專利名稱：一種構(gòu)建cDNA文庫(kù)的方法及其專用引物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域中一種構(gòu)建cDNA文庫(kù)的方法及其專用引物。
背景技術(shù)：
cDNA文庫(kù)的構(gòu)建是分子生物學(xué)，功能基因組學(xué)，優(yōu)異資源基因分離克隆研究中不可缺少的技術(shù)。其構(gòu)建一般采用純化的Poly(A)mRNA為反轉(zhuǎn)錄酶的模板來(lái)合成第一鏈，隨后用DNA聚合酶(Polymerase)合成cDNA雙鏈，為了將合成的cDNA雙鏈克隆到載體中，通常在其末端連接兩個(gè)不同的酶切位點(diǎn)，以便克隆的cDNA具有方向性。這些方法都存在以下問(wèn)題不能保證cDNA合成的全長(zhǎng)性，因而cDNA文庫(kù)質(zhì)量難以保證；為了將合成的cDNA雙鏈克隆到載體中，必須在其末端連接兩個(gè)不同的酶切位點(diǎn)，使操作十分繁瑣；連接時(shí)對(duì)cDNA長(zhǎng)度的選擇性偏差較高使文庫(kù)的代表性降低；都要涉及核酸內(nèi)切酶與DNA連接酶的使用，而且操作步驟繁瑣，需要實(shí)驗(yàn)技術(shù)人員具有嫻熟的操作技能；需用大量的Poly(A)mRNA，也不適應(yīng)通量化的需要，更不能對(duì)微量寶貴樣品建庫(kù)；由于操作太繁瑣，不能高通量化，不適應(yīng)功能基因組學(xué)的飛速發(fā)展的需要。
隨著功能基因組學(xué)的飛速發(fā)展，對(duì)cDNA文庫(kù)的構(gòu)建提出更高更新的要求，包括(1)使用微量總RNA為模板以免mRNA純化，更重要的是使微量寶貴樣品(甚至單細(xì)胞)的建庫(kù)成為可能；(2)操作步驟簡(jiǎn)化以便自動(dòng)化及通量化。
鑒于以上問(wèn)題，不同的解決方法相繼被研究出來(lái)。Clontech公司的LD PCR方法合成雙鏈cDNA可以解決Poly(A)mRNA用量大的問(wèn)題，但不能保證cDNA的全長(zhǎng)性(Chenchik A，Zhu YY，Diatchenko L，Li R，Hill J，and Siebert P.1998.Generation and use of high-quality cDNA from small amount of total RNA bySMART PCR.In Gene Cloning and Analysis by RT-PCR.Edited by Paul Siebertand James Larrick.BioTechique Books，natiek，MA)；Invitrogen公司的GatewayTechnology解決了連接時(shí)對(duì)cDNA長(zhǎng)度的選擇性偏差問(wèn)題，但沒(méi)有完全解決不使用DNA連接酶的問(wèn)題(Ohara O and Temple G.2001.Directional cDNA libraryconstruction assisted by the in vitro recombination reaction.Nucleic AcidResearch.vol.29，No.4 e22)?？傊F(xiàn)在還沒(méi)有一種cDNA文庫(kù)構(gòu)建方法能完全解決以上問(wèn)題。
發(fā)明創(chuàng)造內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種不需核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶的構(gòu)建cDNA文庫(kù)的專用引物。
本發(fā)明所提供的專用引物共兩對(duì)，其中，一對(duì)引物用于cDNA第一條鏈的合成，為序列表中的SEQ ID № 1(attB2(dT)25)和SEQ ID № 2(attB1(rG)3)；另一對(duì)引物用于cDNA第二條鏈的合成，為序列表中的SEQ ID № 3(attB1)和SEQ ID №4(attB2)。
序列表中的SEQ ID № 1(attB2(dT)25)由51個(gè)堿基組成，在3’端帶25個(gè)(d)T，尾端設(shè)計(jì)了VN序列，以提高啟動(dòng)引導(dǎo)的特異性，并在其5’末端設(shè)計(jì)了attB2重組反應(yīng)特異序列，使不涉及核酸內(nèi)切酶與DNA連接酶的克隆操作成為可能；SEQ ID № 2(attB1(rG)3)由28個(gè)堿基組成，基于RNase H-反轉(zhuǎn)錄酶完成mRNA的反轉(zhuǎn)錄之后在第一cDNA鏈3’末端繼續(xù)延長(zhǎng)三個(gè)C堿基的特性(Chenchik A，ZhuYY，Diatchenko L，Li R，Hill J，and Siebert P.1998.Generation and use