專利名稱：預(yù)測(cè)作用于生長(zhǎng)激素受體的制劑的治療反應(yīng)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及預(yù)測(cè)受試者對(duì)作用于生長(zhǎng)激素受體的制劑的治療反應(yīng)強(qiáng)度的方法。優(yōu)選的方面包括增加身材矮小的人類受試者的身高，和治療肥胖癥及肢端肥大癥的方法。
背景技術(shù)：
大多數(shù)身材明顯矮小的兒童并非如通常對(duì)激發(fā)性刺激的生長(zhǎng)激素(GH)反應(yīng)所定義的那樣具有生長(zhǎng)激素缺陷(GHD)。一旦排除了身材矮小的已知原因，便可將這些受試者可分為各種類型，包括家族性身材矮小、體質(zhì)性生長(zhǎng)遲緩、“特發(fā)性”身材矮小(ISS)。對(duì)于身材正常的父母生出的矮小孩子稱為“宮內(nèi)發(fā)育遲緩”(IUGR)。對(duì)于這種出身即矮小的孩子稱為“小于胎齡”(SGA)。一些兒童，預(yù)計(jì)許多這樣的兒童不可能達(dá)到他們的遺傳身高，雖然尚沒有大規(guī)?？v向研究結(jié)果的報(bào)道。因?yàn)橛性S多因素影響到正常的生長(zhǎng)和發(fā)育。ISS、IUGR、SGA患者可能在他們身材矮小的病因?qū)W上不相同。盡管不是典型的GH缺乏，但大多數(shù)ISS兒童能對(duì)GH治療發(fā)生反應(yīng)，雖然不是所有ISS兒童的反應(yīng)都相等。
許多學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)這組受試者中存在自發(fā)性GH分泌失調(diào)。一種假說提出，雖然一些這樣的受試者在生理?xiàng)l件下存在內(nèi)源性GH分泌不足，但如傳統(tǒng)GH刺激試驗(yàn)所顯示的那樣，在對(duì)試劑刺激的反應(yīng)中仍能顯示GH升高。此病稱為“GH神經(jīng)分泌失調(diào)”，該診斷依賴于在長(zhǎng)期采樣的血清中出現(xiàn)GH循環(huán)模式的異常。許多學(xué)者報(bào)告了這類研究的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)這種異常只是偶然存在。其他學(xué)者推測(cè)這些受試者具有“無生物活性的GH”；然而此種結(jié)論尚未證實(shí)。
克隆GH受體(GHR)時(shí)，顯示血液中的主要GH結(jié)合活性是由于一種與GHR基因相同的基因所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)能對(duì)全長(zhǎng)GHR的胞外功能域反應(yīng)。幾乎所有的生長(zhǎng)激素不反應(yīng)性綜合征(或Laron綜合征)(GHIS)患者的血液都缺乏生長(zhǎng)激素受體結(jié)合活性，和缺乏GH-結(jié)合蛋白(GHBP)活性或非常低。這些受試者的平均身高評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)差(SDS)約為-5到-6，對(duì)GH治療有耐藥性，其GH血清濃度高和胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF-I)血清濃度低。他們對(duì)用IGF-I治療有反應(yīng)。GHR胞外功能域缺乏的受試者中，若循環(huán)血液中缺乏GHBP可作為GH不敏感的標(biāo)志。
用外源性GH治療ISS患者顯示對(duì)治療有不同的反應(yīng)率。具體說，許多兒童對(duì)GH治療有點(diǎn)反應(yīng)但不完全。這些患兒的生長(zhǎng)速度有所提高但只是具有完全反應(yīng)兒童的一半左右。療程結(jié)束后這些兒童的身高總增長(zhǎng)量不如有完全反應(yīng)的兒童，取決于治療時(shí)間的長(zhǎng)短。改進(jìn)不完全反應(yīng)患兒治療效果的一種方法是增加GH劑量，這可導(dǎo)致生長(zhǎng)速度和身高總增長(zhǎng)有所改善。然而，增加GH劑量由于其潛在的副作用對(duì)所有患兒并不理想。增加GH劑量還導(dǎo)致增加費(fèi)用。不幸的是目前還沒有能在長(zhǎng)期治療和觀察期前，鑒定反應(yīng)可能較差患兒的方法。
因此，該領(lǐng)域需要可用于鑒定對(duì)GH治療反應(yīng)率顯示低下的患兒亞組的方法。也需要開發(fā)能治療對(duì)外源性GH反應(yīng)低下患兒的改進(jìn)的治療試劑的方法。該領(lǐng)域還需要可用于鑒定對(duì)GH治療反應(yīng)率顯示提高的患兒亞組的方法，和需要開發(fā)能治療對(duì)外源性GH反應(yīng)增高患兒的改進(jìn)的治療試劑的方法。
這類受試者的例子包括身材矮小的個(gè)體，或患肥胖癥、感染或糖尿病的個(gè)體；肢端肥大癥或巨人癥，或與其相關(guān)的泌乳性、致糖尿病性、脂肪分解和蛋白同化效應(yīng)；與鈉或水滯留相關(guān)的癥狀；代謝綜合征；心境和睡眠障礙、癌癥、心臟病和高血壓。
發(fā)明概述本發(fā)明依據(jù)以下發(fā)現(xiàn)攜帶有含外顯子3缺失(GHRd3)的生長(zhǎng)激素受體(GHR)等位基因的受試者對(duì)于通過GHR通路起作用試劑的治療陽性反應(yīng)比不攜帶GHRd3等位基因的受試者更強(qiáng)。具體說，攜帶GHRd3等位基因的受試者對(duì)用重組生長(zhǎng)激素(GH)治療的陽性反應(yīng)，比不攜帶所述GHRd3等位基因的受試者更強(qiáng)。用重組GH治療療程結(jié)束時(shí)，ISS、IUGR或SGA和攜帶GHRd3的受試者獲得的生長(zhǎng)速度，大約是GHRf1等位基因純合子ISS受試者的二倍。他們的總身高變化與試劑作用成比例增加。
如上所述GH受體(GHR)介導(dǎo)了GH的活性。已證明二分子的GHR與一分子的GH相互反應(yīng)(Cunningham等，1991，Science 254821-825；de Vos等，1992，Science255306-312；Sundstrom等，1996，J.Biol.Chem.27132197-32203；和Clackson等，1998，J.Mol.Biol.2771111-1128)。結(jié)合發(fā)生在GH上的二個(gè)獨(dú)特GHR結(jié)合位點(diǎn)與二個(gè)受體的胞外功能域上常見的結(jié)合溝槽之間。GH上的位點(diǎn)1親和力比位點(diǎn)2高，認(rèn)為受體的二聚化依次發(fā)生，一個(gè)受體結(jié)合GH的位點(diǎn)1，隨后使第二個(gè)受體與位點(diǎn)2結(jié)合。Cnningham等(1991，同上)提出，受體的二聚化是導(dǎo)致信號(hào)激活的關(guān)鍵，而GH的結(jié)合促使了此二聚化(Ross等，J.Clin.Endocrinol.& Metabolism(2001)86(4)1716-171723)。配體結(jié)合時(shí)，GHR迅速內(nèi)化(Maarnra，1999，J.Biol.Chem 27414791-14798；和Harding等，1996，J.Biol.Chem.2716708-7612)，其一部分被再循環(huán)送到細(xì)胞表面(Roupas等，1987，Endocrinol.1211521-1530)。
最近發(fā)現(xiàn)了GHRd3的GHR同工型，它缺失了外顯子3(Urbanek等，Mol Endocrinol1992 Feb；6(2)179-87；Godowski等，1989，PNAS USA 868083-8087)。認(rèn)為這種缺失是交替剪接的結(jié)果，導(dǎo)致或保留或排除外顯子3，相當(dāng)于或是全長(zhǎng)的GHRf1同工型，或是外顯子3缺失的GHRd3同工型。幾種相矛盾的結(jié)果發(fā)生在GHRd3同工型鑒定之后，有報(bào)告提出，GHRd3同工型是組織特異性剪接而致，這種表達(dá)模式受發(fā)育的調(diào)節(jié)，然而其它報(bào)告提出，GHRd3同工型是個(gè)體特異性的。另一報(bào)告提出，這種剪接是按孟德爾性狀和交替剪接轉(zhuǎn)遞的遺傳多樣性而致(Stallings-Mann等，1996，PNASUSA.9412394-12399)。最后，Pantel等，2000，J.Biol.Chem.275(25)18664-18669)對(duì)GHR基因座的分析顯示，人燈類中GHRd3同工型轉(zhuǎn)錄自攜帶有橫跨外顯子3的2.7kb基因組缺失的GHR等位基因。Pantel還在只表達(dá)GHRf1的個(gè)體的基因組DNA樣品中鑒定出二個(gè)側(cè)接反式元件，但在表達(dá)GHRd3個(gè)體的DNA中只有一個(gè)反式元件，提示外顯子3缺失是位于同一個(gè)GHRf1等位基因上的二個(gè)反式元件同源重組的結(jié)果。
HGHRd3蛋白與全長(zhǎng)hGHR(GHRf1)不同之處在于，該受體的胞外結(jié)構(gòu)域中缺失了22個(gè)氨基酸。GHRd3同工型編碼穩(wěn)定的功能性GHR蛋白(Urbanek等，1993，J.Biol.Chem.268(25)19025-19032)。雖然Urbanek等(1993)報(bào)導(dǎo)GHRd3同工型穩(wěn)定地整合入細(xì)胞膜，并能象hGHR一樣有效地結(jié)合和內(nèi)化配體，但沒能鑒定出與GHRf1同工型在功能上有所差別。
本發(fā)明涉及所鑒定的GHR等位基因和同工型，可作為導(dǎo)致對(duì)外源性GH陽性反應(yīng)發(fā)生差別的重要因素。因此本發(fā)明提供對(duì)采用經(jīng)GHR通路而起作用的化合物(優(yōu)選能結(jié)合GHR的化合物如GH組合物)治療發(fā)生陽性反應(yīng)的程度的預(yù)測(cè)方法。這些方法可將受試者分類為優(yōu)先的，如高反應(yīng)者或低反應(yīng)者。這樣可使將給予某具體受試者的治療具有經(jīng)濟(jì)的效益和/或可減少副作用(如減少采用適當(dāng)劑量GH組合物或采用給予受試者后不能顯示消除GHR反應(yīng)的化合物所引起的副作用)。
本發(fā)明還證明，GHRd3和GHRf1等位基因雜合子受試者在對(duì)GH治療的反應(yīng)中，生長(zhǎng)速度和身高變化都優(yōu)于GHRf1等位基因純合子受試者。因此本發(fā)明提供GHRf1等位基因純合子個(gè)體的GHR反應(yīng)或GHR活性低下的檢測(cè)和診斷方法。GHR活性低下可能是，例如GHR水平、表達(dá)或蛋白質(zhì)活性低下所致。本發(fā)明也提供GHRd3等位基因純合子或雜合子個(gè)體的GHR反應(yīng)或GHR活性升高的檢測(cè)和診斷方法。預(yù)計(jì)檢測(cè)GHR活性的升高或降低，對(duì)采用經(jīng)GHR通路起作用的治療試劑來治療各種可治疾病有用。例子包括治療身材矮小(如優(yōu)選ISS、IUGR或SGA受試者)、肥胖癥、感染或糖尿病；肢端肥大癥或巨人癥，或與其相關(guān)的泌乳性、致糖尿病性、脂肪分解和蛋白同化效應(yīng)；與鈉或水滯留相關(guān)的癥狀；代謝綜合征；心境和睡眠障礙、癌癥、心臟病和高血壓。優(yōu)選的例子包括能結(jié)合GHR蛋白，如可作為GHR激動(dòng)劑或拮抗劑的重組GH組合物的試劑。
因此本發(fā)明提供測(cè)定或預(yù)測(cè)GHR介導(dǎo)活性的方法，包括預(yù)測(cè)GHR對(duì)治療(試劑)的反應(yīng)的方法，和鑒定處在患此病危險(xiǎn)中受試者的方法，或診斷GHR活性低下相關(guān)疾病的方法。優(yōu)選本發(fā)明提供預(yù)測(cè)某受試者對(duì)可與GHR多肽相互作用(如結(jié)合)的試劑有無反應(yīng)的方法。
因此，一方面，本發(fā)明公開了預(yù)測(cè)某受試者對(duì)能與GHR蛋白結(jié)合的試劑有何種反應(yīng)的方法，該方法包括測(cè)定該受試者中是否存在GHR基因的某個(gè)等位基因，該等位基因與對(duì)所述試劑的陽性反應(yīng)可能增高或降低相關(guān)聯(lián)，從而鑒定該受試者對(duì)用所述試劑治療的反應(yīng)可能增高或降低。
本發(fā)明也提供預(yù)測(cè)某受試者，如選自身材矮小(如優(yōu)選ISS、IUGR或SGA)、肥胖癥、感染或糖尿病；肢端肥大癥或巨人癥，或與其相關(guān)的泌乳性、致糖尿病性、脂肪分解和蛋白同化效應(yīng)；與鈉或水滯留相關(guān)的癥狀；代謝綜合征；心境和睡眠障礙、癌癥、心臟病和高血壓等疾病患者對(duì)某試劑有何種反應(yīng)的方法，所述方法包括測(cè)定該受試者中是否存在GHR基因的某個(gè)等位基因，該等位基因與對(duì)所述試劑的陽性反應(yīng)可能增高或降低相關(guān)聯(lián)，從而鑒定該受試者對(duì)用所述試劑治療的反應(yīng)可能增高或降低。在優(yōu)選方面，本發(fā)明提供預(yù)測(cè)受試者對(duì)可提高受試者身高的試劑有何種反應(yīng)的方法，該方法包括測(cè)定該受試者中是否存在GHR基因的某個(gè)等位基因，該等位基因與對(duì)所述試劑的陽性反應(yīng)可能增高或降低相關(guān)聯(lián)，從而鑒定該受試者對(duì)用所述試劑治療的反應(yīng)可能增高或降低。
優(yōu)選本發(fā)明的方法包括測(cè)定該受試者的GHR等位基因的外顯子3中是否存在一個(gè)或多個(gè)核酸的缺失、插入或替代，或最優(yōu)選基本上全部外顯子3都缺失。
還提供鑒定某受試者對(duì)采用能結(jié)合GHR蛋白的試劑來治療疾病或病癥的可能性高或低的方法，所述方法包括a)使存在GHR基因等位基因與受試者對(duì)能結(jié)合GHR蛋白的試劑的反應(yīng)相關(guān)聯(lián)；和b)在該受試者中檢測(cè)步驟a)的等位基因，從而鑒定受試者對(duì)用所述試劑治療的反應(yīng)可能高或低。在另一方面，包括鑒定與采用能結(jié)合GHR蛋白的試劑治療疾病或病癥的可能性增高或降低相關(guān)聯(lián)的GHR基因的等位基因的方法，該方法包括a)測(cè)定某受試者中是否存在GHR基因的等位基因；和b)將步驟a)所述等位基因的存在與用能結(jié)合GHR蛋白的試劑治療疾病可能性的高或低相關(guān)聯(lián)，從而鑒定出與用所述試劑治療的反應(yīng)可能增高或降低相關(guān)的等位基因。
所述的疾病或病癥可選自身材矮小(如優(yōu)選ISS、IUGR或SGA)、肥胖癥、感染或糖尿??；肢端肥大癥或巨人癥，或與其相關(guān)的泌乳性、致糖尿病性、脂肪分解和蛋白同化效應(yīng)；與鈉或水滯留相關(guān)的癥狀；代謝綜合征；心境和睡眠障礙、癌癥、心臟病和高血壓。
最優(yōu)選，本發(fā)明的方法包括測(cè)定受試者GHR基因外顯子3的基因型，當(dāng)存在外顯子3時(shí)，表示所述受試者患有GHR反應(yīng)低下的相關(guān)疾病，或患此類疾病的危險(xiǎn)性高；或當(dāng)缺失外顯子3時(shí)，表示所述受試者患GHR反應(yīng)低下疾病的危險(xiǎn)性低。
本發(fā)明的方法可特別有利地用于治療方法中。所述基因型優(yōu)選能表明所述治療(試劑)的功效或治療益處。在一實(shí)施例中，采用本發(fā)明方法來確定給予受試者的試劑劑量。在另一實(shí)施例中，用本方法評(píng)估臨床試驗(yàn)中受試者的治療反應(yīng)，或?yàn)榕R床試驗(yàn)選擇受試者。例如，本發(fā)明的方法可包括測(cè)定受試者GHR基因外顯子3的基因型，其中所述基因型可將所述受試者分成臨床試驗(yàn)亞組，或臨床試驗(yàn)所包括的亞組。
本發(fā)明也提供治療受試者的方法，該方法包括(a)測(cè)定該受試者中是否存在GHR基因的等位基因，將該等位基因與對(duì)能結(jié)合GHR蛋白的試劑或通過GHR通路起作用的試劑的陽性反應(yīng)可能增高或降低相關(guān)聯(lián)；和(b)選擇或確定給予所述受試者的所述試劑的有效量。
本發(fā)明任一方法所述的能結(jié)合GHR蛋白，或通過GHR通路起作用的任何試劑，優(yōu)選在治療選自身材矮小(如優(yōu)選ISS、IUGR或SGA)、肥胖癥、感染或糖尿??；肢端肥大癥或巨人癥，或與其相關(guān)的泌乳性、致糖尿病性、脂肪分解和蛋白同化效應(yīng)；與鈉或水滯留相關(guān)的癥狀；代謝綜合征；心境和睡眠障礙、癌癥、心臟病和高血壓等疾病中有效的任何試劑。
特別地，本發(fā)明提供治療受試者的方法包括(a)測(cè)定受試者中是否存在GHR基因的等位基因，將該等位基因與對(duì)能治療選自身材矮小(如優(yōu)選ISS、IUGR或SGA)、肥胖癥、感染或糖尿??；肢端肥大癥或巨人癥，或與其相關(guān)的泌乳性、致糖尿病性、脂肪分解和蛋白同化效應(yīng)；與鈉或水滯留相關(guān)的癥狀；代謝綜合征；心境和睡眠障礙、癌癥、心臟病和高血壓等疾病的試劑的陽性反應(yīng)可能增高或降低相關(guān)聯(lián)；和(b)選擇或確定給予所述受試者的所述試劑的有效量。
在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明公開了促進(jìn)受試者生長(zhǎng)的方法，該方法包括(a)測(cè)定受試者中是否存在GHR基因的等位基因，將該等位基因與對(duì)能促進(jìn)受試者生長(zhǎng)的試劑的陽性反應(yīng)的可能性高或低相關(guān)聯(lián)；和(b)選擇或確定給予所述受試者的所述試劑的有效量。
在一優(yōu)選方面，本發(fā)明公開了加快人類受試者生長(zhǎng)的方法，該方法包括(a)檢測(cè)該受試者的身高是否低于同年齡和同性別正常人的不到大約一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差，或更優(yōu)選不到大約二個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差，(b)檢測(cè)該受試者的DNA是否編碼GHRd3多肽；和(c)給予該受試者有效量的GH，以提高該受試者的生長(zhǎng)速度。優(yōu)選該受試者不是患Laron綜合征的受試者。
所述治療人類受試者的方法優(yōu)選包括給予GHRf1等位基因純合子受試者的試劑有效劑量，宜高于給予其DNA編碼GHRd3蛋白的同種受試者的有效劑量。
在優(yōu)選方面，所述試劑是GH分子。給予受試者的GH有效量宜在約0.001-0.2mg/kg/天之間，更優(yōu)選GH的有效量在約0.01-0.1mg/kg/天之間。在其它方面，給予受試者的GH有效量至少為約0.2mg/kg/天。在另一方面，GH的有效量至少為約0.25mg/kg天。在另一方面，GH的有效量至少為約0.3mg/kg天。GH宜每天給藥一次。GH宜皮下注射給藥。最優(yōu)選配制該生長(zhǎng)激素的pH約為7.4-7.8。
本發(fā)明另一方面涉及使用藥物的方法，該方法包括獲得受試者的DNA樣品，測(cè)定該DNA樣品是否含有與對(duì)該藥物的陽性反應(yīng)增強(qiáng)相關(guān)聯(lián)的GHR基因的等位基因和/或該DNA樣品是否含有與對(duì)該試劑的陽性反應(yīng)低下相關(guān)聯(lián)的GHR基因的等位基因；如果該DNA樣品含有與對(duì)該藥物的陽性反應(yīng)增強(qiáng)相關(guān)聯(lián)的GHR基因的等位基因和/或該DNA樣品缺乏與對(duì)該藥物的陽性反應(yīng)低下相關(guān)聯(lián)的GHR基因的等位基因，則給予該受試者有效量的該藥物。
另一方面，本發(fā)明包括治療對(duì)外源性GH反應(yīng)低下的受試者。在此方面，本發(fā)明提供利用藥物治療的方法，該方法包括獲得受試者的DNA樣品；測(cè)定該DNA樣品是否含有與對(duì)該藥物的陽性反應(yīng)增強(qiáng)相關(guān)聯(lián)的GHR基因的等位基因和/或該DNA樣品是否含有與對(duì)該藥物的陽性反應(yīng)低下相關(guān)聯(lián)的GHR基因的等位基因；和如果該DNA樣品含有與對(duì)該藥物的陽性反應(yīng)增強(qiáng)相關(guān)聯(lián)的GHR基因的等位基因和/或該DNA樣品缺乏與對(duì)該藥物的陽性反應(yīng)低下相關(guān)聯(lián)的GHR基因的等位基因，則給予該受試者有效量的該藥物。
如上述，這些方法包括測(cè)定該受試者的GHR等位基因外顯子3中是否存在有一個(gè)或多個(gè)核酸缺失、插入或替代，或更優(yōu)選基本上缺失全部外顯子3。對(duì)藥物陽性反應(yīng)增強(qiáng)相關(guān)聯(lián)的GHR基因的等位基因是缺失外顯子3的GHR等位基因，優(yōu)選GHRd3等位基因。對(duì)藥物陽性反應(yīng)低下相關(guān)聯(lián)的GHR基因的等位基因優(yōu)選含有外顯子3的GHR等位基因(GHRf1)(當(dāng)受試者是該等位基因的純合子時(shí))。
本發(fā)明還涉及藥物的臨床測(cè)試方法，該方法包括以下步驟—給予一受試者群體某種藥物；和—從所述受試者群中鑒定出受試者的DNA編碼GHRd3多肽同工型的第一亞群，和受試者的DNA不編碼GHRd3多肽同工型的第二亞群。
所述方法還包括(a)評(píng)估所述第一亞群受試者對(duì)所述藥物的反應(yīng)；和/或(b)評(píng)估所述第二亞群受試者對(duì)所述藥物的反應(yīng)。宜同時(shí)評(píng)估所述第一和第二亞群受試者對(duì)所述藥物的反應(yīng)。宜分別評(píng)估所述第一和第二亞群受試者對(duì)所述藥物的反應(yīng)。評(píng)估對(duì)所述藥物的反應(yīng)宜包括測(cè)定受試者身高的變化。
本發(fā)明還涉及試劑的臨床測(cè)試方法，該方法包括以下步驟—鑒定出其DNA編碼GHRd3多肽的第一群受試者，和其DNA不編碼GHRd3多肽的第二群受試者；—給予所述第一群和/或所述第二群受試者某種藥物。在一這施方案中，給予所述第一群受試者此藥物但不給予所述第二群受試者。在一實(shí)施方案中，給予所述第二群受試者此藥物但不給予所述第一群受試者。在另一實(shí)施方案中，同時(shí)給予所述第一和所述第二群受試者藥物。
上述方法中的藥物優(yōu)選是用于治療身材矮小、肥胖癥、感染或糖尿??；肢端肥大癥或巨人癥，或與其相關(guān)的泌乳性、致糖尿病性、脂肪分解和蛋白同化效應(yīng)；與鈉或水滯留相關(guān)的癥狀；代謝綜合征；心境和睡眠障礙、癌癥、心臟病和高血壓的藥物。
本發(fā)明的一優(yōu)選方面涉及一種藥物，優(yōu)選能加快受試者生長(zhǎng)的藥物的臨床測(cè)試方法。該方法包括以下步驟—給予一受試者群某一種藥物，優(yōu)選能加快受試者生長(zhǎng)的藥物；和—從所述受試者群中鑒定出受試者的DNA編碼GHRd3多肽同工型的第一亞群受試者，和受試者的DNA不編碼GHRd3多肽同工型的第二亞群受試者。
另一優(yōu)選方面涉及一種藥物，優(yōu)選能加快受試者生長(zhǎng)或能改善ISS、IUGR或SGA的藥物的臨床測(cè)試方法。該方法包括以下步驟—鑒定受試者的DNA編碼GHRd3多肽同工型的第一亞群受試者，和受試者的DNA不編碼GHRd3多肽同工型的第二亞群受試者。
—給予所述第一和/或第二群受試者，優(yōu)選能加快受試者生長(zhǎng)或能改善ISS、IUGR或SGA的藥物。在一實(shí)施方案中，給予所述第一群受試者此藥物但不給予所述第二群受試者。在一實(shí)施方案中，給予所述第二群受試者此試劑但不給予所述第一群受試者。在另一實(shí)施方案中，同時(shí)給予所述第一和所述第二群受試者藥物。
評(píng)估對(duì)于能加快受試者生長(zhǎng)或能改善ISS、IUGR或SGA的藥物的反應(yīng)，包括評(píng)估受試者身高的變化。提高受試者的生長(zhǎng)速度不僅包括該受試者獲得了與用GH治療的GH缺陷受試者(即診斷為GHD的受試者)至少相同的最終身高情況，而且指該受試者獲得了與用GH治療的GH缺陷受試者在身高上相同的生長(zhǎng)速度，或達(dá)到了成人的在目標(biāo)身高范圍內(nèi)的身高情況，即最終身高與他們的遺傳潛力相一致的身高，如用中等身高父母親的目標(biāo)身高測(cè)決定的那樣。
本發(fā)明方法之一的某一方面中，測(cè)定受試者的DNA是否編碼某特定的GHR多肽同工型的步驟，可采用能特異性結(jié)合GHR核酸分子的核酸分子進(jìn)行。另一方面，測(cè)定受試者的DNA是否編碼某GHR多肽同工型的步驟，采用能特異性結(jié)合GHR核酸分子的核酸分子進(jìn)行。本發(fā)明的方法宜包括測(cè)定某受試者的DNA是否編碼GHRd3蛋白或多肽。這可能包括測(cè)定某受試者的基因組DNA是否含有GHRd3等位基因，獲自某受試者的mRNA是否編碼GHRd3多肽，或該受試者是否表達(dá)GHRd3多肽。
例如，在上述任一實(shí)施方案中，測(cè)定受試者的DNA是否編碼GHRd3多肽包括以下步驟a)提供生物樣品；b)使所述生物樣品接觸ii)能在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與GHR，優(yōu)GHRd3核酸雜交的多核苷酸；或iii)能選擇性結(jié)合GHR，優(yōu)選GHRd3多肽的可檢測(cè)多肽；和c)檢測(cè)所述樣品中所述多核苷酸與RNA種類之間是否發(fā)生雜交，或所述可檢測(cè)多肽與所述樣品中的多肽是否發(fā)生結(jié)合。
優(yōu)選使生物樣品接觸能在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與GHRd3核酸雜交的多核苷酸，或接觸能選擇性結(jié)合GHRd3多肽的可檢測(cè)多肽，其中，檢測(cè)到所述雜交或所述結(jié)合，表明所述樣品中表達(dá)有所述GHRd3蛋白。
所述多核苷酸優(yōu)選是引物，其中通過檢測(cè)含有所述引物序列的擴(kuò)增產(chǎn)物的存在，來檢測(cè)所述的雜交。所述可檢測(cè)的多肽優(yōu)選是抗體?？刹捎眠m當(dāng)?shù)姆椒▉頇z測(cè)GHRd3和GHRf1多肽或核酸。例如，可評(píng)估GHRd3或GHRf1的胞外功能域(如高親和力GH結(jié)合蛋白)的血清水平。能與GHRd3基因組或cDNA序列特異性雜交的寡核苷酸探針或引物也是本發(fā)明的一部分，以及采用所述引物和探針的DNA擴(kuò)增和檢測(cè)方法。
本發(fā)明還涉及GHRd3多肽候選調(diào)節(jié)劑的方法。這些方法可包括，例如鑒定能在GHRd3等位基因的純合子或雜合子個(gè)體中起作用的GHR激動(dòng)劑或抑制劑的方法?？衫眠@些方法來鑒定已知的GH組合物，如GENOTROPINTM、PROTROPINTM、NUTROPINTM、SOMAVERTTM(培維索孟)中的化合物，來鑒定治療最有效的化合物。這些方法可用來鑒定能加快受試者生長(zhǎng)，能改善肥胖癥、感染或糖尿?。恢朔蚀蟀Y或巨人癥，或與其相關(guān)的泌乳性、致糖尿病性、脂肪分解和蛋白同化效應(yīng)；與鈉或水滯留相關(guān)的癥狀；代謝綜合征；心境和睡眠障礙、癌癥、心臟病和高血壓的試劑。
在一方面，本發(fā)明涉及鑒定GHRd3多肽候選調(diào)節(jié)劑的方法，所述方法包括a)提供GHRd3多肽；b)使所述混合物與測(cè)試化合物接觸；和c)測(cè)定所述化合物是否能選擇性結(jié)合于所述GHRd3多肽；其中檢測(cè)到所述化合物結(jié)合了所述多肽，表明所述化合物是所述GHRd3多肽的候選調(diào)節(jié)劑。該測(cè)試化合物宜是GH多肽或其一部分或變體。測(cè)試化合物可以是GHRd3多肽的激動(dòng)劑或抑制劑。在優(yōu)選實(shí)施方案中，將所述GHRd3多肽摻入到膜中。
本發(fā)明也提供鑒定GHRd3多肽候選調(diào)節(jié)劑的方法，所述方法包括a)提供GHRd3多肽；b)使所述混合物與測(cè)試化合物接觸；和c)測(cè)定所述化合物是否能選擇性調(diào)節(jié)GHR的活性；其中檢測(cè)到所述化合物選擇性調(diào)節(jié)了GHR的活性，表明所述化合物是GHRd3多肽活性的候選調(diào)節(jié)劑。該測(cè)試化合物宜是GH多肽或其一部分或變體。測(cè)試化合物可以是GHRd3多肽的激動(dòng)劑或抑制劑。測(cè)到該測(cè)試化合物能刺激GHR活性，表明該測(cè)試化合物是候選的激動(dòng)劑。測(cè)到該測(cè)試化合物能抑制GHR活性，表明該測(cè)試化合物是候選的抑制劑在優(yōu)選實(shí)施方案中，將所述GHRd3多肽摻入到膜中。
本發(fā)明還提供鑒定GHRd3多肽候選調(diào)節(jié)劑的方法，所述方法包括a)提供含有GHRd3多肽的細(xì)胞；b)使所述細(xì)胞接觸測(cè)試化合物；和c)測(cè)定所述化合物是否能選擇性調(diào)節(jié)GHR的活性；
其中檢測(cè)到所述化合物選擇性調(diào)節(jié)了GHR的活性，表明所述化合物是GHRd3多肽活性的候選調(diào)節(jié)劑。該測(cè)試化合物宜是GH多肽或其一部分或變體。測(cè)試化合物可以是GHRd3多肽的激動(dòng)劑或抑制劑。測(cè)到該測(cè)試化合物能刺激GHR活性，表明該測(cè)試化合物是候選的激動(dòng)劑。測(cè)到該測(cè)試化合物能抑制GHR活性，表明該測(cè)試化合物是候選的抑制劑所述細(xì)胞宜為人293細(xì)胞。在所述方法的另一方面，該細(xì)胞是非洲爪蟾卵母細(xì)胞，步驟(a)包括將GHRd3cRNA導(dǎo)入到所述細(xì)胞中。
本發(fā)明還提供可能以GHRd3和GHRf1異質(zhì)雙體多肽存在的GHR。因此另一方面，本發(fā)明也涉及鑒定GHR異質(zhì)雙體(GHRd3/f1)多肽的候選調(diào)節(jié)劑的方法。這些方法可包括，例如鑒定GHR激動(dòng)劑或抑制劑的方法。這些方法也包括鑒定能加快受試者生長(zhǎng)，能改善肥胖癥、感染或糖尿?。恢朔蚀蟀Y或巨人癥，或與其相關(guān)的泌乳性、致糖尿病性、脂肪分解和蛋白同化效應(yīng)；與鈉或水滯留相關(guān)的癥狀；代謝綜合征；心境和睡眠障礙、癌癥、心臟病和高血壓的試劑的方法。
