，優(yōu)選地為反饋抗性形式、高絲氨酸激酶的增強、蘇氨酸合酶的增強、天冬氨酸激酶的增強，任選地為反饋抗性形式、天冬氨酸半醛脫氫酶的增強、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的增強，任選地為反饋抗性形式、磷酸烯醇丙酮酸合酶的增強、轉(zhuǎn)氫酶的增強、RhtB基因產(chǎn)物的增強、RhtC基因產(chǎn)物的增強、YfiK基因產(chǎn)物的增強、丙酮酸羧化酶的增強、及乙酸形成的弱化。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)腸桿菌科的微生物在yjgF基因或其開放讀框(ORF)或等位基因被弱化、特別是被消除后以改良的形式產(chǎn)生L-氨基酸，尤其L-蘇氨酸。
大腸桿菌的基因或開放讀框(ORF)的核苷酸序列屬于現(xiàn)有技術(shù)并也可以在由Blattner等(Science 2771453-1462(1997))公布的大腸桿菌基因組序列中發(fā)現(xiàn)。
大腸桿菌K12的yjgF ORF通過如下數(shù)據(jù)描述描述開放讀框功能未知功能描述開放讀框yjgF編碼15.1kDa蛋白質(zhì)，等電點為5.8；在染色體上位于例如大腸桿菌K12 MG1655，其位于編碼P-Typ1的Mg2+轉(zhuǎn)運ATP酶的基因mgtA和編碼天冬氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶的調(diào)節(jié)亞基的pyrI基因的基因間區(qū)域。
參考文獻Wasinger VC.and Humphery-Smith I.；FEMSMicrobiology Letters 169(2)375-382(1998)Volz K.；Protein Science 8(11)2428-2437(1999)Parsons et al.；Biochemistry 42(1)80-89(2003)登記號 AE000495來自鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)的yjgF ORF在如下參考文獻中描述Enos-Berlage et al.；Journal of Bacteriology 180(24)6519-6528(1998)。
核酸序列可在如下數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)the National Library ofMedicine(Bethesda，MD，USA)的National Center for BiotechnologyInformation(NCBI)，European Molecular Biologies Laboratories(EMBL，Heidelberg，Germany or Cambridge，UK)的核苷酸序列數(shù)據(jù)庫，或者日本DNA數(shù)據(jù)庫(DDBJ，Mishima，Japan)。
為了更好地闡明，大腸桿菌的yjgF ORF的已知序列示于SEQ IDNO1，鼠傷寒沙門氏菌的yjgF ORF的已知序列示于SEQ ID NO11。由這些讀框編碼的蛋白質(zhì)示于SEQ ID NO2和SEQ ID NO12。
提及的參考文獻中所述的開放讀框根據(jù)本發(fā)明可以使用。也可以使用由于遺傳密碼的簡并性或者如下所述的突變所致的這些開放讀框或基因尤其是腸桿細菌科的開放讀框或基因的等位基因。優(yōu)選使用內(nèi)源性基因或開放讀框。
“內(nèi)源性基因”或“內(nèi)源性核苷酸序列”是指一個物種群體中存在的基因或開放讀框等位基因或核苷酸序列。
合適的yjgF ORF的等位基因包括含有中性功能突變或“有義突變”的那些。這些包括導(dǎo)致由其編碼的蛋白質(zhì)中至少一個(1)保守的氨基酸置換的那些等位基因。保守氨基酸置換的最大數(shù)目可以涉及2、3、5、10、20，但決不超過30個氨基酸。通過所述保守氨基酸置換，功能性降低或增加0％至不超過24％、20％、10％、5％、3％、2％或1％。
在芳族氨基酸的情況中，保守置換是指苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸彼此相互置換。在疏水性氨基酸的情況中，保守置換是指亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸彼此相互置換。在極性氨基酸的情況中，保守置換是指谷氨酰胺和天冬酰胺彼此相互置換。在堿性氨基酸的情況中，保守置換是指精氨酸、賴氨酸和組氨酸彼此相互置換。在酸性氨基酸的情況中，保守置換是指天冬氨酸和谷氨酸彼此相互置換。在含有羥基基團的氨基酸的情況中，保守置換是指絲氨酸和蘇氨酸彼此相互置換。所有其它氨基酸置換均稱為非保守的氨基酸置換。
同樣，也可以使用編碼所述蛋白質(zhì)的變體的那些核苷酸序列，所述蛋白質(zhì)的變體在其N或C末端額外含有至少一個氨基酸(1)的延長或縮短。這種延長或縮短不超過30、20、10、5、3或2個氨基酸或氨基酸基團。
合適的等位基因還包括編碼其中插入(插入)或除去(缺失)至少一個(1)氨基酸的蛋白質(zhì)的那些等位基因。這種稱為插入/缺失(indels)的改變的最大數(shù)目可涉及2、3、5、10、20但決不超過30個氨基酸。
合適的等位基因進一步包括使用SEQ ID NO1或SEQ ID NO11或其部分，特別是編碼區(qū)或與其互補的序列，通過雜交，特別是在嚴格條件下雜交可獲得的那些等位基因。
利用雜交鑒別DNA序列的指導(dǎo)可見于專業(yè)手冊“The DIGSystem Users Guide for Filter Hybridization”，Boehringer MannheimGmbH(Mannheim，Germany，1993)及Liebl et al.(International Journalof Systematic Bacteriology 41255-260(1991))。雜交在嚴格條件下發(fā)生，也就是說只形成了其中探針和靶序列，即用探針處理的多核苷酸是至少70％相同的雜交體。已知通過改變緩沖液組成、溫度和鹽濃度可以影響或確定雜交包括洗滌步驟的嚴格性。雜交反應(yīng)一般在與洗滌步驟相比相對低的嚴格條件下進行(Hybaid Hybridisation Guide，Hybaid Limited，Teddington，UK，1996)。
雜交反應(yīng)可以利用例如在大約50-68℃相應(yīng)于5×SSC的緩沖液進行。探針在此也可以和與探針序列具有少于70％相同性的多核苷酸雜交。這種雜交體穩(wěn)定性較低并通過在嚴格條件下洗滌而除去。這可以例如在大約50-68℃下，通過將鹽濃度降低至2×SSC及任選隨后降低至0.5×SSC(The DIG System User′s Guide for FilterHybridisation，Boehringer Mannheim，Mannheim，Germany，1995)而實現(xiàn)。任選地可以將鹽濃度降低至相應(yīng)于0.2×SSC或0.1×SSC的濃度。與所用的探針序列有例如至少70％或至少80％或至少90％-95％或者至少96％-99％相同性的多核苷酸片段可以通過將雜交溫度從50℃逐步(大約1-2℃)提高至68℃而分離。關(guān)于雜交的進一步的指導(dǎo)在市場上可以所謂的試劑盒形式獲得(例如DIG Easy Hyb，Roche Diagnostics′GmbH，Mannheim，Germany，Catalogue No.1603558)。
為實現(xiàn)弱化，例如可以將基因或開放讀框的表達或者酶蛋白質(zhì)的催化性質(zhì)降低或消除?？梢匀芜x地組合這兩種措施。
基因表達的降低可通過適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)、通過遺傳修飾(突變)基因表達的信號結(jié)構(gòu)或者也通過反義RNA技術(shù)而發(fā)生?；虮磉_的信號結(jié)構(gòu)是例如阻抑基因、激活基因、操縱基因、啟動子、弱化子、核糖體結(jié)合位點、起始密碼子和終止子。專業(yè)人員可以在例如如下文獻中發(fā)現(xiàn)這方面的信息Jensen and Hammer(Biotechnology andBioengineering 58191-195(1998)，Carrier und Keasling(BiotechnologyProgress 1558-64(1999))，F(xiàn)ranch and Gerdes(Current Opinion inMicrobiology 3159-164(2000))及已知的遺傳學(xué)和分子生物學(xué)教科書，例如Knippers(″Molekulare Genetik″，6th edition，Georg ThiemeVerlag，Stuttgart，Germany，1995)或者Winnacker(″Gene und Klone″，VCH Verlagsgesellschaft，Weinheim，Germany，1990)所著教科書。