ofhigh-quality cDNA from small amount of total RNA by SMART PCR.In Gene Cloningand Analysis by RT-PCR.Edited by Paul Siebert and James Larrick.BioTechiqueBooks，natiek，MA)，在引物3’末端設(shè)計(jì)了三個(gè)rG(非脫氧核甘酸G)，這三個(gè)rG與第一cDNA鏈3’末端延長(zhǎng)的三個(gè)C堿基互補(bǔ)，使RNase H-反轉(zhuǎn)錄酶在合成中自動(dòng)進(jìn)行模板轉(zhuǎn)換，并將重組反應(yīng)特異序列attB1固定在第一cDNA鏈3’末端。
序列表中的SEQ ID № 3和SEQ ID № 4均由29個(gè)堿基組成，SEQ ID № 3含有attB1序列，SEQ ID № 4含有attB2序列。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種可確保cDNA的全長(zhǎng)性的合成cDNA第一鏈的方法。
本發(fā)明所提供的合成cDNA第一鏈的方法，是以總RNA(Total RNA)為模板，以序列表中的SEQ ID № 1和SEQ ID № 2為引物合成cDNA第一條鏈。
其中，所述cDNA第一條鏈的合成反應(yīng)分兩步進(jìn)行，先用序列表中的SEQ ID №1合成cDNA第一條鏈，然后再用SEQ ID № 2進(jìn)行cDNA第一條鏈合成中的模板轉(zhuǎn)換反應(yīng)。cDNA第一條鏈的合成過(guò)程如圖1所示，cDNA第一條鏈的合成反應(yīng)步驟如下將以下試劑按順序加入微試管之中RNA樣品 (1微克總量RNA)attB2(dT)25引物(10uM) 1微升DEPC-H2O 至5微升混勻并將溶液離心至管底，置于72℃水浴2分鐘，之后快速冰浴2分鐘，再加入下面試劑5×第一鏈合成緩沖液 2微升DTT(20mM) 1微升dNTP(10mM)1微升SuperScript II反轉(zhuǎn)錄酶1微升反應(yīng)容積 10微升混勻，離心，置于42℃，反應(yīng)進(jìn)行60分鐘后，加入以下試劑進(jìn)行模板轉(zhuǎn)換反應(yīng)attB1(rG)3引物(10uM) 1微升5×第一鏈合成緩沖液 0.5微升SuperScript II反轉(zhuǎn)錄酶1微升反應(yīng)容積 12.5微升混勻，離心，置于42℃，60分鐘后反應(yīng)完畢。
該方法將cDNA第一鏈合成反應(yīng)與模板轉(zhuǎn)換反應(yīng)分解為兩步，但仍然在同一反應(yīng)管中進(jìn)行，這樣，第一鏈合成完畢之后，再進(jìn)行模板轉(zhuǎn)換反應(yīng)，有效地避免了反轉(zhuǎn)錄未完成之前的模板轉(zhuǎn)換，從而大大提高了cDNA的全長(zhǎng)性。
本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種完全不需核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶的構(gòu)建全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)的方法。
本發(fā)明所提供的完全不需核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶的構(gòu)建cDNA文庫(kù)的方法，包括以下步驟1)以總RNA(Total RNA)為模板，以序列表中的SEQ ID № 1和SEQ ID № 2為引物合成cDNA第一條鏈；2)用序列表中的SEQ ID № 3和SEQ ID № 4合成雙鏈cDNA；3)將步驟2)合成的雙鏈cDNA用λ噬菌體插入/切除特異序列重組系統(tǒng)連接到載體中，將所述載體導(dǎo)入宿主，得到cDNA文庫(kù)。
其中，步驟1)中所述cDNA第一條鏈的合成反應(yīng)分兩步進(jìn)行，先用序列表中的SEQ ID № 1合成cDNA第一條鏈，然后再用SEQ ID № 2進(jìn)行cDNA第一條鏈合成中的模板轉(zhuǎn)換反應(yīng)。cDNA第一條鏈的合成過(guò)程如圖1所示，cDNA第一條鏈的合成反應(yīng)步驟如下將以下試劑按順序加入微試管之中RNA樣品(1微克總量RNA)attB2(dT)25引物(10uM) 1微升
DEPC-H2O至5微升混勻并將溶液離心至管底，置于72℃水浴2分鐘，之后快速冰浴2分鐘，再加入下面試劑5×第一鏈合成緩沖液 2微升DTT(20mM)1微升dNTP(10mM) 1微升SuperScript II反轉(zhuǎn)錄酶 1微升反應(yīng)容積 10微升混勻，離心，置于42℃，反應(yīng)進(jìn)行60分鐘后，加入以下試劑進(jìn)行模板轉(zhuǎn)換反應(yīng)attB1(rG)3引物(10uM)1微升5×第一鏈合成緩沖液 0.5微升SuperScript II反轉(zhuǎn)錄酶 1微升反應(yīng)容積 12.5微升混勻，離心，置于42℃，60分鐘后反應(yīng)完畢。