一方面，本發(fā)明涉及鑒定GHR異質(zhì)雙體多肽候選調(diào)節(jié)劑的方法，所述方法包括a)混合GHRf1和GHRd3多肽；b)使所述混合物接觸測(cè)試化合物；和c)測(cè)定所述化合物是否能選擇性調(diào)節(jié)GHR的活性；其中檢測(cè)到所述化合物選擇性調(diào)節(jié)了GHR的活性，表明所述化合物是GHR異質(zhì)雙體活性的候選調(diào)節(jié)劑。該測(cè)試化合物宜是GH多肽或其一部分或變體。測(cè)試化合物可以是GHR異質(zhì)雙體的激動(dòng)劑或抑制劑。測(cè)到該測(cè)試化合物能刺激GHR活性，表明該測(cè)試化合物是候選的激動(dòng)劑。測(cè)到該測(cè)試化合物能抑制GHR活性，表明該測(cè)試化合物是候選的抑制劑。在優(yōu)選實(shí)施方案中，將所述GHRf1和GHRd3多肽摻入到膜中。
本發(fā)明還提供鑒定GHR異質(zhì)雙體多肽候選調(diào)節(jié)劑的方法，所述方法包括a)提供含有GHRf1和GHRd3多肽的細(xì)胞；b)使所述細(xì)胞接觸測(cè)試化合物；和c)測(cè)定所述化合物是否能選擇性調(diào)節(jié)GHR的活性；其中檢測(cè)到所述化合物選擇性調(diào)節(jié)了GHR的活性，表明所述化合物是GHR異質(zhì)雙體活性的候選調(diào)節(jié)劑。該測(cè)試化合物宜是GH多肽或其一部分或變體。測(cè)試化合物可以是GHR異質(zhì)雙體的激動(dòng)劑或抑制劑。測(cè)到該測(cè)試化合物能刺激GHR活性，表明該測(cè)試化合物是候選的激動(dòng)劑。測(cè)到該測(cè)試化合物能抑制GHR活性，表明該測(cè)試化合物是候選的抑制劑。所述細(xì)胞宜為人293細(xì)胞。在所述方法的另一方面，該細(xì)胞是非洲爪蟾卵母細(xì)胞，步驟(a)包括將GHRd3cRNA導(dǎo)入到所述細(xì)胞中。
細(xì)胞宜是表達(dá)GHRf1和GHRd3多肽的細(xì)胞。在優(yōu)選方面，步驟(a)包括在所述細(xì)胞中導(dǎo)入含GHRd3核苷酸序列的核酸和含GHRf1核苷酸序列的核酸。在其它方面，步驟(a)包括在表達(dá)GHRf1核酸的細(xì)胞中，導(dǎo)入含GHRd3核苷酸序列的核酸。另外的其它方面，步驟(a)包括在表達(dá)GHRd3核酸的細(xì)胞中導(dǎo)入含GHRf1核苷酸序列的核酸。
本發(fā)明也提供含GHRd3和GHRf1的編碼多核苷酸的重組載體。還包括宿主細(xì)胞含本發(fā)明的重組載體。本發(fā)明也提供一組至少二個(gè)重組載體，其包含具有GHRd3多核苷酸的第一重組載體，和具有GHRf1多核苷酸的第二重組載體。本發(fā)明也提供含所述第一和所述第二重組載體的宿主細(xì)胞，以及含有所述重組載體的非人宿主動(dòng)物或哺乳動(dòng)物。
本發(fā)明也提供含有的GHR基因由于同源重組而敲除了含GHRd3多核苷酸載體而遭到破壞的宿主細(xì)胞。本發(fā)明也提供含有的GHR基因由于同源重組而敲除了含GHRd3多核苷酸載體而遭到破壞的非人哺乳動(dòng)物宿主。
如上所述，將會(huì)明白，進(jìn)行上述試驗(yàn)的所述方法、鑒定GHR異質(zhì)雙體調(diào)節(jié)劑的方法、重組的載體、宿主細(xì)胞和非人哺乳動(dòng)物宿主，均可利用基本上全部外顯子3都缺失的GHRd3等位基因，或可利用外顯子3中含有一個(gè)或多個(gè)核酸缺失、插入或替代的GHR核酸所編碼的合適GHR等位基因或同工型。
附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示編碼GHRf1同工型的cDNA序列(SEQ ID NO1)。
圖2顯示GHRf1同工型號(hào)的氨基酸序列(SEQ ID NO2和3)。
圖3顯示圍繞人GHR基因外顯子3的基因組DNA序列(SEQ ID NO4)。
圖4顯示圍繞人GHR基因GHRd3等位基因缺失的外顯子3的基因組DNA序列(SEQID NO6)(Genbank登錄號(hào)AF210633)。
發(fā)明詳述對(duì)用重組GH治療試驗(yàn)中注冊(cè)的97名特發(fā)性身材矮小兒童，檢查了常見的GHR外顯子3變異和生長(zhǎng)速度對(duì)GH治療反應(yīng)的關(guān)系。47名病兒中存在GHRd3等位基因，其中3人是GHRd3/d3純合子，44人是GHRd3/f1雜合子。判定年齡、性別、GH劑量后，發(fā)現(xiàn)攜帶GHRd3變體的兒童當(dāng)用GH治療時(shí)生長(zhǎng)速度最高。GHRd3/f1或GHRd3/d3基因型的兒童治療第一年的生長(zhǎng)速度為9.0±0.3cm/年，第二年為7.8±0.2cm/年，與之相比，GHRf1/f1基因型兒童分別為7.4±0.2和6.5±0.2cm/年(P＜0.0001)。該基因型分類與其它醫(yī)學(xué)和治療特征相當(dāng)。因此認(rèn)為GHR基因組的變異與rGH治療效果的顯著差異有關(guān)。
如上所述，本發(fā)明涉及藥理遺傳學(xué)和預(yù)測(cè)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，該領(lǐng)域中采用診斷試驗(yàn)、預(yù)后試驗(yàn)和監(jiān)測(cè)性臨床試驗(yàn)來預(yù)測(cè)受試者治療的結(jié)果。因此，本發(fā)明一方面涉及用于測(cè)定生物樣品(如血液、血清、細(xì)胞、組織)中的GHR蛋白和/或核酸表達(dá)的診斷試驗(yàn)，來確定個(gè)體的GHR反應(yīng)，具體是對(duì)用外源性GH組合物治療起反應(yīng)的性質(zhì)。此試驗(yàn)也可用于檢測(cè)個(gè)體是否患有GHR反應(yīng)或活性低下的相關(guān)疾病或病癥，或有發(fā)生這類疾病的危險(xiǎn)。涉及GHR活性的疾病或病癥包括身材矮小、肥胖癥、感染或糖尿病；肢端肥大癥或巨人癥，或與其相關(guān)的泌乳性、致糖尿病性、脂肪分解和蛋白同化效應(yīng)；與鈉或水滯留相關(guān)的癥狀；代謝綜合征；心境和睡眠障礙、癌癥、心臟病和高血壓。本發(fā)明也提供判定某個(gè)體是否處在發(fā)生與GHR蛋白活性有關(guān)的疾病危險(xiǎn)中的預(yù)后(或預(yù)測(cè))性試驗(yàn)。例如可測(cè)定生物樣品中的GHRd3和GHRf1同工型。這種試驗(yàn)可用于預(yù)后或預(yù)測(cè)目的，從而可在GHR反應(yīng)低下為特征的或相關(guān)的疾病發(fā)生之前，對(duì)個(gè)體進(jìn)行預(yù)防性治療，例如通過給予有效量的GH使受試者獲得的最終身高與他們的遺傳潛力相一致。在其它方面，本發(fā)明檢測(cè)能調(diào)節(jié)GHRd3/GHRf1異質(zhì)雙體活性試劑的方法。這些試劑可用來治療上述涉及GHR活性的疾病或病癥。
定義術(shù)語“試劑”本文用于指化學(xué)化合物、化學(xué)化合物的混合物、生物大分子，優(yōu)選肽或蛋白質(zhì)、或從生物物質(zhì)舅細(xì)菌、植物、真菌或動(dòng)物(特別是哺乳動(dòng)物)細(xì)胞或組織制備的提取物。
本文中，對(duì)試劑或制劑的“陽性反應(yīng)”或“陽性治療反應(yīng)”可定義為包括疾病或病癥相關(guān)癥狀的減輕。例如，陽性反應(yīng)可以是給予某試劑后身高或生長(zhǎng)速度增加。本文中，對(duì)試劑的“陰性反應(yīng)”可定義為包括缺乏對(duì)該試劑的陽性反應(yīng)，或在給予試劑后觀察到其引起的副作用。
術(shù)語“多肽”指氨基酸的聚合物，不論該聚合物的長(zhǎng)度，因此，肽、寡肽和蛋白質(zhì)都包括在多肽的定義中。此術(shù)語也不特指或排除多肽的表達(dá)后修飾。例如，包括共價(jià)結(jié)合糖基、?；⒘姿峄?、脂基團(tuán)等的多肽都包括在該術(shù)語多肽中。該定義也包括含有一個(gè)或多個(gè)氨基酸同類物(包括例如，非天然產(chǎn)生的氨基酸，只天然產(chǎn)生于無關(guān)生物體系中的氨基酸，哺乳動(dòng)物系統(tǒng)的修飾氨基酸等)的多肽，含取代連接鍵的多肽，及本領(lǐng)域已知的其它修飾的多肽，天然產(chǎn)生的和非天然產(chǎn)生的多肽。
“分離的”或“純化的”蛋白質(zhì)或其生物活性部分，指基本上無來自產(chǎn)生該蛋白質(zhì)的細(xì)胞或組織的細(xì)胞物質(zhì)或其它污染性蛋白，或基本上無化學(xué)合成時(shí)的化學(xué)前體物質(zhì)或其它化學(xué)物質(zhì)。詞語“基本上無細(xì)胞物質(zhì)”包括GH或GHR蛋白制品中，該蛋白質(zhì)已與產(chǎn)生該蛋白的細(xì)胞的細(xì)胞組分相分離，或是重組產(chǎn)生的。在一實(shí)施方案中，詞語“基本上無細(xì)胞物質(zhì)”包括GH或GHR蛋白制品中含有的非GH或非GHR蛋白(本文也稱為“污染蛋白”)不到約30％(干重)，更優(yōu)選非GH或非GHR蛋白不到約20％，還要優(yōu)選非GH或非GHR蛋白不到約19％，最優(yōu)選非GH或非GHR蛋白不到約5％。當(dāng)用重組方法紀(jì)產(chǎn)生GH功GHR蛋白或它們的生物活性部分時(shí)，也宜基本上無細(xì)胞培養(yǎng)基成分，即培養(yǎng)基成分不到該蛋白質(zhì)制品的約20％，更優(yōu)選不到約10％，最優(yōu)選不到約5％。
詞語“基本上無化學(xué)前體物質(zhì)或其它化學(xué)物質(zhì)”包括GH或GHR蛋白制品中，該蛋白質(zhì)已與其合成時(shí)加入的化學(xué)前體物質(zhì)或其它化學(xué)物質(zhì)相分離。在一實(shí)施方案中，詞語“基本上無化學(xué)前體物質(zhì)或其它化學(xué)物質(zhì)”包括GH或GHR蛋白制品中，化學(xué)前體物質(zhì)或非GH或非GHR化學(xué)物質(zhì)不超過約30％(干重)，更優(yōu)選化學(xué)前體物質(zhì)或非GH或非GHR化學(xué)物質(zhì)不超過約20％，還要優(yōu)選化學(xué)前體物質(zhì)或非GH或非GHR化學(xué)物質(zhì)不超過約10％，最優(yōu)化學(xué)前體物質(zhì)或非GH或非GHR化學(xué)物質(zhì)不超過約5％。
術(shù)語“重組多肽”本文用于指經(jīng)人工設(shè)計(jì)的含有在它們的原始天然環(huán)境中沒發(fā)現(xiàn)為連續(xù)多肽序列的至少二條多肽序列的多肽，或指由重組多核苷酸表達(dá)的多肽。
某核酸當(dāng)將其置于與另一核酸序列功能上相關(guān)的位置上時(shí)稱為“操作性相連接”。例如，將啟動(dòng)子或增強(qiáng)子操作性連接于一編碼序列，使其能影響該序列的轉(zhuǎn)錄。關(guān)于轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列，操作性連接意味著被連接的DNA序列是毗連的，當(dāng)必須連接二個(gè)蛋白質(zhì)編碼區(qū)時(shí)，應(yīng)毗連和讀框內(nèi)連接。
術(shù)語“引物”指一種特殊的寡核苷酸序列，它與靶核苷酸序列互補(bǔ)，用來與該靶核苷酸序列雜交。引物的作用是DNA聚合酶、RNA聚合酶或逆轉(zhuǎn)錄酶催化的核苷酸聚合反應(yīng)的引發(fā)點(diǎn)。
術(shù)語“探針”指一種確定的核酸區(qū)段(或核苷酸同類物區(qū)段，如本文定義的多核苷酸)，可用來鑒定樣品中存在的特定多核苷酸序列，所述核酸區(qū)段包含與待鑒定的特定多聚核酸互補(bǔ)的核苷酸序列。
“測(cè)試樣品”本文用于指獲自感興趣受試者的生物樣品。例如，測(cè)試樣品可以是生物液(如血清)、細(xì)胞樣品或組織。
術(shù)語“性狀”或“表型”在本文中可互換使用，指某生物體任何臨床上可鑒別的、可檢測(cè)的可測(cè)量的性質(zhì)，如疾病的癥狀或易感性。術(shù)語“性狀”或“表型”本文常用于指?jìng)€(gè)體對(duì)作用于GHR試劑的反應(yīng)。
術(shù)語“基因型”本文用于指?jìng)€(gè)體或樣品中存在的等位基因的鑒定。本文中基因型宜指?jìng)€(gè)體或樣品中存在的等位基因的說明。術(shù)語給樣品或個(gè)體的等位基因作“基因分型”包括測(cè)定該個(gè)體所攜帶的特定等位基因。
術(shù)語“等位基因”本文用于指核苷酸序列的變體。例如，GHR核苷酸序列的等位基因包括GHRd3和GHRf1。
如本文所用，“同工型”和“GHR同工型”指由GHR基因的至少一個(gè)外顯子編碼的多肽。GHR同工型的例子包括GHRd3和GHRf1多肽。
術(shù)語“多態(tài)性”本文用于指在不同的基因組或個(gè)體之間發(fā)生了二種或多種交互的基因組序列?！岸鄳B(tài)性的”指在一群體中可能發(fā)現(xiàn)某特定基因組序列有二種或多種變體?！岸鄳B(tài)性位點(diǎn)”是發(fā)生變體的基因座。多態(tài)性可包括一個(gè)或多個(gè)核苷酸的替代、缺失或插入。單一核苷酸多態(tài)性是一個(gè)堿基對(duì)臺(tái)戲改變。
如本文所用，“外顯子”指存某間斷基因的任何區(qū)段，它在于成熟的RNA產(chǎn)物中。
如本文所用，“內(nèi)含子”指成熟RNA產(chǎn)物中不存在的某間斷基因的片段。內(nèi)含子是原始核轉(zhuǎn)錄物的一部分，但被剪掉而產(chǎn)生mRNA，mRNA然后轉(zhuǎn)運(yùn)到胞質(zhì)中。
如本文所用，“生長(zhǎng)激素”功“GH”指生長(zhǎng)激素的天然序列或變體形式，可來自任何來源，天然的、合成的或重組的。例子包括但不限于人生長(zhǎng)激素(hGH)，它是含人天然序列的天然或重組GH(如GENOTROPINTMTM，生長(zhǎng)激素(somatotropin)或促生長(zhǎng)激素(somatropin))；和重組生長(zhǎng)激素(rGH)，其指通過重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的任何GH或GH變體，包括人蛋氨生長(zhǎng)素、生長(zhǎng)激素、促生長(zhǎng)激素、培維索孟(pegvisomant)。GH分子可以是GHR的激動(dòng)劑或拮抗劑。
如本文所用，“生長(zhǎng)激素受體”或“GHR”指生長(zhǎng)激素受體的天然序列或變體形式，可得自任何來源，天然的、合成的或重組的。術(shù)語“GHR”包括GHRd3和GHRf1同工型。例子包括人生長(zhǎng)激素受體(hGHR)，是為含人天然序列的天然或重組的GHR。如本文所用，“GHRd3”指外顯子3缺失的GHR同工型。術(shù)語“GHRf1”指含有外顯子3的GHR同工型。術(shù)語GHRd3包括但不限于Urbanek M等，Mol Endocrine 1992 Feb；6(2)279-87(納入本文作參考)中所述的多肽。術(shù)語GHRf1包括但不限于Leung等，Nature.330537-543(1987)中所述的多肽(納入本文作參考)。
術(shù)語“GHR基因”本文包括編碼GHR蛋白的基因組mRNA和cDNA序列，包括基因組DNA中的不被翻譯的調(diào)節(jié)區(qū)。術(shù)語“GHR基因”也包括GHR基因的等位基因，如GHRd3等位基因和GHRf1等位基因。
人GHR基因和蛋白質(zhì)人GHR基因是一種單拷貝基因，橫跨5p13-12染色體區(qū)的90kb。這含有9個(gè)編碼外顯子(編號(hào)2-10)和幾個(gè)不被翻譯的外顯子外顯子2編碼信號(hào)肽，外顯子3-7編碼胞外結(jié)構(gòu)域，外顯子8編碼跨膜結(jié)構(gòu)域，外顯子9和10編碼胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。如上所述，hGHRd3蛋白不同于肝臟hGHR之處在于該受體的胞外結(jié)構(gòu)域中缺失了22個(gè)氨基酸(Godowski等，1989)。納入本文作參考的Genbank登錄號(hào)AF155912所公開的序列提供了GHR基因外顯子周圍基因組DNA區(qū)域的核苷酸序列(如GHRf1等位基因)。這個(gè)6.8bp片段包含外顯子3和內(nèi)含子2和3的一部分，還包含二個(gè)251bp重復(fù)元件。這些重復(fù)元件側(cè)接外顯子3的5’和3’端，二重復(fù)元件位于該外顯子的上游577bp和下游1821bp處。此二元件含有屬于HERV-P家族的人內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒的171bp長(zhǎng)末端重復(fù)(LTR)片段(Boeke，J.D.和Stoye，J.P.(1997)，選自Retroviruses(Coffin，J.M.，Hughes，S.H.和Varmus，H.E.編，pp.343-435，Coid Spring HarborLaborator，Cold Spring Harbor，NY)。該LTR之后是80bp的中等重復(fù)頻率NER-4型序列(Smit，A.F.(1996)Curr.Opin.Genet.Dev.6743-748)。此二個(gè)長(zhǎng)251bp拷貝的序列稱為5’和3’重復(fù)序列，有99％的相同性，只在該序列的14、245和246處有三個(gè)核苷酸不同。特別是，Pantel等(2000)報(bào)告說，位于外顯粒子3上游的該元件在14位是胞嘧啶，245和246位是胸腺嘧啶；而位于外顯子3下游的該元件這些位置是鳥嘌呤、胞嘧啶和腺嘌呤。此外，發(fā)現(xiàn)有病毒來源的其它序列側(cè)接外顯子3。
GHRd3等位基因記功有外顯子3和內(nèi)含子2和3周圍部分的缺失。與GHRf1等位基因不同，GHRd3等位基因含有一個(gè)251bpLTR，它在序列上與GHRf1上鑒定出的3’拷貝LTR元件相同。GHRd3等位基因的基因組DNA序列缺失了外顯子3區(qū)，見Genbank登錄號(hào)AF210633所公開的序列(納入本文作參考)。根據(jù)GHRd3和GHRf1序列，可利用檢測(cè)GHR核酸或多肽的已知方法來測(cè)定某個(gè)體是否帶有GHRd3等位基因。
含外顯子3缺失的GHRd3蛋白與全長(zhǎng)hGHR(GHRf1)不同在于該受體的胞外結(jié)構(gòu)域中缺失了22個(gè)氨基酸。因此可用任何已知方法來檢測(cè)GHRd3或GHRf1的存在。也可檢測(cè)到GHRd3和GHRf1的截短形式，或截短形式如“高親和力的生長(zhǎng)激素結(jié)合蛋白”、“高親和力的GHBP”或“GHBP”，指存在于幾種生物循環(huán)血液中的具有GHBP功能的GHR的胞外功能域(Ymer和Herington，1985.Mol Crll Endocrinol.41153；Smith和Talamantes，1988.Endocrinology，1231489-1494；Emtner和Roos，ActaEndocrinologica(Copenh.)，122296-302，1990.包括人。Baumann等，J ClinEndocrinol Metab.，62134-141，1986；EP 366，710；Herington等，J Clin Invest.，771817-1823，1986；Leung等，Nature.330537-543，1987)。已有測(cè)定血清中功能性GHBP的各種方法，優(yōu)選的方法是美國(guó)專利5,210,017中所述的配體介導(dǎo)的免疫功能試驗(yàn)(LIFA)和本文所述的其它試驗(yàn)。
GHRd3在診斷學(xué)、治療和試劑遺傳學(xué)中的用途在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及測(cè)定受試者是否表達(dá)與對(duì)治療的反應(yīng)增高或降低相關(guān)的，或與GHR活性升高或降低相關(guān)的GHR等位基因?？赏ㄟ^檢測(cè)GHR蛋白或核酸來測(cè)定某受試者是否表達(dá)GHR等位基因。
治療、診斷功評(píng)估受試者的方法宜包括評(píng)估或測(cè)定受試者是否表達(dá)GHRd3和/或GHRf1等位基因，如測(cè)定受試者是否為GHRf1等位基因工程的純合子(GHRf1/f1)，GHRd3等位基因的純合子(GHRd3/d3)或雜合子(GHRd3/f1)。因此本發(fā)明優(yōu)選包括測(cè)定生物樣品中是否表達(dá)GHRd3，測(cè)定步驟包括a)使所述生物樣品接觸i)能在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與GHRd3核酸雜交的多核苷酸；或ii)能選擇性結(jié)合GHRd3多肽的可檢測(cè)性多肽；和b)檢測(cè)所述多核苷酸與所述樣品中的RNA種類之間是否發(fā)生雜交，或所述可檢測(cè)性多肽是否能結(jié)合樣品中的多肽。檢測(cè)到所述雜交或所述結(jié)合，表明所述樣品中表達(dá)有所述GHRd3等位基因或同工型。所述多核苷酸優(yōu)選是引物，其中，通過檢測(cè)含有所述引物序列的擴(kuò)增產(chǎn)物的存在，而檢測(cè)所述雜交的發(fā)生，或可檢測(cè)性多肽是抗體。
也考慮測(cè)定哺乳動(dòng)物(優(yōu)選人)的GHRd3表達(dá)水平是否增高或降低的方法，該方法包括a)提供所述哺乳動(dòng)物的生物生物樣品；和b)比較所述樣品中GHRd3多肽的量，或編碼GHRd3多肽的GHRd3 RNA的量與對(duì)照樣品所檢測(cè)到的水平或期望水平。所述生物樣品中所述GHRd3多肽或所述GHRd3 RNA的量，與所述對(duì)照樣品所檢測(cè)到的水平或期望水平相比若高，表明所述哺乳動(dòng)物的GHRd3表達(dá)水平高；所述生物樣品中所述GHRd3多肽或所述GHRd3 RNA的量，與所述對(duì)照樣品所檢測(cè)到的水平或期望水平相比若低，表明所述哺乳動(dòng)物的GHRd3表達(dá)水平降低。
檢測(cè)生物樣品中是否存在GHRd3蛋白或核酸的示范性方法包括獲得測(cè)試受試者的生物樣品，使該生物樣品接觸能檢測(cè)GHRd3蛋白或編碼GHRd3蛋白的核酸(如mRNA，基因組DNA)的化合物或試劑，以檢測(cè)生物樣品中GHRd3蛋白或核酸的存在。檢測(cè)GHRd3 mRNA或基因組的優(yōu)選試劑，是能與GHRd3 mRNA或基因組DNA雜交的標(biāo)記的核酸探針。該核酸探針可以是，例如人的核酸或及一部分，如長(zhǎng)至少15、30、50、100、250或500個(gè)核苷酸并能在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與GHRd3 mRNA或基因組DNA充分雜交的核酸探針。用于本發(fā)明診斷試驗(yàn)的其它探針如本文所述。
檢測(cè)GHRd3蛋白的優(yōu)選試劑是能結(jié)合GHRd3蛋白的抗體，優(yōu)選帶可檢測(cè)標(biāo)記的抗體?？贵w可以是多克隆抗體，更優(yōu)選單克隆抗體?？刹捎猛暾贵w或及片段(如Fab或F(ab’)2)。術(shù)語“標(biāo)記的”探針或抗體指通過偶聯(lián)(即物理性連接)一可檢測(cè)物質(zhì)于該探針或抗體來直接標(biāo)記，及通過與另一直接標(biāo)記的試劑反應(yīng)來間接標(biāo)記該探針或抗體。間接標(biāo)記的例子包括用熒光標(biāo)記的第二抗體和末端標(biāo)記了生物素的DNA探針(可用熒光標(biāo)記的鏈霉親和素檢測(cè))來檢測(cè)第一抗體，術(shù)語“生物樣品”包括分離自受試者的組織、細(xì)胞和體液。即可用本發(fā)明的檢測(cè)方法檢測(cè)體外及體內(nèi)的生物樣品中的候選mRNA、蛋白質(zhì)或基因組DNA。例如，體外檢測(cè)候選蛋白質(zhì)的技術(shù)包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、免疫印跡、免疫沉淀和免疫熒光。體外檢測(cè)候選基因組DNA的技術(shù)包括Southern雜交。另外，體內(nèi)檢測(cè)GHRd3蛋白質(zhì)的技術(shù)包括將標(biāo)記的抗抗體導(dǎo)入受試者體內(nèi)。例如可用放射活性標(biāo)志標(biāo)記抗體，然后用標(biāo)準(zhǔn)的成象技術(shù)檢測(cè)受試者體內(nèi)該抗體的存在位置。
在一實(shí)施方案中，生物樣品含有受試者的蛋白質(zhì)分子?；蛘撸飿悠房珊惺茉囌叩膍RNA分子或受試者的基因組DNA分子。優(yōu)選的生物樣品是用常規(guī)方法分離自受試者的積血清樣品。
本發(fā)明也包括檢測(cè)生物樣品中存在的GHRd3蛋白、mRNA或基因組DNA的試劑盒。例如，該試劑盒可裝有能檢測(cè)生物樣品中的GHRd3蛋白或mRNA的標(biāo)記的化合物或試劑；測(cè)定樣品中GHRd3蛋白或mRNA量的試劑；將樣品中的GHRd3蛋白、mRNA或基因組DNA與標(biāo)準(zhǔn)品作比較的試劑。所述化合物或試劑可裝在適當(dāng)?shù)娜萜髦?。該試劑盒還或包括此試劑盒檢測(cè)GHRd3蛋白或核酸的用法說明書。
最優(yōu)選地，可利用本文所述的試驗(yàn)，如上面的診斷試驗(yàn)或后面的試驗(yàn)，來鑒定受試者是否具有GHR反應(yīng)低下或有發(fā)生此病的危險(xiǎn)。具體說，鑒定出受試者為GHRf1純合子就有GHR反應(yīng)低下或有發(fā)生此病的危險(xiǎn)。其它方面，可利用本文所述的診斷方法鑒定受試者具有此病或有發(fā)生此病、有發(fā)生反常的或更具體說GHR水平低下相關(guān)疾病或性狀的危險(xiǎn)。例如可利用本文所述的試驗(yàn)，如上面的診斷試驗(yàn)或后面的試驗(yàn)，來鑒定受試者是否具有或有發(fā)生GHR水平、表達(dá)或活性低下相關(guān)癥狀的危險(xiǎn)。在另一實(shí)施例中，可利用本文所述的試驗(yàn)，來鑒定受試者是否具有或有發(fā)生GHR水平、表達(dá)或活性低下的危險(xiǎn)。如上所述，預(yù)計(jì)GHRd3/f1雜合子的GHR反應(yīng)性或GHR活性比GHRf1/f1純合子要高。
可用本文所述的預(yù)后試驗(yàn)來測(cè)定是否按照那個(gè)給藥方案給予受試者通過GHR通路發(fā)揮作用的制劑來治療疾病或病癥。因此，本發(fā)明提供測(cè)定某受試者是否能擴(kuò)通過學(xué)習(xí)GHR通路發(fā)揮作用的試劑有效治療的方法，在該法中獲得測(cè)試樣品，并測(cè)定GHRd3蛋白或核酸的表達(dá)式或活性。如上所述預(yù)計(jì)顯示了GHRd3蛋白或核酸表達(dá)的受試者對(duì)所述試劑的陽性反應(yīng)，比不顯示GHRd3或核酸表達(dá)的受試者要高。
大部分情況下，由于給予通過GHR介導(dǎo)的通路而發(fā)揮作用的試劑可能適合于對(duì)該試劑的反應(yīng)增高或降低的受試者，因而檢測(cè)個(gè)體對(duì)GHR活性低下的易感性非常重要。所述試劑不一定必須直接作用于GHR蛋白，也可作用于GHR蛋白的上游，例如作用于最終能與GHR蛋白相互反應(yīng)的另一分子。在優(yōu)選實(shí)施方案中，該試劑是直接作用于GHR蛋白的試劑。更優(yōu)選該試劑是結(jié)合GHR蛋白起激動(dòng)劑或拮抗劑作用的試劑。在其它實(shí)施方案中，該試劑是能結(jié)合但不能激活GHR蛋白的GH蛋白。
涉及GHR的疾病包括，例如身材矮小、肥胖癥、感染或糖尿??；肢端肥大癥或巨人癥，或與其相關(guān)的泌乳性、致糖尿病性、脂肪分解和蛋白同化效應(yīng)；與鈉或水滯留相關(guān)的癥狀；代謝綜合征；心境和睡眠障礙、癌癥、心臟病和高血壓。因此，可利用本發(fā)明的方法來預(yù)測(cè)對(duì)用于這些疾病任何一種的治療試劑的反應(yīng)。
如上所述，本發(fā)明公開了治療選自患有身材矮小、肥胖癥、感染或糖尿??；肢端肥大癥或巨人癥，或與其相關(guān)的泌乳性、致糖尿病性、脂肪分解和蛋白同化效應(yīng)；與鈉或水滯留相關(guān)的癥狀；代謝綜合征；心境和睡眠障礙、癌癥、心臟病和高血壓疾病的受試者的方法，該方法包括(a)測(cè)定該受試者中是否存在GHR基因的等位基因，所述的該等位基因與具有對(duì)能改善所述疾病的試劑治療反應(yīng)高或低的可能性相關(guān)連；和(b)選擇或確定給予所述受試者的所述試劑的有效量。
因此，本發(fā)明也涉及治療哺乳動(dòng)物優(yōu)選人的方法，該方法包括以下步驟—任選地測(cè)定某個(gè)體的DNA是否編碼GHRd3蛋白；—選出其DNA不編碼GHRd3蛋白的個(gè)體；—隨訪所述個(gè)體有無GHR反應(yīng)低下相關(guān)癥狀表現(xiàn)；和—在適當(dāng)時(shí)期給予所述個(gè)體有效量的針對(duì)GHR反應(yīng)低下或針對(duì)其癥狀的治療性試劑。
本發(fā)明另一實(shí)施方案包括治療哺乳動(dòng)物優(yōu)選伯方法，該方法包括以下步驟—任選地測(cè)定某個(gè)體的DNA是否編碼GHRd3蛋白；—選出其DNA不編碼GHRd3蛋白的受試者；—給予所述個(gè)體針對(duì)GHR反應(yīng)低下的預(yù)防性治療試劑。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及治療哺乳，動(dòng)物優(yōu)選人，的方法，該方法包括以下步驟—任選地測(cè)定某個(gè)體的DNA是否編碼GHRd3蛋白；—選出其DNA不編碼GHRd3蛋白的個(gè)體；—隨訪所述個(gè)體有無GHR反應(yīng)低下相關(guān)癥狀的表現(xiàn)和發(fā)展；和任選地—在適當(dāng)時(shí)期給予所述個(gè)體針對(duì)GHR反應(yīng)低下或針對(duì)其癥狀的治療性試劑。