導(dǎo)致酶蛋白質(zhì)的催化性質(zhì)改變或降低的突變已為本領(lǐng)域所已知?？梢蕴峒暗膶嵗侨缦氯藛T的研究Qiu and Goodman(Journal ofBiological Chemistry 2728611-8617(1997))，Yano et al.(Proceedings ofthe National Academy of Sciences of the United States of America 955511-5515(1998))，Wente and Schachmann(Journal of BiologicalChemistry 26620833-20839(1991))。概括描述可在已知的遺傳學(xué)和分子生物學(xué)教科書中發(fā)現(xiàn)，例如Hagemann(″Allgemeine Genetik″，Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1986)。
可能的突變是轉(zhuǎn)換、顛換、插入和缺失至少一個(1)堿基對或核苷酸。根據(jù)突變所致氨基酸置換對酶活性的作用，稱作“錯義突變”或“無義突變”。錯義突變導(dǎo)致蛋白質(zhì)中一個特定的氨基酸置換為另一個，特別是非保守的氨基酸置換。蛋白質(zhì)的功能性或活性通過這種方式削弱并降低至0-75％、0-50％、0-25％、0-10％或0-5％。無義突變在基因的編碼區(qū)內(nèi)產(chǎn)生一個終止密碼子并因此提前中斷翻譯。在基因中插入或缺失至少一個堿基對導(dǎo)致“移碼突變”，這導(dǎo)致?lián)饺氩徽_的氨基酸或提前中斷翻譯。如果終止密碼子由于突變的結(jié)果而在編碼區(qū)內(nèi)形成，這也導(dǎo)致翻譯的提前終止。缺失至少一個(1)或多個密碼子典型地也導(dǎo)致酶活性的完全喪失。
產(chǎn)生這種突變的指導(dǎo)是現(xiàn)有技術(shù)并可以見于已知的遺傳學(xué)和分子生物學(xué)教科書，例如Knippers(″Molekulare Genetik″，6th edition，Georg Thieme Verlag，Stuttgart，Germany，1995)、Winnacker(″Gene undKlone″，VCH Verlagsgesellschaft，Weinheim，Germany，1990)或Hagemann(″Allgemeine Genetik″，Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1986)所著教科書。
基因中的合適突變例如缺失突變(見SEQ ID NO10)可以通過基因或等位基因置換而摻入合適的菌株中。
通常的方法是Hamilton等(Journal of Bacteriology 1714617-4622(1989))所述的借助于條件性復(fù)制的pSC101衍生物pMAK705的基因置換。另外可以應(yīng)用本領(lǐng)域所述的其它方法，例如Martinez-Morales et al.(Journal of Bacteriology 1817143-7148(1999))或者Boyd et al.(Journal of Bacteriology 182842-847(2000))所述方法。
也可以通過綴合或轉(zhuǎn)導(dǎo)將特定基因中的突變或者影響特定基因或開放讀框表達的突變轉(zhuǎn)移進不同菌株中。
關(guān)于遺傳學(xué)和分子生物學(xué)中術(shù)語的更詳細的解釋見已知的遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的教科書所述，例如Birge(Bacterial andBacteriophage Genetics，4th ed.，Springer Verlag，New York(USA)，2000)或Berg，Tymoczko and Stryer(Biochemistry，5thed.，F(xiàn)reeman andCompany，New York(USA)，2002)所著教科書或者Sambrook et al.(Molecular Cloning，A Laboratory Manual，(3 volume set)，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor(USA)，2001)所著手冊。
除了弱化yjgF ORF之外，增強已知蘇氨酸生物合成途徑的一或多種酶或者添補代謝的酶或者生產(chǎn)還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的酶或者糖酵解的酶或者PTS酶或者硫代謝的酶對使用腸桿菌科菌株生產(chǎn)L-氨基酸特別是L-蘇氨酸另有優(yōu)勢。
文中所用術(shù)語“增強”是指例如使用編碼具有高活性的相應(yīng)酶或蛋白質(zhì)的有力啟動子或基因或開放讀框，通過增加一或多個基因或開放讀框的拷貝數(shù)而增加微生物中由相應(yīng)的DNA編碼的一或多種酶或蛋白質(zhì)的胞內(nèi)活性或濃度，及任選組合這些措施。
通過增強措施，特別是過表達，相應(yīng)蛋白質(zhì)的活性或濃度在野生型蛋白質(zhì)或者起始微生物中蛋白質(zhì)的活性或濃度基礎(chǔ)上一般增加至少10％、25％、50％、75％、100％、150％、200％、300％、400％、或500％，直至最大值1000％或2000％。
為生產(chǎn)L-氨基酸，特別是L-蘇氨酸，除了弱化yjgF ORF之外，同時增強，特別是過表達選自如下一組的一或多個基因是有利的·編碼天冬氨酸激酶、高絲氨酸脫氫酶、高絲氨酸激酶和蘇氨酸合酶的thrABC操縱子(US-A-4,278,765)，·編碼丙酮酸羧化酶的谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)的pyc基因(WO99/18228)，·編碼磷酸烯醇丙酮酸合酶的pps基因(Molecular and GeneralGenetics 231(2)332-336(1992))，·編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的ppc基因(Gene 31279-283(1984))，·編碼轉(zhuǎn)氫酶的pntA和pntB基因(European Journal ofBiochemistry 158647-653(1986))，
·賦予高絲氨酸抗性的rhtB基因(EP-A-0 994 190)，·編碼蘋果酸:醌氧化還原酶的mqo基因(WO 02/06459)，·賦予蘇氨酸抗性的rhtC基因(EP-A-1 013 765)，·編碼蘇氨酸輸出蛋白的谷氨酸棒桿菌的thrE基因(WO01/92545)，·編碼谷氨酸脫氫酶的gdhA基因(Nucleic Acids Research 115257-5266(1983)；Gene 23199-209(1983))，·編碼DNA結(jié)合蛋白HLP-II的hns基因(WO 03/004671)，·編碼葡糖磷酸變位酶的pgm基因(WO 03/004598)，·編碼果糖二磷酸醛縮酶的fba基因(WO 03/004664)，·編碼磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)PTS的磷酸組氨酸蛋白質(zhì)己糖磷酸轉(zhuǎn)移酶的ptsHIcrr操縱子的ptsH基因(WO 03/004674)，·編碼磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)PTS的酶I的ptsHIcrr操縱子的ptsI基因(WO 03/004674)，·編碼磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)PTS的葡萄糖特異性IIA成分的ptsHIcrr操縱子的crr基因(WO 03/004674)，·編碼葡萄糖特異性IIBC成分的ptsG基因(WO 03/004670)，·編碼亮氨酸調(diào)節(jié)子的調(diào)節(jié)物的lrp基因(WO 03/004665)，·編碼全局調(diào)節(jié)物Csr的csrA基因(Journal