步驟1)將cDNA第一鏈合成反應(yīng)與模板轉(zhuǎn)換反應(yīng)分解為兩步，但仍然在同一反應(yīng)管中進(jìn)行，這樣，第一鏈合成完畢之后，再進(jìn)行模板轉(zhuǎn)換反應(yīng)，有效地避免了反轉(zhuǎn)錄未完成之前的模板轉(zhuǎn)換，從而大大提高了cDNA的全長(zhǎng)性。
因?yàn)槔眯蛄斜碇械腟EQ ID № 1和SEQ ID № 2將attB1與attB2序列分別固定在第一鏈的5’與3’末端，cDNA雙鏈的合成變得非常簡(jiǎn)單，如圖2所示，cDNA雙鏈的合成可以采用PCR擴(kuò)增來(lái)實(shí)現(xiàn)。
cDNA雙鏈的合成反應(yīng)完畢后進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，通常采用0.75％的瓊脂糖凝膠電泳。然后進(jìn)入文庫(kù)構(gòu)建，與常規(guī)建庫(kù)一樣，在構(gòu)建文庫(kù)前，擴(kuò)增好的cDNA必須經(jīng)過(guò)分子篩(層析或瓊脂糖凝膠電泳)去掉合成不完全的小片段cDNA?；厥盏腸DNA就可以供文庫(kù)構(gòu)建。
其中步驟3)中所述λ噬菌體插入/切除特異序列重組系統(tǒng)包括重組克隆酶和載體，所述載體含有attP1和attP2特異重組位點(diǎn)，所述重組克隆酶和載體均有商業(yè)試劑盒，如Invitrogen的BP Clonase即λ噬菌體插入酶(integrase)與pDONR207。cDNA文庫(kù)的構(gòu)建按照?qǐng)D3所示的程序進(jìn)行。至此，cDNA文庫(kù)已經(jīng)被構(gòu)建在質(zhì)粒載體之中。之后，用以上反應(yīng)液轉(zhuǎn)化大腸桿菌，如大腸桿菌DH10B感受態(tài)細(xì)胞，得到cDNA文庫(kù)。
序列表中的SEQ ID № 1和SEQ ID № 2這兩個(gè)引物，不但奠定了LD PCR合成雙鏈cDNA的基礎(chǔ)，而且將重組克隆有機(jī)的整合，使不涉及核酸內(nèi)切酶與DNA連接酶的克隆操作成為可能。本發(fā)明將cDNA第一鏈合成反應(yīng)與模板轉(zhuǎn)換反應(yīng)分解，分兩步進(jìn)行(但仍然在同一反應(yīng)管中)，這樣，第一鏈合成完畢之后，再進(jìn)行模板轉(zhuǎn)換反應(yīng)，有效地避免了反轉(zhuǎn)錄未完成之前的模板轉(zhuǎn)換，從而保證了cDNA的全長(zhǎng)性。
本發(fā)明基于RNase H-反轉(zhuǎn)錄酶的特性(Clark JM.1988.Novel non-templatednucleotide addition reaction catalyzed by prokaryotic and eucaryotic DNApolymerases.Nucleic Acid Research.169677-9686)與λ噬菌體插入/切除(integration/excision)特異序列重組系統(tǒng)(site-specific recombinationsystem，Bauer CE，Gardner JF，Gumport RI.1985.Extent of sequence homologyrequired for bacteriophage lambda site-specific recombination.J.Mol.Biol.181187-197)，設(shè)計(jì)了cDNA的合成引物與cDNA文庫(kù)的構(gòu)建方法，使cDNA的合成及文庫(kù)構(gòu)建更加快捷簡(jiǎn)便，文庫(kù)cDNA的全長(zhǎng)性得到保障，由于完全不需要核酸內(nèi)切酶與DNA連接酶的介入，大大簡(jiǎn)化操作程序，便于高通量化而適應(yīng)功能基因組學(xué)的飛速發(fā)展的需要；此外，該方法還具有如下優(yōu)點(diǎn)采用重組方法將合成的cDNA雙鏈定向克隆到載體中，不需要在其末端必須連接兩個(gè)不同的酶切位點(diǎn)，使操作更加簡(jiǎn)便；只需要微量總RNA，不需用大量的Poly(A)mRNA，適應(yīng)通量化的需要，更使微量寶貴樣品甚至單細(xì)胞的建庫(kù)成為可能；cDNA的插入具有方向性；重組頻率高(＞106克隆/μg cDNA)；由于采用重組克隆，對(duì)cDNA長(zhǎng)度的選擇性偏差小，使所建文庫(kù)具有更高的代表性；應(yīng)用λ噬菌體的切除酶系統(tǒng)可將所建文庫(kù)穿梭轉(zhuǎn)移至其它載體，如表達(dá)載體以供基因表達(dá)的通量分析。本發(fā)明的方法及其專用引物適用性很廣，可用于任何來(lái)源生物樣品RNA，將為我國(guó)資源基因發(fā)掘利用提供一種新的強(qiáng)有力的基因克隆技術(shù)。