為了用于確定個(gè)體治療的過程，本發(fā)明還涉及的治療方法包括以下步驟—選出其DNA編碼與GHR反應(yīng)、活性或表達(dá)低下相關(guān)的，或與其癥狀相關(guān)的蛋白質(zhì)的個(gè)體—給予所述個(gè)體針對(duì)GHR反應(yīng)低下或其癥狀的治療有效量試劑。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述與GHR反應(yīng)低下或與其癥狀相關(guān)的蛋白質(zhì)是GHR蛋白，更優(yōu)選GHRf1蛋白。最優(yōu)選的個(gè)體是GHRf1/f1同工型純合子。
本發(fā)明方法所述個(gè)體可以是患以下疾病的個(gè)體身材矮小(如優(yōu)選ISS)、肥胖癥、感染或糖尿??；肢端肥大癥或巨人癥，或與其相關(guān)的泌乳性、致糖尿病性、脂肪分解和蛋白同化效應(yīng)；與鈉或水滯留相關(guān)的癥狀；代謝綜合征；心境和睡眠障礙、癌癥、心臟病和高血壓。
GHR反應(yīng)低下，宜為對(duì)能通過GHR通路發(fā)揮作用的，或更宜為對(duì)能結(jié)合GHR蛋白的試劑的治療反應(yīng)低下。這類試劑的優(yōu)選例子包括治療身材矮小、肥胖癥、感染或糖尿??；肢端肥大癥或巨人癥，或與其相關(guān)的泌乳性、致糖尿病性、脂肪分解和蛋白同化效應(yīng)；與鈉或水滯留相關(guān)的癥狀；代謝綜合征；心境和睡眠障礙、癌癥、心臟病和高血壓病的試劑。
對(duì)于GHR反應(yīng)低下或其癥狀的有效治療，可能在某適當(dāng)方面與對(duì)不具有GHR反應(yīng)低下個(gè)體的治療有所不同。一個(gè)方面，這種治療在給予的試劑劑量上不相同。另一方面，這種治療在試劑配方上不相同。另一方面，該方法在給予組合物的時(shí)間上不相同。還有一方面，用于有效治療GHR反應(yīng)低下或其癥狀的試劑在結(jié)構(gòu)上與用于治療所述疾病(如身材矮小、肥胖)的試劑不同。在一優(yōu)選方面，給予GHRf1純合子個(gè)體的含有GH蛋白、其變體或片段的組合物在劑量上，比給予其DNA編碼GHRd3蛋白的個(gè)體要高。
優(yōu)選所述試劑是GH多肽或其片段，更優(yōu)選重組GH多肽或其片段，它們的例子將在本文中進(jìn)一步討論。重組GH多肽可以是GHR激動(dòng)劑(如用于提高生長(zhǎng)率或治療肥胖)或GHR拮抗劑(如治療肢端肥大或巨人癥)。將在本文作進(jìn)一步討論的所述反應(yīng)，可以是身高或生長(zhǎng)速度的變化，肥胖癥狀(如體重指數(shù)BMI)、感染或糖尿病癥狀的改善；肢端肥大癥或巨人癥的改善；或鈉或水滯留、代謝綜合征、心境和睡眠障礙、癌癥、心臟病和高血壓相關(guān)癥狀的改善。
一方面，所述個(gè)體可以是已經(jīng)患有或懷疑患有疾病的個(gè)體，和可以是已經(jīng)過治療，可以是正將治療的個(gè)體，或可以是進(jìn)一步治療的候選者。最優(yōu)選所述個(gè)體是患有或懷疑患有選自身材矮小、肥胖癥、感染或糖尿?。恢朔蚀蟀Y或巨人癥，或與其相關(guān)的泌乳性、致糖尿病性、脂肪分解和蛋白同化效應(yīng)；與鈉或水滯留相關(guān)的癥狀；代謝綜合征；心境和睡眠障礙、癌癥、心臟病和高血壓疾病的個(gè)體。在優(yōu)選方面，本發(fā)明提供治療患有一種或多種所述疾病的方法。本發(fā)明可給予這些具有上述GH反應(yīng)低下的受試者具體的治療方法。
獲得待治療個(gè)體的DNA樣品以測(cè)定該DNA是否編碼GHRd3蛋白。分析該DNA樣品以確定它是否含有GHRd3序列或該個(gè)體是否為GHRf1同工型的純合子。DNA若編碼GHRd3蛋白將會(huì)對(duì)該試劑治療有更強(qiáng)的陽性反應(yīng)，DNA缺乏編碼GHRd3的等位基因的個(gè)體與GHRd3個(gè)體相比，陽性反應(yīng)將低下。
本發(fā)明方法也可用于評(píng)估和進(jìn)行藥物的臨床試驗(yàn)。所述方法包括鑒定對(duì)所述藥物有陽性反應(yīng)的第一群個(gè)體，和對(duì)所述藥物為陰性反應(yīng)、可其對(duì)所述藥物陽性反應(yīng)比所述第一群個(gè)體低下的第二群個(gè)體。在一實(shí)施方案中，給予臨床試驗(yàn)中的受試者藥物，如果其DNA樣品含有對(duì)該藥物治療陽性反應(yīng)相關(guān)的一種或多種等位基因，和/或如果其DNA樣品缺乏與對(duì)該藥物治療為陰性或低下陽性反應(yīng)相關(guān)的一種或多種等位基因。另一方面，給予臨床試驗(yàn)中的受試者藥物，如果其DNA樣品含有對(duì)該藥物治療為陰性或低下陽性反應(yīng)相關(guān)的一種或多種等位基因，和/或如果其DNA樣品缺乏與對(duì)該藥物治療為陽性反應(yīng)或陽性反應(yīng)增強(qiáng)相關(guān)的一種或多種等位基因。
因此可采用本發(fā)明方法通過考慮藥的臨床試驗(yàn)對(duì)象中GHR反應(yīng)的差異來評(píng)估藥物的效率。如果需要，評(píng)價(jià)藥物效率的試驗(yàn)可在包含基本上對(duì)該藥物具有有利反應(yīng)的個(gè)體人群中進(jìn)行，或在包含基本上對(duì)該藥物的反應(yīng)不如另一人群的個(gè)體人群中進(jìn)行。例如，可在GHRd3個(gè)體人群可在GHRf1/f1個(gè)體中人群中評(píng)價(jià)含GH蛋白的組合物。另一方面，設(shè)計(jì)用來治療GH反應(yīng)低下個(gè)體的藥物可優(yōu)選在GHRf1/f1個(gè)體人群中評(píng)價(jià)。
檢測(cè)GHRd3和GHRf1考慮可按照本發(fā)明通過檢測(cè)具體核酸中核苷酸的變化來鑒定GHR基因的其它突變(美國(guó)專利4,988,617，納入本文作參考)。為此考慮可采用的各種不同試驗(yàn)包括但不限于原位雜交熒光檢測(cè)(FISH美國(guó)專利5,633,365和5,665,549，各自內(nèi)容納入本文作參考)，直接DNA測(cè)序，PFGE分析、Southern或Northern印跡，單鏈構(gòu)型分析(SSCA)，RNA酶保護(hù)試驗(yàn)，等位基因特異性寡核苷酸(ASO，如美國(guó)專利5,639,611)，斑點(diǎn)印跡分析變性梯度凝膠電泳(如美國(guó)專利5,190,856，納入本文作參考)，RFLP(如美國(guó)專利5,324,631，納入本文作參考)和PCR-SSCP。檢測(cè)和定量生物液體事的基因序列的方法風(fēng)美國(guó)專利5,496,699中所述，其內(nèi)容納入本文作參考。
引物和探針術(shù)語引物在這里定義為包括能在模板-依賴性過程中引導(dǎo)巢式核酸合成的任何核酸。通常引物是長(zhǎng)10-20個(gè)堿基對(duì)的寡核苷酸，但可采用更長(zhǎng)的序列。引物以雙鏈或單鏈形式提供，雖然優(yōu)選單鏈形式。探針有不同定義，雖然它們也可作為引物。探針雖然也可引導(dǎo)，但設(shè)計(jì)用于結(jié)合靶DNA或RNA，在擴(kuò)增過程中不需要使用。
圖3和4分別提供了圍繞GHR基因中外顯子3或缺失外顯子3位點(diǎn)的基因組DNA序列SEQ ID NO1顯示了GHRf1 cDNA。本發(fā)明可利用GHRd3和GHRf1等位基因之間核苷酸序列的任何一個(gè)差別來檢測(cè)和鑒別個(gè)體中的具體GHR等位基因。為鑒定GHRf1基因組DNA或cDNA分子，可設(shè)計(jì)能與外顯子3核酸雜交的引物。為鑒定GHRd3基因組DNA，可設(shè)計(jì)跨越GHR基因的內(nèi)含子2和3連接區(qū)的引物或探針，如在GHRd3等位基因工程的基因組DNA中所見那樣，從而可鑒別含外顯子3的GHRf1等位基因與不含外顯子3的GHRd3等位基因。在另一實(shí)施例中，可設(shè)計(jì)跨越外顯子2和4連接區(qū)的引物或探針來鑒定GHRd3cDNA分子，從而鑒別含外顯子3的GHRf1cDNA分子與不含外顯子3的GHRd3cDNA分子。檢測(cè)GHRd3的合適引物的其它例子見Pantel等(同上)和以下實(shí)施1中的列表。
本發(fā)明包括用于本發(fā)明方法中推辭為引物和探針的多核苷酸。這些多核苷酸由，基本上由，或含有本文提供的任何序列的連續(xù)核苷酸序列，及其互補(bǔ)序列組成?！斑B續(xù)序列”可以至少長(zhǎng)25、35、40、50、70、80、100、250、500或1000個(gè)核苷酸，這樣長(zhǎng)度的連續(xù)序列與特定序列ID的長(zhǎng)度相一致。應(yīng)注意本發(fā)明的多核苷酸不限于具有圍繞感興趣靶序列(見序列表中的編號(hào))的精確的側(cè)接序列。而是，應(yīng)知道多態(tài)性周圍的側(cè)接序列，或任何一個(gè)距標(biāo)志更遠(yuǎn)的本發(fā)明的探針引物，可長(zhǎng)于或短于與它們的用途相容的任何長(zhǎng)度，本發(fā)明特別考慮這樣的序列。將會(huì)明白本文所指的多核苷酸可以是與它們用途相容的任何長(zhǎng)度。連續(xù)序列外的側(cè)接區(qū)域不需要與受試者真實(shí)產(chǎn)生的天然側(cè)接序列同源。其它要特別考慮的是任何一種核苷酸序列應(yīng)與該核苷酸的用途相容。優(yōu)選的多核苷酸可由，基本上由，或含有SEQ ID NO1、4或6序列的，或與其相互補(bǔ)序列的連續(xù)核苷酸序列。該“連續(xù)序列”至少長(zhǎng)8、10、12、15、50、70、80、100、250、500或1000個(gè)核苷酸。
可從本領(lǐng)域已知的任何方法所公開的序列，具體是能測(cè)試本文公開的特定序列或標(biāo)記的方法，設(shè)計(jì)本發(fā)明的探針。可以用本領(lǐng)域已知的任何方式設(shè)計(jì)用于本發(fā)明雜交試驗(yàn)的優(yōu)選探針組，使它們能選擇性結(jié)合多態(tài)性的一個(gè)等位基因，但在具體的試驗(yàn)條件下不結(jié)合其它基因。
如果需要，可標(biāo)記本發(fā)明的任何時(shí)候一種多核苷酸，即加入可被分光光度法、光化學(xué)法、生物化學(xué)方法、免疫化學(xué)法或化學(xué)方法檢測(cè)的標(biāo)記。例如，有用的標(biāo)記包括放射活性物質(zhì)、熒光染料和生物素。優(yōu)選在多核苷酸的3’和5’端標(biāo)記。也可利用標(biāo)記來捕捉引物，以促進(jìn)引物，或引物延伸產(chǎn)物如擴(kuò)增的DNA，固定在固相支持物上附著于引物或探針的捕捉標(biāo)記可以是能與固相試劑的一特異性結(jié)合成員(如生物素)形成結(jié)合對(duì)的另一特異性結(jié)合成員(如鏈霉親和素)。因此取決于多核苷酸或探針?biāo)鶐У臉?biāo)記類型，可用一捕捉或檢測(cè)靶DNA。另外，將會(huì)理解本文所提供的多核苷酸、引物或探針本身可作為捕捉標(biāo)記。例如，就一固相試劑的結(jié)合成員是一核酸序列而言，可選擇該成員能結(jié)合引物或探針的互補(bǔ)部分，從而可將該引物或探針固定在固相上。當(dāng)多核苷酸探針本身作為結(jié)合成員，本領(lǐng)域技術(shù)人員知道該探針含有不與靶序列互補(bǔ)的序列或“尾”。當(dāng)多核苷酸引物本身作為捕捉標(biāo)記時(shí)，該引物的至少一部分將不與固相上的核酸雜交。DNA標(biāo)記技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。
可將本發(fā)明的任何多核苷酸、引物和探針方便地固定在固相支持物上。固相支持物是本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的，包括反應(yīng)盤的壁或孔、試管、聚乙烯珠、磁珠、硝酸纖維條、膜、微粒如乳膠顆粒、綿羊(或其它動(dòng)物)的紅細(xì)胞、duracyte等。固相支持物不是關(guān)鍵可由本領(lǐng)域技術(shù)人員選擇。因此，乳膠顆粒、微粒、磁性或非磁性小珠、膜、塑料試管、微滴板孔的壁、玻璃或硅芯片、綿羊(或其它動(dòng)物)的紅細(xì)胞、duracyte等都是適當(dāng)?shù)睦?。將核本固定到固相上的合適方法包括離子性、疏水性、共價(jià)反應(yīng)等。要文所用的固有相支持物指不溶性材料，或可通過后續(xù)反應(yīng)變成不溶性的材料?？蛇x擇天生能結(jié)合和固定捕捉試劑的固相支持物。或者，可在固相上保留能結(jié)合和固定捕捉試劑的其它受體。該其它受體可包括一帶電物質(zhì)其電荷與捕捉試劑自身的電荷相反，從而可結(jié)合該捕捉試劑?；蛘撸撌荏w分子可以是固定(結(jié)合)在固相支持物上的一種特異性結(jié)合成員，能通過特異性結(jié)合反應(yīng)來固定該捕捉試劑。該受體分子能在試驗(yàn)前或試驗(yàn)期間將捕捉試劑間接結(jié)合于固相支持物/固相支持物可以是塑料、衍生化塑料、磁性或非磁性金屬、試管的玻璃或硅表面、微滴板孔、紙、珠、微粒、芯片、綿羊(或其它動(dòng)物)的紅細(xì)胞、duracytes和本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的其它構(gòu)型。本了明的多核苷酸可單獨(dú)或?qū)⒈景l(fā)明的至少2、5、8、10、12、15、20或25個(gè)不同多核苷酸組合結(jié)合或固定于一個(gè)固相支持物上。此外，可將本發(fā)明之外的多核苷酸，如同本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)多核苷酸那樣，結(jié)合于同一個(gè)固相支持物上。
本文提供的任一多核苷酸可附著于固相支持物上的重疊區(qū)域或隨機(jī)部位。或者，本發(fā)明的多核苷酸可附著在編號(hào)的陣列中，在陣列中每個(gè)多核苷酸附著在與任何其它多核苷酸附著點(diǎn)不相重疊的固相支持物的獨(dú)特區(qū)域。這種有序的多核苷酸陣列稱為“可尋址”陣列，其中各特定部位都有記錄并可作為試驗(yàn)程序的一部分進(jìn)入?？蓪ぶ返亩嗪塑账彡嚵邪斜姸嗖煌墓押塑账崽结?，它們與各不同的已知部位基底表面相偶聯(lián)。知道各多核苷酸的精確部位使這些“可尋址”陣列特別有用于雜交試驗(yàn)。可采用本發(fā)明的多核苷酸和該領(lǐng)域已知的任何可尋址陣列技術(shù)。已知的這些多核苷酸陣列的一個(gè)具體實(shí)施方案是Genechip，在美國(guó)專利5,143,854；和PCT出版物WO 90/15070和92/10092中有所描述。這些陣列通?？捎脵C(jī)械合成方法或光指導(dǎo)的合成方法，加光刻蝕法和和固相寡核苷酸合成的組合方法產(chǎn)生(Fodor等，Science，251767-777，1991)。寡核苷酸陣列固定在固相支持物上賦予了開發(fā)通常鑒定為“非常大規(guī)模固定的聚合物”(VLSIPS)技術(shù)的可能性，此法中，探針通常固定在芯片固相表面上的向密度陣列中。美國(guó)專利5,143,854和5,412,087和PTC出版物WO 90/15070\WO 92/10092和WO 95/11995中提供了VLSIPS技術(shù)的例子，描述了通過例如光指導(dǎo)合成技術(shù)形成寡核苷酸陣列的方法。設(shè)計(jì)的策略目的是提供固定在固相支持物上的核苷酸陣列，進(jìn)一步開發(fā)了目前的策略在芯片上排列和展示寡核苷酸陣列以圖獲得最高的雜交模式和序列信息。目前策略的例子見PTC出版物WO94/12305、WO 94/11530、WO 97/29212和WO 97/31256中所述。
模板依賴性擴(kuò)增方法模板的數(shù)量取決于用于擴(kuò)增某給定模板樣品中標(biāo)記序列的方法。一種最為熟悉的擴(kuò)增方法是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，詳見美國(guó)專利4,683,195、4,683,202和4,800,159以及Innis等，PCR Protocols，Academic Press，Inc.San Diego Caiif.，1990中所述，它們的內(nèi)容納入本文作參考。
簡(jiǎn)言之，在PCR中，制備二條與標(biāo)記序列相反互補(bǔ)鏈上的區(qū)域相互補(bǔ)的引物。在反應(yīng)混合物中加入過量的脫氧核苷酸三磷酸的DNA聚合酶，如Taq聚合酶。如果樣品中存在有標(biāo)記序列，引物將與其結(jié)合，而聚合酶將沿該標(biāo)記序列添加核苷酸導(dǎo)致引物延伸。通過升高和降低反應(yīng)混合物的溫度使延伸的引物從標(biāo)記物上解離下來形成反應(yīng)產(chǎn)物，過量的引物將結(jié)合標(biāo)記物和反應(yīng)產(chǎn)物，重復(fù)此過程。
可進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄酶OCR擴(kuò)增以定量檢測(cè)擴(kuò)增的mRNA量。將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA的方法是熟知的，見Sambrook等，選自Molecular Cloning.A Laboratory Manual第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor.N.Y.，1989。其它逆轉(zhuǎn)錄方法利用耐溫的RNA-依賴性DNA聚合酶。這些方法風(fēng)WO 90/07641中的描述。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的方法是本領(lǐng)域熟知的。
另一種擴(kuò)增方法是連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(“LCR”美國(guó)專利5,494,810、5,484,699和歐洲專利320,308，各自內(nèi)容納入本文作參考)在LCR中，制備二對(duì)互補(bǔ)的探針，每對(duì)可結(jié)合它們緊鄰的靶序列的相反互補(bǔ)鏈。存在連接酶時(shí)，該二對(duì)探針相連接形成一個(gè)單元。
通過溫度的循環(huán)變化，PCR中相連的單元從靶上解離下來，可作為過量的探險(xiǎn)針對(duì)的“靶序列”。美國(guó)專利4,883,750描述了一種類似于LCR的使探針對(duì)與靶序列結(jié)合的方法。
Qbeta復(fù)制酶、RNA-指導(dǎo)的RNA聚合酶也是可用于本發(fā)明的另一種擴(kuò)增方法。此法中，將具有與靶序列相互補(bǔ)區(qū)域的復(fù)制性RNA序列加入到存在RNA聚合酶的樣品中。該聚合酶將拷貝可被檢測(cè)的該復(fù)制性序列。其內(nèi)容納入本文作參考的美國(guó)專利4,786,600也描述了類似方法，是關(guān)于用RNA指導(dǎo)的RNA聚合酶合成互補(bǔ)性單鏈分子時(shí)，可作為模板的重組RNA分子。這樣形成的產(chǎn)物分子可作為合成原初重組RNA分子其它拷貝的模板。
一種等溫?cái)U(kuò)增方法中，采用限制性內(nèi)切核酸酶來擴(kuò)增靶分子，其在一條鏈中含有核苷酸5’-[α-硫代]-三磷酸限制性位點(diǎn)，也可用于擴(kuò)增本發(fā)明的核酸(Walker等，1992，Pro Natl Acad Sci USA.89392-396；美國(guó)專利5,270,184，納入本文作參考)。美國(guó)專利5,747,255(納入本文作參考)描述了采用可切割寡核苷酸進(jìn)行等溫?cái)U(kuò)增作多核苷酸檢測(cè)。在本文所述方法中，提供含有彼此相互補(bǔ)的序列的不同群寡核苷酸，當(dāng)它們至少含有一個(gè)可被切斷的可剪切連接鍵，當(dāng)適宜的匹配雙鏈體形成時(shí)含有此連接鍵。當(dāng)靶多核苷酸接觸第一寡核苷酸時(shí)，發(fā)生切割，產(chǎn)生的第一片段可與第二寡核苷酸雜交。發(fā)生這種雜交時(shí)，第二寡核苷酸被切斷釋放出第二片段，該第二片段進(jìn)而以類似于靶多核苷酸的方式與第一寡核苷酸雜交。
標(biāo)準(zhǔn)置換式擴(kuò)增(SDA)是進(jìn)行核酸等溫?cái)U(kuò)增的另一種方法，該方法包括多輪標(biāo)準(zhǔn)置換和合成，即缺口翻譯(如美國(guó)專利5,744,311、5,733,752、5,733,733、5,712,124)。一種類似方法稱為修補(bǔ)鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RCR)，其包括在擴(kuò)增的靶區(qū)域中使若干探險(xiǎn)針退火，然后進(jìn)行的修補(bǔ)反應(yīng)中4個(gè)堿基只存在2個(gè)堿基，每次檢測(cè)時(shí)其它2個(gè)堿基作為生物素化衍生物加入。在SDA中采用了類似方法。也可用循環(huán)(CPR)檢測(cè)靶特異性序列。在CPR中，具有非特異性DNA的3’和5’序列及特異性RNA的中間序列的探針，與樣品中存在的DNA雜交。雜交后用RNA酶H處理反應(yīng)物，鑒定探針的產(chǎn)物，經(jīng)消化后釋放成為特定性產(chǎn)物。使最初的模板與另一循環(huán)探險(xiǎn)針退火并重復(fù)此反應(yīng)。
其內(nèi)容納入本文作參考的GB專利申請(qǐng)2,202,328和PCT專利申請(qǐng)PCT/US89/01025中還描述了另一種擴(kuò)增方法可用于本發(fā)明。在前一申請(qǐng)中，“修飾”的引物用于PCR樣的模板和酶依賴的合成中。所述引物采用可捕獲分子(如生物素)和/或可檢測(cè)分子(如酶)作標(biāo)記進(jìn)行修飾。在后一申請(qǐng)中，將過量的探針加入樣品中。存在靶序列時(shí)，探針結(jié)合并被催化而切斷。切斷后完整釋放出的靶序列被過量探針結(jié)合。切下的標(biāo)記的探針表明存在有靶序列。
其它核酸擴(kuò)增技術(shù)包括基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增系統(tǒng)(TAS)，包括核酸序列為基礎(chǔ)的擴(kuò)增(NASBA)和3SR(Kwok等，1989，Pro Natl Acad Sci USA.861173；和WO 88/10315，其內(nèi)容納入本文作參考)。在NASBA中，可通過標(biāo)準(zhǔn)的苯酚/氯仿抽提法、臨床臨床樣品熱變性、用裂解液和微離心柱分離DNA和RNA、或氯化胍提取RNA來制備用于擴(kuò)增的核酸。這些擴(kuò)增技術(shù)包括退火具有靶特異性序列的引物。聚合反應(yīng)后，用RNA酶H消化DNA/RNA雜交體，同時(shí)再加熱變性雙鏈DNA分子。在此二種情況下，通過加入第二靶特異性引物然后聚合，將單鏈DNA制成完整的雙鏈。然后用RNA聚合酶，如T7或SP6多重轉(zhuǎn)錄該雙鏈DNA分子。在等溫循環(huán)反應(yīng)中，RNA被逆轉(zhuǎn)錄為單鏈DNA，其再轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈DNA，然后再用RNA酶如T7或SP6轉(zhuǎn)錄一次。所得產(chǎn)物無論是截短的或完整的，顯示了靶特異性序列。
Davey等在歐洲專利329,822(其內(nèi)容納入本文作參考)中公開的核酸擴(kuò)增方法包括循環(huán)合成單鏈RNA(“ssRNA”)、ssDNA；和雙鏈DNA(dsDNA)，可用于本發(fā)明。該ssRNA是第一引物寡核苷酸有模板，可通過逆轉(zhuǎn)錄酶(RNA依賴的DNA聚合酶)延伸。然后通過核糖核酸酶H(RNA酶H，一種使RNA與DNA或RNA形成雙鏈體的特異性RNA酶)的作用從獲得的DNA:RNA雙鏈體中去除RNA。產(chǎn)生的ssDNA作為第二引物的模板，也含有其5’端與該模板同源的RNA聚合酶啟動(dòng)子(示范性的如T7 RNA聚合酶)的序列。然后用DNA聚合酶(示范性的如大腸桿菌DNA聚合酶I的大“Klenow”片段)延伸該引物，產(chǎn)生的雙鏈DNA分子(“dsDNA”)具有與二引物之間初始RNA相同的序列和在一端附加的啟動(dòng)子序列。該啟動(dòng)子序列通過適當(dāng)?shù)腞NA酶可用于制備該DNA的許多拷貝。然后讓這些拷貝再進(jìn)入循環(huán)導(dǎo)致極其迅速的擴(kuò)增。用適當(dāng)選擇的酶，可在等溫下進(jìn)行擴(kuò)增而無須在每輪中加入酶。因?yàn)榇朔椒ǖ难h(huán)性質(zhì)，可選擇DNA或RNA形式的起始序列。
PCT申請(qǐng)WO 89/06700(其內(nèi)容納入本文作參考)分開了一種核酸序列擴(kuò)增方案，依據(jù)啟動(dòng)子/引物序列與單鏈靶DNA(“ssDNA”)雜交，然后將此序列轉(zhuǎn)錄成許多RNA拷貝。此方案不是循環(huán)性的，即新模板不產(chǎn)生自得到的RNA轉(zhuǎn)錄物。其它擴(kuò)增方法包括“RACE”和“一側(cè)PCR”(Frohman，選自PCR Protocols.A Guide To Methodsana Applications Academic Press N.Y.，1990；O’hara等，1989.Pro Natl AcadSci USA.，865673-5677；各自內(nèi)容納入本文作參考)。
在本發(fā)明的擴(kuò)增步驟中也可采用基于二條(或多條)寡核苷酸在存在具有所得“雙-寡核苷酸”序列的核酸時(shí)，相連接，從而擴(kuò)增該雙-寡核苷酸(Wu等，1989，Genomics，4560，納入本文作參考)。
Southern/Northern印跡印跡技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。Southern印跡涉及采用DNA作靶子，而Northern印跡用RNA作靶子。各自提供不同類型的信息，雖然cDNA印跡在許多方面與RNA型印跡相類同。
簡(jiǎn)言之，采用的探針可靶向已固定在適當(dāng)基質(zhì)(常用硝酸纖維濾膜)上的DNA或RNA。不同的核酸應(yīng)分開固定以有利于分析。常用核酸凝膠電泳分離然后“印制”到濾膜上。
隨后將印制的靶分子在能促進(jìn)變性和重雜交的條件下與探針(常作標(biāo)記)一起培育，由于設(shè)計(jì)的探針與靶序列堿基相配，在復(fù)性條件下探針將結(jié)合靶序列的一部分。除去未結(jié)合的探針，如上所述進(jìn)行檢測(cè)。
分離方法通常希望在一個(gè)階段或另一階段，將擴(kuò)增產(chǎn)物與模板和過量的引物分開，目的是確定是否發(fā)生的特異性擴(kuò)增。在一實(shí)施方案中，用標(biāo)準(zhǔn)方法通過瓊脂糖、瓊脂糖-丙烯酰胺或聚丙烯酰胺凝膠電泳來分離擴(kuò)增產(chǎn)物。見Sambrook等，1989。
或者，可采用層析技術(shù)來有效分離。有許多類型的層析技術(shù)可用于本發(fā)明吸附、分相、離子交換和分子篩；使用它們的許多志門化技術(shù)包括柱子、紙、薄層和氣相色譜(Freifelder.Physical Biochemistry Applications to Biochemistry andMolecular Biology，第二版，Wm，F(xiàn)reeman and Co.，New York，N.Y.1982。
檢測(cè)方法可觀察產(chǎn)物以證實(shí)擴(kuò)增了標(biāo)記序列。一種典型的觀察方法涉及用溴乙錠染色在紫外線燈下觀察。或者，如果可使擴(kuò)增產(chǎn)物暴光X線膠片，在適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)光譜下觀察，然后分離。
在一實(shí)施方案中，進(jìn)行間接觀察。分離擴(kuò)增產(chǎn)物后，使標(biāo)記的探針與擴(kuò)增的標(biāo)志序列接觸。宜將該探針與生色基團(tuán)相偶聯(lián)而不是放射標(biāo)記。在另一實(shí)施方案中，使探針與結(jié)合伴侶，如抗體或生物素相偶聯(lián)，該結(jié)合對(duì)的另一成員攜帶有可檢測(cè)基團(tuán)。在一實(shí)施方案中，用標(biāo)記的探針作檢測(cè)。涉及的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，在許多分子方案的標(biāo)準(zhǔn)教課書中可以找到。見Sambrook等，1989。例如在擴(kuò)增期間或之后鑒定生色團(tuán)、放射標(biāo)記探針或引物。
納入本文作參考的美國(guó)專利5,279,721描述了一個(gè)例子，分開了自動(dòng)化電泳和核酸轉(zhuǎn)移的裝置和方法。其裝置可進(jìn)行電泳和印跡，無須過多凝膠操作，很理想地適合進(jìn)行本發(fā)明的方法。
此外，可采用標(biāo)準(zhǔn)的序列分析技術(shù)，對(duì)上述擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列分析以鑒定特定種類的變體。在某些方法中，采用為最優(yōu)測(cè)序設(shè)計(jì)的引物組作序列分析進(jìn)行基因的大量分析(Pignon等，1994，Hum Mutat，3126-132)。本發(fā)明提供的方法可采用所有這些類型的分析。采用本文公開的序列，可設(shè)計(jì)寡核苷酸引物來擴(kuò)增整個(gè)GHR基因的序列，然后用直接測(cè)序分析。
各種測(cè)序反應(yīng)是本領(lǐng)域知道的，可通過比較樣品的序列與相應(yīng)的野生型(對(duì)照)序列直接測(cè)定GHR基因的序列。測(cè)序反應(yīng)的例子包括Maxam and Gilbert((1977)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74560)或Sanger((1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，745463)所發(fā)展的技術(shù)。當(dāng)進(jìn)行診斷性試驗(yàn)時(shí)也考慮可采用各種自動(dòng)化測(cè)序方法之一種。
