專(zhuān)利名稱(chēng)：預(yù)測(cè)抗氧化劑治療在預(yù)防高血糖患者的心血管疾病中的益處的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
和
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及一種依據(jù)觸珠蛋白2等位基因的多態(tài)性確定補(bǔ)充抗氧化劑在預(yù)防糖尿病患者的心血管疾病方面的預(yù)期益處的方法。
心血管疾病(CVD)是2型糖尿病患者的最常見(jiàn)的、最嚴(yán)重的和最昂貴的并發(fā)癥1。這是一種在2型糖尿病患者中最主要的死亡原因，它與糖尿病的病程無(wú)關(guān)2。一些基于人群的研究已經(jīng)一致表明糖尿病個(gè)體的CVD的相對(duì)危險(xiǎn)度要比非糖尿病患者高出數(shù)倍3-7。在女性中所增加的危險(xiǎn)甚至更為突出4，5，8。危險(xiǎn)因素例如高血壓、高脂血癥和吸煙都獨(dú)立地增加了糖尿病患者發(fā)生CVD的相對(duì)危險(xiǎn)度，但是糖尿病的作用顯示出是獨(dú)立于常見(jiàn)危險(xiǎn)因素的9。
雖然在所有被研究的人群中，糖尿病患者中的CVD發(fā)病率都要比非糖尿病患者更高，但糖尿病患者的CVD的相對(duì)危險(xiǎn)度仍存在著明顯的地區(qū)和人種的差異，這并不能被組間的常見(jiàn)心臟危險(xiǎn)因素的差異所完全解釋10-20。例如，對(duì)生活在英國(guó)的不同人種組中的CVD的相對(duì)危險(xiǎn)度的分析已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，與歐洲人起源的糖尿病患者比較，南亞人起源的糖尿病患者有著明顯增高的CVD危險(xiǎn)度12，5，而非洲-加勒比海的糖尿病患者有著明顯減低的CVD危險(xiǎn)度14，16。
這些研究說(shuō)明遺傳差異可能造成糖尿病患者對(duì)CVD易感性的差異。
當(dāng)構(gòu)思本發(fā)明時(shí)，當(dāng)時(shí)假設(shè)一個(gè)可能的原因在于觸珠蛋白基因的功能性等位基因的多態(tài)性。
觸珠蛋白(Hp)是一種結(jié)合血紅蛋白的血清蛋白，它在保護(hù)性對(duì)抗血色素啟動(dòng)的氧化應(yīng)激上發(fā)揮著重要作用23，24。缺少Hp基因的鼠表現(xiàn)出氧化應(yīng)激的顯著增加以及特別是在腎臟內(nèi)的氧化性組織損傷。在人類(lèi)，有兩種常見(jiàn)的Hp等位基因(1和2)，表現(xiàn)為1-1、2-1和2-2三種主要的表型21-23。
已經(jīng)證實(shí)三種表型在結(jié)合血紅蛋白能力上的功能差異。Hp1-1表型患者的每克Hp比含有觸珠蛋白2等位基因產(chǎn)物的Hp能結(jié)合更多的血紅蛋白23。觸珠蛋白1-1表型患者的觸珠蛋白分子也是更為有效的抗氧化劑，因?yàn)楦◇w積的觸珠蛋白1-1比觸珠蛋白2等位基因的產(chǎn)物更容易進(jìn)入氧化性組織損傷的血管外部分。這也包括具有觸珠蛋白1-1的患者具有顯著更大的腎小球?qū)τ|珠蛋白的濾過(guò)(sieving)22。
觸珠蛋白2等位基因顯示是在將近2000萬(wàn)年前經(jīng)部分基因復(fù)制事件起源于1等位基因，并作為與耐感染性病原體相關(guān)的選擇壓力的結(jié)果在全球范圍內(nèi)得以散布24，25。目前，觸珠蛋白等位基因的相對(duì)頻率在不同的人種中有著很大不同?；驈?fù)制事件已經(jīng)造成2等位基因中的每一個(gè)所編碼的觸珠蛋白蛋白的生物物理和生物化學(xué)性能的極大變化26。例如，與2等位基因所產(chǎn)生的蛋白產(chǎn)物比較，1等位基因的蛋白產(chǎn)物是更好的抗氧化劑23。通過(guò)凝膠電泳容易從10ml血漿中鑒定出任何個(gè)體的觸珠蛋白表型1-1、2-1或2-2。
最近已經(jīng)證實(shí)觸珠蛋白表型是糖尿病患者發(fā)生各種微血管并發(fā)癥的預(yù)測(cè)因素27-29。具體地，發(fā)現(xiàn)觸珠蛋白1等位基因純合子的患者發(fā)生視網(wǎng)膜病變和腎病的危險(xiǎn)降低。在1型和2型糖尿病患者中都觀察到了這種作用，至少是對(duì)腎病的作用，以及觸珠蛋白2等位基因數(shù)目與發(fā)生腎病的梯度效應(yīng)的發(fā)現(xiàn)強(qiáng)化了這種相關(guān)性29。此外，已經(jīng)顯示觸珠蛋白表型可能是糖尿病患者發(fā)生大血管并發(fā)癥的預(yù)測(cè)因素。我們已經(jīng)顯示具有1-1觸珠蛋白表型的糖尿病患者經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈成形術(shù)后的再狹窄的發(fā)生是顯著降低的27，30。以往的檢測(cè)普通人群的觸珠蛋白和冠狀動(dòng)脈疾病的回顧性和橫向研究已經(jīng)得到了相互矛盾的結(jié)果31-38。還沒(méi)有研究觸珠蛋白表型在糖尿病患者發(fā)生冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性疾病中的作用。
以往認(rèn)為不容易發(fā)生冠狀動(dòng)脈疾病的美洲印第安人現(xiàn)在也正在流行CVD20。CVD發(fā)病率的增加已經(jīng)被歸結(jié)于2型糖尿病在該人群中的快速增長(zhǎng)1，2。Strong心臟研究已經(jīng)檢測(cè)了3個(gè)地理區(qū)域內(nèi)的美洲印第安人的心血管病的發(fā)病率、患病率和危險(xiǎn)因素，從1988年開(kāi)始并持續(xù)監(jiān)測(cè)到現(xiàn)在20。該人群患者的相對(duì)的遺傳學(xué)均一性可以容許識(shí)別出引起糖尿病病變中的CVD的特異的遺傳因素。
因此，在美國(guó)專(zhuān)利No.6,613,519中，首次在Strong心臟研究的病例/對(duì)照樣本中得出了糖尿病患者的CVD的相對(duì)危險(xiǎn)度與觸珠蛋白表型之間的相關(guān)性。
一些以往的科學(xué)出版物描述了在觸珠蛋白表型與疾病之間建立聯(lián)系的方法。WO98/37419教導(dǎo)了一種用于確定觸珠蛋白的方法和試劑盒并具體地涉及包括人觸珠蛋白的應(yīng)用。該申請(qǐng)的內(nèi)容集中于觸珠蛋白2-2表型作為獨(dú)立危險(xiǎn)因素的用途，特別是涉及難治性原發(fā)性高血壓的靶器官損傷，涉及動(dòng)脈粥樣硬化(普通人群)和急性心肌梗死以及涉及HIV感染的死亡率。這個(gè)申請(qǐng)沒(méi)有提及觸珠蛋白表型作為DM的心血管病的危險(xiǎn)因素的用途。因?yàn)橛|珠蛋白2-2表型具有使得患者更容易成為氧化應(yīng)激的趨勢(shì)，因此可能會(huì)有人認(rèn)為該專(zhuān)利間接提及了2-2表型作為DM的心血管病的負(fù)性預(yù)測(cè)因素的用途。但是，該專(zhuān)利的闡述沒(méi)有包括如下的想法，即將觸珠蛋白1-1表型作為減少DM發(fā)生心血管病的傾向的陽(yáng)性預(yù)測(cè)因素，或作為補(bǔ)充抗氧化劑的療效的陽(yáng)性預(yù)測(cè)因素。事實(shí)上，在后來(lái)的研究中，PCT WO98/37419的作者報(bào)告了相反的結(jié)果，他們總結(jié)Hp1-1患者的心血管病死亡率的危險(xiǎn)是增加的(De Bacquer et al，Atherosclerosis2001；157161-6)。既然許多研究已經(jīng)報(bào)道沒(méi)有結(jié)果或相互矛盾的結(jié)果(Buhlin et al Eur Heart J 2003；242099-107；Lind et al Angiology 2003；54401-10；Hong et al Hum Hered 1997；47283-7)，那么所推論的觸珠蛋白表型和疾病之間的有用的相關(guān)性就需要仔細(xì)和富有想象力的分析。
換句話說(shuō)，已經(jīng)提出來(lái)源于Hp 2-1或2-2表型的氧化應(yīng)激造成了普通人群中的血管并發(fā)癥。也已知某些血管并發(fā)癥與DM相關(guān)的氧化應(yīng)激相關(guān)。然而，對(duì)于Hp1-1表型是否能影響對(duì)用于預(yù)防糖尿病患者的血管并發(fā)癥的補(bǔ)充抗氧化劑治療的反應(yīng)，現(xiàn)在仍不清楚也不能預(yù)測(cè)。
PCT WO98/37419的描述包括一種觸珠蛋白結(jié)合伴侶的用途。PCTWO98/37419的結(jié)合伴侶可以是任何具有至少兩個(gè)與觸珠蛋白結(jié)合的位點(diǎn)的分子。可以通過(guò)肽、抗體或它們的一部分，或通過(guò)凝集素、細(xì)胞受體、分子印跡(imprint)或細(xì)菌抗原或它們的一部分，而形成位點(diǎn)。這個(gè)專(zhuān)利的描述具體提及了化膿性鏈球菌的T4抗原的用途。所有的觸珠蛋白都含有α鏈和β鏈。
所有觸珠蛋白的β鏈都是相同的，但是觸珠蛋白基因的兩個(gè)等位基因之間的α鏈?zhǔn)遣煌?。觸珠蛋白的α2鏈?zhǔn)歉鶕?jù)不等交換的突變的結(jié)果，它包括142個(gè)氨基酸，不同于α1鏈的83個(gè)氨基酸。α1和α2鏈?zhǔn)敲庖邔W(xué)相似的，除了α2鏈具有獨(dú)特的氨基酸殘基序列(Ala-Val-Gly-Asp-Lys-Leu-Pro-Glu-Cys-Glu-Ala-Asp-Asp-Gly-Gln-Pro-Pro-Pro-Lys-Cys-Ile，SEQ ID NO1)。因此，這個(gè)獨(dú)特肽序列的任一部分可以是用于形成區(qū)別含有α1和α2鏈的觸珠蛋白的抗體的適合的抗原決定簇，如在“應(yīng)用抗體實(shí)驗(yàn)手冊(cè)”(Ed Harlow and David Lane eds.，Cold SpringHarbor Laboratory Press(1999))中所描述的那樣，在此將其全部?jī)?nèi)容一同并入?yún)⒖?。這些抗體可以是單克隆的、多克隆的或它們的任何部分，它們可以被本領(lǐng)域人員所熟知的各種方法中的任何一種方法所富集或純化。另外，編碼該序列的核苷酸序列可以被便利地用于區(qū)分Hp基因型。
抗氧化劑、觸珠蛋白和糖尿病患者的心血管疾病(CVD)的預(yù)防與普通人群中的2-4％的發(fā)病率相比較，成人糖尿病患者中的冠狀動(dòng)脈疾病的總發(fā)病率超過(guò)55％。與非糖尿病患者相比較，有糖尿病的CVD男性患者的死亡率比無(wú)糖尿病的患者多兩倍，女性患者更要多四倍(Stamler，etal.Diabetes Care 1993；16434-444)。氧化應(yīng)激的增加代表了一種吸引人的統(tǒng)一機(jī)制，其可解釋一些已知的介導(dǎo)糖尿病血管病變的信號(hào)傳導(dǎo)通路的共同激活(Nishikawa et al.，Nature 2000；404787-790)。高糖血癥和葡萄糖自氧化所形成的氧化環(huán)境使得形成了進(jìn)展的糖化終產(chǎn)物(AGE)(Ohgami et al.，J Diabetes Complic 2002；1656-59)及經(jīng)修飾的低密度脂蛋白(ox-LDL)(Steinberg D J Biol Chem 1997；27220963-6)，它能刺激涉及糖尿病血管病中所發(fā)現(xiàn)的病理和形態(tài)學(xué)改變的多種炎性因子的形成。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)據(jù)支持了氧化假說(shuō)，其中抗氧化劑例如維生素E已經(jīng)被證實(shí)能顯著地延遲動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程(Williams et al Atherosclerosis 1992；94153-59)。但是，盡管在體外和實(shí)驗(yàn)室研究中有著有希望的結(jié)果，但是一些最近的、大規(guī)模的前瞻性的安慰劑對(duì)照臨床試驗(yàn)不能提供結(jié)論性的證據(jù)支持單獨(dú)使用維生素E(HOPE Study Investigators N E J Med 2000；342154-160；Hodis et al，Circulation 2002；1061453-59；Jiang et al，J BiolChem 2002；27731850-6)或與其他抗氧化維生素聯(lián)合使用維生素E(GISSI，Lancet 1999；3544477-55；Brown et al NE J Med 2001；3451538-92；Marchioli et al，Lipids；200136SupplS53-63；Waters et al，JAMA 2002；2882432-40；Witztum et al Trends Cardio Med 2001；1193-102)減少大的不良性心血管事件的發(fā)生率的益處。心臟后果預(yù)防評(píng)價(jià)(HOPE)試驗(yàn)就是這樣的一個(gè)研究，它特異地研究了維生素E治療對(duì)預(yù)防糖尿病的CVD的療效(HOPE Study Investigators N E J Med 2000；342154-160)。HOPE研究沒(méi)有證實(shí)每日施與400IU維生素E 4.5年對(duì)心血管(CV)后果的任何臨床益處。已經(jīng)提出一些機(jī)制解釋維生素E在這些研究中表面失敗的原因。Steinberg已經(jīng)提出只有在表現(xiàn)為氧化應(yīng)激增強(qiáng)的特異的患者亞組中才有可能證實(shí)抗氧化劑治療的益處(Steinberg et alCirculation 2002；1052107-111)。
