專利名稱：一種人蛋白c的表達(dá)方法及其專用引物與表達(dá)載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域中一種人蛋白C的表達(dá)方法及其專用引物與表達(dá)載體。
背景技術(shù)：
血液中的抗凝系統(tǒng)主要包含三個(gè)體系抗凝血酶-III、蛋白C系統(tǒng)和組織因子途徑抑制物，它們共同參與抗凝。蛋白C系統(tǒng)由蛋白C(protein C，PC)、凝血酶調(diào)節(jié)蛋白(thrombomodulin，TM)、蛋白S(protein S，PS)和蛋白C抑制物(protein Cinhibitor，PCI)組成，對血液的凝固起到重要的調(diào)節(jié)作用，其中蛋白C是該系統(tǒng)中的關(guān)鍵成分。蛋白C作為血液中一種重要的抗凝物質(zhì)，對于調(diào)節(jié)凝血系統(tǒng)和纖溶系統(tǒng)的功能起到重要作用，其血漿水平低下與靜脈血栓形成、新生兒突發(fā)性紫癜、彌散性血管內(nèi)凝血(disseminated intravascular coagulation，DIC)、肝臟疾病等有關(guān)。
1960年，Mammen和Seegers在處理凝血酶原(prothrombin)復(fù)合物時(shí)發(fā)現(xiàn)蛋白C，當(dāng)時(shí)命名為“自激凝血酶原IIa(autoprothrombin IIa)”。1970年，Seegers從牛血中純化得到此物質(zhì)。1976年，Stenflo從牛血漿中分離出一種維生素K依賴性蛋白(vitamin K-dependent protein)，因其位于蛋白洗脫的第三峰而稱為蛋白C。Seegers證實(shí)蛋白C與他先前發(fā)現(xiàn)的autoprothrombin IIa是同一蛋白。
蛋白C是一種維生素K依賴的糖蛋白，屬于絲氨酸蛋白酶，在肝細(xì)胞中合成。其分子量為62kDa，消光系數(shù)為14.5，等電點(diǎn)為4.4-4.5。人血漿中蛋白C的正常含量約為2-6mg/L，無性別差異，有隨年齡增長有增加的趨勢。蛋白C基因以單拷貝的形式位于人2號染色體(2q13-2q14)，長11.2kb，包括6kb的5’端側(cè)翼序列、9個(gè)外顯子、8個(gè)內(nèi)含子和4kb的3’端側(cè)翼序列，其中內(nèi)含子占全部序列的83％。蛋白C的mRNA總長為1795nt，占總mRNA的0.02％。蛋白C的cDNA已被克隆，包括5’非編碼區(qū)(73bp)、開放閱讀框架(1383bp)、3’非編碼區(qū)(296bp)和polyA尾(38bp)。
人血漿中的蛋白C以兩種形式存在雙鏈分子和單鏈分子，分別占80-90％和10-20％。雙鏈的蛋白C由輕鏈和重鏈組成，鏈間由二硫鍵連接。蛋白C輕鏈N端的γ-羧基谷氨酸(γ-Gla)結(jié)構(gòu)域含9個(gè)γ-Gla殘基，是由新生肽鏈中谷氨酸羧化加工而成。此γ-Gla殘基是蛋白C與Ca2+高親和力結(jié)合的部位，結(jié)合了Ca2+的γ-Gla殘基可進(jìn)一步與帶負(fù)電的膜磷脂相互作用而使蛋白C呈現(xiàn)其生物活性。此外在蛋白C活化過程中，其Gla結(jié)構(gòu)域可直接與TM結(jié)合，故9個(gè)γ-羧基谷氨酸對維持蛋白C的抗凝活性起到至關(guān)重要的作用。輕鏈上的兩個(gè)表皮生長因子(EGF)結(jié)構(gòu)域同源于EGF前體，存在一個(gè)與γ-Gla無關(guān)的高親和力Ca2+結(jié)合部位，是凝血酶-血栓調(diào)節(jié)蛋白復(fù)合物激活蛋白C所必需的。蛋白C重鏈C端存在一個(gè)絲氨酸蛋白酶樣結(jié)構(gòu)域，是蛋白C的活性區(qū)域。蛋白C前體在Arg157和Asp158(從成熟單鏈蛋白C的氨基端計(jì)數(shù))間的肽鍵受到胰蛋白酶樣肽鏈內(nèi)切酶的作用后斷裂，然后，由一種羥基肽酶B樣蛋白酶從C-端移去Arg157和Lys156，二硫鍵連接輕鏈和重鏈形成雙鏈蛋白C。