試劑盒組分檢測(cè)和測(cè)序GHR及其變體需要的所有必須材料和試劑可一起裝在試劑盒中，這通常包括預(yù)先選擇的探針，也包括適合擴(kuò)增核酸的酶，包括各種聚合酶(RT、Taq、SequenaseTM等)，脫氧核苷酸，以提供擴(kuò)增所必須的反應(yīng)混合物。這種試劑盒通過包括適合方式的各試劑和酶及各個(gè)引物或探針的不同容器。
相關(guān)的定量測(cè)定RT-PCRTM的設(shè)計(jì)和滴度倒數(shù)考慮可采用將RNA逆轉(zhuǎn)錄(RT)為cDNA然后進(jìn)行相關(guān)的定量測(cè)定PCR(RT-PCR)，來測(cè)定分離自受試者的特異性mRNA的相對(duì)濃度。通過測(cè)定特特性mRNA的濃度變化，顯示編碼該特異性MRNA的基因有差異必表達(dá)。例如可用定量PCR來檢查待用通過GHR通路起作用的試劑治療的受試者，懷疑患GHR活性低下或優(yōu)選患有39-15。。的受試者中GHRd3和GHRf1 mRNA的相對(duì)水平。
在PCR中，擴(kuò)增的靶DNA分子的數(shù)目在反應(yīng)每輪循環(huán)中以接近2的因數(shù)增加，直到某些試劑變得有限。因此擴(kuò)增速率遞增性降低直到二輪之間被擴(kuò)增的靶序列不再增加。如果制作的點(diǎn)狀圖中，X軸為循環(huán)輪次，Y軸為擴(kuò)增的靶DNA濃度的對(duì)數(shù)，連接各點(diǎn)形成具有特征性形狀的曲線。從第一輪開始，該曲線的斜率是陽性和恒定的，即是說這是該曲線的線性部分。在某試劑變得有限后，此曲線的斜率開始下降并最終變成零。在此點(diǎn)，擴(kuò)增的靶DNA濃度變成接近某固定值的漸進(jìn)線。即是說這是該曲線的平臺(tái)部分。
在反應(yīng)開始之前，PCR擴(kuò)增線性部分靶DNA的濃度與該靶序列的起始濃度成正比。通過測(cè)定完成了相同輪次PCR反應(yīng)時(shí)靶DNA擴(kuò)增產(chǎn)物的濃度在它們的線性范圍內(nèi)，可能測(cè)出原初DNA混合物中特異性靶序列的濃度。如果該DNA混合物是從分離自不同組織或細(xì)胞的RNA所合成的cDNA，即可測(cè)定各組織或細(xì)胞衍生的靶序列所產(chǎn)生的特異性mRNA的相對(duì)豐度。PCR產(chǎn)物濃度與相對(duì)mRNA豐度之間的正比關(guān)系只在PCR反應(yīng)堆線性范圍內(nèi)才如此。
通過測(cè)定反應(yīng)混合物中試劑的利用度(不取決于靶DNA的原初濃度)可測(cè)得該曲線平臺(tái)部分靶DNA的最終濃度。因此，在用RT-PCR測(cè)定RNA群體收集物的mRNA種類相對(duì)豐度之前必須滿足的第一條件是，當(dāng)PCR反應(yīng)處在其曲線的線性部分時(shí)必須采樣測(cè)定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的濃度。
RT-PCR實(shí)驗(yàn)?zāi)艹晒y(cè)定mRNA種類的相對(duì)豐度必須滿足的第二條件是，必須將可擴(kuò)增的cDNA相對(duì)濃度歸一化至某種獨(dú)立的標(biāo)準(zhǔn)量。RT-PCR實(shí)驗(yàn)的目的是測(cè)定樣品中相對(duì)于所有mRNA種類平均豐度的某特定mRNA種類的豐度。在下述實(shí)驗(yàn)中，可采用GHRf1的mRNA作為比較GHRd3 mRNA相對(duì)豐度的標(biāo)準(zhǔn)品。
大多數(shù)競(jìng)爭(zhēng)性PCR方案利用差不多與靶序列相同豐度的內(nèi)部PCR標(biāo)準(zhǔn)物。如果在PCR線性范圍時(shí)采樣品測(cè)定擴(kuò)增產(chǎn)物這些策略是有效的。如果當(dāng)反應(yīng)達(dá)到平臺(tái)時(shí)產(chǎn)品取樣，那么豐度較低的產(chǎn)物會(huì)相對(duì)高于實(shí)際情況。對(duì)許多不同RNA產(chǎn)物作相對(duì)豐度比較，如當(dāng)檢查RNA樣品的不同表達(dá)時(shí)將會(huì)被歪曲，從而產(chǎn)生RNA相對(duì)豐度看來不如它們真實(shí)數(shù)值的差異。如果內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物豐度比靶序列高得多這不是嚴(yán)重問題。如果內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物比靶序列豐富，可在RNA樣品之間進(jìn)行直接線性比較。
以上討論從理論上分析了臨床材料的RT-PCR試驗(yàn)。臨床樣品的固有問題是它們?cè)跀?shù)量上不同(使歸一化成問題)和它們?cè)谫|(zhì)量上不同(必須同時(shí)擴(kuò)增可靠的內(nèi)部對(duì)照物，或許長(zhǎng)度比靶序列更大)。如果進(jìn)行的RT-PCR是采用內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物的相對(duì)定量性RT-PCR，而內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物是比靶cDNA片斷大的可擴(kuò)增cDNA片斷，編碼該內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物的mRNA豐度比編碼靶序列的mRNA豐度高5-100倍，即可克服這二個(gè)問題。此試驗(yàn)測(cè)定的是各mRNA種類的相對(duì)豐度并非絕對(duì)豐度。
可采用更方便的相對(duì)定量性RT-PCR試驗(yàn)和外部標(biāo)準(zhǔn)方案進(jìn)行其它研究。這些試驗(yàn)采取擴(kuò)增曲線線性部分的PCR產(chǎn)物樣品。對(duì)于每種靶cDNA片斷必須憑經(jīng)驗(yàn)來確定取樣的最佳PCR輪次。此外，必須小心地將分離自不同組織樣品的每群RNA的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物歸一化到可擴(kuò)增cDNA的相等濃度。這種考慮非常重要，因?yàn)樵撛囼?yàn)測(cè)定的是絕對(duì)mRNA豐度。絕對(duì)化mRNA豐度只可用作歸一化樣品中不同基因表達(dá)的一種衡量。雖然憑經(jīng)驗(yàn)確定擴(kuò)增曲線的線性范圍和歸一化cDNA制品是費(fèi)力費(fèi)時(shí)的過程，但RT-PCR試驗(yàn)的結(jié)果優(yōu)于采用內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物的相對(duì)定量性RT-PCR試驗(yàn)的結(jié)果。
這種優(yōu)點(diǎn)的一個(gè)理由是無需內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物/競(jìng)爭(zhēng)物，在擴(kuò)增曲線的性范圍內(nèi)所有的試劑都可轉(zhuǎn)變成單一的PCR產(chǎn)物，從而提高了該試驗(yàn)的靈敏度。另一理由是，只有一種PCR產(chǎn)物，在電泳凝膠上顯示該當(dāng)產(chǎn)物或其它顯示方法就不會(huì)復(fù)雜，本底低而易于解釋。
芯片技術(shù)本發(fā)明特別考慮以芯片為基礎(chǔ)的DNA技術(shù)，如Hacia等，(1996，Nature Genetics，14441-447)和Shoemaker等，(1998，Nature Genetics，14450-456)所述。簡(jiǎn)言之，這些技術(shù)涉及快速和精確分析大量基因的定量方法。通過用寡核苷酸標(biāo)記基因或用固定的探針陣列，可采用芯片技術(shù)來分隔靶分子成為高密度陣列和以雜交為基礎(chǔ)篩檢這些分子。也見Pease等((1994)Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA，915022-5026)；Fodor等((1991)Science.251767-773)。
檢測(cè)GHRd3或GHRf1蛋白的方法可利用抗體通過例如ELISA和免疫印跡技術(shù)來特征鑒定健康和患病組織中的GHRd3和/或GHRf1成分。獲得GHRd3和GHRf1多肽的方法本文將進(jìn)一步描述，可用已知方法進(jìn)行。同樣，制備能選擇性GHRd3和GHRf1同工型抗體的方法本文將作進(jìn)一步描述。
一實(shí)施例中，考慮不能鑒別GHRd3和GHRf1的GHR抗體，包括GHRd3、GHRf1和GHR抗體可用于ELISA試驗(yàn)中。例如，將抗-GHR抗體固定在所選表面上，宜為對(duì)蛋白質(zhì)有親和力的表面如聚苯乙烯微滴板的孔。洗去未完全吸附的物質(zhì)后，需要用已知在抗原性上與測(cè)試血清為中性的非特異性蛋白，如牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白或奶粉溶液結(jié)合或包被試驗(yàn)平板。這得以封閉固定表面上的非特異性吸附位點(diǎn)，從而降低抗原非特異性結(jié)合該表面所產(chǎn)生的本底。
抗體結(jié)合在孔上后，用非反應(yīng)性物質(zhì)包被以減少本底，洗去未結(jié)合物質(zhì)使該固定表面接觸待測(cè)樣品形成免疫復(fù)合物(抗原/抗體)。
在測(cè)試樣品與結(jié)合的抗體之間形成特異性免疫復(fù)合物后洗滌，使之接觸不同于第一抗體的對(duì)GHR有特異性的第二抗體，來檢測(cè)該免疫復(fù)合物的形成和量。適合的條件宜包括用稀釋液如BSA、牛γ球蛋白(BGG)和磷酸鹽(PBS)緩沖液/吐溫，稀釋樣品。這些加入的試劑也有助于降低非特異性本底。然后層疊加入抗血清培育2-4小時(shí)，溫度宜為約25-27℃。培育后洗滌抗血清接觸過的表面以去除非免疫復(fù)合性物質(zhì)。優(yōu)選的洗滌方法包括用PBS/吐溫或碳酸緩沖液溶液洗滌。
為了提供檢測(cè)工具，第二抗體宜與酶偶聯(lián)，這樣當(dāng)其與適當(dāng)?shù)纳镔|(zhì)一起培育時(shí)可產(chǎn)生顏色。例如，需要在有利于免疫復(fù)合物形成的條件下(如室在含PBS的溶液如PBS/吐溫)中培育2小時(shí))使結(jié)合第二抗體的表面秘脲酶或過氧化物酶偶聯(lián)的抗人-IgG接觸和培育一段時(shí)間。
與酶標(biāo)第二抗體培育后，再經(jīng)洗滌去除未結(jié)合物質(zhì)，與生色底物如脲素和溴甲酚紫，或當(dāng)酶標(biāo)記物是過氧化物酶時(shí)用2’2’-重氮-二(3-乙基-甲苯噻唑啉)-6-硫酸酯(ABTS)和H2O2，培育定量檢測(cè)標(biāo)記物的量。通過檢測(cè)顯色程度，如用可見光分光光度計(jì)進(jìn)行定量檢測(cè)。
可先使樣品與測(cè)試板結(jié)合改變上述試驗(yàn)方式，然后用第一抗體培育測(cè)試板，接著用對(duì)第一抗體具有特異的標(biāo)記第二抗體檢測(cè)結(jié)合的第一抗體。
各種其它可用的免疫檢測(cè)方法的步驟在科學(xué)文獻(xiàn)中有所描述，如Nakamura等，選自Handbook of Experimental Immunology(第4版)Weir E，，Herzenberg，L.A，Blackwell，C.，Herzenberg L編，第1卷27章，Blackwell Scientific Publ，Oxford，1987納入本文作參考)。免疫試驗(yàn)就其最簡(jiǎn)單和直接的含意而言是結(jié)合試驗(yàn)。某些優(yōu)選的免疫試驗(yàn)是各種類型的放射免疫試驗(yàn)(RIA)和免疫珠捕捉試驗(yàn)。采用組織切片的免疫組化檢測(cè)也特別有用。然而不難懂得，檢測(cè)不局限于這些技術(shù)，免疫印跡、斑點(diǎn)印跡、FACS分析等也可結(jié)合用于本發(fā)明。
一優(yōu)選實(shí)施例中，可用上述方法以GHRd3特異性抗體檢測(cè)GHRd3水平。在其它方法中，不區(qū)分GHRd3和GHRf1而測(cè)定GHR的總量和測(cè)定GHRf1的量。不區(qū)分的GHR量與GHRf1量的差別表明是GHRd3存在的量。
宜用這些方法檢測(cè)循環(huán)中的GHBP(如GHRd3或GHRf1的胞外部分)。該方法的優(yōu)選例子可以檢測(cè)不區(qū)分的GHR(如從不區(qū)分的GHR總量減GHRd3，與GHRf1相比較)、檢測(cè)GHRd3和/或檢測(cè)GHRf1。這類方法包括ELISA試驗(yàn)、配體介導(dǎo)的免疫功能試驗(yàn)(LIFA)的放射免疫試驗(yàn)(RIA)。
檢測(cè)不區(qū)分的(如GHRd3或GHRf1)GHR的LIFA可用Pflaum等，1993，Exp ClinEndocrino1.101(Suppl.1)44和Kratzsch等，2001.Clin Endocrinol.54；61-68所述方法進(jìn)行。簡(jiǎn)言之，在一實(shí)施例中，用單克隆抗rGHBP抗體包被微滴板來檢測(cè)不區(qū)分的GHR。將血清2清或糖化rGHBP標(biāo)準(zhǔn)品與10ng/孔的hGH一起培育，抗hGH單克隆抗體為生物素化的示蹤劑。用銪標(biāo)記的鏈霉親和素系統(tǒng)擴(kuò)增信號(hào)，用熒光計(jì)檢測(cè)。另一實(shí)施例中，進(jìn)行放射性免疫試驗(yàn)來檢測(cè)不區(qū)分的GHBP，如Kratsch等，1995，Eur J Endocrinal.132306-312所述，用抗-rhGHBP抗體、rhGHBP標(biāo)準(zhǔn)品和125I-rhGHBP作標(biāo)記抗原。
在Kratsch等，2001.Clin Endocrinal.5461-68中所述的另一實(shí)施例中，用100微升能在hGH結(jié)合位點(diǎn)之外GHBP的溶于50mM磷酸鈉緩沖液pH9.6的單克隆抗體10B8(rOWLINSON等，1999)包被微滴板檢測(cè)不區(qū)分的GHBP。洗滌步驟后，加入25微升樣品或標(biāo)準(zhǔn)品，溶于75微升試驗(yàn)緩沖液(50mM Tris-(羥甲基)-氨基甲烷、150mMNaCl、0.05％NaN3、0.01％Tween 40、0.5％BSA、0.05％牛γ球蛋白、20μMdiethylenetriaminepenta乙酸鹽)中的50納克生物素標(biāo)記的抗GHBP mAb 5C6(其能結(jié)合hGH結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)的GHBP，Rowlinson等，1999)，培養(yǎng)過夜。然后用含外顯子3的GHBP f1型特異性抗體檢測(cè)GHRf1的量。簡(jiǎn)言之，檢測(cè)不區(qū)分的GHBP時(shí)將mAb 10B8固定在微滴板上。洗滌后加入25微升樣品或標(biāo)準(zhǔn)品，和75微升Kratzsch等，(2001)所述的兔抗GHRd3多肽多克隆抗體(1∶10000稀釋)培育過夜。加入20納克生物素化鼠抗兔IgG培育2小時(shí)然后反復(fù)淋洗。用銪標(biāo)記的鏈霉親和素系統(tǒng)擴(kuò)增信號(hào)，用熒光計(jì)檢測(cè)。重組的非糖基化hGHBP以綿羊血清稀釋用作標(biāo)準(zhǔn)品。
可用已知方法獲得用于本發(fā)明的GHRd3特異性抗體。分離的GHRd3蛋白或其一部分或片段可作為免疫原，用標(biāo)準(zhǔn)的多克隆和單克隆抗體制備技術(shù)來產(chǎn)生能結(jié)合GHRd3的抗體。可用GHRd3蛋白，或者本發(fā)明提供的GHRd3抗原性肽片段作為免疫原。
可用已知方法從獲自個(gè)體的生物樣品中純化制備GHRd3多肽，或更優(yōu)選重組的多肽。GHRf1的氨基酸序列顯示在SEQ ID NOS2和3中，GHRd3與其不同處為缺失了外顯子3編碼的22個(gè)氨基酸。GHRd3抗原肽宜含有SEQ ID NOS2和3所示氨基酸序列的至少8個(gè)殘基，其中至少一個(gè)氨基酸在所述外顯子3編碼氨基酸殘基之外。所述抗原性肽含有GHRd3的一個(gè)表位，因而產(chǎn)生的抗該肽抗體可與GHRd3形成特異性免疫復(fù)合物。抗體宜選擇性或優(yōu)先與GHRd3結(jié)合而基本上不結(jié)合GHRf1。該抗原肽宜含至少10個(gè)氨基酸殘基，優(yōu)選至少15個(gè)氨基破殘基，甚至更優(yōu)選區(qū)至少20個(gè)氮基酸殘基，最優(yōu)選至少30個(gè)氨基酸殘基。
該抗原性肽的優(yōu)選表位是位于該蛋白表面的區(qū)域，如親水性區(qū)域。
GHRd3免疫原通常用于免疫適當(dāng)?shù)膭?dòng)物(如兔、羊、小鼠或其它動(dòng)物)來制備抗體。合適的免疫原性制品可包括，例如重組表達(dá)的GHRd3蛋白或化學(xué)合成的GHRd3多肽。該制品也可包括佐劑，如弗氏完全或不完全佐劑，或類似的免疫刺激劑。用免疫原性GHRd3制品免疫合適的動(dòng)物可誘導(dǎo)多克隆抗-GHRd3抗體應(yīng)答。
因此，本發(fā)明另一方面涉及抗GHRd3抗體。術(shù)語“抗體”本文用于指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有能特異性結(jié)合抗原如GHRd3，的抗原結(jié)合位點(diǎn)的分子。免疫球蛋白分子的免疫活性部分的例子包括F(ab)和F(ab’)片段，可用酶如胃蛋白酶處理該抗體產(chǎn)生。本發(fā)明提供GHRd3的多克隆和單克隆抗體。術(shù)語“單克隆抗體”或“單克隆抗體組合物”本文用于指只含有能與GHRd3某特定表位起免疫反應(yīng)的一種抗原結(jié)合位點(diǎn)的抗體分子群。一種單克隆抗體組合物因而通常顯示對(duì)與其起免疫反應(yīng)的特定GHRd3蛋白的單一親和力。
本發(fā)明涉及的抗體組合物為多克隆或單克隆，能選擇性結(jié)合含有表位的多肽。該多肽包含SEQ ID NO2和3的連續(xù)跨越的至少6個(gè)氨基酸，優(yōu)選至少8-10個(gè)氨基酸，更優(yōu)選至少12、15、20、25、30、40、50或100個(gè)氨基酸，所述連續(xù)跨越宜包括GHR基因外顯子3所編碼22個(gè)氨基酸以外的至少一個(gè)氨基酸。
可如上述用GHRd3免疫原免疫合適的動(dòng)物制備抗GHRd3多克隆抗體。免疫動(dòng)物中的抗GHRd3抗體滴度可用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，如酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)，采用固定的GHRd3隨時(shí)監(jiān)測(cè)。如需要，可從哺乳動(dòng)物(如血液)中分離并用熟知的技術(shù)，如蛋白A層析法獲得IgG組分進(jìn)一步純化得到抗GHRd3抗體分子。在免疫后的適當(dāng)時(shí)間，如當(dāng)抗-GHRd3抗體滴度最高時(shí)，獲得動(dòng)物的抗體產(chǎn)生細(xì)胞，用標(biāo)準(zhǔn)方法如最初由Kohler和Milstein(1975)Nature.256495-497所述的雜交瘤技術(shù)(也參見Brown等，1981.JImmunol.127539-46；Brown等，1980，J.Biol.Chem.2554980-83；Yeh等，1976.PNAS 762927-31；和Yeh等，1982，Int.J.Cancer.29269-75).最近的人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kozbor等，1983.Immunol Today.472)，EBV-雜交瘤技術(shù)(Cole等，1985，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R Liss Inc.，pp.77-96)或三雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體。產(chǎn)生單克隆抗體雜交瘤的技術(shù)是熟知的(風(fēng)R HKenneth，選自Monoclonal AntibodiesA New Dimension In Biological Analyses，Plenum Publishing Corp.，New York，N.Y.(1980)；E A Lerner.，1981.Yale J BiolMed.，54387-402；M L Gefter等，1977，Somatic Cell Genet.3231-36)。簡(jiǎn)言之，將不死的細(xì)胞系(通常為骨髓瘤)與用上述GHRd3免疫原免疫的哺乳動(dòng)物的淋巴細(xì)胞(通常為脾細(xì)胞)融合，對(duì)得到的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液進(jìn)行篩選。鑒定出能產(chǎn)生結(jié)合GHRd3單克隆抗體的雜交瘤。
可將用于融合淋巴細(xì)胞與不死細(xì)胞系的許多熟知方法之一應(yīng)用于產(chǎn)生抗GHRd3單克隆抗體的目的(見例如G Galfre等，1977.nature.26655052；Gefter等，SomaticCell Genet.，同上；Lerner，Yale J Biol Med，同上；Kenneth，.MonoclonalAntibodies，同上)。然而普通技術(shù)人員會(huì)懂得這類方法的許多變化也是有用的。通常上述的不死細(xì)胞系(如骨髓瘤細(xì)胞系)衍生自與淋巴細(xì)胞相同種類的哺乳動(dòng)物。例如，可用本發(fā)明的免疫原性制品免疫小鼠的淋巴細(xì)胞與不死的小鼠細(xì)胞系融合來制備小鼠雜交瘤。優(yōu)選的不死細(xì)胞系是對(duì)含有次黃嘌呤、氨基喋啶和胸腺嘧啶的培養(yǎng)液(“HAT”培養(yǎng)液)敏感的小鼠雜交瘤細(xì)胞系?？捎米鳂?biāo)準(zhǔn)技術(shù)的融合伙伴的許多骨髓瘤細(xì)胞系例如有P3-NS1/1-Ag4-1，P3-x63-Ag8.653或Sp2/O-Ag14骨髓瘤細(xì)胞系。這些骨髓瘤細(xì)胞系可從AYCC處得到。通常采用聚乙二醇(“PEG”)將HAT-敏感的小鼠骨髓瘤細(xì)胞與小鼠脾細(xì)胞融合，用HAT培養(yǎng)液選擇融合所產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞，該培養(yǎng)液能殺傷未融合的和不能產(chǎn)生融合的骨髓瘤細(xì)胞(未能融合的脾細(xì)胞因未被轉(zhuǎn)化于幾天后死亡)。通過例如用標(biāo)準(zhǔn)的ELISA試驗(yàn)，篩選雜交瘤培養(yǎng)上清液中的能GHRd3的抗體，檢測(cè)能產(chǎn)生本發(fā)明單克隆抗體的雜交瘤。
制備單抗分泌性雜交瘤的另一種方法，通過用GHRd3篩檢組成型重組免疫球蛋白庫(如抗體的噬菌體展示文庫)來分離能結(jié)合GHRd3的免疫球蛋白文庫成員，鑒定抗GHRd3單抗。產(chǎn)生和篩檢噬菌體展示文庫的試劑盒可從市場(chǎng)上購買到(如PharmaciaRecombinant Phage Antibody System，目錄編號(hào)27-9400-01；和Stratagene SurfZAP.TM.Phage Display Kit，目錄編號(hào)240612)。此外，特別適合用于產(chǎn)生和篩檢抗體展示文庫的方法和試劑可在以下文獻(xiàn)中尋找，如Ladner等，美國(guó)專利5,223,409；Kang等，國(guó)際出版物WO 92/18619；Dower等，國(guó)際出版物WO 91/17271；Wintr等，國(guó)際出版物WO 92/20791；Markland等，國(guó)際出版物WO 92/15679；Breitling等，國(guó)際出版物WO 93/01288；McCafferty等，國(guó)際出版物WO 92/01047；Garrard等，國(guó)際出版物WO 92/09690；Ladner等，國(guó)際出版物WO 90/02809；Fucha等，1991.Bio/Technology.91370-1372；Hay等，1992.Hum Antibod Hybridomas.381-85；Husa等，1989.Science.2461275-1281；Griffiths等，1993.ENBO J.12725-734；Hawkins等，1992.JMol Biol.226889-896；Clarkson等，1991.Nature.352624-628；Gram等，1992.Nuc Acid Res.194133-4137；Barbas等，1991.PNAS.887978-7982；和McCafferty等，Nature.1990.348552-554。
可用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)如親和層析或免疫疫沉淀，用抗-GHRd3抗體(如單抗)來分離GHRd3?？笻GRd3抗體可有利于細(xì)胞的天然GHRd3和宿主細(xì)胞表達(dá)重組產(chǎn)生的HGRd3的純化。而且可用抗GHRd3抗體來檢測(cè)細(xì)胞裂解液可細(xì)胞上清液中的GHRd3，以評(píng)價(jià)GHRd3蛋白表達(dá)的豐度和模式。診斷上可利用抗GHRd3抗體來監(jiān)測(cè)組織中的蛋白水平作為臨床測(cè)試程序的一部分，如測(cè)定某給定治療方案的效果。將該抗體結(jié)合(物理性連接)于一可檢測(cè)標(biāo)記物有利于此種檢測(cè)?？蓹z測(cè)標(biāo)記物的例子包括各種酶、互補(bǔ)基團(tuán)、熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)、生物發(fā)光物質(zhì)、和放射活性物質(zhì)。合適的酶例子包括辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、半乳糖苷酶或乙酰膽堿酯酶；合適的互補(bǔ)基團(tuán)復(fù)合物例子包括鏈霉親和素/生物素和親和素/生物素；適合的熒光物質(zhì)的例子包括7-羥基香豆素、熒光素、異硫氰酸熒光素、羅丹明、二氯三嗪胺熒光素、丹磺酰氯或藻紅蛋白；發(fā)光物質(zhì)的例子包括魯米諾；生物發(fā)光物質(zhì)的例子包括熒光素酶、熒光素和水母蛋白；合適的放射活性物質(zhì)的例子包括125I、131I、35S或3H。
在一優(yōu)選實(shí)施例中，獲得基本純的GHRd3蛋白或多肽。例如在Amicon過濾裝置上濃縮來調(diào)節(jié)最終產(chǎn)品中的蛋白質(zhì)濃度至每毫升幾毫克水平。然后可如下制備抗該蛋白的單克隆或多克隆抗體按照Kohler和Milstein(Nature，256495，1975)的經(jīng)典方法或從其衍生的方法(見Harlow等Lane，Antibodies A Laboratory Manual，Cold Spring，Harbor Laboratory，pp.53-242，1988)從小鼠雜交瘤制備針對(duì)GHRd3可其一部分表位的雜交瘤融合產(chǎn)生的單克隆抗體。
簡(jiǎn)言之，給小鼠多次接種幾毫克的GHRd3或其一部分?jǐn)?shù)周時(shí)間。然后處死小鼠分離得到抗體產(chǎn)生細(xì)胞。用聚乙二醇融合脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞，在含氨基喋呤的選擇性培養(yǎng)基(HAT培養(yǎng)基)中培養(yǎng)該系統(tǒng)破壞過量的未融合細(xì)胞。稀釋成功融合的細(xì)胞并將稀釋等份置于微滴板孔中繼續(xù)培養(yǎng)。采用免疫試驗(yàn)如ELISA(最初由EngvallE，Meth Enzymol。70419(1980)報(bào)導(dǎo))檢測(cè)各孔上清液中的抗體來鑒定抗體產(chǎn)生克隆。選出陽性克隆擴(kuò)增，收集它們產(chǎn)生的單克隆抗體應(yīng)用。單克隆抗體生產(chǎn)的詳細(xì)程序見Davis L.等，Basic Methods in Molecular Biology Elsevier，New York.第21-2章中所述。
本發(fā)明的抗體組合物將在名疫印跡或Western印跡分析中有很大用途。這些抗體可用作鑒定固定于固相支持基質(zhì)，如硝纖膜或尼龍膜或其組合上蛋白質(zhì)的高親和力主要試劑。與免疫沉淀法聯(lián)用然后作凝膠電泳中，這些抗體可用作第一步的試劑來檢測(cè)第二試劑針對(duì)的抗原，該抗原可能引起不良背景。與Western印跡相結(jié)合的免疫檢測(cè)方法包括然對(duì)毒性分子的酶標(biāo)記、放射標(biāo)記和熒光標(biāo)記的第二抗體，在關(guān)于這類標(biāo)記的美國(guó)專利3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149和4,366,241中描述了其具體的應(yīng)用，各專利內(nèi)容納入本文作參考。當(dāng)然，如該領(lǐng)域所知，發(fā)現(xiàn)通過采用第二結(jié)合配體，如第二抗體或生物素/親和素配體結(jié)合對(duì)有另外的好處。