of Bacteriology 1754744-4755(1993))，·編碼fad調(diào)節(jié)子的調(diào)節(jié)物的fadR基因(Nucleic Acids Research167995-8009(1988))，·編碼中心中間代謝(central intermediate metabolism)的調(diào)節(jié)物的iclR基因(Journal of Bacteriology 1722642-2649(1990))，·編碼10kd侶伴蛋白的mopB基因(WO 03/004669)，其也已知稱作groES，·編碼烷基氫過氧化物還原酶的小亞基的ahpCF操縱子的ahpC基因(WO 03/004663)，·編碼烷基氫過氧化物還原酶的大亞基的ahpCF操縱子的ahpF基因(WO 03/004663)，·編碼半胱氨酸合酶A的cysK基因(WO 03/006666)，·編碼cys調(diào)節(jié)子的調(diào)節(jié)物的cysB基因(WO 03/006666)，·編碼NADPH亞硫酸鹽還原酶的黃素蛋白的cysJIH操縱子的cysJ基因(WO 03/006666)，·編碼NADPH亞硫酸還原酶的血蛋白的cysJIH操縱子的cysI基因(WO 03/006666)，·編碼腺苷酰硫酸還原酶的cysJIH操縱子的cysH基因(WO03/006666)，·編碼pho調(diào)節(jié)子的陽性調(diào)節(jié)物PhoB的phoBR操縱子的phoB基因(WO 03/008606)，·編碼pho調(diào)節(jié)子的傳感蛋白的phoBR操縱子的phoR基因(WO03/008606)，·編碼外細胞膜蛋白E的phoE基因(WO 03/008606)，·編碼果糖刺激的丙酮酸激酶I的pykF基因(WO 03/008609)，·編碼6-果糖磷酸激酶II的pfkB基因(WO 03/008610)，·編碼麥芽糖轉(zhuǎn)運的周質(zhì)結(jié)合蛋白(periplasmic binding protein)的malE基因(WO 03/008605)，·編碼超氧化物歧化酶的sodA基因(WO 03/008613)，·編碼具有抗sigmaE活性的膜蛋白的rseABC操縱子的rseA基因(WO 03/008612)，·編碼sigmaE因子的全局調(diào)節(jié)物的rseABC操縱子的rseC基因(WO 03/008612)，·編碼2-酮戊二酸脫氫酶的脫羧酶亞基的sucABCD的sucA基因(WO 03/008614)，
·編碼2-酮戊二酸脫氫酶的二氫硫辛酸轉(zhuǎn)琥珀酸酶E2亞基的sucABCD的sucB基因(WO 03/008614)，·編碼琥珀酰-CoA合成酶的β亞基的sucABCD操縱子的sucC基因(WO 03/008615)，·編碼琥珀酰-CoA合成酶的α亞基的sucABCD操縱子的sucD基因(WO 03/008615)，·編碼腺苷酸激酶的adk基因(Nucleic Acids Research 13(19)7139-7151(1985))，·編碼具有侶伴蛋白樣功能的周質(zhì)蛋白的hdeA基因(Journal ofBacteriology 175(23)7747-7748(1993))，·編碼具有侶伴蛋白樣功能的周質(zhì)蛋白的hdeB基因(Journal ofBacteriology 175(23)7747-7748(1993))，·編碼異檸檬酸脫氫酶的icd基因(Journal of BiologicalChemistry 262(22)10422-10425(1987))，·編碼周質(zhì)葡萄糖結(jié)合轉(zhuǎn)運蛋白HLP-II的mglB基因(Molecularand General Genetics 229(3)453-459(1991))，·編碼二氫硫辛酰胺脫氫酶的lpd基因(European Journal ofBiochemistry 135(3)519-527(1983))，·編碼丙酮酸脫氫酶復(fù)合物的E1成分的aceE基因(EuropeanJournal of Biochemistry 133(1)155-162(1983))，·編碼丙酮酸脫氫酶復(fù)合物的E2成分的aceF基因(EuropeanJournal of Biochemistry 133(3)481-489(1983))，·編碼氨肽酶B的pepB基因(Journal of Fermentation andBioengineering 82392-397(1996))，·編碼醛脫氫酶的aldH基因(E.C.1.2.1.3)(Gene 99(1)15-23(1991))，·編碼離子貯存同源蛋白(ion storage homoprotein)(細菌鐵蛋白)的bfr基因(Journal of Bacteriology 171(7)3940-3947(1989))，·編碼尿苷磷酸酶的udp基因(Nucleic Acids Research 17(16)6741(1989))及·編碼sigmaE因子活性調(diào)節(jié)物的rseB基因(MolecularMicrobiology 24(2)355-371(1997))。
一般優(yōu)選使用內(nèi)源基因或開放讀框。
除了弱化yjgF ORF之外，弱化特別是消除或降低選自如下一組的一或多個基因的表達對生產(chǎn)L-氨基酸特別是蘇氨酸也是有利的·編碼蘇氨酸脫氫酶的tdh基因(Journal of Bacteriology 1694716-4721(1987))，·編碼蘋果酸脫氫酶的mdh基因(E.C.1.1.1.37)(Archives inMicrobiology 14936-42(1987))，·開放讀框(orf)yjfA的基因產(chǎn)物(Accession Number AAC77180，the National Center for Biotechnology Information(NCBI，Bethesda，MD，USA)，WO 02/29080)，·開放讀框(orf)ytfP的基因產(chǎn)物(Accession Number AAC77179，the National Center for Biotechnology Information(NCBI，Bethesda，MD，USA)，WO 02/29080)，·編碼磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的pckA基因(WO 02/29080)，·編碼丙酮酸氧化酶的poxB基因(WO 02/36797)，·編碼異檸檬酸裂合酶的aceA基因(WO 02/081722)，·編碼磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)的DgsA調(diào)節(jié)物的dgsA基因(WO02/081721)，其也已知稱為mlc基因，·編碼果糖阻抑物的fruR基因(WO 02/081698)，其也已知稱作cra基因，·編碼sigma38因子的rpoS基因(WO 01/05939)，其也已知稱作katF基因，
·編碼天冬氨酸銨裂合酶(天冬氨酸酶)的aspA基因(WO03/008607)及·編碼蘋果酸合酶A的aceB基因(WO 03/008603)。
除了弱化yjgF ORF之外，消除不希望的副反應(yīng)對L-氨基酸、特別是L-蘇氨酸的生產(chǎn)是有利的(Nakayama″Breeding of Amino AcidProducing Microorganisms″，inOverproduction of Microbial Products，Krumphanzl，Sikyta，Vanek(eds.)，Academic Press，London，UK，1982)。
根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的微生物可以分批次培養(yǎng)(分批培養(yǎng))，補料分批培養(yǎng)(補料方法)或者重復(fù)補料分批培養(yǎng)(重復(fù)補料方法)。已知培養(yǎng)方法的概述見Chmiel(Bioprozesstechnik 1.Einführung in dieBioverfahrenstechnik(Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1991))或者Storhas(Bioreaktoren und periphere Einrichtungen(Vieweg Verlag，Braunschweig/Wiesbaden，1994))所著教科書中所述。