蛋白C具有強(qiáng)大的抗凝、促纖溶活性以及潛在的抗炎作用，顯示出重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。早在二十世紀(jì)八十年代末，人們就將從血漿中提取的蛋白C應(yīng)用于蛋白C缺乏癥患者。近年來，蛋白C在感染性疾病特別是嚴(yán)重感染中的治療作用倍受關(guān)注。據(jù)1996年的統(tǒng)計(jì)，全美國蛋白C的年總需求高達(dá)100公斤，并逐年增長。迄今為止，臨床治療所用的蛋白C多為從人血漿中提取的蛋白C濃縮劑。但是，蛋白C在人血漿中的含量低、半衰期短，從凝血因子濃縮物或人血漿中提取天然蛋白C，不但成本高，工藝復(fù)雜，而且存在蛋白純度、穩(wěn)定性和安全性等問題，血源性蛋白C產(chǎn)品遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足臨床的需要。自八十年代至今，美國、加拿大、日本等國一直進(jìn)行重組人蛋白C(recombinated human protein C，rhPC)的研究開發(fā)，已在哺乳動物細(xì)胞中得到表達(dá)。
蛋白C的結(jié)構(gòu)和功能復(fù)雜，在其生物合成的過程中經(jīng)歷復(fù)雜的翻譯中和翻譯后修飾過程，從細(xì)胞中表達(dá)出高水平且具有生物活性的蛋白C較為困難。原核表達(dá)系統(tǒng)因不能進(jìn)行蛋白C所需的修飾過程，其表達(dá)的蛋白C缺乏生物學(xué)活性。人們已在HEK293、CHO、BHK中進(jìn)行過表達(dá)，而在哺乳動物細(xì)胞表達(dá)存在表達(dá)量低、活性不高以及在異源宿主中表達(dá)時(shí)的翻譯后修飾等問題，如表達(dá)產(chǎn)物糖基化和羧基化不完全、單鏈形式所占比例過高。蛋白C在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，其糖基化、翻譯后加工與天然蛋白C存在一定差異，另外生產(chǎn)工藝復(fù)雜、成本高，也是不可忽視的問題。由于乳腺組織的固有優(yōu)點(diǎn)，近年來，已成為生產(chǎn)藥用蛋白的主要靶器官，尤其是用量較大、需要在動物體內(nèi)進(jìn)行蛋白翻譯后加工的產(chǎn)品。乳腺生物反應(yīng)器成為生產(chǎn)藥用蛋白C的重要手段。目前，已在轉(zhuǎn)基因小鼠和轉(zhuǎn)基因豬進(jìn)行了研究。Velander等(Ann N Y Acad Sci.1992，665391)以WAP為啟動子，將人蛋白C的cDNA轉(zhuǎn)入CD-1小鼠，經(jīng)檢測獲得6只轉(zhuǎn)基因小鼠，其乳汁中蛋白C表達(dá)水平為1.0-3.0μg/ml，高峰期達(dá)8-12天。轉(zhuǎn)基因小鼠所表達(dá)的蛋白C具有較高的抗凝活性，單鏈與雙鏈的比率在5-30％，與天然蛋白C近似。但此研究中并沒有分析重組蛋白C的糖基化和氨基酸序列。在轉(zhuǎn)基因豬的研究中，乳汁中蛋白C的表達(dá)量達(dá)到0.1-1mg/ml，在其26天的泌乳期保持穩(wěn)定。以鼠WAP為啟動子，其調(diào)控序列可以控制人蛋白C在豬乳腺中高效表達(dá)，每小時(shí)達(dá)380μg/ml，其抗凝活性與血漿來源的蛋白C相近。豬所分泌的重組蛋白C中的30-60％已充分γ-羧基化，表明轉(zhuǎn)基因豬的乳腺對蛋白C能進(jìn)行充分的γ-羧基化，但由于在乳汁中不能進(jìn)行有效的切割，轉(zhuǎn)基因豬分泌的單鏈蛋白C占較高的比例。蛋白C必須切割前肽Lys-2-Arg-1和去除連接輕鏈和重鏈間的Lys156-Arg157后，才能形成成熟的分子，轉(zhuǎn)基因小鼠和轉(zhuǎn)基因豬的乳腺都不能進(jìn)行有效切割。為能使轉(zhuǎn)基因動物直接分泌雙鏈形式的蛋白C，Drews等選用成對堿性氨基酸切割酶(paired basic amino acid cleavingenzyme，PACE)又名furin的人蛋白前體加工酶，與蛋白C在轉(zhuǎn)基因動物體內(nèi)共表達(dá)，使人蛋白C在正確的位置被切割，從而表達(dá)出成熟的雙鏈形式。