GH組合物的給藥本發(fā)明所用的GH可以是天然序列形式，或天然的、合成的或重組來源的變體形式。例子包括具有人的天然序列的天然或重組的人生長(zhǎng)激素(hGH)(GENOTROPINTM、生長(zhǎng)激素或促生長(zhǎng)激素)，和用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)的稱為GH或GH變體的重組生長(zhǎng)激素(rGH)，包括人蛋氨生長(zhǎng)素、生長(zhǎng)激素和促生長(zhǎng)激素。人用時(shí)優(yōu)選其N-末端有或沒有甲硫氨酸的重組的天然序列的成熟人GH。最優(yōu)選重組的人GH多肽GENOTROPINTM(Pharmacia，USA)。也優(yōu)選如1988年6月5日注冊(cè)的美國(guó)專利4,755,465和Goeddael等，Nature.282544(1979)中所述大腸桿菌生產(chǎn)的甲硫?；松L(zhǎng)激素(met-hGH)。銷售產(chǎn)品PROTROPINTM(Genetech Inc.USA)的met-hGH除了存在一個(gè)N-末端甲硫氨酸外，與天然多肽相同。另一例子是銷售產(chǎn)品NUTROPINTM(Genetech Inc.USA)的重組hGH。后面的hGH缺乏此甲硫氨酸殘基，其氨基酸序列與天然激素相同。見Gray等，Biotechnology.2161(1984)。另一GH例子是具有純的促生長(zhǎng)而非泌乳活性的胎盤型hGH變體，見美國(guó)專利4,670,393。也包括GH變體，例如WO 90/04780和WO 92/09690中所述的變體。其它例子包括起GHR拮抗劑作用的GH組合物，如培維索孟(SOMAVERTTM，Pharmacia，USA)，可用于治療肢端肥大癥。
可通過適當(dāng)技術(shù)直接給予受試者GH，包括腸胃道外、鼻內(nèi)、肺內(nèi)、口服或透皮吸收?？删植炕蛉斫o予。腸胃道外給藥的例子包括皮下、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)和腹膜內(nèi)給藥。優(yōu)選每日皮下注射給藥。
治療用的GH的配制和劑量以優(yōu)秀醫(yī)學(xué)實(shí)施(GMP)相一致的方式進(jìn)行，要考慮受試者個(gè)體的臨床情況(特別是單用GH治療時(shí)的副作用)GH組合物遞送的部位、給藥的方法、給藥的時(shí)間表和醫(yī)師知道的其它因素。用于本目的各組分的“有效量”應(yīng)由這些考慮所確定，這個(gè)量應(yīng)能提高受試者的生長(zhǎng)速度。
對(duì)于GH，宜采用約0.2mg/kg/周以上的劑量，更優(yōu)選約0.25mg/kg/周以上的劑量，甚至更優(yōu)選約0.3mg/kg/周以上的劑量。在一實(shí)施方案中，GH的劑量范圍約0.3-1.0mg/kg/，在另一實(shí)施方案中為0.35-1.0mg/kg/周。
GH宜每天皮下一次給予。優(yōu)選方面，GH的劑量范圍約0.001-0.2mg/kg/天，更優(yōu)選GH劑量為0.010-0.10mg/kg/天。
如上所述，預(yù)期GHRd3等位基因純合子或雜合子端正人對(duì)GH治療比GHRf1純合子受試者有更強(qiáng)的陽性反應(yīng)。在優(yōu)選方面，給予GHRf1純合子受試者的劑量將比給予GHRd3純合子或雜合子受試者的更高。
GH適合在特定時(shí)間(如每天一次)以特定劑量的注射形式連續(xù)或不連續(xù)給藥，注射時(shí)GH的血漿濃度升高，然后其血漿濃度下降直到下一次注射。其它不連續(xù)給藥方法是采用可賣到的PLGA微球和許多植入裝置，它們可提供活性成分的不連續(xù)釋放，例如先是暴發(fā)性釋放，然后是活性成分的緩慢釋放，見美國(guó)專利4,767,628。
也可給予GH使其在給藥期間在血液中持續(xù)存在。最好的辦法是通過例如微型泵(如滲透微型泵)連續(xù)灌注，或者采用頻繁注射GH(每天一次以上，如每天二次或三次)適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行。
另一實(shí)施方案中，采用長(zhǎng)效GH劑型給予GH，該劑型可延緩GH從血中清除或?qū)е翯H從注射部位緩慢釋放。延長(zhǎng)GH血漿清除率的長(zhǎng)效劑型可以是GH復(fù)合物形式，或?qū)⑵涔矁r(jià)偶聯(lián)于(通過可逆性或不可逆性結(jié)合)大分子，如其一種或多種結(jié)合蛋白質(zhì)(WO 92/08985)或選自PEG和聚乙二醇單聚體和聚氧乙烯聚醇的水溶性聚合物，即可在室溫溶于水的聚合物?；蛘呖蓪H與能提高其循環(huán)半衰期的聚合物復(fù)合或結(jié)合?？捎糜诖四康牡木垡蚁┐己途垩跻蚁┐嫉睦影ň垩跻蚁└视?、聚乙二醇、聚氧乙烯山梨醇、聚氧乙烯葡萄糖等。聚氧乙烯甘油的甘油骨架與動(dòng)物和人類中的單、雙和三甘油脂骨架相同。不需要特定分子量的該聚合物，但優(yōu)選分子量在約3500-100000之間，更優(yōu)選在5000-40000之間。優(yōu)選PEG單體是不取代的，但也可在一端被烷基取代。優(yōu)選該烷基是C1-C4烷基，最優(yōu)選甲基。該聚合物最優(yōu)選未取代的PEG單體、單甲基取代的PEG單體(mPEG)或分子量約5000-40000的聚氧乙烯甘油(POG)。
通過GH的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基將GH與該聚合物的末端反應(yīng)基團(tuán)共價(jià)結(jié)合，主要取決于反應(yīng)條件、聚合物的分子量等。本文設(shè)計(jì)的帶有反應(yīng)基團(tuán)的聚合物是為活化的聚合物。該反應(yīng)基團(tuán)可選擇性地與GH上的氨基或其它反應(yīng)基反應(yīng)。然而，將會(huì)理解要獲得最佳結(jié)果，所選反應(yīng)基團(tuán)的類型和數(shù)量，及所用聚合物的類型將取決于所用的具體GH，以避免該反應(yīng)基團(tuán)與GH上過多的具體活性基團(tuán)反應(yīng)。因?yàn)檫@不可能完全避免，通常根據(jù)蛋白質(zhì)濃度推薦每分子活化聚合物約0.1-1000，優(yōu)選2-200個(gè)分子的蛋白質(zhì)。每分子活化聚合物的蛋白質(zhì)最終量是能維持該蛋白質(zhì)最佳活性，同時(shí)如果可能最佳的循環(huán)半衰期平衡的量。
雖然所述殘基可以是該蛋白質(zhì)上的任何反應(yīng)性氨基酸，如一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸或N-端氨基酸，但優(yōu)選的反應(yīng)性氨基酸是可通過其游離的ε氨基連接于活化聚合物反應(yīng)基團(tuán)的賴氨酸，或可通過酰胺鍵連接該聚合物的谷氨酸或天冬氨酸。
可采用常用的能使生物活性物質(zhì)與橢性聚合物反應(yīng)的任何適當(dāng)方法，進(jìn)行共價(jià)修飾，如果GH上的反應(yīng)基團(tuán)是賴氨酸，宜在約pH5-9。更宜在pH7-9時(shí)進(jìn)行。通常，該過程包括制備活化的聚合物(含至少一個(gè)末端羥基)，制備該聚合物的活性底物，和使GH與該活性底物反應(yīng)以產(chǎn)生配方所適合的GH。上述修飾反應(yīng)可用幾種方法進(jìn)行，包括一個(gè)或多個(gè)步驟?？捎糜谠谝徊椒磻?yīng)中產(chǎn)生活化聚合物的修飾試劑的例子包括氰尿酸氯(2，4，6-三氯-S-三嗪)和氰尿酸氟。
在一實(shí)施方案中，該修飾反應(yīng)分二步進(jìn)行，其中該聚合物先與酸酐如琥珀酸酐或戊酸酐反應(yīng)，形成羧酸，然后羧酸與一化合物反應(yīng)，該化合物能與該羧酸反應(yīng)形成帶活性酯基團(tuán)能與GH反應(yīng)的活化聚合物。這類化合物的例子包括N-羥基琥珀酰亞胺或4-羥基-3-硝基苯磺酸等。優(yōu)選采用N-羥基琥珀酰亞胺或4-羥基-3-硝基苯磺酸。例如，單甲基取代的PEG可在溫度升高時(shí)反應(yīng)，優(yōu)選在約100-110℃與戊酸酐反應(yīng)4小時(shí)。然后在存在碳三亞胺試劑如二環(huán)已基或異丙基碳二亞胺時(shí)使產(chǎn)生的單甲基PEG戊酸與N-羥基琥珀酰亞胺反應(yīng)，產(chǎn)生活化的聚合物甲氧基聚乙二醇-N-琥珀酰亞胺戊二酸酯，其然后能與GH反應(yīng)。此方法在Abuchowski等，Cancer Biochem Biophys.7175-186.1984中有詳細(xì)說明。另一例子，該單甲基取代的PEG可與戊酸酐反應(yīng)，存在二環(huán)己基碳二亞胺時(shí)再與4-羥基-3-硝基苯磺酸(HNSA)反應(yīng)，產(chǎn)生活化的聚合物。在Bhatnagar等，PeptidesSyethese-Structure-Function，Proccedings of rheSeventh American Peptide Symposium，Rich等編(Pierce Chemical Co.，Rockford，III，1981)，p.97-100和Nitecki等，High-Technology Route to Virus Vaccines(American Society For Microbiology1986)，題為“Novel Agent for CouplingSynthetic Peptides to Carriers and Its Applications”中描述了HNSA。
產(chǎn)生偶聯(lián)PEG的GH的具體方法包括關(guān)于PEG-GH的美國(guó)專利4,179,337和美國(guó)專利4,93,465中描述的方法，它們說明了PEG能可逆地但共價(jià)地連接GH。
GH也適合通過緩釋系統(tǒng)給藥。本文可用的緩釋組合物的例子包括成形物體形式的半透過聚合物基質(zhì)，如膜或微球。緩釋基質(zhì)包括聚交酯(美國(guó)專利3,773,919，歐洲專利58,481)、L-谷氨酸和L-谷氨酸-γ-乙酯的共聚物(Sidnab等，Biopolymers，22547-556，1983)、聚(2-羥乙基甲基丙烯酸酯)(Langer等，J.Biomed Mater Res，15167-277.1981；Langer，Chem Tech，1298-105，1982)、醋酸乙烯乙酯(Langer等，同上)或聚-D-(-)-3-羥基丁酸(EP133,988)、或PLGA微球。
緩釋GH組合物也包括脂質(zhì)體包裹的GH。含GH的化質(zhì)體可用以下文獻(xiàn)所述方法制備DE3，218，121；Epstein等，Proc Natl Acad Sci USA.823688-3692，1985；Hwang等，Proc Natl Acad Sci USA.774031-4034，1980；EP52,322；EP36,676；EP88,046；EP142,949；EP142,641；日本專利申請(qǐng)83-118008；專利美國(guó)專利4,485,045和4,544,545及EP102,324。通常脂質(zhì)體是小單室型(約200-800埃)肥質(zhì)體，其脂質(zhì)成分大于約30mol百分比的脂固醇，最佳治療時(shí)需調(diào)節(jié)所選擇的比例。此外，可從共價(jià)連接于活化多糖的GH加合物制備生物活性緩釋制劑，見美國(guó)專利4,857,505中所述。另外，美國(guó)專利4,837,381描述了一種緩釋用的含脂肪或蠟質(zhì)或它們的混合物與GH的微球組合物。
在另一實(shí)施方案中，以上鑒定的受試者也用有效量的IGF-I治療。作為通用比例，腸胃道外給藥的IGF-I總的藥學(xué)有效量，每日劑量范圍是受試者體重約50-240微克/公斤/天，優(yōu)選100-200微克/公斤/天，雖然如上所述，這個(gè)劑量還要考慮許多治療情況。IGF-I也宜每天給藥1或2次，皮下注射。在另一實(shí)施方案中，IGF-I和GH可以各自的有效量，或聯(lián)用時(shí)以有效的亞適劑量一起給予受試者。優(yōu)選約0.001-0.2毫克/公斤/天，或更優(yōu)選0.01-0.1毫克/公斤/天給予GH。IGF-I和GH二者宜注射給藥，采用靜脈內(nèi)或皮下注射。更優(yōu)選IGF-I和GH二者皮下注射給藥，最優(yōu)選每天注射。
醫(yī)師在設(shè)計(jì)IGF-I和GH二者的劑量時(shí)應(yīng)注意考慮已知的這些激素治療的副作用。對(duì)于GH，副作用包括鈉滯留和細(xì)胞外間隙的膨脹(Ikkos等，ActaEndocrinol.(Copenhagen)，32341-361，1959；Biglieri等，J Clin EndocrinolMetab，21361-370.1961)及高胰島素血癥和高血糖。IGF-I的主要副作用表現(xiàn)為低血糖(Guler等，Proc Natl Acad Sci USA.862868-2872.1989)。事實(shí)上，IGF-I和GH聯(lián)用可導(dǎo)致此二試劑不良副作用(如IGF-I引起的低血糖和GH引起的高胰島素血癥)的減少。
對(duì)于腸胃道外給藥，在一實(shí)施方案中，通常將所需純度的GH與藥學(xué)上可接受的載體(即對(duì)接受者無毒性、所用劑量和濃度與該制劑的其它成分相容)相混合來制備GH。例如，該制劑不宜包含已知可能損害多肽的氧化劑和其它化合物。通常使GH接觸運(yùn)載的液體或細(xì)分的固體載體或二者來制備此制劑。如果需要，可將產(chǎn)品制成所需制劑的形狀。載體宜為腸胃道外運(yùn)載仃，更優(yōu)選運(yùn)載液體與接受者血液等到滲。這類載體的例子包括水、鹽水、林格氏液和葡聚糖液。非水性載體如固定油和油酸乙酯及脂質(zhì)體也可用。
該載體宜含有微量添加劑，如能提高滲透性和化學(xué)穩(wěn)定性的物質(zhì)。這類物質(zhì)在所用的劑量和濃度時(shí)應(yīng)對(duì)接受者無毒性，包括緩沖劑，如磷酸、檸檬酸、琥珀酸、醋酸和其它有機(jī)酸或它們的鹽；抗氧化劑如抗壞血酸；低分子量(如不到10個(gè)殘基)多肽如聚精氨酸或三肽；蛋白質(zhì)如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸或精氨酸；單糖、二糖的其它碳水化合物，包括纖維素及其衍生物、葡萄糖、甘露糖和葡聚糖；螯合劑如EDTA；糖醇如甘露醇或山梨醇；抗衡離子如鈉；和/或非離子表面活性劑如聚山梨醇酯、波洛沙姆或PEG。
GH通常單獨(dú)配制在這類載體中，濃度約0.1-100mg/ml，優(yōu)選1-10mg/ml，pH約4.5-8。GH的pH宜為7.4-7.8。將會(huì)理解，采用上述賦形劑、載體或穩(wěn)定劑可導(dǎo)致形成GH的鹽。
雖然可用任何合適的方法配制GH，但優(yōu)選的GH制劑如下對(duì)于優(yōu)選的hGH(GENOTROPINTM)，含重組促生長(zhǎng)激素0.2mg、0.4mg、0.6mg、0.8mg、1.0mg、1.2mg、1.4mg、1.6mg、1.8mg或2.0mg的單劑量針筒。所述GENOTROPINTM針筒也含有0.21mg甘油、12.5mg甘露醇、0.045mg單三磷酸(monoatriumphosphate)、0.025mg磷酸氫二鈉和水加到0.25ml。
對(duì)于met-GH(PROTROPINTM)，預(yù)先凍干的溶液含2.0mg/ml的GH、18.0mg/ml甘露醇、0.14mg/ml磷酸鈉和1.6mg/ml磷酸鈉(一價(jià)一水合物)，pH7.8。wet-GH的5mg小瓶裝有5mg met-GH、40mg甘露醇、和1.7mg總磷酸鈉(干重，無水氫二鈉)pH7.8。10-mg小瓶裝有10mg wet-GH、80mg甘露醇和3.4mg總磷酸鈉(干重，無水氫二鈉)，pH7.8。
對(duì)于metless-GH(NUTROPINTM)，預(yù)先凍干的溶液含2.0mg/ml的GH、18.0mg/ml甘露醇、0.68mg/ml甘氨酸、0.45mg/ml磷酸鈉和1.3mg/ml的磷酸二氫鈉一水，pH7.4。5mg小瓶裝有5mg GH、45mg甘露醇、1.7mg/ml甘氨酸和1.7mg總磷酸鈉(干重，無水氫二鈉)pH7.4。10-mg小瓶裝有10mg GH、90mg甘露醇、3.4mg/ml甘氨酸和3.4mg總磷酸鈉(干重，無水氫二鈉)。
或者，可采用NUTROPINTMhGH的液體制劑，例如5.0±0.5mg/ml rhGH、8.8±0.9mg/ml的氯化鈉、2.0±0.2mg/ml的聚山梨醇酯20、2.5±0.3mg/ml的苯酚、2.68±0.3mg/ml的檸檬酸鈉二水、和0.17±0.02mg/ml的無水檸檬酸(總的無水檸檬酸鈉/檸檬酸是2.5mg/ml或10mM)、pH6.0±0.3。此制劑適合放在10-mg小瓶中，該小瓶在3-cc玻璃瓶中可裝2.0ml上述制劑?；蛘?，可將含上述制劑的10-mg(2.0ml)針芯裝在注射筆中，給受試者注射液體GH。
用于治療給藥的GH組合物應(yīng)是除菌的。通過無菌過濾膜(如0.2微米孔膜)過濾不難進(jìn)行除菌。治療性GH組合物一般裝在具有無菌出入口的容器中，例如靜脈輸液袋，或具有皮下注射針頭瓶塞的小瓶。
GH通常貯存在單劑或多劑容器中，例如密封的安瓿或小瓶中，為水溶液或可重建的凍干制劑。作為凍干制劑的例子，將小瓶裝上無菌過濾的GH水溶液(w/v)，然后凍干所產(chǎn)生的混合物。用除菌注射用水重建凍干的GH制成灌注液。
試劑篩選試驗(yàn)攜帶GHRd3等位基因的個(gè)體，現(xiàn)GHRf1等位基因純合子個(gè)體相比，對(duì)通過GHR通路起作用的試劑治療陽性反應(yīng)強(qiáng)度提高這一發(fā)現(xiàn)，提供了可用于評(píng)價(jià)通過GHR通路起作用的治療試劑的試驗(yàn)方法。例如，基于GHRd3的篩檢試驗(yàn)中，對(duì)GHR活性或GHRd3的能力評(píng)估，可用于鑒定治療表達(dá)GHRd3等位基因個(gè)體最有用的試劑。如以下進(jìn)一步描述，可測(cè)試的試劑包括可用來治療該病的試劑，如GH組合物，包括生長(zhǎng)激素或促生長(zhǎng)激素，優(yōu)選GENOTROPINTM或PROTROPINTM、NUTROPINTM或培維索孟，優(yōu)選SOMAVERTTM或尚不知可用于治療該病的試劑。
一方面，本發(fā)明提供細(xì)胞為基礎(chǔ)的試驗(yàn)，在此試驗(yàn)中，使GHRd3蛋白或其生物活性部分與測(cè)試化合物接觸，測(cè)定該測(cè)試化合物調(diào)節(jié)GHR活性的能力。可通過監(jiān)測(cè)GHR多肽的活性進(jìn)行測(cè)試化合物調(diào)節(jié)(刺激或抑制)GHR活性的測(cè)定。檢測(cè)GHR的活性包括評(píng)估適當(dāng)?shù)目蓹z測(cè)活性，包括例如測(cè)試化合物所誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖、GHR的內(nèi)化和/或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，見以下所述。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供鑒定候選GH調(diào)節(jié)劑(激動(dòng)劑或拮抗劑)的方法，所述方法包括a)提供含有GHRd3多肽的細(xì)胞；b)使所述細(xì)胞與測(cè)試化合物接觸；和c)測(cè)定所述化合物是否選擇性激活或抑制了GHR的活性。在一實(shí)施方案中，該方法包括a)提供一種人細(xì)胞(優(yōu)選293細(xì)胞)；b)在所述細(xì)胞中導(dǎo)入含GHRd3多肽編碼核酸序列的載體；和c)使所述細(xì)胞與測(cè)試化合物接觸；和d)檢測(cè)GHR活性。檢測(cè)到所述化合物能抑制GHR活性，表明所述化合物是候選的GHRd3抑制劑。檢測(cè)到所述化合物能激發(fā)GHR活性，表明所述化合物是候選的GHRd3激動(dòng)劑。在另一實(shí)施例中，該方法包括a)提供非洲爪蟾卵母細(xì)胞；b)在所述卵母細(xì)胞中導(dǎo)入GHRd3cRNA；c)使所述卵母細(xì)胞接觸某測(cè)試化合物；和d)檢測(cè)所述卵細(xì)胞中的GHR活性。檢測(cè)到所述化合物能激發(fā)GHR活性，表明所述化合物是候選的GHRd3激動(dòng)劑。檢測(cè)到所述化合物能抑制GHR活性，表明所述化合物是候選的GHRd3拮抗劑。在本文GHRd3/f1異二聚體有關(guān)內(nèi)容中還詳細(xì)說明了篩選試驗(yàn)。
GHRd3/GHRf1異二聚體評(píng)估GHRd3/f1異二聚體活性的方法如上所述，本發(fā)明提供的GHRd3多肽可以是天然存在的與GHRf1多肽形成的異二聚體。因此本發(fā)明提供評(píng)估GHRd3多肽活性的方法。在優(yōu)選方面，本發(fā)明包括檢測(cè)含有GHRd3多肽和GHRf1多肽的多肽復(fù)合物的活性。本發(fā)明為此提供評(píng)估含有GHRd3多肽和GHRf1多肽的多肽復(fù)合物活性的方法。優(yōu)選該復(fù)合物是含有GHRd3多肽、GHRf1多肽和GH多肽的復(fù)合物。
本發(fā)明還提供檢測(cè)GHRd3核苷酸序列功能性變體活性或獲得它們的方法，包括提供GHRd3核酸變體或修飾物，及評(píng)估它們所編碼的多肽是否顯示了GHR活性的方法。評(píng)估GHRd3多肽功能的這類方法包括a)提供GHRd3多肽和GHRf1多肽；和b)評(píng)估GHR活性?？刹捎萌魏魏线m的形式，包括無細(xì)胞(如以膜為基礎(chǔ))、基于細(xì)胞和體內(nèi)試驗(yàn)形式。例如所述試驗(yàn)可包括在某宿主細(xì)胞中表達(dá)GHRd3和GHRf1核酸，和觀察所述細(xì)胞中的GHR活性。在另一實(shí)施例中，將GHRd3和GHRF1多肽導(dǎo)入某細(xì)胞中并觀察GHR活性。在另一實(shí)施例中，將GHRd3多肽導(dǎo)入表達(dá)GHRF1多肽的某細(xì)胞中并觀察GHR活性。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，檢測(cè)GHR活性可包括檢測(cè)GHR蛋白進(jìn)而調(diào)節(jié)某下游因子(如GHR-介導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路組分)活性的能力。例如可測(cè)定該效應(yīng)分子對(duì)適當(dāng)靶物質(zhì)的活性，或如上所述可測(cè)定該效應(yīng)分子與某適當(dāng)靶物質(zhì)的結(jié)合。優(yōu)選評(píng)估jak-2/Stat-5信號(hào)傳遞。在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，檢測(cè)GHR活性還可包括評(píng)估任何適當(dāng)?shù)目蓹z測(cè)活性，包括GHR配體誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖、GHR與GHR配體的結(jié)合、GHR和/或配體的內(nèi)化。最優(yōu)選所述GHR配體是GH多肽。這些方法可測(cè)定由GHRd3和GHRf1多肽所組成的GHR異質(zhì)雙體的活性。
評(píng)估GHRd3活性的方法可用于特征鑒定修飾的GHRd3多肽。例如，可特征鑒定在必須或非必須氨基酸殘基上含突變的GHRd3多肽。可在GHRd3的序列中制造導(dǎo)致“非必須氨基酸殘基”中氨基酸取代的核苷酸取代。“非必須”氨基酸殘基是野生型GHRd3多肽序列中發(fā)生改變但不改變其生物活性的殘基。而“必須”氨基酸殘基是生物活性所需要的殘基。例如本發(fā)明GHRd3蛋白中保守的氨基酸殘基預(yù)計(jì)不能忍受這種改變。此外，其它保守性殘基可以是本發(fā)明GHRd3蛋白中保守的氨基酸。其它實(shí)施例中，人群中可能存在GHRd3序列的天然等位基因變體，可在GHRd3核酸的核苷酸序列中導(dǎo)入突變引起變化。從而導(dǎo)致編碼的GHRd3蛋白質(zhì)氨基酸序列的變化，而不改變GHRd3蛋白的功能活性。
藥物篩選試驗(yàn)本發(fā)明提供鑒定和/或評(píng)估GHR激動(dòng)劑和拮抗劑，即能通過GHR通路起作用的候選藥物或測(cè)試化合物或藥物(如優(yōu)選多肽，但也可以是肽、擬肽、小分子功其它藥物)的方法。GHR激動(dòng)劑和拮抗劑宜為能結(jié)合GHRd3和GHRf1蛋白的化合物，從而可形成含有GHRd3多肽、GHRf1多肽和所述化合物的復(fù)合物。試驗(yàn)可以是細(xì)胞或非細(xì)胞試驗(yàn)。優(yōu)選的非細(xì)胞試驗(yàn)是膜試驗(yàn)。這些試驗(yàn)本文中也指“篩選試驗(yàn)”。篩選試驗(yàn)可以是結(jié)合試驗(yàn)，或基于已知的合適的GHR活性試驗(yàn)的其它功能性試驗(yàn)。
一方面，在細(xì)胞試驗(yàn)中，使表達(dá)GHRd3蛋白和GHRf1蛋白，或它們的生物活性部分的細(xì)胞接觸測(cè)試化合物，測(cè)定該測(cè)試化合物調(diào)節(jié)GHR活性的能力?？赏ㄟ^監(jiān)測(cè)GHR多肽(如含有GHRd3和GHRf1蛋白的GHR多肽復(fù)合物)的活性，來測(cè)定測(cè)試化合物調(diào)節(jié)(如激活或抑制)GHR活性的能力。檢測(cè)GHR活性可包括評(píng)估任何可適當(dāng)檢測(cè)的活性，如包括測(cè)試化合物誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖、GHR的內(nèi)化和/或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供鑒定GHR候選調(diào)節(jié)劑(如激動(dòng)劑或拮抗劑)的方法，所述方法包括a)提供含有GHRd3和GHRf1多肽的細(xì)胞；b)使所述細(xì)胞與測(cè)試化合物接觸；和c)測(cè)定所述化合物是否選擇性激活或抑制了GHR的活性。在一實(shí)施方案中，該方法包括a)提供一種人細(xì)胞(優(yōu)選293細(xì)胞)；b)在所述細(xì)胞中導(dǎo)入含GHRd3多肽編碼核酸序列的載體，并任選導(dǎo)入含編碼GHRf1多肽核酸序列的載體；和c)使所述細(xì)胞與測(cè)試化合物接觸；和d)檢測(cè)GHR活性。檢測(cè)到所述化合物能抑制GHR活性，表明所述化合物是候選的GHRd3/GHRf1異質(zhì)雙體抑制劑。檢測(cè)到所述化合物能激發(fā)GHR活性，表明所述化合物是候選的GHRd3/GHRf1異質(zhì)雙體激動(dòng)劑。在另一實(shí)施例中，該方法包括a)提供非洲爪蟾卵母細(xì)胞；b)在所述卵母細(xì)胞中導(dǎo)入GHRd3cRNA和任選的GHRf1 cRNA；c)使所述卵母細(xì)胞接觸某測(cè)試化合物；和d)檢測(cè)所述卵母細(xì)胞中的GHR活性。檢測(cè)到所述化合物能激發(fā)GHR活性，表明所述化合物是候選的GHRd3/GHRf1異質(zhì)雙體激動(dòng)劑。檢測(cè)到所述化合物能抑制GHR活性，表明所述化合物是候選的GHRd3/GHRf1異質(zhì)雙體拮抗劑。
檢測(cè)GHR活性可包括評(píng)估任何合適的可檢測(cè)活性，包括細(xì)胞增殖、GHR與GHR配體(如GH多肽)的結(jié)合、GHR和/或GHR配體的內(nèi)化、和/或GHR介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。
在293細(xì)胞內(nèi)GHR介導(dǎo)的jak2-Stat5信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的GHR功能試驗(yàn)例子見Maarnra等，1999.J.Biol.Chem.27414791-14798，中所述，其內(nèi)容納入本文作參考。在非洲爪蟾卵母細(xì)胞中的GHR功能試驗(yàn)例子見Urbanek等，1993，J.Biol.Chem.268(25)19025-19032中所述，其內(nèi)容納入本文作參考。產(chǎn)生cDNA模板、體外轉(zhuǎn)錄和翻譯、卵母細(xì)胞注射、注射的mRNA穩(wěn)定性的分析、測(cè)定GH與GHR的結(jié)合和受體內(nèi)化分析的方法，基本上可按Urbanek等(1993)中所述進(jìn)行。
在另一優(yōu)選方面，一種試驗(yàn)是細(xì)胞結(jié)合試驗(yàn)，其中，使表達(dá)GHRd3蛋白和GHRf1蛋白或它們生物活性部分的細(xì)胞與測(cè)試化合物接觸，檢測(cè)該測(cè)試化合物結(jié)合GHR多肽的能力。另一方面，一種試驗(yàn)是非細(xì)胞結(jié)合試驗(yàn)，其中，使含有GHRd3蛋白和GHRf1蛋白或它們生物活性部分的膜與測(cè)試化合物接觸，檢測(cè)該測(cè)試化合物結(jié)合GHR多肽的能力?？捎靡阎椒y(cè)定測(cè)試化合物結(jié)合GHR(如GHRd3或GHRf1)多肽的能力。
結(jié)合試驗(yàn)例如，可包括a)提供含有GHRd3和GHRf1多肽的細(xì)胞；b)使所述細(xì)胞與測(cè)試化合物接觸；和c)測(cè)定所述化合物是否選擇性結(jié)合了GHR多肽。在一實(shí)施方案中，該方法包括a)提供一種人細(xì)胞(優(yōu)選293細(xì)胞)；b)在所述細(xì)胞中導(dǎo)入含GHRd3多肽編碼核酸序列的載體，并任選導(dǎo)入含編碼GHRf1多肽核酸序列的載體；和c)使所述細(xì)胞與測(cè)試化合物接觸；和d)檢測(cè)所述化合物是否選擇性結(jié)合了GHR多肽。檢測(cè)到所述化合物結(jié)合了GHR多肽，表明所述化合物是候選的GHRd3/GHRf1異質(zhì)雙體調(diào)節(jié)劑。在另一實(shí)施例中，該方法包括a)提供非洲爪蟾卵母細(xì)胞；b)在所述卵母細(xì)胞中導(dǎo)入GHRd3cRNA和任選的GHRf1 cRNA；c)使所述卵母細(xì)胞接觸某測(cè)試化合物；和d)檢測(cè)所述所述化合物是否選擇性結(jié)合了GHR多肽。檢測(cè)到所述化合物能結(jié)合GHR多肽，表明所述化合物是候選的GHRd3/GHRf1異質(zhì)雙體激動(dòng)劑。
基于293細(xì)胞的GHR結(jié)合試驗(yàn)的例子見Ross等，2001.J Clin Endocrinol Metabol.86(4)1716-1723中所述，其內(nèi)容納入本文作參考。
用于上述試驗(yàn)的細(xì)胞優(yōu)選能表達(dá)GHRf1多肽的293細(xì)胞。表達(dá)GHR的293細(xì)胞見Maarnra等，1999，J.Biol.Chem.27414791-14798，中所述，其內(nèi)容納入本文作參考。