使用的培養(yǎng)基必須以合適的方式符合特定菌株的需要。關(guān)于各種微生物的培養(yǎng)基的描述見“Manual of Methods for GeneralBacteriology”of the American Society for Bacteriology(WashingtonD.C.，USA，1981)所述。
糖和碳水化合物例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、糖蜜、淀粉，及任選地纖維素，油和脂肪例如豆油、葵花子油、花生油和椰子油，脂肪酸例如棕櫚酸、硬脂酸和亞油酸，醇例如甘油和乙醇，及有機酸例如乙酸可用作碳源。這些物質(zhì)可單獨應(yīng)用或作為混合物應(yīng)用。
有機含氮化合物如胨、酵母提取物、肉膏、麥芽膏、玉米浸液、大豆粉和尿素，或者無機化合物如硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨和檸檬酸銨可用作氮源。這些氮源可以單獨使用或作為混合物使用。
磷酸、磷酸二氫鉀或者磷酸氫二鉀或者相應(yīng)的含鈉鹽可用作磷源。培養(yǎng)基必須另外包含生長必需的金屬鹽，例如硫酸鎂或硫酸鐵。最后，除了上述物質(zhì)之外還可以應(yīng)用必需的生長物質(zhì)如氨基酸和維生素。合適的前體可以另外加入培養(yǎng)基中。起始物質(zhì)可以單批加入培養(yǎng)物中，或者可以在培養(yǎng)期間以合適的方式補料。
發(fā)酵一般在pH5.5-9.0、特別是在6.0-8.0下進行。可以適當(dāng)方式應(yīng)用堿性化合物如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氨或氨水，或者酸性化合物如磷酸或硫酸，以控制培養(yǎng)物的pH。可以應(yīng)用抗泡沫劑例如脂肪酸聚乙二醇酯以控制泡沫的產(chǎn)生?？梢詫⒕哂羞x擇作用的適當(dāng)物質(zhì)例如抗生素加入培養(yǎng)基中以保持質(zhì)粒的穩(wěn)定性。為保持有氧條件，將氧氣或含氧氣體混合物如空氣導(dǎo)入培養(yǎng)物中。培養(yǎng)溫度通常為25℃-45℃，優(yōu)選30℃-40℃。持續(xù)培養(yǎng)直至形成最大量的L-氨基酸或L-蘇氨酸。這個目標(biāo)通常在10小時至160小時內(nèi)達到。
L-氨基酸的分析可以如Spackman et al.(Analytical Chemistry，301190-1206(1958))所述，通過陰離子交換層析及隨后的茚三酮衍生反應(yīng)而進行，或者可以如Lindroth et al.(Analytical Chemistry 511167-1174(1979))所述通過反向HPLC進行。
本發(fā)明的方法用于發(fā)酵生產(chǎn)L-氨基酸，例如L-蘇氨酸、L-異亮氨酸、L-纈氨酸、L-甲硫氨酸、L-高絲氨酸和L-賴氨酸，特別是L-蘇氨酸。
大腸桿菌K-12菌株DH5α/pMAK705的純培養(yǎng)物根據(jù)布達佩斯條約于2000年9月8日保藏在德國微生物保藏中心(DSMZ，德國不倫瑞克)，保藏號為DSM 13720。
本發(fā)明借助于如下實施例得以更詳細的闡述。
培養(yǎng)大腸桿菌所使用的基本培養(yǎng)基(M9)和完全培養(yǎng)基(LB)由J.H.Miller(A Short Course in Bacterial Genetics(1992)，Cold SpringHarbor Laboratory Press)描述。質(zhì)粒DNA從大腸桿菌中的分離及限制、連接、Klenow和堿性磷酸酶處理的所有技術(shù)均通過Sambrook等(Molecular Cloning-A Laboratory Manual(1989)Cold Spring HarborLaboratory Press)所述技術(shù)進行。除非特別說明，大腸桿菌的轉(zhuǎn)化通過Chung等(Proceedings of the National Academy of Sciences of the UnitedStates of America 862172-2175(1989))所述方法進行。
制備菌株和轉(zhuǎn)化體的保溫溫度是37℃。在Hamilton等的基因置換方法中使用的溫度是30℃和44℃。
實施例1yjgF ORF的缺失突變的構(gòu)建使用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)及合成寡核苷酸，從大腸桿菌K12中擴增位于yjgF ORF上游和下游的部分基因區(qū)域以及yjgF ORF的部分5’和3’區(qū)域。從yjgF ORF的核苷酸序列及位于大腸桿菌K12 MG1655(SEQ ID NO1，登記號AE000495)上游和下游的序列出發(fā)，合成如下PCR引物(MWG Biotech，Ebersberg，Germany)yjgF-15-TCGCGATCTGGTACTGTAAG-3(SEQ ID NO3)yjgF-25-CTGTACGTAAGGACCGATAG-3(SEQ ID NO4)yjgF-35-CGCTGTTCGTCGCTAATCTT-3(SEQ ID NO5)yjgF-45-GATCTTCTTCGGACCGATCA-3(SEQ ID NO6)用于PCR的大腸桿菌K12 MG1655染色體DNA根據(jù)廠商指導(dǎo)用“Qiagen Genomic-tips 100/G”(QIAGEN，Hilden，Germany)分離。來自yjgF ORF的5’區(qū)域的大小為622bp的一個DNA片段被稱為yjgF5’并示于SEQ ID NO7，來自yjgF ORF的3’區(qū)域的大小為612bp的一個DNA片段被稱為yjgF3’并示于SEQ ID NO8，這兩個片段可以使用特異性引物，用Taq-DNA聚合酶(Gibco-BRL，Eggenstein，Germany)在標(biāo)準PCR條件下擴增(Innis et al.(1990)PCR Protocols.AGuide to Methods and Applications，Academic Press)。
將每個PCR產(chǎn)物根據(jù)廠商指導(dǎo)與載體pCR2.1TOPO(TOPO TACloning Kit，Invitrogen，Groningen，The Netherlands)連接并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌菌株TOP10F′中。在加入50μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂上選擇攜帶質(zhì)粒的細胞。在分離質(zhì)粒DNA后，將載體pCR2.1yjgF5′用限制酶Ec1136II和XbaI切割，隨后在0.8％瓊脂糖凝膠中分離，yjgF5′片段借助于QIAquick凝膠提取試劑盒(QIAGEN，Hilden，Germany)分離。分離質(zhì)粒DNA之后，將載體pCR2.1yjgF3′用酶EcoRV和XbaI切割并與分離的yjgF5′片段連接。將大腸桿菌菌株DH5α用連接混合物轉(zhuǎn)化并在加入了50μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂上選擇攜帶質(zhì)粒的細胞。分離質(zhì)粒DNA之后，將克隆有SEQ ID NO9所示突變DNA序列的那些質(zhì)粒通過用酶HindIII/XbaI和StuI/HincII對照切割而進行檢測。這些質(zhì)粒有一個被稱作pCR2.1TOPOΔyjpF。
實施例2置換載體pMAK705ΔyjgF的構(gòu)建實施例1所述缺失的yjgF ORF在用酶HindIII和XbaI消化載體pCR2.1TOPOΔyjgF并在0.8％瓊脂糖凝膠中分離之后從所述載體中分離，并與已經(jīng)用酶HindIII和Xbal消化的質(zhì)粒pMAK705(Hamilton etal.(1989)Journal of Bacteriology 171，4617-4622)連接。將連接混合物轉(zhuǎn)化進DH5α中并在加入了20μg/ml氯霉素的LB瓊脂上選擇攜帶質(zhì)粒的細胞。在分離質(zhì)粒DNA并用酶HindIII/XbaI和PstI切割后，證實克隆成功。形成的置換載體pMAK705ΔyjgF(＝pMAK705deltayjgF)如

圖1所示。
實施例3大腸桿菌菌株MG442中yjgF ORF的位點特異性誘變生產(chǎn)L-蘇氨酸的大腸桿菌菌株MG442在專利說明書US-A-4.278.765中描述，并保藏在俄羅斯國家工業(yè)微生物保藏中心(VKPM，Moscow，Russia)，保藏號為CMIM B-1628。