應(yīng)用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)高等真核生物基因時(shí)，其表達(dá)產(chǎn)物往往沒有生物活性，并且分離純化較為困難。哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)基本上克服了原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的缺點(diǎn)，但培養(yǎng)較困難，周期長、成本高，表達(dá)水平不理想。與以上兩種表達(dá)系統(tǒng)相比，酵母表達(dá)系統(tǒng)的發(fā)展越來越受到人們的青睞。酵母細(xì)胞是一種應(yīng)用前景良好、發(fā)展迅速的異源蛋白表達(dá)系統(tǒng)，具有類似哺乳動物細(xì)胞蛋白質(zhì)翻譯后的加工特性，表達(dá)產(chǎn)物不混雜熱原物質(zhì)，尤其是分泌性表達(dá)時(shí)，細(xì)胞較少分泌本身蛋白，易于目的蛋白的純化；另外，酵母細(xì)胞又具有易于培養(yǎng)及發(fā)酵成本低廉等類似原核表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn)。越來越多的外源蛋白則在酵母細(xì)胞中獲得高效表達(dá)，尤其是pichia pastoris酵母表達(dá)系統(tǒng)的研制，更是大大促進(jìn)了酵母表達(dá)系統(tǒng)的利用和發(fā)展。目前，未見蛋白C在酵母中進(jìn)行表達(dá)的相關(guān)研究。
發(fā)明創(chuàng)造內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種擴(kuò)增人蛋白C基因的專用引物。
本發(fā)明所提供的擴(kuò)增人蛋白C基因的專用引物為序列表中的SEQ ID №1和SEQID №2。
SEQ ID №1由34個(gè)堿基組成；SEQ ID №2由28個(gè)堿基組成；其中，SEQ ID№1的自5’端第4位至第9位堿基為XhoI的酶切位點(diǎn)；SEQ ID №2的自5’端第3位至第8位堿基為EcoRI的酶切位點(diǎn)。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種人蛋白C的表達(dá)載體，其表達(dá)產(chǎn)物可分泌到胞外，利于人蛋白C的提取，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
本發(fā)明所提供的人蛋白C的表達(dá)載體是含有人蛋白C基因的重組畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9-hPC。
重組畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9-hPC是通過下述步驟得到的(1)應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)，從人胎肝總RNA中釣取人蛋白C cDNA；(2)將步驟(1)中的得到的人蛋白C cDNA連接到酵母表達(dá)載體pPIC9上，得到重組畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9-hPC。
其中，步驟(1)中RT以O(shè)ligo(dT)15為引物；PCR擴(kuò)增引物可為序列表中的SEQ ID№1和SEQ ID №2。
本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種表達(dá)人蛋白C的方法。
一種表達(dá)人蛋白C的方法，是將重組畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9-hPC轉(zhuǎn)化到畢赤酵母中，得到陽性克隆，誘導(dǎo)培養(yǎng)所述陽性克隆，表達(dá)耐高溫木聚糖酶。
為了獲得更好的效果，畢赤酵母優(yōu)選為GS115菌株并用終濃度為0.25-1％的甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)陽性克隆，其中甲醇的終濃度優(yōu)選為0.5％。
本發(fā)明采用基因克隆技術(shù)，成功構(gòu)建了酵母表達(dá)載體pPIC9-hPC；利用電穿孔轉(zhuǎn)化方法，得到具有外源基因的酵母轉(zhuǎn)化子，表達(dá)的人蛋白C經(jīng)部分凝血活酶時(shí)間(APTT)法測定表明可延長血液凝固時(shí)間，起到了抗凝血的作用。本發(fā)明的方法在人蛋白C的生產(chǎn)中具有廣闊的工業(yè)前景。