這些試驗(yàn)對(duì)測(cè)定GH多肽或其片段或變體特別有用。特別優(yōu)選的是經(jīng)修飾，例如通過連接聚乙二醇分子而具有較長(zhǎng)血循環(huán)時(shí)間的GH多肽。其它實(shí)施方案中，GH多肽可以是GHR拮抗劑，如能結(jié)合GHR蛋白(如優(yōu)選能形成含GHRd3和GHRf1蛋白的復(fù)合物)但不激發(fā)GHR活性的GH多肽。
在其它實(shí)施方案中，該試驗(yàn)包括使表達(dá)GHRd3蛋白和GHRf1蛋白或它們生物活性部分的細(xì)胞與GHR配體接觸形成試驗(yàn)混合物，使該試驗(yàn)混合物與測(cè)試化合物接觸，檢測(cè)GHR活性。該方法宜包括測(cè)試化合物激發(fā)或抑制GHR蛋白(如含GHRd3和GHRf1蛋白或它們生物活性部分的的GHR雙體)活性的能力，其中測(cè)定測(cè)試化合物抑制GHR蛋白活性的能力，包括測(cè)定該測(cè)試化合物抑制GHRd3和GHRF1表達(dá)細(xì)胞生物活性的能力(如測(cè)定測(cè)試化合物抑制信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)或蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互反應(yīng)的能力)。
測(cè)定GHR蛋白結(jié)合或與GHR配體相互反應(yīng)的能力，或上述測(cè)定直接結(jié)合的方法之一進(jìn)行。其它實(shí)施方案中，測(cè)定GHRd3蛋白或含GHRd3蛋白的復(fù)合物結(jié)合或與GHR配體分子相互反應(yīng)的能力，可通過檢測(cè)其誘導(dǎo)的靶細(xì)胞第二信使(即胞內(nèi)Ca2+、二酰甘油、IP3等)、檢測(cè)對(duì)相應(yīng)底物的催化/酶促活性、檢測(cè)誘導(dǎo)的報(bào)告基因(包括操作性連接編碼某可檢測(cè)標(biāo)記如熒光素酶的反應(yīng)性調(diào)節(jié)元件)、或檢測(cè)GHR調(diào)節(jié)的細(xì)胞應(yīng)答，如信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)或蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互反應(yīng)。
另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的試驗(yàn)是無細(xì)胞試驗(yàn)，其中GHRd3蛋和GHRf1蛋白或它們的生物活性部分提供在一種膜上，使GHR蛋白或該膜接觸測(cè)試化合物，測(cè)定測(cè)試化合物結(jié)合GHR蛋白(如GHRd3和/或GHRf1蛋白)或它們生物活性部分的能力。可如上所述直接或間接測(cè)定測(cè)試化合物與GHRd3蛋白的結(jié)合。在優(yōu)選實(shí)施方案中，該試驗(yàn)包括使GHR蛋白(如GHR異質(zhì)雙體)或其生物活性部分與某已知化合物，如能結(jié)合GHR的GH多肽接觸，形成試驗(yàn)混合物，使該試驗(yàn)混合物與某測(cè)試化合物接觸，測(cè)定該測(cè)試化合物GHR蛋白相互反應(yīng)的能力，其中，測(cè)定該測(cè)試化合物與GHR異質(zhì)雙體相互反應(yīng)的能力，包括測(cè)定該測(cè)試化合物與該已知化合物相比，優(yōu)先結(jié)合GHR蛋白或其生物活性部分的能力。
在另一實(shí)施方案中，所述試驗(yàn)無細(xì)胞試驗(yàn)，其中GHRd3蛋和GHRf1蛋白或它們的生物活性部分提供在一種膜上，使GHR多肽或該膜接觸測(cè)試化合物，測(cè)定測(cè)試化合物調(diào)節(jié)(如激發(fā)或抑制)GHR蛋白或它們生物活性部分活性的能力。測(cè)定該測(cè)試化合物調(diào)節(jié)GHR活性的能力，可例如通過評(píng)估任何合適的可檢測(cè)活性，包括細(xì)胞增殖、GHR與GHR配體(如GH多肽)的結(jié)合、GHR和/或GHR配體的內(nèi)化、和/或GHR介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)來檢測(cè)。
也可通過例如將某測(cè)試化合物，如GH蛋白分子或其一部分或衍生物與放射性同位素或酶標(biāo)記物偶聯(lián)，不檢測(cè)測(cè)試化合物抑制GHR活性的能力，這樣GH分子結(jié)合GHR異質(zhì)雙體可通過檢測(cè)復(fù)合物中標(biāo)記的GH蛋白或其生物活生部分來測(cè)定。例如可用125I、35S、14C或3H直接或間接標(biāo)記化合物(如GH蛋白或其生物活性部分)，通過直接計(jì)數(shù)放射發(fā)散光或液閃計(jì)數(shù)檢測(cè)放射性同位?；蛘?，可用例如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶或熒光素酶標(biāo)記化合物，通過檢測(cè)相應(yīng)底物轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物來測(cè)定酶標(biāo)記。
本發(fā)明的范圍還包括測(cè)定化合物(如GH蛋白或其一部分或片段)與GHR多肽(如GHRd3/GHRf1異質(zhì)雙體)的相互反應(yīng)而不標(biāo)記任何中間產(chǎn)物(interactant)。例如，可利用微觀物理學(xué)計(jì)量?jī)x(microphysiometer)來檢測(cè)某化合物與其本著靶分子的相互反應(yīng)而無須標(biāo)記該化合物或該受體(McConnll，H.M.等，1992，Science.2571906-1912)。微觀物理學(xué)計(jì)量?jī)x如細(xì)胞傳感器是一種采用光可尋址電位傳感器(LAPS)的分析儀器，能測(cè)量細(xì)胞酸化其周圍環(huán)境的速率。這種酸化速率的變化可作為化合物和受體之間相互反應(yīng)的指標(biāo)。
測(cè)定GHR蛋白結(jié)合GHR配體或測(cè)試化合物的能力，也可用實(shí)時(shí)生物分子相互反應(yīng)分析(BIA)技術(shù)來測(cè)定(Sjolander，S.等，Uebaniczky C.，1991.Anal Chem.632338-2345和Szabo等，1995.Curr Opin Struct Biol.5699-705)。如本文所用“BIA”是實(shí)時(shí)研究生物特異性相互反應(yīng)的一種技術(shù)，無須標(biāo)記任何反應(yīng)中間物(如BIAcore)?？衫帽砻尜|(zhì)子共振(SPR)光學(xué)現(xiàn)象的變化作為生物分子之間實(shí)時(shí)反應(yīng)的指標(biāo)。
測(cè)試化合物‘候選的’或“測(cè)試的”化合物或“試劑”(如測(cè)試的GHR激動(dòng)劑和拮抗劑)可以是任何適當(dāng)形式，包括多肽、肽、擬肽、小分子和其它試劑。所述化合物功試劑包括那些已知可用于治療疾病的試劑，或尚不知可用于治療疾病的試劑。
在一優(yōu)選實(shí)施方案中，測(cè)試化合物是GH多肽。優(yōu)選的GH可以是天然序列或變體形式，可得自任何來源天然的、合成的或重組的。例子包括含人天然序列的天然或重組的人生長(zhǎng)激素(hGH)和用重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的任何GH或GH變體的重組生長(zhǎng)激素(rGH)。一方面，該GH應(yīng)能激活GHR受體，例子包括生長(zhǎng)激素或促生長(zhǎng)激素，優(yōu)選GENOTROPINTM或PROTROPINTM、NUTROPINTM。
另一方面，GH多肽是能起GHR拮抗劑作用的GH變體。GHR拮抗劑是一類能結(jié)合GHR多肽而阻抑GHR功能的試劑。GHR拮抗劑的一個(gè)例子見Ross等，2001.J ClinEndocrinol Metabol.86(4)1716-1723中所述。Ross等公開的此種GHR拮抗劑稱為B2036-PEG，是一種PEG化的GH變體，含有的1位突變提高了GHR結(jié)合能力，而2位突變阻斷了GHRd3/GHRf1異質(zhì)雙體受體的二聚化。優(yōu)選的GHR拮抗劑或抑制劑是PEG化生長(zhǎng)激素(培維索孟)，優(yōu)選SOMAVERTTM。GHR拮抗劑可用于治療肢端肥大癥，一種常因腦垂體腺瘤過量分泌GH所致的疾病。
本發(fā)明的測(cè)試化合物可用本領(lǐng)域已知的組合文庫方法中的許多辦法之一獲得，包括生物文庫、分選可尋址平行固相或液相文庫、需要去卷積的合成文庫方法、一珠一化合物文庫方法、和采用親和層析選擇的合成文庫方法。采用肽文庫的生物文庫方法，雖然其它4種方法也可應(yīng)用于肽、非肽寡聚物可小分子化合物文庫(Lam KS.1997.Anticancer Drug Des，12145)。
合成分子文庫方法的例子可在以下文獻(xiàn)中找到例如DeWitt等，.1993.Proc NatlAcad Sci USA.906909；Erb等，1994.Proc Natl Acad Sci USA.9111422；Zuckermann等，1994.J Med Chem.372678；Cho等，1993.Science.2611303；Carrell等，1994.Angew Chem Int Ed Engl.332059；Carell等，1994.Angew Chem Int Ed Engl.332061；和Gallop等，1994.J Med Chem.371233。
化合物文庫可提供在液體中(如Houghten，1992.Biotechniques.13412-421)，或小珠上(Lam.1991.Nature.35482-84)，芯片上(Fodor.1993.Nature.364555-556)，細(xì)菌上(ladner 5,223,409)，芽孢上(Ladner 5,223,409)，質(zhì)粒上(Cull等，1992.Pro Natl Acad Sci USA.891865-1869)或噬菌體上(Scott和Smith.1990.Science.249386-290)；(Devin.1990.Science.249404-406)；(Cwirla等，1990.Proc Natl Acad Sci.876378-6382)；(Felici.1990.J Med Biol.222301-310)；(Ladner，同上)。
本發(fā)明也涉及用上述篩選試驗(yàn)鑒定的新試劑和用這些試驗(yàn)產(chǎn)生這類試劑的方法。因此在一實(shí)施方案中，本發(fā)明包括用含有上述篩選試驗(yàn)之一(如細(xì)胞試驗(yàn)或無試驗(yàn))的步驟獲得的化合物或試劑。所述化合物或試劑宜含有GH多肽或其一部分或變體。
因此，在本發(fā)明范圍內(nèi)還包括在適當(dāng)?shù)膭?dòng)物模型中使用上述鑒定的試劑。例如，可在動(dòng)物模型中采用本文所述的試劑(如GHR調(diào)節(jié)劑，如GH多肽或其一部分或變體，反義GHRd3核酸分子，GHRd3特異性抗體或GHRd3結(jié)合伴侶)，以測(cè)定用這種試劑治療的效果、毒性或副作用?；蛘?，可在動(dòng)物模型中采用本文所述鑒定的試劑來測(cè)定這種試劑的作用機(jī)制。另外，本發(fā)明涉及上述篩選試驗(yàn)鑒定的新的試劑來進(jìn)行所述的治療。
本發(fā)明也涉及上述篩選試驗(yàn)鑒定的新的試劑用于診斷、預(yù)后主如上所述的治療。因此，屬于本發(fā)明范圍的還有在設(shè)計(jì)、配制、合成、制造和/或生產(chǎn)用于診斷、預(yù)后或上述治療中使用的試劑。例如，在一實(shí)施方案中，本發(fā)明包括參照上述篩選試驗(yàn)之一獲得的化合物結(jié)構(gòu)和/或性能，合成或產(chǎn)生試劑或試劑組合物的方法。例如可根據(jù)在表達(dá)GHRd3和GHRf1多肽的細(xì)胞與測(cè)試化合物接觸，并測(cè)定測(cè)試化合物結(jié)合或調(diào)節(jié)GHR多肽(優(yōu)選含GHRd3和GHRF1多肽的復(fù)合物)的能力的方法中獲得的化合物的結(jié)構(gòu)和/或性能，合成試劑或試劑組合物。在另一示范性實(shí)施方案中，本發(fā)明包括根據(jù)在GHRd3蛋白或其生物活性部分與測(cè)試化合物接觸，并測(cè)定該測(cè)試化合物與GHR蛋白，優(yōu)選含GHRD3和GHRF1蛋白的GHR雙體或其生物活性部分相結(jié)合，或調(diào)節(jié)(如激活或抑制)其活性的方法中獲得的化合物的結(jié)構(gòu)和/或性能，合成或產(chǎn)生試劑或試劑組合物的方法。
GHRd3核酸和蛋白質(zhì)如本文所述，本發(fā)明涉及GHRd3核酸和多肽的用途在優(yōu)選實(shí)施方案中，GHRd3蛋白含苞欲放毗連跨越的至少6個(gè)氨基酸，優(yōu)選至少8-10個(gè)氨基酸，更優(yōu)選至少12、15、20、25、30、40、50、100、200、300、400、500、或600個(gè)氨基酸。在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，該毗連氨基酸的長(zhǎng)度中含突變的或功能性突變的位點(diǎn)，包括GHRd3蛋白序列中氨基酸的缺失、添加、替換或截短。于本發(fā)明也可利用的是GHRd3蛋白的生物活性部分，此肽部分含有的氨基酸序列與GHRd3蛋白的氨基酸序列足夠同源或從其衍生，包括的氨基酸序列長(zhǎng)度不到GHRd3的全長(zhǎng)，顯示了GHR蛋白的至少一種活性。在其它實(shí)施方案中，GHRd3蛋白基本上與天然GHRd3序列同源并保留了天然GHRd3蛋白的功能活性，但由于天然的等位基因差異或誘變?cè)诎被嵝蛄猩嫌兴煌?。因此在加一?shí)施方案中，GHRd3蛋白質(zhì)是所含有氨基酸序列至少與(Urbanek等，1992)中所述的氨基酸序列有約60％同源性，并保留了GHRd3蛋白的各種功能活性。該蛋白優(yōu)選與Urbanek等(1992)的有至少約30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或99.8％的同源性。
為了確定二條氨基酸或二條核酸序列的同源性性百分比，可將二序列排列對(duì)比作最佳比較(如在第一條氨基酸或核酸序列中導(dǎo)入空格，與第二條氨基酸或核酸序列作最佳排列對(duì)比，或比較時(shí)可不顧非同源性序列)。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，作排列比較的參比序列的至少30％，優(yōu)選至少40％，更優(yōu)選至少50％，甚至更優(yōu)選至少60％，還要優(yōu)選至少70％、80％、90％或95％的長(zhǎng)度作比較(如當(dāng)排列對(duì)比第二條序列與GHRd3的氨基酸序列時(shí)，至少對(duì)比100個(gè)，優(yōu)選至少200個(gè)氨基酸殘基)。然后比較相應(yīng)氨基酸位點(diǎn)或核酸位點(diǎn)的氨基酸或核苷酸。當(dāng)?shù)谝粭l序列的某位點(diǎn)占據(jù)的是與第二條序列相應(yīng)位點(diǎn)相同的氨基酸殘基或核苷酸時(shí)，那么二分子在該位點(diǎn)同源(即如本文所用，氨基酸或核酸的“相同性”等同于氨基酸或核酸的“同源性”)。二序列之間的同源性百分比是相同之處位點(diǎn)數(shù)除以序列長(zhǎng)度的函數(shù)(即％同源性＝相同位點(diǎn)數(shù)/位點(diǎn)總數(shù)×100)。
可采用數(shù)學(xué)算法進(jìn)行二序列之間的序列比較和同源性百分比測(cè)定。一個(gè)用于序列比較的優(yōu)選的非限制性數(shù)學(xué)算法的例子是Karlin和Altschul.1993.Proc Natl AcadSci USA.872264-68的算法，Kalin和Altschul.1993.Proc natl Acad SciUSA.905873-77作了修改。將這一算法加入到Altschul等，1990.J Mol Biol.215403-10的NBLAST T XBLAST程序中(第二版)。可用NBLAST程序進(jìn)行BLAST核苷酸檢索，評(píng)分＝100，字度＝12可獲得本發(fā)明GHRd3核酸分子的核苷酸序列同源性?？捎肵BLAST程序進(jìn)行BLAST蛋白質(zhì)檢索，評(píng)分＝50，字長(zhǎng)＝3可獲得本發(fā)明GHRd3蛋白分子的氨基酸序列同源性?？刹捎肁ltschul等，1997.nucleic Acids Research.25(17)3389-3402所述的空格BLAST。當(dāng)采用BLAST和空格BLAST程序時(shí)，可采用各程序(如XBLAST和NBLAST)的默認(rèn)參數(shù)。見http//www.ncbi.nlm.nih.gov。用于序列比較落后的另一優(yōu)選非限制性數(shù)學(xué)算法的例子是Myers和Miller，CABIOS(1989)的算法。將此算法加入GCG序列對(duì)比軟件包一部分的ALIGN程序(第二版)中。當(dāng)利用該ALIGN程序比較氨基酸序列時(shí)，可采用PAM120權(quán)重殘基表，空格長(zhǎng)度罰分12和空格罰分4。
重組表達(dá)載體和宿主細(xì)胞可用任何適當(dāng)?shù)姆椒ㄖ苽浜珿HRd3蛋白編碼核酸的載體，優(yōu)選表達(dá)載體，同樣，在優(yōu)選方面，也可制備含GHRF1蛋白(或其一部分)編碼核酸的表達(dá)載體。任選地表達(dá)載體含有編碼GHRd3蛋白的核酸及編碼GHRf1蛋白的核酸。如本文所用，術(shù)語“載體”指能轉(zhuǎn)運(yùn)與其相連的另一核酸的核酸分子。一種種類型的載體是“質(zhì)?！?，是一種可連接其它DNA區(qū)段的雙鏈環(huán)狀DNA。另一類載體是病毒載體，此載體中其它的DNA區(qū)段連接于病毒基因組中。某些載體能在其導(dǎo)入的宿主細(xì)胞中自身復(fù)制(如具有細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的細(xì)菌載體和游離型哺乳動(dòng)物載體)其它在導(dǎo)入宿主細(xì)胞時(shí)整合入宿主細(xì)胞基因組中的載體(如非游離型哺乳動(dòng)物載體)能與宿主基因組一起復(fù)制。然而，某些載體能指導(dǎo)與它們操作性相連的基因表達(dá)。這種載體本文稱作“表達(dá)載體”。一般用于DNA重組技術(shù)中的載體常為質(zhì)粒形式。在本說明書中，“質(zhì)?！焙汀拜d體”可互換使用，因?yàn)橘|(zhì)粒是最常用形式的載體。然而本發(fā)明還包括功能相當(dāng)?shù)钠渌问降谋磉_(dá)載體，如病毒載體(如復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒)。
本發(fā)明的重組表達(dá)載體包含適合在宿主細(xì)胞中表達(dá)的核酸形式的GHRd3和GHRf1核酸，意味著該重組表達(dá)載體包含根據(jù)宿主細(xì)胞選擇的用于表達(dá)的一個(gè)或多個(gè)調(diào)節(jié)序列，它們操作性連接于待表達(dá)的核酸序列。在重組表達(dá)載體中，“操作性連接”指感興趣核苷酸序列以能使該核苷酸序列表達(dá)的方式，連接于該調(diào)節(jié)序列(如當(dāng)該載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞時(shí)處在體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)中或宿主細(xì)胞內(nèi))。術(shù)語“調(diào)節(jié)序列”指啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和其它表達(dá)調(diào)控元件(如聚腺苷酸化信號(hào))這些調(diào)控序列可見例如GoeddelGene Expression TechnologyMethods in Enzymology 185，AcademicPress，San Diego，Calf.1990所述。調(diào)控序列包括能指導(dǎo)核苷酸序列在許多類型宿主細(xì)胞中表達(dá)的序列，和能指導(dǎo)該核苷酸序列只在某些宿主細(xì)胞中表達(dá)的序列(如組織特異性調(diào)控序列)。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道可根據(jù)一些因素，如所選的待轉(zhuǎn)化細(xì)胞，所需的蛋白質(zhì)表達(dá)水平等來設(shè)計(jì)表達(dá)載體?？蓪⒃摫磉_(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞中來產(chǎn)生蛋白質(zhì)或肽。
可設(shè)計(jì)能在原核或真核細(xì)胞中表達(dá)GHRd3蛋白的本發(fā)明重組表達(dá)載體。例如，可在細(xì)菌，如大腸桿菌、昆蟲細(xì)胞(利用桿狀病毒載體)、酵母菌細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)GHRd3蛋白。適合的宿主細(xì)胞見GoeddelGene Expression TechnologyMethods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，Calf.1990所述?；蛘撸捎肨7啟動(dòng)子調(diào)控序列的T7聚合酶體外轉(zhuǎn)錄和翻譯該重組表達(dá)載體。
最常用含有能指導(dǎo)融合或非融合蛋白表達(dá)的組成型或可誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的載體，在原核細(xì)胞中進(jìn)行蛋白質(zhì)的表達(dá)。融合載體常在重組蛋白的氨基末端將氨基酸逐個(gè)加入到編碼蛋白中。這類融合載體目的有三1)提高重組蛋白的表達(dá)；2)提高重組蛋白的可溶性；3)通過與配體的作用在親和純化中邦助重組蛋白的純化。常在融合表達(dá)載體中融合部分與重組蛋白連接處，導(dǎo)入一蛋白水解切割位點(diǎn)，使得能夠分離重組蛋白與融合部分，然后純化該融合蛋白。這類酶和它們相應(yīng)的識(shí)別序列包括因子Xa、凝血酶和腸激酶。典型的融合表達(dá)載體包括pGEXT(Pharmacia Biotech Inc.；Smith D B和Johnson K S，1988，Gene，6731-40)、pMAL(New England Biolabs，Beverly，Mass)和pRIT5(Pharmacia，Piscataway，N.J.)，它們可將谷胱苷肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、麥芽糖E結(jié)合蛋白、或蛋白分別融合于靶重組蛋白。
適合的可誘導(dǎo)型非融合大腸桿菌表達(dá)載體的例子，包括pTrc(Amann等，1988，Gene，69301-315)和pET 11d(Studier等，Gene Expression TechnologyMethodsin Enzymology 185，Academic Pree，San Diego，Calf.1990.60-89)。pTrc載體的靶基因表達(dá)依賴于宿主RNA聚合酶對(duì)雜交性trp-lac融合啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄。pET 11d載體的靶基因表達(dá)，依賴于共表達(dá)的病毒RNA聚合酶(T7 gn 1)介導(dǎo)的對(duì)T7 gn10-lac融合啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄。此病毒聚合酶由寄居在宿主菌株BL21(DE3)或HMS174(DE3)的含有T7 gn 1基因的原噬菌體在lacUV5啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄控制下提供。
在大腸桿菌中最大程度表達(dá)重組蛋白的一種策略，是在蛋白水解切割重且蛋白能力減弱的宿主細(xì)菌中表達(dá)該蛋白(Gottesman S.，Gene Expression TechnologyMethods in Enzymology 185，Academic Pree，San Diego，Calf.1990.119-128)。另一策略是改變被插入表達(dá)載體中核酸的核酸序列，使每個(gè)氨基酸的個(gè)別密碼子為大腸桿菌所偏愛的(Wada等，1992.Nucleic Acid Res.20 2111-2118)?？捎脴?biāo)準(zhǔn)DNA合成技術(shù)進(jìn)行本發(fā)明核酸序列的這種改變。
另一實(shí)施方案中，GHRd3表達(dá)載體是酵母菌表達(dá)載體。釀酒酵母表達(dá)載體的例子包括pYepSec 1(Baldari等，1987.Embo J.6229-234)，pMFa(Kurjan和Herskowitz，1982.Cell.30933-943)，pJRY88(Schultz等，1987.Gene.54113-123)，pYES2(Invitrogen Corporation，San Diego，Calf.)pieZ(Invitrogen Corp，San Diego，Calf.)或者，GHRd3蛋白可用桿狀病毒表達(dá)載體在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)。可得到能在培養(yǎng)的昆蟲細(xì)胞(如Sf9細(xì)胞)中表達(dá)蛋白的桿狀病毒載體，包括pAc系列(Smith等，1983.Mol Cell Biol.32156-2165)和pVL系列(Lucklow和Summers.1989.Virology.17031-39)。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，按Kaeniki等，Am J Physiol.1998.275F79-87所述表達(dá)GHRd3蛋白。
另一實(shí)施方案中，利用哺乳動(dòng)物表達(dá)載體在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)本發(fā)明的核酸。哺乳動(dòng)物表達(dá)載體的例子包括pCDM8(Seed B.，1987.Nature.329840)和pMT2PC(Kaufman等，1987.EMBO J.6187-195)。當(dāng)用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞時(shí)，該表達(dá)載體的調(diào)控功能常由病毒調(diào)節(jié)元件所提供。例如，常用多瘤病毒、腺病毒2、巨細(xì)胞病毒和仙臺(tái)病毒40衍生的啟動(dòng)子。原核和真核細(xì)胞的其它合適表達(dá)系統(tǒng)見SambrookJ.，F(xiàn)ritsh E F和Maniatis T.，Molecular CloningA Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratoryu，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor.N.Y.，1989中的16和17章。
本發(fā)明其它方面涉及在其中導(dǎo)入了本發(fā)明重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。術(shù)語“宿主細(xì)胞”和“重組宿主細(xì)胞”在本文中可互換使用。應(yīng)理解此術(shù)語不僅指特定的主體細(xì)胞，也指此細(xì)胞的子代或潛在的子代。因?yàn)槟承┬揎椨捎谕蛔兓颦h(huán)境影響可能發(fā)生在后代中，其子代事實(shí)上不可能與親代細(xì)胞相同，這也包括在本文所用此術(shù)語的范圍內(nèi)。
可通過常規(guī)的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染技術(shù)將載體DNA導(dǎo)入原核或真核細(xì)胞中。如本文所用，“轉(zhuǎn)化”和“轉(zhuǎn)染”意指本領(lǐng)域熟知的將外源核酸(如DNA)導(dǎo)入宿主細(xì)胞中的技術(shù)，包括磷酸鈣和氯化鈣共沉淀、DEAE葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染或電穿孔。轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的合適方法可在Sambrook等，(Molecular CloningA LaboratoryManual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratoryu，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989)和其它實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)中找到。
對(duì)于哺乳細(xì)胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，已知取決于所用的表達(dá)載體和轉(zhuǎn)染技術(shù)，只有少數(shù)的細(xì)胞可整合外源DNA到其基因組中。為了鑒定和選擇這些整合的細(xì)胞，通?？蓪⒕幋a一種可選擇標(biāo)記(如抗菌素抗性)的基因與感興趣基因一起導(dǎo)入宿主細(xì)胞中。優(yōu)選的可選擇標(biāo)記包括能賦予對(duì)試劑，如G418、潮霉素和氨甲喋呤抗性的標(biāo)記。編碼可選擇性標(biāo)記的核酸可在與編碼GHRd3蛋白的同一載體中的導(dǎo)入宿主細(xì)胞，或在不同的載體中導(dǎo)入。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了導(dǎo)入核酸的細(xì)胞可通過試劑選擇鑒定(如摻入了可選擇性標(biāo)記基因的細(xì)胞能存活，而其它細(xì)胞死亡)。