為了用質(zhì)粒編碼的缺失構(gòu)建體置換染色體yjgF ORF，將MG442用質(zhì)粒pMAK705ΔyjgF轉(zhuǎn)化。基因置換通過Hamilton等(1989)Journalof Bacteriology 171，4617-4622)所述選擇方法進行，并使用如下引物通過標(biāo)準PCR方法證實(Innis et al.(1990)PCR Protocols.A Guide toMethods and Applications，Academic Press)yjgF-15′-TCGCGATCTGGTACTGTAAG-3′(SEQ ID NO3)yjgF-45′-GATCTTCTTCGGACCGATCA-3′(SEQ ID NO6)在發(fā)生置換后，MG442含有SEQ ID NO10所示ΔyjgF等位基因形式。獲得的菌株稱作MG442ΔyjgF。
實施例4使用菌株MG442ΔyjgF制備L-蘇氨酸MG442ΔyjgF在具有如下成分的基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)3.5g/lNa2HPO4*2H2O，1.5g/l KH2PO4，1g/l NH4Cl，0.1g/l MgSO4*7H2O，2g/l葡萄糖，20g/l瓊脂。在100ml錐形瓶中的10ml分批培養(yǎng)物中檢測L-蘇氨酸的形成。為此，接種具有如下成分的10ml預(yù)培養(yǎng)基2g/l酵母提取物，10g/l(NH4)2SO4，1g/l KH2PO4，0.5g/lMgSO4*7H2O，15g/l CaCO3，20g/l葡萄糖，并將混合物在來自KhnerAG(Birsfelden，Switzerland)的ESR溫箱上在37℃以180rpm保溫16小時。將250μl這種預(yù)培養(yǎng)物接種進10ml生產(chǎn)培養(yǎng)基(25g/l(NH4)2SO4，2g/l KH2PO4，1g/lMgSO4*7H2O，0.03g/l FeSO4*7H2O，0.018g/l MnSO4*1H2O，30g/l CaCO3，20g/l葡萄糖)，并將混合物在37℃保溫48小時。在保溫后，培養(yǎng)物懸浮液的光密度(OD)用來自Dr-Lange(Dusseldorf，Germany)的LP2W光度計在660nm測定波長測定。
然后使用來自Eppendorf-BioTronik(Hamburg，Germany)的氨基酸分析儀，通過離子交換層析和帶有茚三酮檢測的柱后反應(yīng)，確定無菌過濾的培養(yǎng)上清中形成的L-蘇氨酸的濃度。
實驗結(jié)果示于表1。
表1
附圖簡述圖1pMAK705ΔyjgF(＝pMAK705deltayjgF)。
長度數(shù)據(jù)是近似值。所用縮寫和名稱具有如下含義·cat氯霉素抗性基因·rep-ts質(zhì)粒pSC101的溫度敏感性復(fù)制區(qū)·yjgF5’yjgF ORF的5’區(qū)域以及上游區(qū)域的一部分·yjgF3’yjgF ORF的3’區(qū)域以及下游區(qū)域的一部分限制酶的縮寫具有如下含義·EcoRV來自大腸桿菌RY13的限制性內(nèi)切核酸酶·Ec1136II來自大腸桿菌的限制性內(nèi)切核酸酶·HincII來自流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)RC的限制性內(nèi)切核酸酶·HindIII來自流感嗜血桿菌RD的限制性內(nèi)切核酸酶·PstI來自Providencia stuartii的限制性內(nèi)切核酸酶·StuI來自Streptomyces tubercidicus的限制性內(nèi)切核酸酶·XbaI來自Xanthomonas badrii的限制性內(nèi)切核酸酶序列表<110>德古薩股份公司<120>使用含有弱化的yjgF ORF序列的腸桿菌科菌株發(fā)酵生產(chǎn)L-氨基酸的方法<130>020491 BT<160>12<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1548<212>DNA<213>Escherichia coli<220>
<221>DNA<222>(1)..(1548)<223>
<220>
<221>CDS<222>(527)..(952)<223>yjgF-Orf<400>1tcgcgatctg gtactgtaag gggaaataga gatgacacac gataataaat tgcaggttga 60agctattaaa cgcggcacgg taattgacca tatccccgcc cagatcggtt ttaagctgtt120gagtctgttc aagctgaccg aaacggatca gcgcatcacc attggtctga acctgccttc180tggcgagatg ggccgcaaag atctgatcaa aatcgaaaat acctttttga gtgaagatca240agtagatcaa ctggcattgt atgcgccgca agccacggtt aaccgtatcg acaactatga300agtggtgggt aaatcgcgcc caagtctgcc ggagcgcatc gacaatgtgc tggtctgccc360gaacagcaac tgtatcagcc atgccgaacc ggtttcatcc agctttgccg tgcgaaaacg420cgccaatgat atcgcgctca aatgcaaata ctgtgaaaaa gagttttccc ataatgtggt480gctggccaat taattgcggt tggtaataaa agtctggctc cctata atg agc cag 535Met Ser Gln1act ttt tac cgc tgt aat aaa gga gaa atc atg agc aaa act atc gcg 583Thr Phe Tyr Arg Cys Asn Lys Gly Glu Ile Met Ser Lys Thr Ile Ala5 10 15
acg gaa aat gca ccg gca gct atc ggt cct tac gta cag ggc gtt gat 631Thr Glu Asn Ala Pro Ala Ala Ile Gly Pro Tyr Val Gln Gly Val Asp20 25 30 35ctg ggc aat atg atc atc acc tcc ggt cag atc ccg gta aat ccg aaa 679Leu Gly Asn Met Ile Ile Thr Ser Gly Gln Ile Pro Val Asn Pro Lys40 45 50acg ggc gaa gta ccg gca gac gtc gct gca cag gca cgt cag tcg ctg 727Thr Gly Glu Val Pro Ala Asp Val Ala Ala Gln Ala Arg Gln Ser Leu55 60 65gat aac gta aaa gcg atc gtc gaa gcc gct ggc ctg aaa gtg ggc gac 775Asp Asn Val Lys Ala Ile Val Glu Ala Ala Gly Leu Lys Val Gly Asp70 75 80atc gtt aaa act acc gtg ttt gta aaa gat ctg aac gac ttc gca acc 823Ile Val Lys Thr Thr Val Phe Val Lys Asp Leu Asn Asp Phe Ala Thr85 90 95gta aac gcc act tac gaa gcc ttc ttc acc gaa cac aac gcc acc ttc 871Val Asn Ala Thr Tyr Glu Ala Phe Phe Thr Glu His Asn Ala Thr Phe100 105 110 115ccg gca cgt tct tgc gtt gaa gtt gcc cgt ctg ccg aaa gac gtg aag 919Pro Ala Arg Ser Cys Val Glu Val Ala Arg Leu Pro Lys Asp Val Lys120 125 130att gag atc gaa gcg atc gct gtt cgt cgc taa tcttgatgga aatccgggct972Ile Glu Ile Glu Ala Ile Ala Val Arg Arg135 140atcatgcccg gattaagtct gatgacaaac gcaaaatcgc ctgatgcgct acgcttatca 1032ggcctacgtg attcctgcaa tttattgaat