圖1為人蛋白C的RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果圖2為重組表達(dá)載體pPIC9-hPC的雙酶切及PCR鑒定結(jié)果圖3為重組表達(dá)載體pPIC9-hPC的測序結(jié)果圖4為菌落PCR鑒定陽性克隆的結(jié)果圖5為表達(dá)上清濃縮后的SDS-PAGE電泳6為表達(dá)上清濃縮后Western Blot檢測圖具體實(shí)施方式
實(shí)施例1、人蛋白C cDNA在畢赤酵母細(xì)胞中的表達(dá)和活性鑒定(一)人蛋白C基因的克隆1.引物設(shè)計(jì)根據(jù)人蛋白C mRNA序列(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/)，設(shè)計(jì)上下游引物P1、P2及限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，其中在上游引物加入XhoI酶切位點(diǎn)，下游引物加入EcoRI酶切位點(diǎn)P15’-GCACTCGAGAAAAGAGCCAACTCCTTCCTGGAGG-3’(劃線的堿基序列為XhoI的酶切位點(diǎn))(序列表中SEQ ID №1)；P25’-CGGAATTCAGGGAGGGTCGCTAAGGTGC-3’(劃線的堿基序列為EcoRI的酶切位點(diǎn))(序列表中SEQ ID №2)。
2.人蛋白C cDNA的制備取液氮凍存新鮮胎肝0.75g，迅速加入Trizol試劑7.5ml，研磨至液體澄清后，加入等體積氯仿/異戊醇12000rpm 10min離心，吸取上清，以無水乙醇沉淀后，溶于50μl DEPC處理的水中，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)，從人胎肝總RNA中釣取人蛋白C cDNA，具體步驟如下取人胎肝總RNA 3μg，用Oligo(dT)15為引物合成cDNA第一鏈。反應(yīng)體系為5×反應(yīng)緩沖液4μl；40U/μl RNA酶抑制劑0.5μl；500μg/ml Oligo(dT)15引物1μl；2.5mmol/L dNTP 4μl；10U/μl AMV反轉(zhuǎn)錄酶1μl；加無核酸酶去離子水至總體積20μl。室溫放置10min，于42℃水浴1h，99℃保溫3min以滅活反轉(zhuǎn)錄酶。
以所獲得的cDNA為模板，用Pyrobest DNA聚合酶擴(kuò)增人蛋白C cDNA。PCR反應(yīng)體系為取上述RT反應(yīng)物7.5μl為模板；10×反應(yīng)緩沖液5μl；上、下游引物P1及P2各25pmol；2.5mmol/L dNTP 4μl；Pyrobest DNA聚合酶2.5U；加去離子水至總體積50μl。PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性4min，94℃ 30sec，58℃45sec，72℃1min，30次循環(huán)后72℃繼續(xù)延伸5min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)生的DNA片段應(yīng)用Promega公司的DNA片段純化試劑盒進(jìn)行純化，按操作說明進(jìn)行。具體步驟如下a.用含EB的1％瓊脂糖凝膠(選用TAE配制)電泳分離PCR反應(yīng)產(chǎn)物，結(jié)果如圖1所示，表明得到1260bp的DNA片段，圖中a為DL2000 DNA Marker，b為RT-PCR產(chǎn)物(不含信號肽的編碼序列)。
b.切取含目的DNA片段的凝膠塊，大小約300ng，凝膠塊放入1.5ml的Ep管，70℃溫育至凝膠完全融化；c.加入1ml純化樹脂，充分混勻20sec，但不能用旋渦器混勻；d.將3ml一次性注射器活塞拔出，微柱與注射器相連；e.將制備好的樹脂凝膠/DNA混合物移入注射器桶，插入活塞，輕輕推樣品入微柱；f.移入2ml 80％異丙醇于注射器中，用異丙醇洗微柱一次；g.將微柱置于1.5mlEp管中，10 000g室溫離心2min，以干燥樹脂；h.移微柱到一新無菌Ep管，加50ul去離子水或TE Buffer于微柱中，室溫放置1min后，10 000g離心20sec，以洗脫DNA片段。洗脫后的DNA貯存于4℃或-20℃。