糖尿病患者的血管并發(fā)癥隨著時(shí)間而發(fā)生，即使用胰島素或口服降糖(降低血糖)藥物控制住他們的血糖水平。有多種糖尿病高危發(fā)生的血管并發(fā)癥，包括糖尿病視網(wǎng)膜病變、糖尿病性白內(nèi)障和青光眼、糖尿病腎病、糖尿病神經(jīng)病變、間歇性跛行和壞疽、高脂血癥和心血管問(wèn)題例如高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化和冠狀動(dòng)脈疾病。動(dòng)脈粥樣硬化可以引起心絞痛和心臟病發(fā)作，并且它在糖尿病人群中的發(fā)病率是非糖尿病人群的兩倍，同等影響著男性和女性。
越來(lái)越多的證據(jù)顯示這些糖尿病的血管疾病只發(fā)生在那些遺傳學(xué)易感的患者中(UK Prospective Study Group Diab Care 1998；211271-77)。觸珠蛋白基因具有多態(tài)性，具有兩類(lèi)主要類(lèi)型的等位基因，稱(chēng)為1和2。最近已經(jīng)證實(shí)觸珠蛋白基因的這種多態(tài)性是糖尿病個(gè)體的CVD的獨(dú)立的危險(xiǎn)因素(見(jiàn)2003年9月2日授予Levy等的美國(guó)專(zhuān)利No6,613,519、下面的實(shí)施例1、和Levy et alJ Am Coll Card 2002；401984-90)。發(fā)現(xiàn)觸珠蛋白2等位基因純合子的糖尿病患者有著比那些觸珠蛋白1等位基因純合子的患者高出5倍的CVD危險(xiǎn)度。同一作者也已經(jīng)證實(shí)觸珠蛋白2等位基因蛋白產(chǎn)物是一種弱抗氧化劑，弱于觸珠蛋白1等位基因蛋白產(chǎn)物(Melamed-Frank et al Blood 2001；983693-98)。但是，上述的研究既沒(méi)有尋找也沒(méi)有暗示補(bǔ)充抗氧化劑和糖尿病患者的CVD、以及觸珠蛋白表型的相關(guān)性、或這種相關(guān)性在預(yù)測(cè)從抗氧化劑治療中獲益的用途。因此，我們假設(shè)補(bǔ)充抗氧化劑對(duì)于觸珠蛋白2等位基因純合子的糖尿病患者在預(yù)防不良的心血管事件上將是有益的。為了驗(yàn)證這種假說(shuō)，我們用觸珠蛋白將HOPE研究的參與者分類(lèi)并依據(jù)維生素E和雷米普利(Ramipril)治療確定出這些可能的觸珠蛋白類(lèi)型的主要心血管終點(diǎn)的相對(duì)危險(xiǎn)率。
一種預(yù)測(cè)哪些特定的糖尿病患者有著更低的心血管病的危險(xiǎn)以及哪些特殊的患者亞組將從預(yù)防性抗氧化劑治療中獲益的方法是一種被廣泛認(rèn)同的需要，并且這將是極為有益的。這樣的一種方法將容許醫(yī)生最好地利用可獲得的資源，且最大程度地將每個(gè)患者的危險(xiǎn)最小化。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)本發(fā)明，提供了一種確定糖尿病患者從用于治療血管并發(fā)癥的抗氧化劑治療中獲益的可能性的方法，該方法包括確定糖尿病患者的觸珠蛋白表型并據(jù)此確定出糖尿病患者從所述的抗氧化劑治療中獲益的可能性，其中與具有觸珠蛋白1-2表型或觸珠蛋白1-1表型的患者相比，具有觸珠蛋白2-2表型的患者從所述的抗氧化劑治療中的獲益更大。
根據(jù)本發(fā)明的仍另一個(gè)部分，提供了一種確定減少糖尿病患者的氧化應(yīng)激對(duì)于預(yù)防糖尿病相關(guān)的血管并發(fā)癥的重要性的方法，該方法包括確定糖尿病患者的觸珠蛋白表型的步驟，并據(jù)此確定出減少特定的糖尿病患者的氧化應(yīng)激的重要性，其中與具有觸珠蛋白1-2表型或觸珠蛋白1-1表型的患者相比，在具有觸珠蛋白2-2表型的患者中減少氧化應(yīng)激的重要性更大。
根據(jù)下面描述的本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案的進(jìn)一步的特點(diǎn)，血管并發(fā)癥選自由微血管并發(fā)癥和大血管并發(fā)癥所構(gòu)成的組。
根據(jù)下面描述的本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案的進(jìn)一步的特點(diǎn)，血管并發(fā)癥是一種選自由慢性心衰、心血管死亡、中風(fēng)、心肌梗死和冠狀動(dòng)脈血管成形術(shù)相關(guān)的再狹窄所構(gòu)成的組的大血管并發(fā)癥。
根據(jù)下面描述的本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案的進(jìn)一步的特點(diǎn)，微血管并發(fā)癥選自由糖尿病視網(wǎng)膜病變、糖尿病腎病和糖尿病神經(jīng)病變所構(gòu)成的組。
根據(jù)下面描述的本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案的進(jìn)一步的特點(diǎn)，大血管并發(fā)癥選自由冠狀動(dòng)脈側(cè)支血管減少(fewer coronary artery collateralblood vessels)和心肌缺血所構(gòu)成的組。
根據(jù)下面描述的本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案的進(jìn)一步的特點(diǎn)，通過(guò)確定糖尿病患者的觸珠蛋白基因型實(shí)現(xiàn)對(duì)觸珠蛋白表型的確定。
根據(jù)下面描述的本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案的仍進(jìn)一步的特點(diǎn)，通過(guò)一種選自由信號(hào)擴(kuò)增法、直接檢測(cè)法和對(duì)至少一種序列改變的檢測(cè)所構(gòu)成的組的方法實(shí)現(xiàn)確定糖尿病患者的觸珠蛋白基因型的步驟。
根據(jù)下面描述的本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案的進(jìn)一步的特點(diǎn)，信號(hào)擴(kuò)增法擴(kuò)增一種選自由DNA分子和RNA分子所構(gòu)成的組的分子。
根據(jù)下面描述的本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案的仍進(jìn)一步的特點(diǎn)，信號(hào)擴(kuò)增法選自由PCR、LCR(LAR)、自動(dòng)維持合成反應(yīng)(3SR/NASBA)和Q-β(即Qβ)復(fù)制酶反應(yīng)所構(gòu)成的組。
根據(jù)下面描述的本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案的仍進(jìn)一步的特點(diǎn)，直接檢測(cè)法選自由循環(huán)探針?lè)磻?yīng)(CPR)和分支DNA(branched DNA)分析所構(gòu)成的組。
根據(jù)下面描述的本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案的進(jìn)一步的特點(diǎn)，對(duì)至少一種序列改變的檢測(cè)采用了一種選自由限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP分析)、等位基因特異性寡核苷酸(ASO)分析、變性/溫度梯度凝膠電泳(DGGE/TGGE)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)和雙脫氧指紋印跡法(ddF)所構(gòu)成的組的方法。
根據(jù)下面描述的本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案的仍進(jìn)一步的特點(diǎn)，通過(guò)直接確定糖尿病患者的觸珠蛋白表型實(shí)現(xiàn)對(duì)所述的觸珠蛋白表型的確定。
根據(jù)下面描述的本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案的仍進(jìn)一步的特點(diǎn)，通過(guò)免疫檢測(cè)法實(shí)現(xiàn)確定觸珠蛋白表型的步驟。
根據(jù)下面描述的本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案的進(jìn)一步的特點(diǎn)，免疫檢測(cè)法選自由放射免疫檢測(cè)法(RIA)、酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)法(ELISA)、western印跡法、免疫組織化學(xué)分析法和熒光激活細(xì)胞分選術(shù)(FACS)所構(gòu)成的組。
具體實(shí)施方案本發(fā)明是一種評(píng)價(jià)高血糖患者發(fā)生心血管疾病的危險(xiǎn)的方法，以便能夠在適當(dāng)?shù)那闆r下施用預(yù)防性藥物。具體地，本發(fā)明是一種評(píng)價(jià)糖尿病患者從用于預(yù)防心血管疾病(CVD)的抗氧化劑治療中獲益的可能性的方法。
在詳細(xì)地解釋本發(fā)明的至少一種具體實(shí)施方案之前，要明白本發(fā)明并沒(méi)有將其應(yīng)用限定于在下面的描述和


中所公開(kāi)的成分的構(gòu)建和排列的細(xì)節(jié)中。本發(fā)明能以不同的方法實(shí)踐或?qū)嵤┢渌膶?shí)施方案。也要明白在此所采用的措辭和術(shù)語(yǔ)只是用于說(shuō)明的目的，并不應(yīng)當(dāng)被認(rèn)作為限制。
根據(jù)一些大的最近發(fā)表的大臨床試驗(yàn)，抗氧化劑治療沒(méi)有被推薦用于預(yù)防CVD高?；颊叩牟涣嫉腃V后果(The Heart Outcomes PreventionEvaluation Study Investigators.N Eng J Med 2000；342154-160；Hodis，et al.Circulation 2002；1061453-1459；Gruppo Italiano per lo Studio dellaSoprawivenza nell′Infarto Miocardico.Lancet 1999；354447-455；Brown etal.N Engl J Med 2001；3451583-1592.)。
雖然對(duì)來(lái)自一項(xiàng)對(duì)預(yù)防性抗氧化劑治療的療效的大規(guī)模研究的數(shù)據(jù)的分析沒(méi)有提示整個(gè)樣本從抗氧化劑治療中的任何獲益，但是本作者首次證實(shí)了可以鑒定出的確從補(bǔ)充抗氧化劑中獲益的亞組。具體地，在HOPE研究中，用維生素E補(bǔ)充具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義地減少了具有Hp 2-2表型的糖尿病個(gè)體的CV死亡和非致死性心肌梗死，以及用雷米普利治療具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義地減少了復(fù)合終點(diǎn)(非致死性MI、中風(fēng)或心血管死亡)(見(jiàn)以下的實(shí)施例II)。對(duì)Strong心臟研究中的觸珠蛋白表型與CVD的相關(guān)性的分析表明Hp 2-2增加了糖尿病CVD的危險(xiǎn)(見(jiàn)以下的實(shí)施例I，和Levy AP et al.J Am Coll Card 2002；401984-1990)以及Hp 2-2是一種較差的抗氧化劑(Melamed-Frank M，et al.Blood 2001；983693-3698)。無(wú)意于受到單一的假說(shuō)所限制，Hp 2-2的較差的抗氧化劑特性可以解釋從抗氧化劑中獲益可能是選擇性來(lái)自該糖尿病患者亞組的原因，并且這些發(fā)現(xiàn)明顯是具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的。在已經(jīng)觀察到觸珠蛋白類(lèi)型對(duì)非糖尿病患者的CVD發(fā)生率沒(méi)有顯著影響(見(jiàn)以下的實(shí)施例I)，以及已經(jīng)顯示出抗氧化劑治療(用維生素E)對(duì)非糖尿病患者沒(méi)有任何作用(見(jiàn)以下的實(shí)施例II)，從這些事實(shí)中可以找到觸珠蛋白的這種作用的其他支持。無(wú)意于受單一假說(shuō)的限制，可以假設(shè)Hp 2-2的低下的抗氧化活性的重要性只能在存在產(chǎn)生氧化應(yīng)激的其他機(jī)制(糖尿病)的情況下才能在臨床上表現(xiàn)出來(lái)。
因此，根據(jù)本發(fā)明，提供了一種確定糖尿病患者從用于治療血管并發(fā)癥的抗氧化劑治療中獲益的可能性的方法，該方法包括確定出糖尿病患者的觸珠蛋白表型并據(jù)此確定出糖尿病患者從所述的抗氧化劑治療中獲益的可能性，其中與具有觸珠蛋白1-2表型或觸珠蛋白1-1表型的患者相比，具有觸珠蛋白2-2表型的患者從所述的抗氧化劑治療中的獲益更大。