可利用培養(yǎng)的本發(fā)明宿主細(xì)胞，如原核或真核宿主細(xì)胞來生產(chǎn)(即表達(dá))GHRd3蛋白。因此，本發(fā)明還提供用本發(fā)明宿主細(xì)胞生產(chǎn)GHRd3蛋白的方法。一實(shí)施方案中，該方法包括；在適合的培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細(xì)胞(其中導(dǎo)入了編碼GHRD3蛋白的重組表達(dá)載體)來生產(chǎn)GHRd3蛋白。
也可利用本發(fā)明的宿主細(xì)胞來產(chǎn)生非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物GHRd3等位基因的純合子和雜合子。例如，一實(shí)施方案中，本發(fā)明的宿主細(xì)胞是其中已導(dǎo)入了GHRd3編碼序列的受精卵母細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞。楞利用這種細(xì)胞來產(chǎn)生其基因組中已導(dǎo)入了外源性GHRd3序列的非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，或其內(nèi)源性GHRf1序列已改變的同源重組動(dòng)物。這種動(dòng)物可用來研究GHRd3的功能和/或活性，和鑒定和/或評(píng)價(jià)GHRd3活性調(diào)節(jié)劑。如本文所用“轉(zhuǎn)基因動(dòng)物”是一種非人動(dòng)物，優(yōu)選哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選嚙齒類如大鼠或小鼠。此種動(dòng)物的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞中含有轉(zhuǎn)基因。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的其它例子包括非人靈長(zhǎng)動(dòng)物、綿羊、狗、母牛、山羊、雞、兩棲動(dòng)物等。轉(zhuǎn)基因是外源性DNA，其整合入細(xì)胞的基因組中，從該細(xì)胞可產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，而轉(zhuǎn)基因仍留在成熟動(dòng)物的基因組中，因而能指導(dǎo)其編碼的基因產(chǎn)物在該轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的一種或多種類型細(xì)胞或組織中表達(dá)。如本文所用“同源性重組動(dòng)物”是非人動(dòng)物，優(yōu)選哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選小鼠，該動(dòng)物中的內(nèi)源性GHR基因(如GHRf1等位基因)已被內(nèi)源基因與導(dǎo)入該動(dòng)物細(xì)胞(如該動(dòng)物的胚胎細(xì)胞)中的外源DNA分子之間的同源重組所改變，然后產(chǎn)生了該動(dòng)物。
可通過顯微注射、逆轉(zhuǎn)錄病毒感染將GHRd3編碼核酸導(dǎo)入受精卵母細(xì)胞的母體前核中，或讓該卵母細(xì)胞在假孕代孕母動(dòng)物子宮中發(fā)育，產(chǎn)生本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。GHRd3 DNA序列可作為轉(zhuǎn)基因?qū)敕侨藙?dòng)物的基因組中。也可在該轉(zhuǎn)基因中包含內(nèi)含子序列和聚腺苷酸信號(hào)來提高該轉(zhuǎn)基因的表達(dá)效率?？蓪⒔M織特異性調(diào)控序列操作性連接于GHRd3轉(zhuǎn)基因以指導(dǎo)GHRd3蛋白在特定細(xì)胞中的表達(dá)。通過胚胎操作和顯微注射產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，具體動(dòng)物如小鼠的方法在該領(lǐng)域已成常規(guī)，其描述見例如Leder等的美國(guó)專利4,736,866和4,870,009；Wagner等，的美國(guó)專利4,873,191和Hogan B.，Manipulating the Mouse Embryo，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)?？捎妙愃品椒▉懋a(chǎn)生其它轉(zhuǎn)基因動(dòng)物?？筛鶕?jù)動(dòng)物基因組中存在的GHRd3轉(zhuǎn)基因和/或其組織或細(xì)胞表達(dá)的GHRd3 mRNA，鑒定轉(zhuǎn)基因奠基者動(dòng)物。然后可利用該轉(zhuǎn)基因奠基者動(dòng)物來繁殖其它攜帶該轉(zhuǎn)基因的動(dòng)物。而且。，可進(jìn)一步使攜帶編碼GHRd3蛋白轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物與攜帶其它轉(zhuǎn)基因的其它轉(zhuǎn)基因動(dòng)物交配。
為了產(chǎn)生同源重組動(dòng)物，需制備含GHRd3核酸至少一部分的載體從而改變內(nèi)源性GHR(GHRf1)基因。GHRd3基因可以是人基因，或人GHR基因的非人同源基因(如通過與衍生自SEQ ID NO1，4和6的核酸序列嚴(yán)謹(jǐn)性雜交分離得到的cDNA)。優(yōu)選通過修飾非人GHR序列而缺失外顯子3核酸產(chǎn)生該非人同源基因。由于小鼠中沒有發(fā)現(xiàn)GHRD3等位基因，可用已知方法制備小鼠GHRd3核酸。因此在某些方面，可可適當(dāng)?shù)耐粗亟M載體中合成的小鼠GHRd3基因來改變小鼠基因組中的內(nèi)源性GHR基因。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，根據(jù)同源重組設(shè)計(jì)的該載體中，內(nèi)源GHR基因被GHRd3基因取代，而所述GHRd3基因編碼功能性GHRd3蛋白(如可改變其上游調(diào)控區(qū)從而改變內(nèi)源GHRd3蛋白的表達(dá))。在該同源重組載體中，GHRd3基因的5’和3’端側(cè)接有GHR基因的其它核酸序列，使得能在胚胎干細(xì)胞中該載體攜帶的外源GHRd3基因與內(nèi)源GHR基因之間發(fā)生同源重組。其它側(cè)接的GHR核酸序列應(yīng)足夠長(zhǎng)才能與內(nèi)源基因成功同源重組。通常載體中包含的側(cè)接DNA長(zhǎng)幾千個(gè)堿基(5’和3’二端)(見例如Thomas KR和Capecchi M R.，1987.Cell.51503，描述了同源重組載體)。將該載體導(dǎo)入胚胎干細(xì)胞系(如通過電穿孔)，選擇導(dǎo)入的GHRd3基因與內(nèi)源GHR基因同源重組的細(xì)胞(見例如Li E等，1992.Cell.69915)。將選出的細(xì)胞注射到動(dòng)物(如小鼠)的胚泡中形成侵入性嵌合體(見例如Bradley A.，Teratocarcinomas and EmbryonicStem Cells.A Practical Approach，E J Robertson編，(IRL，Oxford，1987)113-152頁)。然后將嵌合性胚胎植入合適的假孕代孕母動(dòng)物子宮中，使胚胎成為胚芽?？衫闷渖臣?xì)胞中攜帶該同源重組DNA的子代動(dòng)物來繁殖后代動(dòng)物，該后代動(dòng)物的所有細(xì)胞通過該轉(zhuǎn)基因的生殖系轉(zhuǎn)移而含有該同源重組載體。構(gòu)建同源重組載體和同源重組動(dòng)物的方法見Bralet A，1991.Current Opinion in Biotechnology.2823-829和Le Mouellec等的PCT國(guó)際出版物WO 90/11354；Smithies等，的WO91/01140；Zijlstra等的WO 92/0968；Berns等的WO 93/64168。
另一實(shí)施方案中，可產(chǎn)生含有能調(diào)節(jié)表達(dá)該轉(zhuǎn)基因的選擇系統(tǒng)的非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。這種系統(tǒng)的一個(gè)例子是噬菌體P1的cre/loxP重組酶系統(tǒng)。cre/loxP重組酶系統(tǒng)的說明可見例如Lakso等，1992，PNAS.896232-6236。重組酶系統(tǒng)的另一例子是釀酒酵母的FLP重組酶系統(tǒng)(O’Gorman等，1991.Science.2511351-1355。如果用cre/loxP重組酶系統(tǒng)來調(diào)節(jié)該轉(zhuǎn)基因的表達(dá)，需要含編碼Cre重組酶和所選蛋白二者轉(zhuǎn)基因的動(dòng)物?？赏ㄟ^構(gòu)建“雙重”轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，如使二種轉(zhuǎn)基因動(dòng)物交配，一種含編碼所選蛋白的轉(zhuǎn)基因與另一種含編碼重組酶的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物交配，來產(chǎn)生這種動(dòng)物。
實(shí)施例實(shí)施例1GHRd3和GHRf1的PCR RFLP基因分型PCR RFLP在96孔微滴板(Perkin Elmer)中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，各孔含有的50μl反應(yīng)混合物中含200ng DNA、1.5mM MgCl2、5μl 10X反應(yīng)緩沖液(Perkin Elmer)、0.2mM各dNTP、0.2μM各引物、1.25U Taq聚合酶(Perkin Elmer)。
用9700 Perkin Elmer溫度循環(huán)儀進(jìn)行35輪PCR。在瓊脂糖凝膠上檢測(cè)PCR產(chǎn)物。
實(shí)施例2檢測(cè)與GH反應(yīng)相關(guān)的GHRd3等位基因檢查了在重組GH治療試驗(yàn)中注冊(cè)的97名患特發(fā)性身材矮小(ISSO兒童，常見的GHR外顯子3變異與對(duì)GH治療生長(zhǎng)速率反應(yīng)的關(guān)系。47名患兒中存在GHRd3等位基因，其中3名為GHRd3/d3純合子，44名為GHRd3/f1雜合子，見表1所示。
表1高加索人個(gè)體中GHR基因型的分布
包括正常的矮小身材的受試者。不包括生長(zhǎng)激素“確實(shí)”有缺陷(GHD)的受試者，具有CNS腫瘤的受試者，具有GHR基因突變的受試者，具有其它激素缺陷的受試者，具有特納綜合征、PHP、季肋發(fā)育不良或其它骨發(fā)育不良、Laron綜合征患者或其它疾病患者。最后，這些受試者包括在GH治療二年結(jié)束后不能表現(xiàn)出青春期體征(乳腺、睪丸)。
關(guān)于其它醫(yī)學(xué)和治療學(xué)特征進(jìn)行基因型分組比較。受試者的特征包括年齡、性別、rGH的劑量、出生時(shí)大小和父母身高都要考慮(表2、3和4)。
表2要考慮的臨床和生物學(xué)表型
表2
圖2表示由實(shí)施例2得到的含水量＜19％且≥17％的新結(jié)晶形式的式(1)化合物的粉末X-射線衍射圖案。
本發(fā)明也涉及含水量＜17％且≥13％的新結(jié)晶形式的式(1)化合物，特征在于其粉末X-射線衍射圖案在大約21.8、11.7、11.0、7.30、5.77、5.51、4.93和3.65d-間距單位處存在峰。
特別地，含水量＜17％且≥13％的新結(jié)晶形式的式(1)化合物的特征在于其粉末X-射線衍射圖案在大約21.8、11.6、11.0、9.2、7.3、7.2、5.77、5.51、4.93、4.49、3.86和3.65d-間距單位處存在峰。
表3表示了由實(shí)施例3得到的含水量＜17％且≥13％的新結(jié)晶形式的式(1)化合物的以Angstrm單位[A]表示的由d指示的晶格平面之間的特征間隔，及其對(duì)應(yīng)的特征相對(duì)強(qiáng)度(很弱(vw)、弱(w)、中等(m)、強(qiáng)(s)或很強(qiáng)(vs))。
結(jié)果顯示，具有GHR外顯子3缺失(GHRd3)的受試者的生長(zhǎng)速度，在共變量判定后，高于含全長(zhǎng)GHR同工型(GHRf1)的純合子受試者。相關(guān)性矩陣顯示，此作用獨(dú)立于其它共變量。
表6各種參數(shù)的線性回歸模式
序列表<110>輝瑞健康股份公司(Bougneres，Pierre)<120>預(yù)測(cè)作用于生長(zhǎng)激素受體的制劑的治療反應(yīng)的方法<130>10806-211<150>60/434,861<151>2002-12-19<160>6<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>4414<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(44)..(1960)<220>
<221>misc_feature<222>(488)..(742)<223>FNS；區(qū)域纖連蛋白3型結(jié)構(gòu)域<220>
<221>misc_feature<222>(524)..(775)<223>FNS；區(qū)域纖連蛋白III型結(jié)構(gòu)域<220>
<221>variation<222>(579)..(579)<223>等位基因＝A；等位基因＝G<220>
<221>variation<222>(601)..(601)<223>等位基因＝A；等位基因＝G在GHR.262和GHR.501中A是G<220>
<221>variation
<222>(729)..(729)<223>等位基因＝A；等位基因＝G<220>
<221>variation<222>(1167)..(1167)<223>在GHR.501中G是U<220>
<221>variation<222>(1362)..(1362)<223>等位基因＝G；等位基因＝T<220>
<221>variation<222>(1516)..(1516)<223>等位基因＝C；等位基因＝T<220>
<221>variation<222>(1526)..(1526)<223>等位基因＝A；等位基因＝C<220>
<221>variation<222>(1673)..(1673)<223>等位基因＝A；等位基因＝C<220>
<221>variation<222>(1778)..(1778)<223>等位基因＝A；等位基因＝C<220>
<221>variation<222>(2260)..(2260)<223>補(bǔ)體-等位基因＝C；等位基因＝T<220>
<221>variation<222>(2479)..(2479)<223>在GHR.110中C在U<220>
<221>variation<222>(3751)..(3751)<223>等位基因＝A；等位基因＝G<220>
<221>polyA_signal<222>(3751)..(3751)<220>
<221>polyA_site<222>(4414)..(4414)<400>1ccgcgctctc tgatcagagg cgaagctcgg aggtcctaca ggt atg gat ctc tgg 55Met Asp Leu Trp1cag ctg ctg ttg acc ttg gca ctg gca gga tca agt gat gct ttt tct103Gln Leu Leu Leu Thr Leu Ala Leu Ala Gly Ser Ser Asp Ala Phe Ser5 10 15 20gga agt gag gcc aca gca gct atc ctt agc aga gca ccc tgg agt ctg151Gly Ser Glu Ala Thr Ala Ala Ile Leu Ser Arg Ala Pro Trp Ser Leu25 30 35caa agt gtt aat cca ggc cta aag aca aat tct tct aag gag cct aaa199Gln Ser Val Asn Pro Gly Leu Lys Thr Asn Ser Ser Lys Glu Pro Lys40 45 50ttc acc aag tgc cgt tca cct gag cga gag act ttt tca tgc cac tgg247Phe Thr Lys Cys Arg Ser Pro Glu Arg Glu Thr Phe Ser Cys His Trp55 60 65aca gat gag gtt cat cat ggt aca aag aac cta gga ccc ata cag ctg295Thr Asp Glu Val His His Gly Thr Lys Asn Leu Gly Pro Ile Gln Leu70 75 80ttc tat acc aga agg aac act caa gaa tgg act caa gaa tgg aaa gaa343Phe Tyr Thr Arg Arg Asn Thr Gln Glu Trp Thr Gln Glu Trp Lys Glu85 90 95 100tgc cct gat tat gtt tct gct ggg gaa aac agc tgt tac ttt aat tca391Cys Pro Asp Tyr Val Ser Ala Gly Glu Asn Ser Cys Tyr Phe Asn Ser105 110 115tcg ttt acc tcc atc tgg ata cct tat tgt atc aag cta act agc aat439Ser Phe Thr Ser Ile Trp Ile Pro Tyr Cys Ile Lys Leu Thr Ser Asn120 125 130ggt ggt aca gtg gat gaa aag tgt ttc tct gtt gat gaa ata gtg caa487Gly Gly Thr Val Asp Glu Lys Cys Phe Ser Val Asp Glu Ile Val Gln135 140 145cca gat cca ccc att gcc ctc aac tgg act tta ctg aac gtc agt tta535Pro Asp Pro Pro Ile Ala Leu Asn Trp Thr Leu Leu Asn Val Ser Leu150 155 160act ggg att cat gca gat atc caa gtg aga tgg gaa gca cca cgc aat583Thr Gly Ile His Ala Asp Ile Gln Val Arg Trp Glu Ala Pro Arg Asn165 170 175 180gca gat att cag aaa gga tgg atg gtt ctg gag tat gaa ctt caa tac631Ala Asp Ile Gln Lys Gly Trp Met Val Leu Glu Tyr Glu Leu Gln Tyr185 190 195aaa gaa gta aat gaa act aaa tgg aaa atg atg gac cct ata ttg aca679Lys Glu Val Asn Glu Thr Lys Trp Lys Met Met Asp Pro Ile Leu Thr
200 205 210aca tca gtt cca gtg tac tca ttg aaa gtg gat aag gaa tat gaa gtg727Thr Ser Val Pro Val Tyr Ser Leu Lys Val Asp Lys Glu Tyr Glu Val215 220 225cgt gtg aga tcc aaa caa cga aac tct gga aat tat ggc gag ttc agt775Arg Val Arg Ser Lys Gln Arg Asn Ser Gly Asn Tyr Gly Glu Phe Ser230 235 240gag gtg ctc tat gta aca ctt cct cag atg agc caa ttt aca tgt gaa823Glu Val Leu Tyr Val Thr Leu Pro Gln Met Ser Gln Phe Thr Cys Glu245 250 255 260gaa gat ttc tac ttt cca tgg ctc tta att att atc ttt gga ata ttt871Glu Asp Phe Tyr Phe Pro Trp Leu Leu Ile Ile Ile Phe Gly Ile Phe265 270 275ggg cta aca gtg atg cta ttt gta ttc tta ttt tct aaa cag caa agg919Gly Leu Thr Val Met Leu Phe Val Phe Leu Phe Ser Lys Gln Gln Arg280 285 290att aaa atg ctg att ctg ccc cca gtt cca gtt cca aag att aaa gga967Ile Lys Met Leu Ile Leu Pro Pro Val Pro Val Pro Lys Ile Lys Gly295 300 305atc gat cca gat ctc ctc aag gaa gga aaa tta gag gag gtg aac aca 1015Ile Asp Pro Asp Leu Leu Lys Glu Gly Lys Leu Glu Glu Val Asn Thr310 315 320atc tta gcc att cat gat agc tat aaa ccc gaa ttc cac agt gat gac 1063Ile Leu Ala Ile His Asp Ser Tyr Lys Pro Glu Phe His Ser Asp Asp325 330 335 340tct tgg gtt gaa ttt att gag cta gat att gat gag cca gat gaa aag 1111Ser Trp Val Glu Phe Ile Glu Leu Asp Ile Asp Glu Pro Asp Glu Lys345 350 355act gag gaa tca gac aca gac aga ctt cta agc agt gac cat gag aaa 1159Thr Glu Glu Ser Asp Thr Asp Arg Leu Leu Ser Ser Asp His Glu Lys360 365 370tca cat agt aac cta ggg gtg aag gat ggc gac tct gga cgt acc agc 1207Ser His Ser Asn Leu Gly Val Lys Asp Gly Asp Ser Gly Arg Thr Ser375 380 385tgt tgt gaa cct gac att ctg gag act gat ttc aat gcc aat gac ata 1255Cys Cys Glu Pro Asp Ile Leu Glu Thr Asp Phe Asn Ala Asn Asp Ile390 395 400cat gag ggt acc tca gag gtt gct cag cca cag agg tta aaa ggg gaa 1303His Glu Gly Thr Ser Glu Val Ala Gln Pro Gln Arg Leu Lys Gly Glu405 410 415 420gca gat ctc tta tgc ctt gac cag aag aat caa aat aac tca cct tat 1351Ala Asp Leu Leu Cys Leu Asp Gln Lys Asn Gln Asn Asn Ser Pro Tyr425 430 435cat gat gct tgc cct gct act cag cag ccc agt gtt atc caa gca gag 1399His Asp Ala Cys Pro Ala Thr Gln Gln Pro Ser Val Ile Gln Ala Glu440 445 450aaa aac aaa cca caa cca ctt cct act gaa gga gct gag tca act cac 1447Lys Asn Lys Pro Gln Pro Leu Pro Thr Glu Gly Ala Glu Ser Thr His455 460 465
caa gct gcc cat att cag cta agc aat cca agt tca ctg tca aac atc1495Gln Ala Ala His Ile Gln Leu Ser Asn Pro Ser Ser Leu Ser Asn Ile470 475 480gac ttt tat gcc cag gtg agc gac att aca cca gca ggt agt gtg gtc1543Asp Phe Tyr Ala Gln Val Ser Asp Ile Thr Pro Ala Gly Ser Val Val485 490 495 500ctt tcc ccg ggc caa aag aat aag gca ggg atg tcc caa tgt gac atg1591Leu Ser Pro Gly Gln Lys Asn Lys Ala Gly Met Ser Gln Cys Asp Met505 5l0 515cac ccg gaa atg gtc tca ctc tgc caa gaa aac ttc ctt atg gac aat1639His Pro Glu Met Val Ser Leu Cys Gln Glu Asn Phe Leu Met Asp Asn520 525 530gcc tac ttc tgt gag gca gat gcc aaa aag tgc atc cct gtg gct cct1687Ala Tyr Phe Cys Glu Ala Asp Ala Lys Lys Cys Ile Pro Val Ala Pro535 540 545cac atc aag gtt gaa tca cac ata cag cca agc tta aac caa gag gac1735His Ile Lys Val Glu Ser His Ile Gln Pro Ser Leu Asn Gln Glu Asp550 555 560att tac atc acc aca gaa agc ctt acc act gct gct ggg agg cct ggg1783Ile Tyr Ile Thr Thr Glu Ser Leu Thr Thr Ala Ala Gly Arg Pro Gly565 570 575 580aca gga gaa cat gtt cca ggt tct gag atg cct gtc cca gac tat acc1831Thr Gly Glu His Val Pro Gly Ser Glu Met Pro Val Pro Asp Tyr Thr585 590 595tcc att cat ata gta cag tcc cca cag ggc ctc ata ctc aat gcg act1879Ser Ile His Ile Val Gln Ser Pro Gln Glv Leu Ile Leu Asn Ala Thr600 605 610gcc ttg ccc ttg cct gac aaa gag ttt ctc tca tca tgt ggc tat gtg1927Ala Leu Pro Leu Pro Asp Lys Glu Phe Leu Ser Ser Cys Gly Tyr Val615 620 625agc aca gac caa ctg aac aaa atc atg cct tag cctttctttg gtttcccaag 1980Ser Thr Asp Gln Leu Asn Lys Ile Met Pro630 635agctacgtat ttaatagcaa agaattgact ggggcaataa cgtttaagcc aaaacaatgt 2040ttaaaccttt tttgggggag tgacaggatg gggtatggat tctaaaatgc cttttcccaa 2100aatgttgaaa tatgatgtta aaaaaataag aagaatgctt aatcagatag atattcctat 2160tgtgcaatgt aaatatttta aagaattgtg tcagactgtt tagtagcagt gattgtctta 2220atattgtggg tgttaatttt tgatactaag cattgaatgg ctatgttttt aatgtatagt 2280aaatcacgct ttttgaaaaa gcgaaaaaat caggtggctt ttgcggttca ggaaaattga 2340atgcaaacca tagcacaggc taattttttg ttgtttctta aataagaaac ttttttattt 2400aaaaaactaa aaactagagg tgagaaattt aaactataag caagaaggca aaaatagttt 2460ggatatgtaa aacatttact ttgacataaa gttgataaag attttttaat aatttagact 2520tcaagcatgg ctattttata ttacactaca cactgtgtac tgcagttggt atgacccctc 2580taaggagtgt agcaactaca gtctaaagct ggtttaatgt tttggccaat gcacctaaag 2640aaaaacaaac tcgtttttta caaagccctt ttatacctcc ccagactcct tcaacaattc 2700taaaatgatt gtagtaatct gcattattgg aatataattg ttttatctga atttttaaac 2760aagtatttgt taatttagaa aactttaaag cgtttgcaca gatcaactta ccaggcacca 2820aaagaagtaa aagcaaaaaa gaaaaccttt cttcaccaaa tcttggttga tgccaaaaaa 2880aaatacatgc taagagaagt agaaatcata gctggttcac actgaccaag atacttaagt 2940