圖1為cDNA第一條鏈的合成示意2為cDNA雙鏈的合成示意3為重組cDNA文庫(kù)的構(gòu)建示意4為合成的鹽芥葉片cDNA的電泳檢測(cè)5為PCR檢測(cè)鹽芥葉片cDNA文庫(kù)的電泳圖具體實(shí)施方式
實(shí)施例1、鹽芥(Thellungiella halophila)鹽誘導(dǎo)葉片cDNA文庫(kù)的構(gòu)建鹽芥鹽誘導(dǎo)葉片(L)cDNA合成?？偭縍NA從三星期大小的植物用Invitrogen的Trizol試劑從葉片抽提，用1微克的總量RNA為作為反轉(zhuǎn)錄的模板，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)采用Invitrogen的SuperScriptII試劑及其使用指南。然后用以上反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液1微升作為PCR擴(kuò)增模板，用TaKaRa公司的ExTaq酶試劑擴(kuò)增雙鏈cDNA。擴(kuò)增的cDNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后回收大于500bp的片段用于建庫(kù)。cDNA文庫(kù)構(gòu)建使用Invitrogen的BP Clonase與pDONR207試劑及其使用指南。具體步驟如下cDNA第一條鏈的合成反應(yīng)步驟如下將以下試劑按順序加入一支0.5毫升的微試管之中RNA樣品(1微克總量RNA)attB2(dT)25引物(10uM) 1微升DEPC-H2O 至5微升混勻并將溶液離心至管底，置管于72℃水浴2分鐘，之后快速冰浴2分鐘，再加入下面試劑5×第一鏈合成緩沖液 2微升DTT(20mM)1微升dNTP(10mM) 1微升SuperScript II反轉(zhuǎn)錄酶 1微升反應(yīng)容積 10微升混勻，離心，置于42℃，反應(yīng)進(jìn)行60分鐘后，加入以下試劑進(jìn)行模板轉(zhuǎn)換反應(yīng)attB1(rG)3引物(10uM)1微升5×第一鏈合成緩沖液 0.5微升SuperScript II反轉(zhuǎn)錄酶 1微升反應(yīng)容積 12.5微升混勻，離心，置于42℃，15分鐘后反應(yīng)完畢。
其中，5×第一鏈合成緩沖液(Invitrogen)cDNA第一鏈合成反應(yīng)液 2微升10×緩沖液(TaKaRa) 10微升dNTP 8微升attB1(10uM) 2微升attB2(10uM) 2微升ExTaq酶 1微升
dH2O 75微升反應(yīng)容積100微升混勻，離心，置于PCR儀上按如下條件進(jìn)行反應(yīng)，95℃ 2分鐘 1個(gè)循環(huán)95℃ 5秒鐘64℃ 10秒鐘72℃ 6分鐘 20個(gè)循環(huán)72℃ 10分鐘 1個(gè)循環(huán)反應(yīng)完畢后取5微升反應(yīng)產(chǎn)物，用0.75％的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，結(jié)果如圖4所示，L為反應(yīng)產(chǎn)物，M為Marker，cDNA大多分布在1至1.5kb之間，說(shuō)明cDNA合成非常成功。擴(kuò)增的cDNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后回收大于500bp的片段用于建庫(kù)。采用Invitrogen的BP Clonase與pDONR207進(jìn)行如下反應(yīng)回收的cDNA 10微升(100-200納克)5×BP克隆酶緩沖液 4微升pDONR207(150納克/微升 2微升BP克隆酶 4微升反應(yīng)容量 20微升混勻，離心，置于25℃過(guò)夜(16小時(shí))。反應(yīng)完畢后，加入2微升蛋白水解酶K，置于37℃，反應(yīng)15分鐘。至此，cDNA文庫(kù)已經(jīng)被構(gòu)建在質(zhì)粒載體之中。其中，5×BP克隆酶緩沖液(Invitrogen)。然后，用以上BP克隆酶反應(yīng)液按常規(guī)方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B感受態(tài)細(xì)胞而獲得cDNA文庫(kù)，每微克cDNA獲得大約3×106個(gè)克隆。文庫(kù)cDNA插入片段PCR擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果如圖5所示，其大小均在500bp以上。
序列表<160>4<210>1<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(50)<223>v＝a，c或g，<220>