ttgttggccg gataaggcat ttacgccgca 1092tccggcatga acaaaactca ctttgtctac aatctgaatc ggggctatcg tgcccagttt 1152attctttatt gccagccgta acgacggcta tagaaccctt tcaccaactg ggttaatgtc 1212atataccctg ccagaatcgc aaccagccac gggaaatagc ttaacggcag cgcctgtaat 1272tgcagataac tggccagcgg tgaaaacggc aatgcgatcc cgacaatcat cacgatcacg 1332gtcatgatca ttaacggcca cgatgcacag ctctgaataa acggcacacg gcgggtgcgg 1392atcatatgca caatcagcgt ttgcgacagt aagcccacca caaaccatcc cgactggaac 1452agcgtttgcg tttccggcgt gttggcatgg aatacccacc acatcaggca aaacgtcaaa 1512atatcgaaga tcgagctgat cggtccgaag aagatc 1548<210>2<211>141<212>PRT<213>Escherichia coli<400>2Met Ser Gln Thr Phe Tyr Arg Cys Asn Lys Gly Glu Ile Met Ser Lys1 5 10 15
Thr Ile Ala Thr Glu Asn Ala Pro Ala Ala Ile Gly Pro Tyr Val Gln20 25 30Gly Val Asp Leu Gly Asn Met Ile Ile Thr Ser Gly Gln Ile Pro Val35 40 45Asn Pro Lys Thr Gly Glu Val Pro Ala Asp Val Ala Ala Gln Ala Arg50 55 60Gln Ser Leu Asp Asn Val Lys Ala Ile Val Glu Ala Ala Gly Leu Lys65 70 75 80Val Gly Asp Ile Val Lys Thr Thr Val Phe Val Lys Asp Leu Asn Asp85 90 95Phe Ala Thr Val Asn Ala Thr Tyr Glu Ala Phe Phe Thr Glu His Asn100 105 110Ala Thr Phe Pro Ala Arg Ser Cys Val Glu Val Ala Arg Leu Pro Lys115 120 125Asp Val Lys Ile Glu Ile Glu Ala Ile Ala Val Arg Arg130 135 140<210>3<211>20<212>DNA<213>Escherichia coli<220>
<221>Primer<222>(1)..(20)<223>yjgF-1<400>3tcgcgatctg gtactgtaag 20<210>4<211>20<212>DNA<213>Escherichia coli<220>
<221>Primer<222>(1)..(20)<223>yjgF-2<400>4ctgtacgtaa ggaccgatag 20<210>5<211>20<212>DNA<213>Escherichia coli
<220>
<221>Primer<222>(1)..(20)<223>yjgF-3<400>5cgctgttcgt cgctaatctt20<210>6<211>20<212>DNA<213>Escherichia coli<220>
<221>Primer<222>(1)..(20)<223>yjgF-4<400>6gatcttcttc ggaccgatca20<210>7<211>622<212>DNA<213>Escherichia coli<220>
<221>prim_transcript<222>(1)..(622)<223>PCR product yjgF5′<400>7tcgcgatctg gtactgtaag gggaaataga gatgacacac gataataaat tgcaggttga 60agctattaaa cgcggcacgg taattgacca tatccccgcc cagatcggtt ttaagctgtt120gagtctgttc aagctgaccg aaacggatca gcgcatcacc attggtctga acctgccttc180tggcgagatg ggccgcaaag atctgatcaa aatcgaaaat acctttttga gtgaagatca240agtagatcaa ctggcattgt atgcgccgca agccacggtt aaccgtatcg acaactatga300agtggtgggt aaatcgcgcc caagtctgcc ggagcgcatc gacaatgtgc tggtctgccc360gaacagcaac tgtatcagcc atgccgaacc ggtttcatcc agctttgccg tgcgaaaacg420cgccaatgat atcgcgctca aatgcaaata ctgtgaaaaa gagttttccc ataatgtggt480gctggccaat taattgcggt tggtaataaa agtctggctc cctataatga gccagacttt540ttaccgctgt aataaaggag aaatcatgag caaaactatc gcgacggaaa atgcaccggc600agctatcggt ccttacgtac ag 622
<210>8<211>612<212>DNA<213>Escherichia coli<220>
<221>prim_transcript<222>(1)..(612)<223>PCR product yjgF3′<400>8cgctgttcgt cgctaatctt gatggaaatc cgggctatca tgcccggatt aagtctgatg 60acaaacgcaa aatcgcctga tgcgctacgc ttatcaggcc tacgtgattc ctgcaattta120ttgaatttgt tggccggata aggcatttac gccgcatccg gcatgaacaa aactcacttt180gtctacaatc tgaatcgggg ctatcgtgcc cagtttattc tttattgcca gccgtaacga240cggctataga accctttcac caactgggtt aatgtcatat accctgccag aatcgcaacc300agccacggga aatagcttaa cggcagcgcc tgtaattgca gataactggc cagcggtgaa360aacggcaatg cgatcccgac aatcatcacg atcacggtca tgatcattaa cggccacgat420gcacagctct gaataaacgg cacacggcgg gtgcggatca tatgcacaat cagcgtttgc480gacagtaagc ccaccacaaa ccatcccgac tggaacagcg tttgcgtttc cggcgtgttg540gcatggaata cccaccacat caggcaaaac gtcaaaatat cgaagatcga gctgatcggt600ccgaagaaga tc612<210>9<211>1411<212>DNA<213>Artificial sequence<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(1411)<223>
<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(57)<223>Technical DNA/residues of polylinker sequence<220>
<221>misc_feature<222>(58)..(671)<223>Part of the upstream region and part of the 5′region of theyjgF Orf
<220>
<221>misc_feature<222>(672)..(737)<223>Technical DNA/residues of polylinker sequence<220>