鑒于例如HOPE和GISSI研究等的研究結(jié)果并沒(méi)有對(duì)抗氧化劑治療對(duì)其起效的亞群作出任何提示，在此所示的數(shù)據(jù)首次清楚地顯示了維生素E補(bǔ)充具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義地減少了具有Hp 2-2表型的糖尿病個(gè)體的CV死亡及非致死性心肌梗死，而雷米普利具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義地減少了復(fù)合終點(diǎn)(非致死性MI、中風(fēng)或心血管死亡)(見(jiàn)以下的實(shí)施例II)。因此，本發(fā)明還提供了一種確定減少糖尿病患者的氧化應(yīng)激以預(yù)防糖尿病相關(guān)的血管并發(fā)癥的重要性的方法，該方法包括確定糖尿病患者的觸珠蛋白表型的步驟，據(jù)此確定出減少特異的糖尿病患者的氧化應(yīng)激的重要性，其中與具有觸珠蛋白1-2表型或觸珠蛋白1-1表型的患者相比，在具有觸珠蛋白2-2表型的患者中減少氧化應(yīng)激的重要性更大。
本發(fā)明也提供了一種用于評(píng)價(jià)糖尿病患者從用于治療血管并發(fā)癥的抗氧化劑治療中獲益的可能性的試劑盒。試劑盒包括用于確定糖尿病患者的觸珠蛋白表型的成套試劑以及該試劑盒被用于評(píng)價(jià)糖尿病患者從用于治療血管并發(fā)癥的抗氧化劑治療中獲益的可能性。從下面的描述以及進(jìn)一步從觸珠蛋白1和2等位基因的熟知的和特征性的序列數(shù)據(jù)中可以發(fā)現(xiàn)，這些試劑的特性對(duì)于本領(lǐng)域人員將是顯而易見(jiàn)的。
通過(guò)下面實(shí)施例部分的表1-6中的數(shù)據(jù)證實(shí)了本發(fā)明的方法和試劑盒的效用。
因此，在來(lái)自基于人群的縱向研究的樣本中，在此證實(shí)了觸珠蛋白表型是一種糖尿病患者從用于治療血管并發(fā)癥的抗氧化劑治療中獲益的可能性的重要的預(yù)測(cè)因素。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，血管并發(fā)癥選自由微血管并發(fā)癥和大血管并發(fā)癥所構(gòu)成的組。
糖尿病患者有著發(fā)生各種血管并發(fā)癥的危險(xiǎn)，包括糖尿病視網(wǎng)膜病變、糖尿病性白內(nèi)障和青光眼、糖尿病腎病、糖尿病神經(jīng)病變、間歇性跛行和壞疽、高脂血癥及心血管問(wèn)題例如高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化和冠狀動(dòng)脈疾病。動(dòng)脈粥樣硬化可以引起心絞痛和心臟病發(fā)作，并且它在糖尿病人群中的發(fā)生率是非糖尿病人群的兩倍，同等影響男性和女性。糖尿病的微血管并發(fā)癥在此包括糖尿病神經(jīng)病變(神經(jīng)損傷)、糖尿病腎病(腎病)和視覺(jué)異常(例如糖尿病視網(wǎng)膜病變、青光眼、白內(nèi)障和角膜疾病)。大血管并發(fā)癥包括進(jìn)展性動(dòng)脈粥樣硬化性冠狀動(dòng)脈血管病變例如心肌梗死、慢性心臟衰竭、心血管死亡和心臟病、中風(fēng)和周?chē)懿?它可導(dǎo)致潰瘍、壞疽和截肢)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，血管并發(fā)癥是一種選自由慢性心衰、心血管死亡、中風(fēng)、心肌梗死、冠狀動(dòng)脈血管成形術(shù)相關(guān)的再狹窄、冠狀動(dòng)脈側(cè)支血管減少和心肌缺血所構(gòu)成的組的大血管并發(fā)癥。在另一個(gè)實(shí)施方案中，血管并發(fā)癥是一種微血管并發(fā)癥，例如糖尿病神經(jīng)病變、糖尿病腎病或糖尿病視網(wǎng)膜病變。
在不同的人種組中的觸珠蛋白1等位基因的頻率與這些組中的糖尿病微血管和大血管并發(fā)癥的相對(duì)發(fā)病率之間的相關(guān)性進(jìn)一步支持了觸珠蛋白對(duì)于補(bǔ)充抗氧化劑對(duì)糖尿病的血管病變的可能益處的預(yù)測(cè)價(jià)值。
例如，非洲-加勒比海的糖尿病患者具有低相對(duì)危險(xiǎn)度的CVD14，16和微血管并發(fā)癥以及高頻率的觸珠蛋白1等位基因(在一些人群中為0.87)26，而澳大利亞土著19的糖尿病患者和南亞的糖尿病患者12，15具有高相對(duì)危險(xiǎn)度的CVD和糖尿病微血管47并發(fā)癥以及相對(duì)低頻率的觸珠蛋白1等位基因(分別為0.18和0.09)26。
最近鑒定了觸珠蛋白表型可以影響動(dòng)脈粥樣硬化性CVD的臨床病程的兩種機(jī)制。首先，經(jīng)皮腔內(nèi)冠狀動(dòng)脈血管成形術(shù)后的再狹窄的分級(jí)危險(xiǎn)被證實(shí)是與觸珠蛋白2等位基因相關(guān)27，30。其次，證實(shí)了具有觸珠蛋白2-1表型的糖尿病個(gè)體比有著相似程度的冠狀動(dòng)脈疾病的具有觸珠蛋白2-2表型的個(gè)體有著顯著更多的冠狀動(dòng)脈的側(cè)支血管。以往已經(jīng)證實(shí)個(gè)體間在冠狀動(dòng)脈側(cè)支循環(huán)程度上的差異是心肌梗死的嚴(yán)重度的關(guān)鍵的決定因素48。
一些功能已經(jīng)被指定到觸珠蛋白，它可以影響動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展。血清觸珠蛋白的主要功能是結(jié)合游離的血紅蛋白，這已經(jīng)被認(rèn)識(shí)超過(guò)60年22。這種相互作用被認(rèn)為是幫助清除鐵并阻止它從尿液的丟失，以及作用為一種抗氧化劑，據(jù)此保護(hù)組織對(duì)抗血紅蛋白介導(dǎo)的組織氧化23。不同觸珠蛋白表型的抗氧化能力已經(jīng)顯示出不同，觸珠蛋白1-1蛋白顯示出具有比其他形式的蛋白更優(yōu)的抗氧化保護(hù)作用23。假定氧化應(yīng)激在發(fā)生糖尿病血管并發(fā)癥中的非常重要的作用，這樣的一種抗氧化劑假說(shuō)是特別吸引人的49，50?？赡苓M(jìn)一步放大的不同類(lèi)型的觸珠蛋白所提供的氧化保護(hù)的表面差異是具有不同表型的個(gè)體中所存在的觸珠蛋白的大小的大體差異。觸珠蛋白1-1明顯要比觸珠蛋白2-2更小，因此可能能更好地進(jìn)入到血管外間隙并預(yù)防血管損傷部位上的血紅蛋白介導(dǎo)的組織損傷23。但是，對(duì)觸珠蛋白在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用仍了解的很少，一些研究相互矛盾地證實(shí)了Hp1-1增加了心血管死亡率的危險(xiǎn)(De Bacquer et al，Atherosclerosis 2001；157161-6)。
觸珠蛋白也被證實(shí)是作為免疫調(diào)節(jié)物發(fā)揮作用，并且這種作用可能不會(huì)與它在血紅蛋白代謝中的作用沒(méi)有關(guān)聯(lián)21，23。最近在單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞中已經(jīng)鑒定出一種觸珠蛋白-血紅蛋白復(fù)合物的特異性受體為CD16351，一個(gè)B組清道夫受體富含半胱氨酸超家族的成員52。另一個(gè)該清道夫受體超家族的成員CD36先前已經(jīng)被表明在LDL代謝中發(fā)揮著重要作用以及對(duì)于動(dòng)脈粥樣硬化病變的發(fā)展具有重要意義53-55。發(fā)現(xiàn)與血紅蛋白復(fù)合的觸珠蛋白2-2對(duì)該受體的親和力比與血紅蛋白復(fù)合的觸珠蛋白1-1高出10倍51。已經(jīng)表明與CD163結(jié)合的配體誘導(dǎo)了酪氨酸激酶依賴性信號(hào)級(jí)聯(lián)所造成的大量炎性細(xì)胞因子的分泌56。也已經(jīng)證實(shí)觸珠蛋白單獨(dú)能與粒細(xì)胞和單核細(xì)胞結(jié)合。觸珠蛋白阻斷了中性粒細(xì)胞對(duì)各種激動(dòng)劑和已知的血漿膜受體的反應(yīng)，說(shuō)明觸珠蛋白可能作用為一種免疫系統(tǒng)的受體-配體相互作用的拮抗劑57。已經(jīng)證實(shí)觸珠蛋白與MAC-1或CD11b/CD18受體58(一種整聯(lián)蛋白家族的成員)的特異性結(jié)合。這些整聯(lián)蛋白已經(jīng)顯示出在血管壁對(duì)損傷的反應(yīng)上發(fā)揮著重要作用59。
多個(gè)研究已經(jīng)說(shuō)明細(xì)菌感染在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的發(fā)展和去穩(wěn)定上的重要作用60。在這個(gè)方面，各種表型在預(yù)防體外和體內(nèi)細(xì)菌及病毒復(fù)制上的能力的差別對(duì)于與觸珠蛋白相關(guān)的動(dòng)脈粥樣硬化的不同的相對(duì)危險(xiǎn)度可能是重要的23-25。這可以歸結(jié)于鐵清除上的差異23以及不同表型所提供的免疫調(diào)節(jié)的差異51。
這些發(fā)現(xiàn)與在此所顯示的關(guān)于觸珠蛋白表型和從用于預(yù)防糖尿病血管并發(fā)癥的補(bǔ)充抗氧化劑中獲益的結(jié)果完全一致。具有不同的觸珠蛋白表型的糖尿病患者對(duì)抗氧化劑治療的相對(duì)反應(yīng)的顯著差異應(yīng)該足以保證在CVD危險(xiǎn)分層算法中和在評(píng)價(jià)為預(yù)防糖尿病患者的CVD所設(shè)計(jì)的潛在的治療干預(yù)(例如補(bǔ)充抗氧化劑和聯(lián)合抗氧化劑與藥物治療)中所用的糖尿病患者進(jìn)行大規(guī)模測(cè)試。
根據(jù)本發(fā)明方法的各種優(yōu)選的實(shí)施方案，通過(guò)多種方法中的任一方法實(shí)現(xiàn)對(duì)受試者的觸珠蛋白表型的確定，這些方法包括但不限定于信號(hào)擴(kuò)增法、直接檢測(cè)法和對(duì)至少一種序列改變的檢測(cè)。這些方法通過(guò)確定基因型間接地確定出表型。如在下面所解釋的那樣，通過(guò)分析觸珠蛋白基因產(chǎn)物直接地完成對(duì)觸珠蛋白表型的確定。
本發(fā)明的各種優(yōu)選的實(shí)施方案的信號(hào)擴(kuò)增法可以擴(kuò)增例如DNA分子或RNA分子?？杀挥米鳛楸景l(fā)明的一部分的信號(hào)擴(kuò)增法包括，但不限定于，PCR、LCR(LAR)、自動(dòng)維持合成反應(yīng)(3SR/NASBA)或Q-β(Qβ)復(fù)制酶反應(yīng)。
聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)如在授予Mullis和Mullis等的美國(guó)專(zhuān)利No.4,683,195和4,683,202中所描述的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)是一種增加基因組DNA混和物中的靶序列片段的濃度且無(wú)克隆或純化的方法。該技術(shù)提供了一種解決低濃度靶序列的問(wèn)題的方法。PCR可被用于將靶序列濃度直接地增加到可被容易檢測(cè)到的水平。用于擴(kuò)增靶序列的這個(gè)方法包括往含有所需的靶序列的DNA混和物中引入摩爾過(guò)量的兩種與雙鏈靶序列的相應(yīng)鏈互補(bǔ)的寡核苷酸引物。將混和物變性，然后雜交。在雜交后，用聚合酶延伸引物使得形成互補(bǔ)鏈。?？砂葱柚貜?fù)變性、雜交(退火)和聚合酶延長(zhǎng)(延伸)的步驟，以獲得相對(duì)高濃度的所需的靶序列片段。
通過(guò)引物彼此的相對(duì)位置可確定所需靶序列片段的長(zhǎng)度，因此該長(zhǎng)度是可控的參數(shù)。因?yàn)樗璧陌行蛄衅纬蔀榱嘶旌臀镏械娘@性序列(按濃度方式)，它們被認(rèn)為是“PCR擴(kuò)增的”。
連接酶鏈反應(yīng)(LCR或LAR)Barany，Proc.Natl.Acad.Sci.，88189(1991)；Barany，PCR Methods and Applic.，15(1991)；和Wu and Wallace，Genomics 4560(1989)所描述的連接酶鏈反應(yīng)[LCR，有時(shí)被稱(chēng)為“連接酶擴(kuò)增反應(yīng)(LAR)]已經(jīng)發(fā)展成為擴(kuò)增核酸的公認(rèn)的可選擇的方法。在LCR中，將四種寡核苷酸，與靶DNA的一條鏈獨(dú)特雜交的兩種鄰近的寡核苷酸，以及與相反鏈雜交的一個(gè)鄰近寡核苷酸的互補(bǔ)組混和，并往混和物中加入DNA連接酶。假若在連接處具有完全的互補(bǔ)性，連接酶將共價(jià)連接每組雜交分子。重要的是，在LCR中，僅當(dāng)探針與靶樣本的序列堿基配對(duì)且無(wú)缺口或錯(cuò)配時(shí)，兩個(gè)探針才被連接在一起。重復(fù)循環(huán)的變性和連接擴(kuò)增DNA的短片段。LCR也已經(jīng)與PCR聯(lián)用得到對(duì)單堿基改變的強(qiáng)化檢測(cè)(Segev，PCT Publication No.WO9001069 A1(1990))。但是，因?yàn)樵诒緳z測(cè)中所用的四種寡核苷酸能配對(duì)形成兩個(gè)短的可連接的片段，因此有形成靶序列非依賴性背景信號(hào)的可能。用于突變篩選的LCR的應(yīng)用被限定于檢查特異性的核酸位點(diǎn)。