3.重組酵母表達(dá)質(zhì)粒pPIC9-hPC的制備所獲得的人蛋白C cDNA純化后，應(yīng)用限制性內(nèi)切酶XhoI、EcoRI進(jìn)行雙酶切反應(yīng)。酵母分泌表達(dá)載體pPIC9也經(jīng)同樣的兩種限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切反應(yīng)。雙酶切反應(yīng)總體積為20μl，其中pPIC9 4μg，XhoI為10U，EcoR I為20U，10×H緩沖液2μl。反應(yīng)條件為37℃水浴3小時(shí)。酶切后樣品純化后，于-20℃?zhèn)溆?。?0μl反應(yīng)體系中，按目的基因片段與載體3∶1的摩爾比加入適量的目的基因片段與載體DNA、10×連接酶緩沖液1μl和T4DNA連接酶2U。在4-6℃水浴中過夜。
常規(guī)制備大腸桿菌DH5α感受態(tài)。取10μl連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于氨芐青霉素抗性LB平板，隨機(jī)挑選白色菌落，37℃活化12h以上后，提取質(zhì)粒DNA，以P1、P2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增以及XhoI、EcoRI雙酶切鑒定，結(jié)果如圖2所示，表明得到陽性細(xì)菌克隆(含有重組質(zhì)粒pPIC9-hPC的大腸桿菌DH5α)；圖中，a為雙酶切陰性對照，b為pPIC9-hPC PCR鑒定，c為pPIC9-hPC XhoI和EcoRI雙酶切，d為DL2 000 marker。挑選陽性克隆，進(jìn)行測序鑒定，結(jié)果如圖3所示，表明所克隆的人蛋白C的cDNA序列正確。
(二)人蛋白C基因的表達(dá)1.酵母轉(zhuǎn)化子的制備酵母表達(dá)載體的線性化酵母表達(dá)載體pPIC9-hPC，經(jīng)StuI單酶切以線性化表達(dá)載體，利于整合入酵母基因組中。單酶切反應(yīng)總體積為30μl，其中重組質(zhì)粒pPIC9-hPC5μg，StuI 0.5U，10×M Buffer 3μl。37℃水浴3h后，加入上樣緩沖液以終止反應(yīng)。取5μl樣品于1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定。經(jīng)純化回收后，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 按如下方法制備酵母感受態(tài)細(xì)胞a.接種單菌落畢赤酵母GS115于5ml YPD培養(yǎng)液，于30℃、220-250rpm劇烈振蕩培養(yǎng)過夜；b.取0.1-0.5ml過夜酵母GS115培養(yǎng)液接種于500ml新的YPD培養(yǎng)液中，繼續(xù)30℃220-250rpm劇烈振蕩培養(yǎng)至OD600＝1.3-1.5；c.于4℃1500g離心5min，棄上清后用500ml預(yù)冷滅菌去離子水重懸沉淀；d.于4℃1500g離心5min，將沉淀重懸于250ml預(yù)冷去離子水中；e.再次于4℃1500g離心5min，用20ml 1mol/L的預(yù)冷無菌山梨醇洗滌；f.于4℃1500g離心5min，將沉淀重懸于1ml 1mol/L預(yù)冷山梨醇中，至體積大約為1.5ml，即可用于轉(zhuǎn)化。
用電擊法將外源基因?qū)氘叧嘟湍竌.選擇5AOX1區(qū)域的單一酶切位點(diǎn)對外源基因載體pPIC9-hPC進(jìn)行線性化，加EDTA溶液終止酶反應(yīng)；b.經(jīng)過酚/氯仿抽提/乙醇沉淀后進(jìn)行滅菌處理，最后線性化的DNA溶于10μl無菌去離子水中(約5-10μgDNA)；c.將制備好的重組質(zhì)粒與200μl懸浮在山梨醇中的畢赤酵母細(xì)胞混合，轉(zhuǎn)到0.2cm預(yù)冷無菌電擊杯中，冰上放置5min；d.在1500V電壓，25μF電容和200Ω電阻參數(shù)下，電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115；e.電擊完成后立即加入1ml 1mo/L預(yù)冷的山梨醇，輕柔混合后轉(zhuǎn)移至無菌的1.5ml離心管中，立即取100μl涂布于含1mo/L山梨醇的MDS平板上，30℃培養(yǎng)3d直至克隆出現(xiàn)。