<221>misc_feature<222>(738)..(1359)<223>Part of the 3′region of the yjgF Orf and part of the downstreamregion<220>
<221>misc_feature<222>(1359)..(1411)<223>Technical DNA/residues of polylinker sequence<400>9agcttggtac cgagctcgga tccactagta acggccgcca gtgtgctgga attcgccctt 60gatcttcttc ggaccgatca gctcgatctt cgatattttg acgttttgcc tgatgtggtg120ggtattccat gccaacacgc cggaaacgca aacgctgttc cagtcgggat ggtttgtggt180gggcttactg tcgcaaacgc tgattgtgca tatgatccgc acccgccgtg tgccgtttat240tcagagctgt gcatcgtggc cgttaatgat catgaccgtg atcgtgatga ttgtcgggat300cgcattgccg ttttcaccgc tggccagtta tctgcaatta caggcgctgc cgttaagcta360tttcccgtgg ctggttgcga ttctggcagg gtatatgaca ttaacccagt tggtgaaagg420gttctatagc cgtcgttacg gctggcaata aagaataaac tgggcacgat agccccgatt480cagattgtag acaaagtgag ttttgttcat gccggatgcg gcgtaaatgc cttatccggc540caacaaattc aataaattgc aggaatcacg taggcctgat aagcgtagcg catcaggcga600ttttgcgttt gtcatcagac ttaatccggg catgatagcc cggatttcca tcaagattag660cgacgaacag cgaagggcga attctgcaga tctcggatcc actagtaacg gccgccagtg720tgctggaatt cgcccttctg tacgtaagga ccgatagctg ccggtgcatt ttccgtcgcg780atagttttgc tcatgatttc tcctttatta cagcggtaaa aagtctggct cattataggg840agccagactt ttattaccaa ccgcaattaa ttggccagca ccacattatg ggaaaactct900ttttcacagt atttgcattt gagcgcgata tcattggcgc gttttcgcac ggcaaagctg960gatgaaaccg gttcggcatg gctgatacag ttgctgttcg ggcagaccag cacattgtcg 1020atgcgctccg gcagacttgg gcgcgattta cccaccactt catagttgtc gatacggtta 1080accgtggctt gcggcgcata caatgccagt tgatctactt gatcttcact caaaaaggta 1140
ttttcgattt tgatcagatc tttgcggccc atctcgccag aaggcaggtt cagaccaatg 1200gtgatgcgct gatccgtttc ggtcagcttg aacagactca acagcttaaa accgatctgg 1260gcggggatat ggtcaattac cgtgccgcgt ttaatagctt caacctgcaa tttattatcg 1320tgtgtcatct ctatttcccc ttacagtacc agatcgcgaa agggcgaatt ctgcagatat 1380ccatcacact ggcggccgct cgagcatgca t 1411<210>10<211>177<212>DNA<213>Articifial sequence<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(177)<223>
<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(3)<223>Start codon of the delta yjgF Orf<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(99)<223>5′region of the delta yjgF Orfs<220>
<221>misc_feature<222>(100)..(162)<223>Technical DNA/residues of polylinker sequence<220>
<221>misc_feature<222>(163)..(174)<223>3′region of the delta yjgF Orf<220>
<221>misc_feature<222>(175)..(177)<223>Stop codon of the delta yjgF Orf<400>10atgagccaga ctttttaccg ctgtaataaa ggagaaatca tgagcaaaac tatcgcgacg 60gaaaatgcac cggcagctat cggtccttac gtacagaagg gcgaattcca gcacactggc120ggccgttact agtggatccg agatctgcag aattcgccct tcgctgttcg tcgctaa 177<210>11
<211>387<212>DNA<213>Salmonella typhimurium<220>
<221>CDS<222>(1)..(387)<223>yjgF Orf<400>11atg agc aaa act att gcg acg gaa aat gca cca gca gca atc ggc cca 48Met Ser Lys Thr Ile Ala Thr Glu Asn Ala Pro Ala Ala Ile Gly Pro1 5 10 15tac gta cag ggc gtt gac ctg ggt agc atg gta atc act tcc ggt cag 96Tyr Val Gln Gly Val Asp Leu Gly Ser Met Val Ile Thr Ser Gly Gln20 25 30atc ccg gtc gat ccg aaa acc ggt gcc gta gcg gaa gac gta tcc gct 144Ile Pro Val Asp Pro Lys Thr Gly Ala Val Ala Glu Asp Val Ser Ala35 40 45cag gca cgt cag tcg ctg gaa aac gtt aaa gct atc gtg gaa gcc gct 192Gln Ala Arg Gln Ser Leu Glu Asn Val Lys Ala Ile Val Glu Ala Ala50 55 60ggc ctg aaa gta ggc gac att gtg aaa acg acc gta ttc gtg aaa gac 240Gly Leu Lys Val Gly Asp Ile Val Lys Thr Thr Val Phe Val Lys Asp65 70 75 80ctg aac gat ttc gcg acc gtc aac gcc acc tac gaa gcc ttc ttc acc 288Leu Asn Asp Phe Ala Thr Val Asn Ala Thr Tyr Glu Ala Phe Phe Thr85 90 95gag cac aac gcc acc ttc ccg gcg cgt tcc tgc gtg gaa gtt gcc cgt 336Glu His Asn Ala Thr Phe Pro Ala Arg Ser Cys Val Glu Val Ala Arg100 105 110ctg ccg aaa gac gtg aaa att gag att gaa gcg atc gct gtt cgt cgc 384Leu Pro Lys Asp Val Lys Ile Glu Ile Glu Ala Ile Ala Val Arg Arg115 120 125taa 387<210>12<211>128<212>PRT<213>Salmonella typhimurium<400>12Met Ser Lys Thr Ile Ala Thr Glu Asn Ala Pro Ala Ala Ile Gly Pro1 5 10 15Tyr Val Gln Gly Val Asp Leu Gly Ser Met Val Ile Thr Ser Gly Gln20 25 30