自動(dòng)維持合成反應(yīng)(3SR/NASBA)自動(dòng)維持合成反應(yīng)(3SR)(Guatelli et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，871874-1878，1990)和Proc.Natl.Acad.Sci.，877797，1990中的勘誤表)是一種基于轉(zhuǎn)錄的體外擴(kuò)增體系(Kwok et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，861173-1177，1989)，它能在單一溫度下指數(shù)擴(kuò)增RNA序列。然后擴(kuò)增的RNA可被用于突變檢測(cè)(Fahy et al.，PCR Meth.Appl.，125-33，1991)。在這個(gè)方法中，寡核苷酸引物被用于將噬菌體RNA聚合酶啟動(dòng)子加入到相關(guān)序列的5’末端。在酶和包括第二種引物、逆轉(zhuǎn)錄酶、RNase H、RNA聚合酶和核糖及脫氧核糖核苷三磷酸的底物的雞尾酒中，靶序列進(jìn)行轉(zhuǎn)錄、cDNA合成及第二鏈合成的重復(fù)循環(huán)以擴(kuò)增相關(guān)區(qū)域。3SR檢測(cè)突變的用途被動(dòng)態(tài)地限定于篩選DNA的小片段(例如200-300個(gè)堿基對(duì))。
Q-β(Qβ)復(fù)制酶在這個(gè)方法中，識(shí)別相關(guān)序列的探針被連接到用于Qβ復(fù)制酶的可復(fù)制的RNA模板上。通過(guò)使用序列特異性連接步驟已的效率下，所需的循環(huán)數(shù)目是被禁止的。另外，以比預(yù)期靶序列更好的平均效率擴(kuò)增的任何的背景產(chǎn)物將成為主導(dǎo)產(chǎn)物。
許多變量也可影響PCR的平均效率，包括靶DNA長(zhǎng)度和二級(jí)結(jié)構(gòu)、引物長(zhǎng)度和設(shè)計(jì)、引物和dNTP濃度、和緩沖液組合物，等等。外源DNA對(duì)反應(yīng)物的污染(例如DNA濺到實(shí)驗(yàn)品的表面)或交叉污染也是一個(gè)主要原因。必須為每個(gè)不同的引物對(duì)和靶序列仔細(xì)地優(yōu)化反應(yīng)條件，甚至對(duì)于有經(jīng)驗(yàn)的研究者，這個(gè)過(guò)程也需要花費(fèi)數(shù)天。這些過(guò)程的煩瑣包括多種技術(shù)原因和其他因素，代表著在臨床實(shí)踐中使用PCR的明顯缺點(diǎn)。事實(shí)上，PCR仍以重要的方式滲透到臨床市場(chǎng)中。LCR有著同樣的問(wèn)題，如LCR必須被優(yōu)化使用各種靶序列的不同的寡核苷酸序列。另外，兩種方法都要求能進(jìn)行精確溫度循環(huán)的昂貴設(shè)備。
核酸檢測(cè)技術(shù)的多個(gè)應(yīng)用例如對(duì)等位基因變異的研究不僅涉及檢測(cè)復(fù)合背景中的特異序列，也涉及具有一些或單個(gè)核苷酸差異的序列之間的區(qū)別。PCR檢測(cè)等位基因特異性變異的一個(gè)方法是依據(jù)當(dāng)模板鏈和引物的3’末端之間存在錯(cuò)配時(shí)難以用Taq聚合酶合成DNA鏈的事實(shí)。通過(guò)使用僅與其中一種可能的等位基因完全配對(duì)的引物可以檢測(cè)等位基因特異性變異，與另一種等位基因的錯(cuò)配作用為阻止引物的延伸，并據(jù)此避免該序列的擴(kuò)增。該方法有著很大的局限，就是錯(cuò)配的堿基組成影響著阻止延伸通過(guò)錯(cuò)配的能力，以及某些錯(cuò)配不能阻止延伸或只有很小的影響(Kwok etal.，Nucl.Acids Res.，18999，1990)。
使用具有更大影響的相似的3’錯(cuò)配策略阻止LCR中的連接(Barany，PCR Meth.Applic.，15，1991)。任何錯(cuò)配有效地阻斷了耐熱連接酶的作用，但是用LCR仍有著靶序列非依賴性背景連接產(chǎn)物啟動(dòng)擴(kuò)增的缺點(diǎn)。而且，用于鑒別個(gè)別位置上的核苷酸的PCR與隨后的LCR的組合對(duì)于臨床實(shí)驗(yàn)室也是非常麻煩的問(wèn)題。
本發(fā)明的各種優(yōu)選的實(shí)施方案的直接檢測(cè)法可以是例如循環(huán)探針?lè)唇?jīng)解決了非雜交探針的復(fù)制所產(chǎn)生的具有假陽(yáng)性的先前被認(rèn)識(shí)到的主要問(wèn)題。但是，可得到的耐熱的DNA連接酶對(duì)于這種RNA底物是無(wú)效的，因此必須用T4DNA連接酶在低溫(37℃)下進(jìn)行裂解。這種方法避免了使用高溫，以此作為得到和LCR一樣的特異性的方法，連接事件可被用于檢測(cè)連接位點(diǎn)處的突變而不是其他部位的突變。
一種成功的診斷方法必須是非常特異的。控制核酸雜交的特異性的筆直方法是通過(guò)控制反應(yīng)溫度。雖然3SR/NASBA和Qβ體系都能生成大量的信號(hào)，但是每個(gè)體系中所含的一種或多種酶無(wú)法在高溫(即＞55℃)下使用。因此，不能通過(guò)提高反應(yīng)溫度避免探針的非特異性雜交。如果為了使得探針更容易在低溫下解鏈而將探針縮短，在復(fù)合基因組中具有超過(guò)一個(gè)完全匹配的類(lèi)然比將增加。因?yàn)檫@些原因，PCR和LCR目前支配著檢測(cè)技術(shù)的研究領(lǐng)域。
PCR和LCR中的擴(kuò)增方法的基礎(chǔ)是一個(gè)循環(huán)的產(chǎn)物成為了所有隨后循環(huán)的模板，據(jù)此每個(gè)循環(huán)將數(shù)量加倍的事實(shí)。每個(gè)如此加倍體系的最終產(chǎn)量可表示為(1+X)n＝y(tǒng)，其中“X”是平均效率(每個(gè)循環(huán)所拷貝的百分比)，“n”是循環(huán)數(shù)目，以及“y”是總效率或反應(yīng)的產(chǎn)量(Mullis，PCRMethods Applic.，11，1991)。如果靶DNA的每個(gè)拷貝都被用作為聚合酶鏈反應(yīng)的每個(gè)循環(huán)的模板，那么平均效率為100％。如果進(jìn)行20個(gè)循環(huán)的PCR，那么產(chǎn)量將是原料的220、或1,048,576個(gè)拷貝。如果反應(yīng)條件將平均效率減少為85％，那么在這20個(gè)循環(huán)內(nèi)的產(chǎn)量將僅僅是原料的1.8520或220,513個(gè)拷貝。換句話說(shuō)，85％效率下進(jìn)行的PCR將產(chǎn)生只有在100％效率下進(jìn)行的反應(yīng)中所產(chǎn)生的終產(chǎn)物的21％。被減少為50％平均效率的反應(yīng)將生成少于1％的可能產(chǎn)物。
在實(shí)踐中，常規(guī)聚合酶反應(yīng)很少得到理論上的最大產(chǎn)率，PCR通常進(jìn)行超過(guò)20個(gè)循環(huán)以補(bǔ)償更低的產(chǎn)量。在50％平均效率下，需要34個(gè)循環(huán)以得到在20個(gè)循環(huán)所得到的理論上可能的百萬(wàn)級(jí)擴(kuò)增，以及在更低應(yīng)或分支DNA分析。
當(dāng)?shù)玫阶銐蛄康乃铏z測(cè)的核酸時(shí)，不是制備靶序列的更多拷貝(如PCR和LCR)而是對(duì)序列的直接檢測(cè)是一個(gè)優(yōu)點(diǎn)。最特別的是，沒(méi)有指數(shù)擴(kuò)增信號(hào)的方法是更適合于定量分析的。甚至如果通過(guò)將多個(gè)染料連接到單個(gè)寡核苷酸來(lái)增強(qiáng)信號(hào)，終信號(hào)強(qiáng)度和靶序列量之間的相關(guān)性是直接的。這樣的一種體系所有的其他優(yōu)點(diǎn)是反應(yīng)的產(chǎn)物本身不會(huì)啟動(dòng)其他的反應(yīng)，所以產(chǎn)物對(duì)實(shí)驗(yàn)品表面的污染不是那樣多被關(guān)注的問(wèn)題。直接檢測(cè)的常用方法包括Northern和Southern區(qū)帶核糖核酸酶保護(hù)測(cè)定通常需要使用放射性以及不適用于自動(dòng)化檢測(cè)。最近設(shè)計(jì)的技術(shù)已經(jīng)設(shè)法去消除使用放射性和/或改善自動(dòng)化格式的敏感性。兩個(gè)實(shí)例是“循環(huán)探針?lè)磻?yīng)”(CPR)和“分支DNA”(bDNA)。
循環(huán)探針?lè)磻?yīng)(CPR)循環(huán)探針?lè)磻?yīng)(CPR)(Duck et al.，BioTech.，9142，1990)使用一種長(zhǎng)的嵌合寡核苷酸，其中中心部分是由RNA構(gòu)成的，而兩個(gè)末端是由DNA構(gòu)成的。探針與靶DNA的雜交以及對(duì)耐熱的RNaseH的暴露造成RNA部分被消化。這就不穩(wěn)定了雙鏈體的剩余的DNA部分，將探針的剩余部分從靶DNA中釋放出來(lái)并容許另一個(gè)探針?lè)肿又貜?fù)該過(guò)程。以線性速度蓄積了以分割的探針?lè)肿有问降男盘?hào)。雖然重復(fù)過(guò)程增加了信號(hào)，但寡核苷酸的RNA部分對(duì)于在樣本制備過(guò)程中所帶入的RNase是敏感的。
分支DNAUrdea et al.，Gene 61253-264(1987)所描述的分支DNA(bDNA)包括具有分支結(jié)構(gòu)的寡核苷酸，它容許每個(gè)單個(gè)寡核苷酸攜帶35到40個(gè)標(biāo)記(例如堿性磷酸酶)。雖然這個(gè)方法增強(qiáng)了來(lái)自雜交事件的信號(hào)，但同樣增加了來(lái)自非特異性結(jié)合的信號(hào)。
根據(jù)本發(fā)明不同的優(yōu)選的實(shí)施方案對(duì)至少一種序列改變的檢測(cè)可以通過(guò)例如限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)分析、等位基因特異性寡核苷酸(ASO)分析、變性/溫度梯度凝膠電泳(DGGE/TGGE)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)分析或雙脫氧指紋(ddF)來(lái)實(shí)現(xiàn)。
在臨床診斷上，對(duì)于容許檢測(cè)特異性核酸序列和序列改變的測(cè)試的需要正在快速增長(zhǎng)。隨著來(lái)自人和致病性生物體的基因的核酸序列數(shù)據(jù)的積累，對(duì)用于檢測(cè)特異序列內(nèi)的突變的快速、廉價(jià)和易用的測(cè)試的需要正在快速增長(zhǎng)。
已經(jīng)設(shè)計(jì)了多種方法來(lái)掃描核酸片段的突變。一個(gè)選擇是確定每個(gè)測(cè)試樣本(例如細(xì)菌分離物)的整個(gè)基因序列。對(duì)于小于近600個(gè)核苷酸的序列，用擴(kuò)增的材料(例如PCR反應(yīng)產(chǎn)物)可以完成測(cè)試。這雖然避免了與克隆相關(guān)片段有關(guān)的時(shí)間和費(fèi)用。但是，需要特殊的設(shè)備和訓(xùn)練有素的人員，并且該方法的勞動(dòng)強(qiáng)度太大和太昂貴，因此在臨床環(huán)境中是不現(xiàn)實(shí)和不有效的。
考慮到與測(cè)序相關(guān)的困難，可以在一些其他的水平上描述核酸的給定片段。在最低分辨率上，可以用電泳通過(guò)與在相同的膠上所跑的已知鏈進(jìn)行比較確定出分子的大小。通過(guò)在電泳之前用限制性酶的組合進(jìn)行分解可以得到分子的更多詳細(xì)的圖像，以容許構(gòu)建出有序的圖譜。用標(biāo)記探針的雜交可以檢測(cè)片段內(nèi)的特異性序列的存在，或用部分化學(xué)降解或在存在鏈終止核苷酸類(lèi)似物時(shí)用引物延伸可以確定出精確的核苷酸序列。
限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)對(duì)于相似序列之間的單堿基差異的檢測(cè)，通常需要最高分辨率水平上的分析。對(duì)于預(yù)先已知相關(guān)核苷酸的位置的情況，已經(jīng)發(fā)展出一些用于檢測(cè)單一堿基改變而非直接測(cè)序的方法。例如，如果相關(guān)突變發(fā)生在限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列內(nèi)，消化模式的改變可作為診斷工具(例如限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性[RFLP]分析)。
通過(guò)RFLP的形成或破壞也可以檢測(cè)單點(diǎn)突變。通過(guò)在錯(cuò)配處的降解所生成的RNA片段的存在或大小可以檢測(cè)并定位突變。用一些化學(xué)試劑也可識(shí)別并降解DNA異雙鏈體中的單核苷酸錯(cuò)配，這提供了一種可選擇的檢測(cè)單堿基取代的策略，遺傳學(xué)稱(chēng)為“錯(cuò)配化學(xué)降解”(MCC)(Gogoset al.，Nucl.Acids Res.，186807-6817，1990)。但是，這種方法需要使用四氧化鋨和六氫吡啶，這是兩種劇毒化學(xué)物，它們不適合用于臨床實(shí)驗(yàn)室。