gctgcaattg cacgcggagt gagtttttta gtgcgtgcag atggtgagag ataagatcta 3000tagcctctgc agcggaatct gttcacaccc aacttggttt tgctacataa ttatccagga 3060agggaataag gtacaagaag cattttgtaa gttgaagcaa atcgaatgaa attaactggg 3120taatgaaaca aagagttcaa gaaataagtt tttgtttcac agcctataac cagacacata 3180ctcatttttc atgataatga acagaacata gacagaagaa acaaggtttt cagtccccac 3240agataactga aaattattta aaccgctaaa agaaactttc tttctcacta aatcttttat 3300aggatttatt taaaatagca aaagaagaag tttcatcatt ttttacttcc tctctgagtg 3360gactggcctc aaagcaagca ttcagaagaa aaagaagcaa cctcagtaat ttagaaatca 3420ttttgcaatc ccttaatatc ctaaacatca ttcatttttg ttgttgttgt tgttgttgag 3480acagagtctc gctctgtcgc caggctagag tgcggtggcg cgatcttgac tcactgcaat 3540ctccacctcc cacaggttca ggcgattccc gtgcctcagc ctcctgagta gctgggacta 3600caggcacgca ccaccatgcc aggctaattt ttttgtattt tagcagagac ggggtttcac 3660catgttggcc aggatggtct cgagtctcct gacctcgtga tccacccgac tcggcctccc 3720aaagtgctgg gattacaggt gtaagccacc gtgcccagcc ctaaacatca ttcttgagag 3780cattgggata tctcctgaaa aggtttatga aaaagaagaa tctcatctca gtgaagaata 3840cttctcattt tttaaaaaag cttaaaactt tgaagttagc tttaacttaa atagtatttc 3900ccatttatcg cagacctttt ttaggaagca agcttaatgg ctgataattt taaattctct 3960ctcttgcagg aaggactatg aaaagctaga attgagtgtt taaagttcaa catgttattt 4020gtaatagatg tttgatagat tttctgctac tttgctgcta tggttttctc caagagctac 4080ataatttagt ttcatataaa gtatcatcag tgtagaacct aattcaattc aaagctgtgt 4140gtttggaaga ctatcttact atttcacaac agcctgacaa catttctata gccaaaaata 4200gctaaatacc tcaatcagtc tcagaatgtc attttggtac tttggtggcc acataagcca 4260ttattcacta gtatgactag ttgtgtctgg cagtttatat ttaactctct ttatgtctgt 4320ggattttttc cttcaaagtt taataaattt attttcttgg attcctgata atgtgcttct 4380gttatcaaac accaacataa aaatgatcta aacc 4414<210>2<211>638<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>2Met Asp Leu Trp Gln Leu Leu Leu Thr Leu Ala Leu Ala Gly Ser Ser1 5 10 15Asp Ala Phe Ser Gly Ser Glu Ala Thr Ala Ala Ile Leu Ser Arg Ala20 25 30Pro Trp Set Leu Gln Ser Val Asn Pro Gly Leu Lys Thr Asn Ser Ser35 40 45Lys Glu Pro Lys Phe Thr Lys Cys Arg Ser Pro Glu Arg Glu Thr Phe50 55 60Ser Cys His Trp Thr Asp Glu Val His His Gly Thr Lys Asn Leu Gly65 70 75 80Pro Ile Gln Leu Phe Tyr Thr Arg Arg Asn Thr Gln Glu Trp Thr Gln85 90 95Glu Trp Lys Glu Cys Pro Asp Tyr Val Ser Ala Gly Glu Asn Ser Cys100 105 110Tyr Phe Asn Ser Ser Phe Thr Ser Ile Trp Ile Pro Tyr Cys Ile Lys115 120 125Leu Thr Ser Asn Gly Gly Thr Val Asp Glu Lys Cys Phe Ser Val Asp
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<221>repeat_region
<222>(6232)..(6303)<223>補(bǔ)體MER4B分散的<400>4aacttanagt atcaaagcag caagtagatt tgaaggaatt gttacaatgc aattttgctt 60tcccgccact ttaaaatcaa ggtgtagtac tttatttact ttaggaaaat gtttgctttt 120tgtcataatt ccttattgca tatgagagta aatgatctat agatgaagat aataataaaa 180tttagagaga gaataaaaaa gaaacacttt cacagctgaa aggctgcttc ccagttagct 240aactgggagg agttactgaa aaagtacatt gaaaagcggc tcaggggcag gtgaattgga 300ctcaccaggc tctgacattc agagagatgg gaatgagtca gctcactgtc cagcacatct 360ttattttatt tctctttctt gttttatatc agaaatagat ttcttggcat tgttactgtg 420ggtttctatt aaggactgaa caaaagtatt aataatctga gagtatgtaa aaaaaaattc 480attttctcct actatactct cataacacag aatattttgg tgaccagaga tcaccaaaat 540gtgtgtggtg tcaacgaaaa gagtcaaact ctctaaaata tttgaagaga ttttttctga 600gccaaatgtg agtgaacatg gcctgtgaca tagccctcag gaggtcctga gaacatgtgc 660ccaaggtggt cagggtacag cttggttttt atatatttta gggaggcata agacatcaat 720caaatacatt taagaaatac gttgatttgg ttcagaaagg caggacaact caaatgggga 780gcttccaggc tataggtaaa tttaaacatt ttctggttga caattagttg agtttgtctg 840aagacctggg attaatggaa aggactattc aggttaagat atgtttctta ttggacctaa 900aactgtgcct ggctcttagt tgattactgc ctggatctgg gaaggaagga aggaaaacaa 960agggggaagg ggattctcta tagaatgtgg atttttccca taagagactt tgtagggcaa1020tttcaaggca tggcaaggaa atatactttg gggctaatat tttnccttgt ctcataatgt1080tatgccagag tcatattgaa aagcaagtca caatatacaa ggtcaaataa aaccatctga1140tgagaaccca tggtttgtag ggcatgactc cccagaaccc ttaggtagga atttgggcaa1200gataaaaaat cggaacttag tcctcggcgg gaatctctcc ccacacaaat tctccaacag1260attcttcagt gggacaccaa ctgggtggtt ctcaaattca attcaattct gaccaatcta1320cctatctacc tggaaatagc atcagataac cacaggttta cggctcattc caacaatact1380gtcccccact tcagatgcca actgcaagta ataggttgtt acctatactt ctagccagtc1440agctgtnaan tggtgttccc acaacctccc cctccggttt gataatttga gacagcttgc1500ttacatgtac cagcttatta gaaaggatat tacaaaggac acagatgaag agatggatag1560ggtaaggtat gtgggttgga gttgcagagt ttccatgacc tctctgagtg cagcatcttc1620atgtgttcag ctatccagaa tctctcggat taagacattg gccactggtg atcaaattaa1680ccttgagtcc ctctcccctt cctgaggttg gagagtgggg ctgaagtgtc tcaacctcta1740atcaactctt ggtctttcct gtgaccatgc cccatcctga ggctctccag gagcccccag1800gcatcagtca actcattagc atacgaaaga cacttatcac tacagagatt cgaaggattt1860taggaactgt gtcaagaaac ggagacaagg tcaaatatgt atttcacaat atcaccagta1920gtttcactgg gaggtaaaac tcagtgttta ctgtgggcct gagccatgct gaccctctaa1980gaataactta gaggtaacgt gatcagatgt ggggaattct ggagaaacac ctttcaccac2040caagcccaga caagagatgc atacttttct agctgggatg cttacaaagc aacccactct2100aatacttcaa ggtagagtga cactacattc atcatttttc attttttcct gttttttatg2160ccatctacta ctaatgtcaa tcaaattacg actgtgttta tagtggatga attatggacc2220atctcacacc ataaagttct gtttctctca tgttgagctt ttcacctccc ttcattccct2280ccctacttcc aggatcattc acatgtttat ttctaaaaat aaactttttt tactgaactt2340tttttcatac tgtttaaaaa gaatttatat ttctcttcat tcttacagat aagattcaag2400tttaaactca aataatgtag gaaatctttt tttaaaaaat tgttccctac tgtgtctagg2460
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<221>GENE<222>(1)..(1474)
<223>生長(zhǎng)激素受體(GHR)包含外顯子3的缺失<220>
<221>repeat_region<222>(268)..(1085)<223>補(bǔ)體LTR1B分散的<220>
<221>repeat_region<222>(1094)..(1165)<223>補(bǔ)體MER4B分散的<400>6aatctttttt taaaaaattg ttccctactg tgtctaggcg tgagacccaa aagtaattaa 60gaccaggttt tcatttgctg tgatttgtgt gagttctttt tagaggttag gtgcaatttt 120aatttttaaa agggggatta ttatgagagg agaaatcata ctttatcatt tgaaaatgat 180gccataacag gtgttagcag aaaaatcaaa ctgtaaaata ttttaaagag atttattctg 240agccaatata agtgactgtg gccccattga aatgagcgag ttccctgatc cctctcacag 300agcttgcgac agggatgtgg ctcacctgtt cagttgcccc accgctcaaa cccctagggg 360gagaatacag acggtcaggt gcaaaggctg gggcaagtgc cttggcccct tggcccctta 420gccccgaggt agtgtctagg ggtggggtgc ctgcaacccc agtgttacaa agttctttca 480gctttgcagt ccacggacag cttgagtgtt aatcagctca atggaccctc tgccttatag 540caaaggcaga gggccagtgt gacagctttc tgtatcccaa gctcttgccc agtgtcctag 600aaaaaacaga tcatacaggg gctcgaagga tgagtgcaag gttttattga gtagtggagg 660tggctctcag caagatggat ggggagtggg aagtggggat ggagtgggaa ggtgaacttc 720ctctgaagtc gggcagccca gtggctggac tcttctccaa cctcccccag gcaagctcct 780ctcagcgtcc agatgttcct cttccctctc tctctctgcc gcatcatttc accatctgtc 840tgctggtcag ctggcttgct ggtgtgctgg tctgttggtc tgctggtctg cttctggaac 900ctcaggttca gagtttatat gagtgcagga tagggggtgt tttgggccaa aaggtagctt 960tttggacatg aaaacggaaa tgcctgttcc catttagggc tgcaggtctt caggcttgag1020ggtggggcct ttgcccagga actaccctct tctacccagt gtttccctgt ctcctgtcca1080tatcaccagt attcacagtc tcaaggagtc ttgagaaagt gtgcccaagg ccgtcagatt1140cagtttggtt ctgtatgtca cagggtctaa gaagcgtaaa cattgtgcct tgttgaaata1200cagcctctag gtatggagga tgtgttgaac aacttcctac cagtcatttg gcatatgttg1260atttcctgtc ttcatgatac gtaagacgac tagctaatta tcattcatat gtggtaagtc1320acatagatac tgacttcccc tatctttcca gctttttctt atcaaaagtc acctgctctc1380tgtcccagga acgactggct aaagtaacct atatcagtgt ctgtaacagt gggcacctat1440catagtgcac atgcttgaac atatcattgc cttt147權(quán)利要求
1.一種預(yù)測(cè)受試者對(duì)能結(jié)合GHR蛋白的試劑的反應(yīng)的方法，其特征在于，所述方法包括測(cè)定受試者內(nèi)是否存在GHR基因的等位基因，其中所述等位基因與對(duì)所述試劑有高或低的陽性反應(yīng)的可能性相互關(guān)聯(lián)，從而可鑒定該受試者對(duì)所述試劑的治療反應(yīng)可能增高或降低。
2.一種預(yù)測(cè)受試者對(duì)能提高受試者身高或生長(zhǎng)速度的試劑的反應(yīng)的方法，其特征在于，所述方法包括測(cè)定受試者內(nèi)是否存在GHR基因的等位基因，其中所述等位基因與對(duì)所述試劑有高或低的陽性反應(yīng)的可能性相互關(guān)聯(lián)，從而可鑒定該受試者對(duì)所述試劑的治療反應(yīng)可能增高或降低。
3.一種預(yù)測(cè)受試者對(duì)治療肥胖癥的試劑的反應(yīng)的方法，其特征在于，所述方法包括測(cè)定受試者內(nèi)是否存在GHR基因的等位基因，其中所述等位基因與對(duì)所述試劑有高或低的陽性反應(yīng)的可能性相互關(guān)聯(lián)，從而可鑒定該受試者對(duì)所述試劑的治療反應(yīng)可能增高或降低。
4.一種預(yù)測(cè)受試者對(duì)治療感染的試劑的反應(yīng)的方法，其特征在于，所述方法包括測(cè)定受試者內(nèi)是否存在GHR基因的等位基因，其中所述等位基因與對(duì)所述試劑有高或低的陽性反應(yīng)的可能性相互關(guān)聯(lián)，從而可鑒定該受試者對(duì)所述試劑的治療反應(yīng)可能增高或降低。
5.一種預(yù)測(cè)受試者對(duì)治療糖尿病的試劑的反應(yīng)的方法，其特征在于，所述方法包括測(cè)定受試者內(nèi)是否存在GHR基因的等位基因，其中所述等位基因與對(duì)所述試劑有高或低的陽性反應(yīng)的可能性相互關(guān)聯(lián)，從而可鑒定該受試者對(duì)所述試劑的治療反應(yīng)可能增高或降低。
6.一種預(yù)測(cè)受試者對(duì)治療肢端肥大癥或巨人癥的試劑的反應(yīng)的方法，其特征在于，所述方法包括測(cè)定受試者內(nèi)是否存在GHR基因的等位基因，其中所述等位基因與對(duì)所述試劑有高或低的陽性反應(yīng)的可能性相互關(guān)聯(lián)，從而可鑒定該受試者對(duì)所述試劑的治療反應(yīng)可能增高或降低。
7.一種預(yù)測(cè)受試者對(duì)治療鈉或水滯留相關(guān)疾病的試劑的反應(yīng)的方法，其特征在于，所述方法包括測(cè)定受試者內(nèi)是否存在GHR基因的等位基因，其中所述等位基因與對(duì)所述試劑有高或低的陽性反應(yīng)的可能性相互關(guān)聯(lián)，從而可鑒定該受試者對(duì)所述試劑的治療反應(yīng)可能增高或降低。
8.一種預(yù)測(cè)受試者對(duì)治療代謝綜合征的試劑的反應(yīng)的方法，其特征在于，所述方法包括測(cè)定受試者內(nèi)是否存在GHR基因的等位基因，其中所述等位基因與對(duì)所述試劑有高或低的陽性反應(yīng)的可能性相互關(guān)聯(lián)，從而可鑒定該受試者對(duì)所述試劑的治療反應(yīng)可能增高或降低。
9.一種預(yù)測(cè)受試者對(duì)治療心境和睡眠障礙的試劑的反應(yīng)的方法，其特征在于，所述方法包括測(cè)定受試者內(nèi)是否存在GHR基因的等位基因，其中所述等位基因與對(duì)所述試劑有高或低的陽性反應(yīng)的可能性相互關(guān)聯(lián)，從而可鑒定該受試者對(duì)所述試劑的治療反應(yīng)可能增高或降低。
10.一種預(yù)測(cè)受試者對(duì)治療癌癥的試劑的反應(yīng)的方法，其特征在于，所述方法包括測(cè)定受試者內(nèi)是否存在GHR基因的等位基因，其中所述等位基因與對(duì)所述試劑有高或低的陽性反應(yīng)的可能性相互關(guān)聯(lián)，從而可鑒定該受試者對(duì)所述試劑的治療反應(yīng)可能增高或降低。
11.一種預(yù)測(cè)受試者對(duì)治療心臟疾病的試劑的反應(yīng)的方法，其特征在于，所述方法包括測(cè)定受試者內(nèi)是否存在GHR基因的等位基因，其中所述等位基因與對(duì)所述試劑有高或低的陽性反應(yīng)的可能性相互關(guān)聯(lián)，從而可鑒定該受試者對(duì)所述試劑的治療反應(yīng)可能增高或降低。
12.一種預(yù)測(cè)受試者對(duì)治療高血壓的試劑的反應(yīng)的方法，其特征在于，所述方法包括測(cè)定受試者內(nèi)是否存在GHR基因的等位基因，其中所述等位基因與對(duì)所述試劑有高或低的陽性反應(yīng)的可能性相互關(guān)聯(lián)，從而可鑒定該受試者對(duì)所述試劑的治療反應(yīng)可能增高或降低。
13.一種鑒定受試者對(duì)采用能結(jié)合GHR蛋白的試劑治療疾病或病癥反應(yīng)可能增高或降低的方法，其特征在于，所述方法包括a)使存在GHR基因的等位基因與受試者對(duì)能結(jié)合GHR蛋白的試劑的反應(yīng)相關(guān)聯(lián)；和b)在該受試者中檢測(cè)步驟a)的等位基因，從而鑒定該受試者對(duì)用所述試劑治療的反應(yīng)可能增高或降低。
14.一種鑒定與采用能結(jié)合GHR蛋白的試劑治療疾病的可能性增高或降低相關(guān)的GHR基因的等位基因的方法，其特征在于，所述方法包括a)測(cè)定受試者中是否存在GHR基因的等位基因；和b)使步驟a)的等位基因的存在情況與用能結(jié)合GHR蛋白的試劑治療疾病的可能性增高或降低相關(guān)聯(lián)，從而鑒定出與用所述試劑治療的反應(yīng)可能增高或降低相關(guān)的等位基因。
15.如權(quán)利要求1或13-14所述的方法，其中，所述能結(jié)合GHR蛋白的試劑是能治療選自以下疾病的試劑身材矮小、肥胖癥、感染或糖尿病；肢端肥大癥或巨人癥，或與其相關(guān)的泌乳性、致糖尿病性、脂肪分解和蛋白同化效應(yīng)；與鈉或水滯留相關(guān)的癥狀；代謝綜合征；心境和睡眠障礙、癌癥、心臟病和高血壓。
16.一種加快受試者生長(zhǎng)的方法，其特征在于，所述方法包括(a)測(cè)定該受試者中是否存在GHR基因的等位基因，其中所述等位基因與對(duì)能加快受試者生長(zhǎng)的試劑的陽性反應(yīng)可能增高或降低相關(guān)聯(lián)；和(b)選擇或確定給予所述受試者的所述試劑的有效量。
17.一種治療肥胖癥患者的方法，其特征在于，所述方法包括(a)測(cè)定該受試者中是否存在GHR基因的等位基因，將該等位基因與對(duì)能改善肥胖或其癥狀的試劑的陽性反應(yīng)可能增高或降低相關(guān)聯(lián)；和(b)選擇或確定給予所述受試者的所述試劑的有效量。
18.一種治療糖尿病患者的方法，其特征在于，所述方法包括(a)測(cè)定該受試者中是否存在GHR基因的等位基因，將該等位基因與對(duì)能改善糖尿病或其癥狀的試劑的陽性反應(yīng)可能增高或降低相關(guān)聯(lián)；和(b)選擇或確定給予所述受試者的所述試劑的有效量。
19.一種治療感染患者的方法，其特征在于，所述方法包括(a)測(cè)定該受試者中是否存在GHR基因的等位基因，將該等位基因與對(duì)能改善感染或其癥狀的試劑的陽性反應(yīng)可能增高或降低相關(guān)聯(lián)；和(b)選擇或確定給予所述受試者的所述試劑的有效量。
20.一種治療肢端肥大癥或巨人癥患者的方法，其特征在于，所述方法包括(a)測(cè)定該受試者中是否存在GHR基因的等位基因，將該等位基因與對(duì)能改善肢端肥大或巨人癥，或與此二種疾病相關(guān)的泌乳性、致糖尿病性、脂肪分解和蛋白同化癥狀的試劑的陽性反應(yīng)可能增高或降低相關(guān)聯(lián)；和(b)選擇或確定給予所述受試者的所述試劑的有效量。
21.一種治療與鈉或水滯留異常相關(guān)癥狀患者的方法，其特征在于，所述方法包括(a)測(cè)定該受試者中是否存在GHR基因的等位基因，將該等位基因與對(duì)能改善所述與鈉或水滯留異常相關(guān)的癥狀的試劑的陽性反應(yīng)可能增高或降低相關(guān)聯(lián)；和(b)選擇或確定給予所述受試者的所述試劑的有效量。
22.一種治療代謝綜合征患者的方法，其特征在于，所述方法包括(a)測(cè)定該受試者中是否存在GHR基因的等位基因，將該等位基因與對(duì)能改善所述代謝綜合征或其癥狀的試劑的陽性反應(yīng)可能增高或降低相關(guān)聯(lián)；和(b)選擇或確定給予所述受試者的所述試劑的有效量。
23.一種治療心境和睡眠障礙患者的方法，其特征在于，所述方法包括(a)測(cè)定該受試者中是否存在GHR基因的等位基因，將該等位基因與對(duì)能改善所述心境和睡眠障礙或其癥狀的試劑的陽性反應(yīng)可能增高或降低相關(guān)聯(lián)；和(b)選擇或確定給予所述受試者的所述試劑的有效量。
24.一種治療癌癥患者的方法，其特征在于，所述方法包括(a)測(cè)定該受試者中是否存在GHR基因的等位基因，將該等位基因與對(duì)能治療癌癥的試劑的陽性反應(yīng)可能增高或降低相關(guān)聯(lián)；和(b)選擇或確定給予所述受試者的所述試劑的有效量。
25.一種治療心臟病或高血壓患者的方法，其特征在于，所述方法包括(a)測(cè)定該受試者中是否存在GHR基因的等位基因，將該等位基因與對(duì)能改善所述心臟病或高血壓或其癥狀的試劑的陽性反應(yīng)可能增高或降低相關(guān)聯(lián)；和(b)選擇或確定給予所述受試者的所述試劑的有效量。
26.如權(quán)利要求16-25中任一項(xiàng)所述的方法，還包括(c)給予所述受試者有效量的所述試劑。
27.如上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述方法包括測(cè)定受試者的DNA是否編碼含外顯子3缺失的GHR多肽。
28.如上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述方法包括測(cè)定受試者中是否存在GHRd3等位基因。
29.如權(quán)利要求27或28所述的方法，所述方法包括測(cè)定受試者是GHRd3等位基因的雜合子還是純合子。
30.如權(quán)利要求27-29所述的方法，其中，所述測(cè)定步驟包括檢測(cè)樣品中的GHRd3核酸。
31.如權(quán)利要求30所述的方法，其中，所述測(cè)定步驟包括進(jìn)行雜交試驗(yàn)。
32.如權(quán)利要求27-29所述的方法，其中，所述測(cè)定包括檢測(cè)樣品中的GHRd3多肽。
33.如權(quán)利要求32所述的方法，其中，所述測(cè)定步驟包括檢測(cè)抗體與樣品中GHRd3多肽的結(jié)合。
34.如上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述受試者是人類受試者。
35.如權(quán)利要求16所述的方法，其中，所述受試者患有ISS。
36.如權(quán)利要求16所述的方法，其中，所述受試者的身高低于同年齡同性別正常人2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差。
37.如權(quán)利要求16或26所述的方法，所述方法還包括測(cè)定受試者的身高是否低于同年齡同性別正常人2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差。
38.如上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述試劑是重組生長(zhǎng)激素多肽，或其片段或變體。
39.如權(quán)利要求38所述的方法，其中，GH的有效量高于約0.2mg/kg/周。
40.如權(quán)利要求38所述的方法，其中，GH的有效量高于約0.25mg/kg/周。
41.如權(quán)利要求38所述的方法，其中，GH的有效量高于約0.3mg/kg/周。
42.如權(quán)利要求38所述的方法，其中，GH的有效量在約0.001-0.2mg/kg/天之間。
43.如權(quán)利要求38所述的方法，其中，GH的有效量在約0.01-0.1mg/kg/天之間。
全文摘要
本發(fā)明提供使受試者對(duì)能結(jié)合生長(zhǎng)素受體(GHR)蛋白的試劑產(chǎn)生反應(yīng)的方法，該方法包括測(cè)定該受試者中是否存在GHR基因的等位基因，其中所述等位基因與對(duì)該試劑有高或低的陽性反應(yīng)的可能性相互關(guān)聯(lián)，從而可鑒定該受試者對(duì)該試劑的治療反應(yīng)可能增高或降低。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1747968SQ200380109702
公開日2006年3月15日 申請(qǐng)日期2003年11月10日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月19日
發(fā)明者P·布格內(nèi)雷斯 申請(qǐng)人:輝瑞健康股份公司