Ile Pro Val Asp Pro Lys Thr Gly Ala Val Ala Glu Asp Val Ser Ala35 40 45Gln Ala Arg Gln Ser Leu Glu Asn Val Lys Ala Ile Val Glu Ala Ala50 55 60Gly Leu Lys Val Gly Asp Ile Val Lys Thr Thr Val Phe Val Lys Asp65 70 75 80Leu Asn Asp Phe Ala Thr Val Asn Ala Thr Tyr Glu Ala Phe Phe Thr85 90 95Glu His Asn Ala Thr Phe Pro Ala Arg Ser Cys Val Glu Val Ala Arg100 105 110Leu Pro Lys Asp Val Lys Ile Glu Ile Glu Ala Ile Ala Val Arg Arg115 120 12權(quán)利要求
1.生產(chǎn)L-氨基酸、特別是L-蘇氨酸的方法，其中進行如下步驟a)發(fā)酵生產(chǎn)所需L-氨基酸的腸桿菌科的微生物，其中所述微生物的yjgF ORF或其編碼核苷酸序列被弱化，特別是被消除，及b)濃縮培養(yǎng)基或微生物細胞中的所需L-氨基酸。
2.權(quán)利要求1的方法，其中分離所需L-氨基酸，產(chǎn)物中任選保留全部或部分(＞0-100％)發(fā)酵肉湯和/或生物量的組分。
3.通過發(fā)酵腸桿菌科的微生物而生產(chǎn)L-氨基酸、特別是L-蘇氨酸或者包含這些化合物的飼料添加劑的方法，其中所述微生物的yjgFORF或其編碼核苷酸序列被弱化，特別是被消除，并且分離所需產(chǎn)物。
4.權(quán)利要求1、2或3的方法，其中通過弱化yjgF ORF使得yjgFORF基因產(chǎn)物的活性或濃度降低至野生型蛋白質(zhì)或者起始微生物中的活性或濃度的0-75％。
5.權(quán)利要求1、2或3的方法，其中采用這樣的微生物，所述微生物中所需L-氨基酸的生物合成途徑的另外基因被額外增強。
6.權(quán)利要求1、2或3的方法，其中采用這樣的微生物，所述微生物中降低所需L-氨基酸形成的代謝途徑至少被部分地消除。
7.權(quán)利要求1、2或3的方法，其中編碼開放讀框yjgF的產(chǎn)物的多核苷酸的表達被弱化，特別是被消除。
8.權(quán)利要求1或4的方法，其中開放讀框yjgF的多核苷酸所編碼的多肽的調(diào)節(jié)和/或催化性質(zhì)被降低。
9.權(quán)利要求1或3的生產(chǎn)L-氨基酸的方法，其中發(fā)酵這樣的腸桿菌科微生物，所述微生物中選自如下一組的一或多個基因同時被額外增強，尤其被過表達9.1編碼天冬氨酸激酶、高絲氨酸脫氫酶，高絲氨酸激酶和蘇氨酸合酶的thrABC操縱子，9.2編碼丙酮酸羧化酶的pyc基因，9.3編碼磷酸烯醇丙酮酸合酶的pps基因，9.4編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的ppc基因，9.5編碼轉(zhuǎn)氫酶的pntA和pntB基因，9.6賦予高絲氨酸抗性的rhtB基因，9.7編碼蘋果酸醌氧化還原酶的mqo基因，9.8賦予蘇氨酸抗性的rhtC基因，9.9編碼蘇氨酸輸出蛋白的thrE基因，9.10編碼谷氨酸脫氫酶的gdhA基因，9.11編碼DNA結(jié)合蛋白HLP-II的hns基因，9.12編碼葡糖磷酸變位酶的pgm基因，9.13編碼果糖二磷酸醛縮酶的fba基因，9.14編碼磷酸組氨酸蛋白己糖磷酸轉(zhuǎn)移酶的ptsH基因，9.15編碼磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)的酶I的ptsI基因，9.16編碼葡萄糖特異性IIA成分的crr基因，9.17編碼葡萄糖特異性IIBC成分的ptsG基因，9.18編碼亮氨酸調(diào)節(jié)子的調(diào)節(jié)物的lrp基因，9.19編碼全局調(diào)節(jié)物Csr的csrA基因，9.20編碼fad調(diào)節(jié)子的調(diào)節(jié)物的fadR，9.21編碼中心中間代謝的調(diào)節(jié)物的iclR基因，9.22編碼10Kd侶伴蛋白的mopB基因，9.23編碼烷基氫過氧化物還原酶的小亞基的ahpC基因，9.24編碼烷基氫過氧化物還原酶的大亞基的ahpF基因，9.25編碼半胱氨酸合酶A的cysK基因，9.26編碼cys調(diào)節(jié)子的調(diào)節(jié)物的cysB基因，9.27編碼NADPH亞硫酸鹽還原酶的黃素蛋白的cysJ基因，9.28編碼NADPH亞硫酸鹽還原酶的血蛋白的cysI基因，9.29編碼腺苷酰硫酸還原酶的cysH基因，9.30編碼pho調(diào)節(jié)子的陽性調(diào)節(jié)物PhoB的phoB基因，9.31編碼pho調(diào)節(jié)子的傳感蛋白的phoR基因，9.32編碼外細胞膜蛋白E的phoE基因，9.33編碼果糖刺激的丙酮酸激酶I的pykF基因，9.34編碼6-果糖磷酸激酶II的pfkB基因，9.35編碼麥芽糖轉(zhuǎn)運的周質(zhì)結(jié)合蛋白的malE基因，9.36編碼超氧化物歧化酶的sodA基因，9.37編碼具有抗sigmaE活性的膜蛋白的rseA基因，9.38編碼sigmaE因子的全局調(diào)節(jié)物的rseC基因，9.39編碼2-酮戊二酸脫氫酶的脫羧酶亞基的sucA基因，9.40編碼2-酮戊二酸脫氫酶的二氫硫辛酸轉(zhuǎn)琥珀酸酶E2亞基的sucB基因，9.41編碼琥珀酰-CoA合成酶的β亞基的sucC基因，9.42編碼琥珀酰-CoA合成酶α亞基的sucD基因，9.43編碼腺苷酸激酶的adk基因，9.44編碼具有侶伴蛋白樣功能的周質(zhì)蛋白的hdeA基因，9.45編碼具有侶伴蛋白樣功能的周質(zhì)蛋白的hdeB基因，9.46編碼異檸檬酸脫氫酶的icd基因，9.47編碼周質(zhì)半乳糖結(jié)合轉(zhuǎn)運蛋白的mglB基因，9.48編碼二氫硫辛酰胺脫氫酶的lpd基因，9.49編碼丙酮酸脫氫酶復(fù)合物的E1成分的aceE基因，9.50編碼丙酮酸脫氫酶復(fù)合物的E2成分的aceF基因，9.51編碼氨肽酶B的pepB基因，9.52編碼醛脫氫酶的aldH基因，9.53編碼離子貯存同源蛋白的bfr基因，9.54編碼尿苷磷酸化酶的udp基因，和9.55編碼sigma E因子活性的調(diào)節(jié)物的rseB基因。
10.權(quán)利要求1或3的生產(chǎn)L-氨基酸的方法，其中發(fā)酵這樣的腸桿菌科的微生物，所述微生物中選自如下一組的一或多個基因表達同時被額外弱化，尤其是被消除或降低10.1編碼蘇氨酸脫氫酶的tdh基因，10.2編碼蘋果酸脫氫酶的mdh基因，10.3開放讀框(orf)yjfA的基因產(chǎn)物，10.4開放讀框(orf)ytfP的基因產(chǎn)物，10.5編碼磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的pckA基因，10.6編碼丙酮酸氧化酶的poxB基因，10.7編碼異檸檬酸裂合酶的aceA基因，10.8編碼磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)的DgsA調(diào)節(jié)物的dgsA基因，10.9編碼果糖阻抑物的fruR基因，10.10編碼sigma38因子的rpoS基因，10.11編碼天冬氨酸銨裂合酶(天冬氨酸酶)的aspA基因，和10.12編碼蘋果酸合酶A的aceB基因。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)L－氨基酸，尤其是L－蘇氨酸的方法，其中進行如下步驟a)發(fā)酵產(chǎn)生所需L－氨基酸的腸桿菌科(Enterobacteriaceae)的微生物，其中所述微生物的yjgF ORF或編碼其的核苷酸序列被弱化，特別是被消除，b)濃縮培養(yǎng)基或細菌細胞中的L－氨基酸，及任選地c)分離所述L－氨基酸。
文檔編號C12P13/10GK1745176SQ200380109389
公開日2006年3月8日 申請日期2003年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月30日
發(fā)明者梅希特希爾德·里平 申請人:德古薩股份公司