RFLP分析具有低敏感性并需要大量樣本。當(dāng)RFLP分析被用于檢測(cè)點(diǎn)突變時(shí)，因?yàn)槠涮匦裕幌拗苾H用于檢測(cè)那些在已知限制性內(nèi)切酶的限制性序列內(nèi)的單堿基改變。此外，大部分現(xiàn)有的酶具有4到6個(gè)堿基對(duì)的識(shí)別序列，并且對(duì)于許多大規(guī)模的DNA操作，這些酶的裂解過(guò)于頻繁(Eckstein and Lilley(eds.)，Nucleic Acids and Molecular Biology，vol.2，Springer-Verlag，Heidelberg，1988)。因此，它只適用于很少部分的情況，因?yàn)榇蠖鄶?shù)突變不在這些位點(diǎn)的范圍內(nèi)。
已經(jīng)分離出許多具有8堿基對(duì)特異性的稀有切割的限制性內(nèi)切酶，它們被廣泛地用于遺傳學(xué)繪圖，但是這些酶很少，被限定于對(duì)富含G+C序列的識(shí)別，并在高度簇生的位點(diǎn)降解(Barlow and Lehrach，TrendsGenet.，3167，1987)。最近，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)I組內(nèi)含子所編碼的內(nèi)切酶可能有著超過(guò)12個(gè)堿基對(duì)的特異性(Perlman and Butow，Science 2461106，1989)，但是它們?nèi)允呛苌贁?shù)目的。
等位基因特異性寡核苷酸(ASO)如果改變不是在識(shí)別序列內(nèi)，那么可以設(shè)計(jì)等位基因特異性寡核苷酸(ASO)以在突變的核苷酸附近進(jìn)行雜交，這樣引物的延伸或連接事件可被作為匹配或錯(cuò)配的指示。與放射性標(biāo)記的等位基因特異性寡核苷酸(ASO)的雜交也已經(jīng)被用于檢測(cè)特異的點(diǎn)突變(Conner et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，80278-282，1983)。該方法依據(jù)單個(gè)核苷酸差異所造成的短DNA片段的解鏈溫度的差異。嚴(yán)格的雜交和洗滌條件可以區(qū)分突變型和野生型等位基因。多個(gè)研究者也已經(jīng)廣泛地用應(yīng)用于PCR產(chǎn)物的ASO方法檢測(cè)并描述ras基因(Vogelsteinet al.，N.Eng.J.Med.，319525-532，1988；和Farr et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，851629-1633，1988)和gsp/gip癌基因(Lyons et al.，Science 249655-659，1990)中的點(diǎn)突變。因?yàn)樵诙鄠€(gè)位點(diǎn)存在不同的核苷酸改變，ASO方法要求使用覆蓋所有可能的致癌性突變的多個(gè)寡核苷酸。
對(duì)于上述的每種技術(shù)(即RFLP和ASO)，必須在測(cè)試前預(yù)先知道可疑突變的精確位置。也就是說(shuō)，當(dāng)需要檢測(cè)一個(gè)相關(guān)基因或序列中是否存在的突變時(shí)，它們是不適合的。
變性/溫度梯度凝膠電泳(DGGE/TGGE)兩種其他的方法依賴于檢測(cè)較少的序列改變所造成的電泳遷移率的改變。這些方法中的一個(gè)方法被稱(chēng)為“變性梯度凝膠電泳”(DGGE)，它根據(jù)對(duì)當(dāng)電泳地溶解于梯度凝膠時(shí)，稍微不同的序列將表現(xiàn)出局灶解鏈的不同模式的觀察。以這種方法，可以將變體區(qū)分為有著單一核苷酸差異的同源雙鏈體對(duì)異源雙鏈體的解鏈特性的差異，這種差異可以檢測(cè)靶序列中的突變的存在，因?yàn)樗鼈兊碾娪具w移率的相應(yīng)改變。用長(zhǎng)的G-C堿基對(duì)(30-80)在一端“鎖定(clamped)”所分析的片段(常為PCR產(chǎn)物)，以容許將相關(guān)序列完全變性而不發(fā)生鏈的完全解離。將GC“鎖(clamp)”連接到DNA片段上的增加了可被DGGE識(shí)別的突變的比例(Abrams et al.，Genomics 7463-475，1990)。將一個(gè)GC“鎖”連接到一個(gè)引物上是關(guān)鍵的，它保證了所擴(kuò)增的序列具有低的解離溫度(Sheffield et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，86232-236，1989；and Lerman and Silverstein，Meth.Enzymol.，155482-501，1987)。已經(jīng)發(fā)展出利用溫度梯度的對(duì)該技術(shù)的修飾方法(Wartell et al.，Nucl.Acids Res.，182699-2701，1990)，并且該方法也可被應(yīng)用于RNARNA雙鏈體(Smith et al.，Genomics 3217-223，1988)。
DGGE應(yīng)用的限制包括需要必須將所測(cè)試的每種類(lèi)型的DNA的變性條件最優(yōu)化。此外，方法還需要制備膠和在電泳期間保持所需高溫的特殊設(shè)備。與合成所測(cè)試的每個(gè)序列的一種寡核苷酸上的鎖定尾(clampingtail)所相關(guān)的費(fèi)用也是一個(gè)主要問(wèn)題。另外，DGGE需要長(zhǎng)的運(yùn)轉(zhuǎn)時(shí)間。在被稱(chēng)為恒定變性凝膠電泳(CDGE)的DGGE的修飾方法中縮短了DGGE的長(zhǎng)運(yùn)轉(zhuǎn)時(shí)間(Borrensen et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 888405，1991)。為了達(dá)到高效地檢測(cè)突變，CDGE要求在不同的變性條件下完成凝膠。
一種與DGGE類(lèi)似的技術(shù)被命名為穩(wěn)定梯度凝膠電泳(TGGE)，它使用溫度梯度而不是化學(xué)變性梯度(Scholz，et al.，Hum.Mol.Genet.22155，1993)。TGGE需要使用能產(chǎn)生垂直定位于電場(chǎng)的溫度梯度的特殊設(shè)備。TGGE能檢測(cè)相對(duì)小的DNA片段中的突變，因此掃描大的基因片段要求在跑膠之前使用多量PCR產(chǎn)物。
單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)另一種常用的方法是Hayashi、Sekya和他們的同事們發(fā)展的被稱(chēng)為“單鏈構(gòu)象多態(tài)性”(Hayashi，PCR Meth.Appl.，134-38，1991所綜述的)，它依據(jù)于單鏈核酸在非變性條件中具有特征性的構(gòu)象的發(fā)現(xiàn)，這些構(gòu)象影響遷移率。認(rèn)為互補(bǔ)鏈具有非常不同的結(jié)構(gòu)，使得一條鏈能與另一條鏈區(qū)分開(kāi)。片段內(nèi)的序列的改變也將改變構(gòu)象，最終改變遷移率，使得它能被用作為一種檢測(cè)序列變異的方法(Orita，etal.，Genomics 5874-879，1989)。
SSCP過(guò)程包括變性在雙鏈上都被標(biāo)記的DNA片段(例如PCR產(chǎn)物)，隨后在非變性的聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行慢的電泳分離，這樣可以形成分子間的相互作用以及在跑膠期間不會(huì)相互干擾。該技術(shù)對(duì)于凝膠組成和溫度上的差異是極為敏感的。這個(gè)方法的嚴(yán)重的局限性是比較在明顯相似的條件下在不同的實(shí)驗(yàn)室所生成的數(shù)據(jù)中會(huì)遇到相當(dāng)大的困難。
雙脫氧指紋印跡法(ddF)雙脫氧指紋印跡法(ddF)是另一種被發(fā)展用于掃描基因內(nèi)突變的技術(shù)(Liu and Sommer，PCR Methods Appli.，497，1994)。ddF技術(shù)組合了Sanger雙脫氧測(cè)序和SSCP的內(nèi)容。用一個(gè)雙脫氧終止物進(jìn)行雙脫氧測(cè)序反應(yīng)，然后如SCCP分析那樣，在非變性的聚丙烯酰胺凝膠上電泳反應(yīng)產(chǎn)物以檢測(cè)出終止片段的遷移率的變更。雖然ddF在增加敏感性方面是對(duì)SSCP的一個(gè)改進(jìn)，但是ddF需要使用昂貴的雙脫氧核苷酸，并且該技術(shù)仍被局限于分析適合于SSCP分析的大小的片段(即，最適合于檢測(cè)200-300個(gè)堿基對(duì)的片段中的突變)。
除外上述的限制外，所有的這些方法都受所分析的核酸片段的大小的限制。對(duì)于直接測(cè)序法，超過(guò)600個(gè)堿基對(duì)的序列需要克隆，以及為了覆蓋整個(gè)片段所需的亞克隆或引物步移所帶來(lái)的耽擱和花費(fèi)。SSCP和DGGE甚至有著更為嚴(yán)重的大小限制。因?yàn)闇p少了對(duì)序列改變的敏感性，認(rèn)為這些方法不適用于更大的片段。盡管報(bào)道SSCP能檢測(cè)200個(gè)堿基對(duì)片段內(nèi)的90％的單堿基取代，但是對(duì)于400個(gè)堿基對(duì)的片段，檢測(cè)降低到了50％。同樣的，當(dāng)片段的長(zhǎng)度達(dá)到500個(gè)堿基對(duì)時(shí)，DGGE的敏感性降低。作為直接檢測(cè)和SSCP組合的ddF技術(shù)也受可被掃描的DNA的相當(dāng)小的大小的限制。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)當(dāng)前的優(yōu)選的實(shí)施方案，通過(guò)單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)技術(shù)例如cDNA-SSCP或基因組DNA-SSCP實(shí)現(xiàn)尋找腫瘤細(xì)胞或來(lái)源于腫瘤患者的細(xì)胞內(nèi)的上述的任一基因例如還原葉酸載體(RFC)基因內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)突變的步驟。不過(guò)，也可采用其他的方法，它們包括但不限定于核酸測(cè)序、聚合酶鏈反應(yīng)、連接酶鏈反應(yīng)、自動(dòng)維持合成反應(yīng)、Qβ復(fù)制酶、循環(huán)探針?lè)磻?yīng)、分支DNA、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析、錯(cuò)配化學(xué)切割、異雙鏈體分析、等位基因寡核苷酸、變性梯度凝膠電泳、恒定變性凝膠電泳、溫度梯度凝膠電泳和雙脫氧指紋印跡法。
如在下面的實(shí)施例部分所進(jìn)一步舉例的那樣，通過(guò)分析觸珠蛋白基因的蛋白基因產(chǎn)物或其部分，也能直接地完成對(duì)觸珠蛋白表型的確定。例如，Wassell等(Ann Clin Biochem 1999；36609-12)描述了一種對(duì)電泳分離的觸珠蛋白蛋白的敏感、直接的分析以及一種特殊染色。另外，用一種免疫學(xué)檢測(cè)法經(jīng)常完成這樣的直接分析。
例如在“Using AntibodiesA Laboratory Manual”(Ed Harlow，DavidLaneeds.，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1999)中充分解釋了免疫學(xué)檢測(cè)法，那些本領(lǐng)域人員能實(shí)現(xiàn)下面所總結(jié)的作為本發(fā)明一部分的各種技術(shù)。所有的免疫學(xué)技術(shù)都需要特異于兩種觸珠蛋白的等位基因的一種等位基因的抗體。適合用作為本發(fā)明的一部分的免疫學(xué)檢測(cè)法包括，但不限定于放射免疫測(cè)定法(RIA)、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)、western印跡法、免疫組化分析和熒光激活細(xì)胞分選術(shù)(FACS)。
放射免疫測(cè)定法(RIA)在一個(gè)版本中，該方法包括用特異的抗體和固定于可沉淀載體例如瓊脂糖珠上的放射性標(biāo)記的抗體結(jié)合蛋白(例如用I125標(biāo)記的蛋白A)沉淀所需的底物，在本例和下面詳細(xì)描述的方法中該底物為觸珠蛋白。在所沉淀的珠中的計(jì)數(shù)數(shù)目與底物的數(shù)目成正比。
在RIA的另一個(gè)版本中，采用了標(biāo)記底物和為標(biāo)記的抗體結(jié)合蛋白。加入不同數(shù)量的含有未知量底物的標(biāo)本。來(lái)自標(biāo)記底物的所沉淀的計(jì)數(shù)的減少與所加入樣本中的底物數(shù)目成正比。
酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)該方法包括將含有蛋白底物的樣本(例如固定的細(xì)胞或蛋白質(zhì)溶液)固定于一個(gè)表面例如微量滴定板的一個(gè)孔上。與酶偶聯(lián)的底物特異性抗體被使用并被容許與底物結(jié)合。然后用采用與抗體偶聯(lián)的酶的色度法反應(yīng)檢測(cè)并定量抗體的存在。在這個(gè)方法中常用的酶包括辣根過(guò)氧化物酶和堿性磷酸酶。如果被很好地標(biāo)定以及在線性的反應(yīng)范圍內(nèi)，樣本中所存在的底物的量與所產(chǎn)生的色度成比例。常采用標(biāo)準(zhǔn)底物提高定量的準(zhǔn)確性。
Western印跡法該方法包括用丙烯酰胺凝膠將底物與其他蛋白分開(kāi)，隨后將底物轉(zhuǎn)移到膜上(例如尼龍或PVDF)。然后用特異于底物的抗體檢測(cè)底物的存在，隨后用抗體結(jié)合試劑檢測(cè)抗體?？贵w結(jié)合試劑可以是例如蛋白A或其他抗體。抗體結(jié)合試劑可以是如上述的被放射性標(biāo)記的或酶聯(lián)的。檢測(cè)可以是通過(guò)放射自顯影技術(shù)、比色反應(yīng)或化學(xué)發(fā)光法。該方法容許定量底物的量并通過(guò)底物在膜上的相對(duì)位置確定出底物的身份，該相對(duì)位置是底物在電泳期間在丙烯酰胺凝膠上的移動(dòng)距離的指不。
免疫組織化學(xué)分析這個(gè)方法包括用底物特異性抗體檢測(cè)固定細(xì)胞內(nèi)的原位底物。底物特異性抗體可以是酶聯(lián)的或與熒光團(tuán)相連的。檢測(cè)是通過(guò)顯微鏡或主觀評(píng)價(jià)。如果采用酶聯(lián)抗體，可能需要比色反應(yīng)。
熒光激活細(xì)胞分選術(shù)(FACS)這個(gè)方法包括用底物特異性抗體檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)原位的底物。底物特異性抗體與熒光團(tuán)相連。檢測(cè)是通過(guò)細(xì)胞分選儀，它可閱讀當(dāng)每個(gè)細(xì)胞經(jīng)過(guò)光束時(shí)所發(fā)射出的光的波長(zhǎng)。這個(gè)方法可以同時(shí)采用兩種或多種抗體。
當(dāng)把本發(fā)明付諸實(shí)踐時(shí)，對(duì)HOPE研究數(shù)據(jù)的分析也首次發(fā)現(xiàn)，維生素E和藥物雷米普利具有相似的觸珠蛋白型特異性的益處。雷米普利是常用的治療高血壓的藥物，因此預(yù)計(jì)它可用于預(yù)防CVD。但是，雷米普利的預(yù)防作用的幅度(RR＝0.57)以及預(yù)防被嚴(yán)格地限定于一種觸珠蛋白表型亞組(Hp 2-2)的情況說(shuō)明，雷米普利的預(yù)防作用超過(guò)了它對(duì)高血壓的療效。除了它的作為血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制劑的活性外，雷米普利還有作為抗氧化劑的活性，因?yàn)槔酌灼绽委熢隗w內(nèi)減少了氧自由基種類(lèi)(Lopez-Jaramillo，et al J Hum Hypertens 2002；16S 1S100-300)。這里兩種具有明顯不同的生物化學(xué)后果的抗氧化劑為經(jīng)觸珠蛋白分型所鑒定出的糖尿病患者亞組提供了相似的臨床益處的論證說(shuō)明，抗氧化劑治療的范例可適用于其他的抗氧化劑，例如Trolox(Sagach et al PharmaRes 202；45435-39)、Raxofelast(Campo et al，Cardiovasc Drug Rev 1997；15157-73)、TMG(Meng et al Bioorg Med Chem Ltrs 2002；122545-48)、AGI-1067(Yoshida et al Atheroscler 2002；162111-17)、Probucol(Kita et alPNAS USA 1987；847725)以及具有與維生素E相似的抗氧化作用的機(jī)制的鈣離子通道阻滯劑(MakI，et al.Pharma Res.2002；4527-33)，例如尼索地平、尼非地平和尼卡地平。因此，預(yù)計(jì)將從這些抗氧化劑的預(yù)防治療獲益的人群(Hp 2-2的糖尿病患者)將類(lèi)似于在此所證實(shí)的從維生素E和雷米普利補(bǔ)充中獲益的人群。但是，對(duì)糖尿病患者從補(bǔ)充抗氧化劑中獲益的確定不能被應(yīng)用于所有的抗氧化劑維生素，因?yàn)椴还苁窃谖唇?jīng)選擇的樣本還是在糖尿病患者中，在CVD后果和維生素C補(bǔ)充之間都沒(méi)有發(fā)現(xiàn)相關(guān)性(數(shù)據(jù)沒(méi)有顯示)。
在此對(duì)HOPE研究數(shù)據(jù)的新的分析處理現(xiàn)在已經(jīng)提供了清楚的證據(jù)，其中抗氧化劑維生素E在未分層的糖尿病患者中沒(méi)有明顯的益處，可以確定出一個(gè)證實(shí)從抗氧化劑治療中顯著獲益的糖尿病患者的亞組。因此，這些數(shù)據(jù)說(shuō)明將所有糖尿病患者的觸珠蛋白表型分型以及為了預(yù)防糖尿病的CVD給具有Hp 2-2表型的患者提供預(yù)防性抗氧劑補(bǔ)充治療的巨大價(jià)值。這種預(yù)防性抗氧化劑作用并不限定于單一的抗氧化劑(例如維生素E)，多種潛在的抗氧化劑例如Trolox、Raxefiolfast、AGI-1067、Probucol、TMG和鈣離子通道阻滯劑也是有效的。從對(duì)其他臨床研究的分析中可以確定出這些不同的藥劑的相對(duì)療效。
本領(lǐng)域人員明白用任何來(lái)自受測(cè)個(gè)體的適合的生物學(xué)樣本都可以直接地或遺傳學(xué)地實(shí)現(xiàn)對(duì)個(gè)體的觸珠蛋白表型的確定，這些樣本包括但不限定于血液、血漿、血細(xì)胞、唾液或漱口所得到的細(xì)胞、以及身體分泌物例如尿液和淚液、以及來(lái)自活檢的樣本等等。
通過(guò)閱讀以下的實(shí)施例，本領(lǐng)域人員將清楚地知道本發(fā)明的其他目的、優(yōu)點(diǎn)和新的特點(diǎn)，這些實(shí)施例無(wú)意于對(duì)本發(fā)明做任何限定。另外，每一個(gè)在上面所描述的以及在下面的權(quán)利要求書(shū)中所要求的本發(fā)明的各種實(shí)施方案和部分都可以在下面的實(shí)施例中找到實(shí)驗(yàn)支持。
實(shí)施例現(xiàn)在一起參照下面的實(shí)施例以及上述的描述，以非限制性方式舉例說(shuō)明了本發(fā)明。
一般地，在此所用的術(shù)語(yǔ)和在本發(fā)明中所用的實(shí)驗(yàn)室方法包括分子、生物化學(xué)、微生物學(xué)和重組DNA技術(shù)。在文獻(xiàn)中已經(jīng)充分地解釋了這些技術(shù)。見(jiàn)例如，“Molecular CloningA laboratory Manual”Sambrook et al.，(1989)；“Current Protocols in Molecular Biology”Volumes l-111 Ausubel，R.M.，ed.(1994)；Ausubel et al.，“Current Protocols in Molecular Biology”，JohnWiley and Sons，Baltimore，Maryland(1989)；Perbal，“A Practical Guide toMolecular Cloning”，John Wiley&Sons，New York(1988)；Watson etal.，“Recombinant DNA”，Sciertific American Books，New York；Birren et al.(eds)“Genome AhalysisA Laboratory Manual Series”，Vols.1-4，ColdSpring Harbor Laboratory Press，New Yory(1998)；如在美國(guó)專(zhuān)利No.4,666,828、4,683,202、4,801,531、5,192,659和5,272,057中所提出的方法學(xué)；“Cell BiologyA Laboratory Handbook”，VolumesI-III Cellis，J.E.，ed.(1994)；“Culture of Animal Cells-A Manual of Basic Technique”by Freshney，Wiley-Liss，N.Y.(1994)，Third Edition；“Current Protocols inImmunology”VolumesI-III Coligan J.E.，ed.(1994)；Stites et al.(eds)，“Basicand Clinical Immunology”(8th Edition)，APPleton&Lange，Norwalk，CT(1994)；Mishell and Shiigi(eds)，“Selected Methods in Cellular Immunology”，W.H.Freeman and Co.，New York(1980)；在專(zhuān)利和科學(xué)文獻(xiàn)中廣泛地描述了可獲得的免疫檢測(cè)法，見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利No.3,791,932、3,839,153、3,850,752、3,850,578、3,853,987、3,867,517、3,879,262、3,901,654、3,935,074、3,984,533、3,996,345、4,034,074、4,098,876、4,879,219、5,011,771和5,281,521；“Oligonucleotide Synthesis”Gait，M.J.，ed.(1984)；“Nucleic Acid Hybridization”Hames，B.D.，and Higgins S.J.，eds.(1985)；“Transcription and Translation”Hames，B.D.，and Higgins S.J.，eds.(1984)；“Animal Cell Culture”Freshney，R.I.，ed.(1986)；“Immobilized Cells andEnzymes”IRL Press，(1986)；“A Practical Guide to Molecular Cloning”P(pán)erbal，B.，(1984)和“Methods in Enzymology”Vol.1-317，Academic Press；“PCRProtocolsA Guide To Methods And Applications”，Academic Press，SanDiego，CA(1990)；Marshak et al.，“Strategies for Protein Purification andCharacterization-A Laboratory Course Manual”CSHL Press(1996)；在此將其全部?jī)?nèi)容一同并入作為參考。在本文件的全文中提供了其他常用的參考文獻(xiàn)。相信這些方法在本領(lǐng)域是熟知的，為了讀者的便利，我們提供了這些方法。在此一同并入?yún)⒖计渌乃行畔ⅰ?br> 實(shí)驗(yàn)方法在給出提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持本發(fā)明的實(shí)施例之前，參照以下的方法患者對(duì)Strong心臟研究的設(shè)計(jì)、調(diào)查方法和實(shí)驗(yàn)室技術(shù)以及參與的印第安人團(tuán)體先前已經(jīng)被發(fā)表20，39，40。
研究組包括超過(guò)4,549位在1989年7月和1992年1月之間在首次進(jìn)行檢查時(shí)年齡為45歲到74歲的個(gè)體。所有入選部落成員的參與率平均為65％。未參與者在年齡和糖尿病的自報(bào)率上與參與者相似。在第二次檢查(1993年7月到1995年12月)及第三次檢查(1997年7月到1999年12月)時(shí)仍存活的個(gè)體的復(fù)檢率平均為88％和90％。
每個(gè)階段的臨床檢查包括個(gè)人調(diào)查和體格檢查。取空腹血液樣本用于生物化學(xué)測(cè)定，并進(jìn)行75克口服葡萄糖耐受試驗(yàn)。將血液樣本收集于EDTA中，收集血漿并儲(chǔ)存于-20℃。得到標(biāo)準(zhǔn)的血壓測(cè)定，以及按先前所描述的連接并記錄心電圖39，40。根據(jù)世界衛(wèi)生組織標(biāo)準(zhǔn)將參與者分類(lèi)為糖尿病41。如果參與者正在服用抗高血壓藥物或者如果他們的收縮壓超過(guò)140mmHg或舒張壓超過(guò)90mmHg，就認(rèn)為這些參與者為高血壓。
通過(guò)部落和醫(yī)院的記錄以及通過(guò)研究者與參與者和他們家庭的直接接觸鑒定出1998年和至今期間的Strong心臟研究組中的死亡。從州衛(wèi)生部中得到死亡證明書(shū)的拷貝并由一位疾病分類(lèi)學(xué)家集中進(jìn)行ICD-9編號(hào)。最初從如前所述的死亡證明書(shū)中鑒定出可能的CVD死亡42。從尸解報(bào)告、病歷記錄摘要和如前所述的填表員的調(diào)查中研究死亡原因42。由Strong心臟研究死亡率復(fù)習(xí)委員會(huì)的醫(yī)師成員獨(dú)立地復(fù)習(xí)所有材料確認(rèn)死亡原因。先前描述了致死性CVD和中風(fēng)的標(biāo)準(zhǔn)42。