<221>misc_feature<222>(51)<223>n＝a，c，g，或t<400>1accactttgt acaagaaagc tgggtttttt tttttttttt tttttttttv n 51<210>2<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(26，27，28)<223>n＝rg
<400>2acaagtttgt acaaaaaagc aggctnnn 28<210>3<211>29<212>DNA<213>人工序列<400>3ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggct 29<210>4<211>29<212>DNA<213>人工序列<400>4ggggaccact ttgtacaaga aagctgggt 29
權(quán)利要求
1.一種構(gòu)建cDNA文庫(kù)的專用引物，共兩對(duì)，其中，一對(duì)引物為序列表中的SEQ ID№ 1和SEQ ID № 2；另一對(duì)引物為序列表中的SEQ ID № 3和SEQ ID № 4。
2.一種合成cDNA第一鏈的方法，是以總RNA為模板，以序列表中的SEQ ID № 1和SEQ ID № 2為引物合成cDNA第一條鏈。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述cDNA第一條鏈的合成反應(yīng)分兩步進(jìn)行，先用序列表中的SEQ ID № 1合成cDNA第一條鏈，然后再用SEQ ID № 2進(jìn)行cDNA第一條鏈合成中的模板轉(zhuǎn)換反應(yīng)。
4.一種構(gòu)建cDNA文庫(kù)的方法，包括以下步驟1)以總量RNA為模板，以序列表中的SEQ ID № 1和SEQ ID № 2為引物合成cDNA第一條鏈；2)用序列表中的SEQ ID № 3和SEQ ID № 4合成雙鏈cDNA；3)將步驟2)合成的雙鏈cDNA用λ噬菌體插入/切除特異序列重組系統(tǒng)連接到載體中，將所述載體導(dǎo)入宿主，得到cDNA文庫(kù)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述cDNA第一條鏈的合成反應(yīng)分兩步進(jìn)行，先用序列表中的SEQ ID № 1合成cDNA第一條鏈，然后再用SEQ ID № 2進(jìn)行cDNA第一條鏈合成中的模板轉(zhuǎn)換反應(yīng)。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征在于步驟3)中所述λ噬菌體插入/切除特異序列重組系統(tǒng)包括重組克隆酶和載體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述重組克隆酶為BP Clonase。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述載體為pDONR207。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述宿主為大腸桿菌。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述大腸桿菌為大腸桿菌DH10B。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種構(gòu)建cDNA文庫(kù)的方法及其專用引物，其目的是提供一種不需核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶的構(gòu)建cDNA文庫(kù)的方法及其專用引物。本發(fā)明所提供的構(gòu)建cDNA文庫(kù)的專用引物，共兩對(duì)，其中，一對(duì)引物為序列表中的SEQ ID № 1和SEQID № 2；另一對(duì)引物為序列表中的SEQ ID № 3和SEQ ID № 4。一種構(gòu)建cDNA文庫(kù)的方法，包括以下步驟1)以總量RNA為模板，以序列表中的SEQ ID № 1和SEQID № 2為引物合成cDNA第一條鏈；2)用序列表中的SEQ ID № 3和SEQ ID № 4合成雙鏈cDNA；3)將步驟2)合成的雙鏈cDNA用λ噬菌體插入/切除特異序列重組系統(tǒng)連接到載體中，將所述載體導(dǎo)入宿主，得到cDNA文庫(kù)。本發(fā)明的方法及其專用引物適用性很廣，可用于任何來(lái)源的生物樣品RNA。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1641040SQ20041000068
公開日2005年7月20日 申請(qǐng)日期2004年1月15日 優(yōu)先權(quán)日2004年1月15日
發(fā)明者向成斌 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)