在每次檢查時(shí)都復(fù)習(xí)病歷記錄以識(shí)別自上一次檢查以來(lái)所已經(jīng)發(fā)生的如前所述的任何致死性心血管事件、明確的MI和明確的CVD。也復(fù)習(xí)了那些在第二次或第三次檢查中沒(méi)有參與的人員的記錄。對(duì)于所有潛在的CVD事件或干涉，病歷記錄被經(jīng)訓(xùn)練的病歷記錄摘錄者所復(fù)習(xí)。復(fù)習(xí)并摘要了門(mén)診隨診記錄中的CVD診斷性操作(例如平板試驗(yàn)、冠狀動(dòng)脈造影)。由Strong心臟研究發(fā)病率或死亡率復(fù)習(xí)委員會(huì)的一個(gè)醫(yī)師成員復(fù)習(xí)了從圖表復(fù)習(xí)中所得到的信息以建立特異的CVD診斷。發(fā)病率復(fù)習(xí)委員會(huì)的其他醫(yī)師成員對(duì)摘要記錄的盲向復(fù)習(xí)顯示在診斷上有著＞90％的一致性。
HOPE研究和患者特征心臟后果預(yù)防評(píng)估(HOPE)研究被設(shè)計(jì)用于驗(yàn)證關(guān)于兩種稱(chēng)為血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制劑或維生素E的預(yù)防性處理策略將比安慰劑更能改善心血管事件高?；颊叩陌l(fā)病率和死亡率的假說(shuō)。在這個(gè)研究中所包括的患者被認(rèn)為是具有未來(lái)致死性或非致死性心血管事件的高危性，因?yàn)樗麄兊哪挲g(＞55歲)、現(xiàn)有的或以往的心血管病或糖尿病。糖尿病患者至少還有一種其他的危險(xiǎn)因素，或者是已知的心血管病或其他因素例如吸煙、高膽固醇或高血壓。將雷米普利或安慰劑加入到伴隨藥物中，在大多數(shù)患者中，這些藥物包括抗高血壓藥物(除ACE-I以外)、降脂藥或阿司匹林。先前已經(jīng)詳細(xì)地描述了HOPE研究設(shè)計(jì)和方案(見(jiàn)例如，The Heart Outcomes Prevention EvaluationStudy Investigators，NE J Med，2000；342154-60and Sleight，P，J RenninAngioten Aldost Sys 2000；118-20)。簡(jiǎn)單地，研究人群包括超過(guò)9,451個(gè)CVD高危的患者(3，654個(gè)DM)。研究為2×2因子設(shè)計(jì)，被隨機(jī)分為400IU天然維生素E(RRR-a-tocophorol acetate)或安慰劑和10mg雷米普利或安慰劑。隨診患者平均4.5年。主要研究后果包括非致死性MI、中風(fēng)或心血管死亡。
病例和對(duì)照的定義本研究是一個(gè)病例對(duì)照研究，設(shè)計(jì)用于檢測(cè)CVD和觸珠蛋白表型之間的相關(guān)性。206個(gè)CVD病例和對(duì)照(經(jīng)年齡、性別和地理區(qū)域匹配)被用于這個(gè)分析。
觸珠蛋白表型分型通過(guò)凝膠電泳和利用Smith最初描述的使用淀粉凝膠電泳和聯(lián)苯胺的過(guò)氧化物酶染色的方法的改良方法的過(guò)氧化物酶染色從10μl EDTA血漿中確定出觸珠蛋白表型44，45，46?；颊哐獫{被儲(chǔ)存在-20℃。所有化合物都購(gòu)自以色列Sigma公司(Rehovot，Israel)。通過(guò)首先在磷酸緩沖鹽水中洗滌血細(xì)胞5次然后將細(xì)胞裂解在每ml壓縮細(xì)胞體積9ml的無(wú)菌水中，從肝素化血液中制備得到10％血紅蛋白水溶液。在10,000g離心細(xì)胞裂解液40分鐘，并將含有血紅蛋白的上清液分裝儲(chǔ)存在-70℃。將血漿(10μl)和2μl 10％血紅蛋白溶液混和，并將樣本在室溫下放置5分鐘以使得形成觸珠蛋白-血紅蛋白復(fù)合物。在跑電泳之前，將等體積(12μl)的含有125mM Tris堿pH6.8、20％(w/v)甘油和0.001％(w/v)溴酚藍(lán)的樣本緩沖液加入到每樣本中。利用含有25mM Tris堿和192mM甘氨酸的緩沖液用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離觸珠蛋白血紅蛋白復(fù)合物。成層膠為125mMTris堿(pH6.8)中的4％聚丙烯酰胺(29∶1丙烯酰胺/雙丙烯酰胺)，以及分離膠是360mM Tris堿(pH8.8)中的4.7％聚丙烯酰胺(29∶1丙烯酰胺/雙丙烯酰胺)。在250伏恒壓下進(jìn)行電泳3個(gè)小時(shí)。在完成電泳后，通過(guò)將膠浸泡在玻璃器皿內(nèi)的新鮮制備的染色溶液中可以肉眼看到觸珠蛋白-血紅蛋白復(fù)合物。染色溶液(通過(guò)按所列的次序加入試劑制備得到)含有5ml 0.2％(w/v)3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺甲醇溶液、0.5ml二甲基亞砜、10ml5％(v/v)冰醋酸、1ml 1％(w/v)鐵氰化鉀和150μl 30％(w/w)過(guò)氧化氫。在15分鐘內(nèi)可看到對(duì)應(yīng)于觸珠蛋白-血紅蛋白復(fù)合物的條帶，該條帶是穩(wěn)定超過(guò)48個(gè)小時(shí)。照相記錄下所有的膠。在實(shí)驗(yàn)室中，無(wú)任何有關(guān)于患者的知識(shí)下確定出所有樣本的觸珠蛋白表型。
實(shí)驗(yàn)室接受用于分析的血漿樣本，觸珠蛋白表型分型在所有的除了6個(gè)樣本外都是可能的。對(duì)于這6個(gè)患者，還不清楚是否它們表示患者不合成任何的觸珠蛋白(Hp 0表型)22，23或觸珠蛋白的濃度在所描述的檢測(cè)法的檢測(cè)限度之下。
對(duì)于來(lái)自HOPE研究的樣本，根據(jù)已建立的方法(Hochberg I et alAtherosclerosis 2002；161441-446)，用聚丙烯酰胺凝膠電泳從10μl樣本中進(jìn)行觸珠蛋白表型分型。從1等位基因純合子(Hp1-1)、2等位基因純合子(Hp2-2)或在觸珠蛋白位點(diǎn)為雜合子(Hp2-1)的個(gè)體中得到標(biāo)記條帶圖案。我們已經(jīng)在從血漿中所確定的觸珠蛋白表型和用聚合酶鏈反應(yīng)從基因組DNA中所確定的觸珠蛋白基因型之間建立了100％一致性(Koch W.et al Clin Chem 2002；27713635-40)。在超過(guò)99.6％的所有檢測(cè)樣本中得到了一個(gè)明確的觸珠蛋白表型。在未知患者的臨床或治療狀態(tài)下進(jìn)行觸珠蛋白表型分型。
統(tǒng)計(jì)學(xué)分析在病例和對(duì)照之間以及在三種觸珠蛋白表型之間比較了CVD的危險(xiǎn)因素年齡、性別、LDL和HDL膽固醇、甘油三脂、收縮期BP、BMI、糖尿病、吸煙、CVD家族史和入選中心。另外，在病例和對(duì)照之間以及在三種觸珠蛋白表型之間比較了由胰島素、空腹血糖水平、HbAlc、DM持續(xù)時(shí)間和DM家族史所構(gòu)成的DM特征。進(jìn)行了單因素和多因素logistic回歸模型以確定出這些CVD危險(xiǎn)因素和DM特征是否與表型相關(guān)。用類(lèi)然比測(cè)定參數(shù)。
通過(guò)調(diào)整三種觸珠蛋白表型的CVD危險(xiǎn)因素和DM特征，運(yùn)行常用的logistic回歸模型將糖尿病患者具有CVD事件的可能性模型化。用兩個(gè)指示符變量編碼糖尿病-表型之間的相互作用，一個(gè)指的是糖尿病患者，另一個(gè)指的是非糖尿病患者。通過(guò)對(duì)殘數(shù)(residuals)進(jìn)行分析測(cè)定出模型的符合度。
用SAS 6.02進(jìn)行對(duì)HOPE研究數(shù)據(jù)的所有分析。按需用t檢驗(yàn)或χ2檢驗(yàn)比較根據(jù)觸珠蛋白的患者的特征。報(bào)告了主要后果心血管死亡、非致死性心肌梗死和中風(fēng)的相對(duì)危險(xiǎn)度(RR)和95％可信度區(qū)間。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)施例I觸珠蛋白表型是糖尿病患者的CVD危險(xiǎn)的預(yù)測(cè)因素在下面的表1中顯示了病例對(duì)照組的根據(jù)CVD危險(xiǎn)因素和DM特征的臨床特征表1病例-對(duì)照組的CVD危險(xiǎn)因素

病例和對(duì)照在年齡、性別和地理區(qū)域上進(jìn)行了匹配。這些數(shù)據(jù)與先前在該人群中的發(fā)現(xiàn)一致，即糖尿病、LDL膽固醇和高血壓都是CVD的獨(dú)立的預(yù)后因素20。
對(duì)本隊(duì)列的觸珠蛋白表型分型發(fā)現(xiàn)了25％1-1、44％2-1和31％2-2的分布。1等位基因的頻率為0.47％，這與已經(jīng)報(bào)道的該人群中的觸珠蛋白等位基因的頻率非常吻合。在不同的觸珠蛋白表型之間都沒(méi)有發(fā)現(xiàn)在單因素和多因素logistic回歸分析具有1-1表型的概率中所確定出的任何的CVD危險(xiǎn)因素或DM特征上任何顯著的差異。
表2提供了在調(diào)整CVD危險(xiǎn)因素和DM特征之前和之后預(yù)測(cè)每個(gè)糖尿病和非糖尿病個(gè)體的觸珠蛋白表型的CVD事件的概率的條件logistic回歸。
表2預(yù)測(cè)CVD事件的條件logistic回歸



這些數(shù)據(jù)顯示，在調(diào)整了所有的CVD危險(xiǎn)因素和DM特征后，在Strong心臟研究的糖尿病參與者中，那些具有觸珠蛋白表型2-2的參與者發(fā)生CVD事件的可能性是那些具有1-1表型的參與者發(fā)生CVD事件的可能性的4.7倍(1.86-11.88OR 95％CI)(p＝0.001)，以及是那些具有2-1表型的參與者發(fā)生CVD事件的可能性的2.5倍(1.14-5.67OR 95％CI)(p＝0.022)。此外，具有觸珠蛋白表型2-1的患者發(fā)生CVD事件的可能性是具有1-1表型的患者的1.8倍(0.86-3.96 OR 95％CI)，盡管沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異。綜上所述，這些數(shù)據(jù)說(shuō)明觸珠蛋白2等位基因數(shù)目造成糖尿病個(gè)體具有不同程度的發(fā)生CVD的危險(xiǎn)。
最后，在非糖尿病患者中，觀察到有著臨界統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異的趨勢(shì)，即具有觸珠蛋白表型2-2的非糖尿病患者發(fā)生CVD事件的可能性是具有1-1表型的非糖尿病患者的3.0倍(0.90-9.77OR 95％CI)(p＝0.073)。
下面的表3總結(jié)了這些結(jié)果。
表3預(yù)測(cè)調(diào)整DM和CVD危險(xiǎn)因素后的CVD事件的概率的條件logistic回歸

實(shí)施例II觸珠蛋白表型是糖尿病患者從抗氧化劑治療中獲益的預(yù)測(cè)因素進(jìn)行觸珠蛋白表型分型的HOPE樣本的患者特征在來(lái)自最初的HOPE隊(duì)列的本來(lái)就已得到血漿的3176個(gè)患者(1078個(gè)糖尿病)中得到觸珠蛋白表型。這些患者代表隨機(jī)選擇的連續(xù)的來(lái)自整個(gè)HOPE隊(duì)列的患者的組。在下面的表4中顯示了根據(jù)CVD危險(xiǎn)因素和治療方案的HOPE隊(duì)列的臨床特征。
表4HOPE研究中的患者特征

這個(gè)HOPE隊(duì)列的亞組的基本特征與整個(gè)隊(duì)列沒(méi)有顯著差異。由觸珠蛋白表型所分組的樣本的基本特征在基本的人口統(tǒng)計(jì)學(xué)的、臨床的或治療特征上都沒(méi)有顯著差異(表4)。
Hp表型對(duì)CV后果的作用在沒(méi)有接受抗氧化劑治療的對(duì)象中，在整個(gè)研究樣本的各個(gè)觸珠蛋白表型的主要復(fù)合終點(diǎn)(非致死性MI、中風(fēng)或心血管死亡)的發(fā)生率上沒(méi)有顯著差異(Hp1-1 45/25917.4％，Hp2-1113/737 15.3％，Hp2-2 95/581 16.4％，趨勢(shì)χ2為0.08，P＝0.87)。但是，與在上述的Strong心臟研究中所報(bào)道的結(jié)果一致(見(jiàn)實(shí)施例I和Levy AP，etal.Haptoglobin phenotype is an independent risk factor for cardiovasculardisease in individuals with diabetesthe strong heart study.J Am Coll Card2002；401984-1990))，我們發(fā)現(xiàn)在沒(méi)有接受抗氧化劑治療的HOPE研究的DM患者中，增加了與Hp等位基因相關(guān)的主要復(fù)合終點(diǎn)(非致死性MI、中風(fēng)或心血管死亡)的危險(xiǎn)度(Hp1-1 13/7916.5％，Hp2-1 44/22519.6％，Hp2-2 48/187 25.7％，趨勢(shì)χ2為5.67，P＝0.02)。
維生素E對(duì)CV后果的作用下面的表5顯示了對(duì)所有患者和糖尿病(DM)患者的與觸珠蛋白表型相關(guān)的有和無(wú)維生素E補(bǔ)充的主要CV后果(非致死性MI、中風(fēng)或心血管死亡)的分析結(jié)果。
表5CV后果與維生素E補(bǔ)充的相對(duì)危險(xiǎn)度所有患者

僅糖尿病患者

給定RRR為有維生素E與無(wú)維生素E的CV事件比較的危險(xiǎn)度的平均值(95％CI)。
*，p＜0.05，統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異；NS，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異。
在整個(gè)所研究的樣本中，不論觸珠蛋白表型如何，沒(méi)有與維生素E補(bǔ)充所相關(guān)的對(duì)任何主要CV后果的顯著性益處(表5，所有患者)。此外，如先前所報(bào)道的(The Heart Outcomes Prevention Evaluation StudyInvestigators.Vitamin E supplementation and cardiovascular events inhigh-risk patients.N Eng J Med 2000；342154-160)(表5，DM患者)，維生素E補(bǔ)充在未選擇的DM組沒(méi)有顯著益處。令人驚奇的是，在具有觸珠蛋白2-2表型的DM患者中，發(fā)現(xiàn)維生素E治療顯著地降低了CV死亡的危險(xiǎn)(RR 0.45，95％CI 0.23-0.90；P＝0.003)以及顯著地降低了非致死性心肌梗死(MI)的危險(xiǎn)(RR 0.57，95％0.33-0.97；P＝0.02)，而維生素E治療對(duì)任何其他的觸珠蛋白表型(Hp1-1和Hp2-1)的DM患者的任何主要CV后果都沒(méi)有顯著的益處。
雷米普利對(duì)CV后果的作用下面的表6顯示了對(duì)所有患者和糖尿病(DM)患者的與觸珠蛋白表型相關(guān)的有和雷米普利補(bǔ)充的主要CV后果(非致死性MI、中風(fēng)或心血管死亡)的分析結(jié)果。
表6CV后果與雷米普利補(bǔ)充的相對(duì)危險(xiǎn)度所有患者

僅糖尿病患者

*，p＜0.05，統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異；NS，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異。給定RRR為有雷米普利與無(wú)雷米普利的CV事件比較的危險(xiǎn)度的平均值(95％CI)。
從對(duì)整個(gè)樣本的分析中可證實(shí)不論觸珠蛋白表型如何，沒(méi)有與雷米普利補(bǔ)充所相關(guān)的對(duì)任何主要CV后果的顯著性益處(表6，所有患者)。和維生素E的作用相似，雷米普利補(bǔ)充在未選擇的DM組中沒(méi)有顯著益處。令人驚奇的是，僅在具有觸珠蛋白2-2表型的DM患者中觀察到雷米普利對(duì)復(fù)合主要終點(diǎn)中風(fēng)、CV死亡和心肌梗死的顯著益處(RR 0.57，95％CI 0.36-0.90；P＜0.05)。雷米普利對(duì)任何其他的觸珠蛋白表型(Hp1-1和Hp2-1)的任何主要CV后果都沒(méi)有益處。
應(yīng)該理解，為了清楚的目的在各個(gè)實(shí)施方案的上下文中所描述的本發(fā)明的某些特征也可以以組合形式出現(xiàn)于單一實(shí)施方案中。相反地，為了簡(jiǎn)潔的目的在單個(gè)實(shí)施方案的上下文中所描述的本發(fā)明的各種特征也可以被分開(kāi)地或以任何合適的亞組合的形式提供。
盡管已經(jīng)結(jié)合特異的實(shí)施方案描述了本發(fā)明，但是本領(lǐng)域人員顯然能進(jìn)行許多變更、修飾和變異。因此，本發(fā)明包括所有這些只要在所附的權(quán)利要求書(shū)的精神及大范圍內(nèi)的變更、修飾和變異。在本說(shuō)明書(shū)中所提及的所有出版物、專(zhuān)利和專(zhuān)利申請(qǐng)均在此以其全部?jī)?nèi)容并入本說(shuō)明書(shū)作為參考，如同每個(gè)出版物、專(zhuān)利或?qū)＠暾?qǐng)均被具體地和單獨(dú)地指明并入本申請(qǐng)作為參考。另外，在本申請(qǐng)中對(duì)任何參考文獻(xiàn)的引用或認(rèn)可都不應(yīng)當(dāng)被解釋為承認(rèn)這些參考文獻(xiàn)作為本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。
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序列表<110>拉帕波特家族醫(yī)學(xué)研究院<120>預(yù)測(cè)抗氧化劑治療在預(yù)防高血糖患者的心血管疾病中的益處的方法<130>P-7339-PC<160>1<170>PatentIn version 3.3<210>haptoglobin peptide alpha 2 chain<211>21<212>PRT<213>Human<400>1Ala Val Gly Asp Lys Leu Pro Glu Cys Glu Ala Asp Asp Gly Gln Pro1 5 10 15Pro Pro Lys Cys Ile20
權(quán)利要求
1.一種確定糖尿病患者從用于治療血管并發(fā)癥的抗氧化劑治療中獲益的可能性的方法，該方法包括確定糖尿病患者的觸珠蛋白表型并據(jù)此確定糖尿病患者從所述的抗氧化劑治療中獲益的可能性，其中與具有觸珠蛋白1-2表型或觸珠蛋白1-1表型的患者相比，具有觸珠蛋白2-2表型的患者從所述的抗氧化劑治療中的獲益更大。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述的血管并發(fā)癥選自由微血管并發(fā)癥和大血管并發(fā)癥所構(gòu)成的組。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述的血管并發(fā)癥是一種選自由慢性心衰、心血管死亡、中風(fēng)、心肌梗死和冠狀動(dòng)脈血管成形術(shù)相關(guān)的再狹窄所構(gòu)成的組的大血管并發(fā)癥。
4.權(quán)利要求2的方法，其中所述的微血管并發(fā)癥選自由糖尿病視網(wǎng)膜病變、糖尿病神經(jīng)病變和糖尿病腎病所構(gòu)成的組。
5.權(quán)利要求2的方法，其中所述的大血管并發(fā)癥選自由冠狀動(dòng)脈側(cè)支血管減少和心肌缺血所構(gòu)成的組。
6.權(quán)利要求1的方法，其中通過(guò)確定糖尿病患者的觸珠蛋白的基因型實(shí)現(xiàn)對(duì)所述的觸珠蛋白表型的確定。
7.權(quán)利要求6的方法，其中通過(guò)一種選自如下一組的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)確定糖尿病患者的觸珠蛋白基因型的步驟，所述的組由信號(hào)擴(kuò)增法、直接檢測(cè)法和對(duì)至少一種序列改變的檢測(cè)組成。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述的信號(hào)擴(kuò)增法擴(kuò)增的是選自DNA分子和RNA分子的分子。
9.權(quán)利要求7的方法，其中所述的信號(hào)擴(kuò)增法選自由PCR、LCR(LAR)、自動(dòng)維持合成反應(yīng)(3SR/NASBA)和Q-β(Qβ)復(fù)制酶反應(yīng)所構(gòu)成的組。
10.權(quán)利要求7的方法，其中所述的直接檢測(cè)法選自由循環(huán)探針?lè)磻?yīng)(CPR)和分支DNA分析所構(gòu)成的組。
11.權(quán)利要求7的方法，其中所述的對(duì)至少一種序列改變的檢測(cè)采用一種選自如下一組的方法，所述的組由限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)分析、等位基因特異性寡核苷酸(ASO)分析、變性/溫度梯度凝膠電泳(DGGE/TGGE)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)分析和雙脫氧指紋印跡法(ddF)所構(gòu)成。
12.權(quán)利要求1的方法，其中通過(guò)直接確定糖尿病患者的觸珠蛋白表型來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)所述的觸珠蛋白表型的確定。
13.權(quán)利要求12的方法，其中用免疫學(xué)檢測(cè)法實(shí)現(xiàn)確定所述的觸珠蛋白表型的步驟。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述的免疫學(xué)檢測(cè)法選自由放射免疫測(cè)定法(RIA)、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)、western印跡法、免疫組織化學(xué)分析和熒光激活細(xì)胞分選(FACS)所構(gòu)成的組。
15.一種確定減少糖尿病患者的氧化應(yīng)激以預(yù)防糖尿病相關(guān)的血管并發(fā)癥的重要性的方法，該方法包括確定糖尿病患者的觸珠蛋白表型的步驟，據(jù)此確定減少特定的糖尿病患者的氧化應(yīng)激的重要性，其中與具有觸珠蛋白1-2表型或觸珠蛋白1-1表型的患者相比，在具有觸珠蛋白2-2表型的患者中減少氧化應(yīng)激的重要性更大。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述的血管并發(fā)癥選自由微血管并發(fā)癥和大血管并發(fā)癥所構(gòu)成的組。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述的血管并發(fā)癥是一種選自由慢性心衰、心血管死亡、中風(fēng)、心肌梗死和冠狀動(dòng)脈血管成形術(shù)相關(guān)的再狹窄所構(gòu)成的組的大血管并發(fā)癥。
18.權(quán)利要求16的方法，其中所述的微血管并發(fā)癥選自由糖尿病視網(wǎng)膜病變、糖尿病神經(jīng)病變和糖尿病腎病所構(gòu)成的組。
19.權(quán)利要求16的方法，其中所述的大血管并發(fā)癥選自由冠狀動(dòng)脈側(cè)支血管減少和心肌缺血所構(gòu)成的組。
20.權(quán)利要求15的方法，其中通過(guò)確定糖尿病患者的觸珠蛋白的基因型實(shí)現(xiàn)對(duì)所述的觸珠蛋白表型的確定。
21.權(quán)利要求15的方法，其中通過(guò)一種選自如下一組的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)確定糖尿病患者的觸珠蛋白基因型的步驟，所述的組由信號(hào)擴(kuò)增法、直接檢測(cè)法和對(duì)至少一種序列改變的檢測(cè)組成。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述的信號(hào)擴(kuò)增法擴(kuò)增的是選自DNA分子和RNA分子的分子。
23.權(quán)利要求21的方法，其中所述的信號(hào)擴(kuò)增法選自由PCR、LCR(LAR)、自動(dòng)維持合成反應(yīng)(3SR/NASBA)和Q-β(Qβ)復(fù)制酶反應(yīng)所構(gòu)成的組。
24.權(quán)利要求21的方法，其中所述的直接檢測(cè)法選自由循環(huán)探針?lè)磻?yīng)(CPR)和分支DNA分析所構(gòu)成的組。
25.權(quán)利要求21的方法，其中所述的對(duì)至少一種序列改變的檢測(cè)采用一種選自如下一組的方法，所述的組由限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)分析、等位基因特異性寡核苷酸(ASO)分析、變性/溫度梯度凝膠電泳(DGGE/TGGE)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)分析和雙脫氧指紋印跡法(ddF)所構(gòu)成。
26.權(quán)利要求15的方法，其中通過(guò)直接確定糖尿病患者的觸珠蛋白表型來(lái)實(shí)現(xiàn)確定所述的觸珠蛋白表型的步驟。
27.權(quán)利要求26的方法，其中通過(guò)免疫學(xué)檢測(cè)法實(shí)現(xiàn)確定所述的觸珠蛋白表型的步驟。
28.權(quán)利要求27的方法，其中所述的免疫學(xué)檢測(cè)法選自由放射免疫測(cè)定法(RIA)、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)、western印跡法、免疫組織化學(xué)分析和熒光激活細(xì)胞分選(FACS)所構(gòu)成的組。
全文摘要
一種確定糖尿病患者從用于治療血管并發(fā)癥的抗氧化劑治療中獲益的可能性的方法，該方法包括確定糖尿病患者的觸珠蛋白表型并據(jù)此確定糖尿病患者從所述的抗氧化劑治療中獲益的可能性，其中與具有觸珠蛋白1－2表型或觸珠蛋白1－1表型的患者相比，具有觸珠蛋白2－2表型的患者從抗氧化劑治療中的獲益要更多。
文檔編號(hào)C12P19/34GK1780921SQ200380110094
公開(kāi)日2006年5月31日 申請(qǐng)日期2003年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月2日
發(fā)明者安德魯·P·利維 申請(qǐng)人:拉帕波特家族醫(yī)學(xué)研究院