所獲得的酵母轉(zhuǎn)化子采用菌落PCR進(jìn)行鑒定陽性克隆a.從MDS平板上任意挑出單菌落，每個(gè)菌落用牙簽挑取其大小的1/4-1/2后置于20μl的無菌水；b.在冰上處理15min，接著轉(zhuǎn)入37℃水浴，放置15min，最后于95℃熱處理10min；c.取10μl冷熱處理后的菌液，再按以下PCR方法進(jìn)行操作PCR反應(yīng)體系為10×反應(yīng)緩沖液2.5μl；25mmol/L MgCl21.5μl；2.5mmol/LdNTP 2μl；引物P1、P2分別為25pmol；Taq DNA聚合酶5U；重組質(zhì)粒2μg；加去離子水至25μl。PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5min，94℃30sec，58℃45sec，72℃1min，30次循環(huán)后72℃繼續(xù)延伸5min。反應(yīng)結(jié)束后，取5μl樣品用1％瓊脂糖凝膠電泳分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，結(jié)果如圖4所示，表明得到陽性克隆圖中，a.b.c.d.e.f.g.j.k為不同克隆，h為陽性對照，i為DL2000Marker，l為陰性對照。
2.分泌性外源蛋白在畢赤酵母GS115中誘導(dǎo)表達(dá)a.挑取陽性克隆畢赤酵母接種于2ml BMGY培養(yǎng)液中，于30℃劇烈振蕩培養(yǎng)至OD600＝2-6(大約需16-18h)，此時(shí)的細(xì)胞處于對數(shù)生長期；b.室溫下1500-3000g離心5min，棄上清后，用BMMY重懸酵母細(xì)胞，至OD600＝1.0左右(大約10-20ml)；c.將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)至50ml的三角瓶，用三層紗布封住瓶口，在30℃、220-300rpm條件下培養(yǎng)，誘導(dǎo)外源蛋白的表達(dá)；d.每天添加甲醇至終濃度0.5％(v/v)以持續(xù)誘導(dǎo)表達(dá)。取7ml酵母培養(yǎng)液，離心后取上清，用于檢測蛋白的表達(dá)情況。
3.陽性克隆表達(dá)產(chǎn)物的鑒定(1)樣品收集對篩選到的陽性克隆進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，間隔24h分別收集表達(dá)上清，于4℃，3000rpm離心5min，取上清貯于-70℃?zhèn)溆谩?br> (2)品濃縮處理樣品于室溫融化后，于4℃、3 000rpm離心5min，將收集的上清液移入透析袋中，浸沒于70％PEG8000，4℃下磁力攪拌4-6h，使30ml左右液體透干，再將透析袋移入TE pH8.0中，繼續(xù)透析過夜。收集透析袋中的樣品，貯存-70℃?zhèn)溆谩?br> (3)SDS-PAGE蛋白電泳取15μl樣品按常規(guī)方法進(jìn)行SDS-PAGE檢測蛋白質(zhì)表達(dá)情況，結(jié)果如圖5所示，表明人蛋白C已表達(dá)，圖中，a為低分子量蛋白質(zhì)Marker218KD，118KD，81.9KD，48.7KD，31.9KD，25.5KD，17.5KD；b.c.d.e.f.g.h為不同克隆；i為人蛋白C純品。
(4)Western Blot檢測酵母表達(dá)上清取15μl樣品先經(jīng)SDS-PAGE分離蛋白，轉(zhuǎn)膜后應(yīng)用蛋白質(zhì)印跡法檢測蛋白質(zhì)表達(dá)情況。Western Blot方法參照《分子克隆》。利用北京六一儀器廠的電泳和電轉(zhuǎn)系統(tǒng)進(jìn)行。分別以兔抗人蛋白C(購自Sigma公司)多抗為第一抗體，第二抗體為AP標(biāo)記的鼠抗兔IgG(購自華美生物工程公司)，BCIP/NBT底物顯色。具體步驟如下a.封閉封閉液5％BSA浸沒硝酸纖維素膜，4℃封閉過夜；
b.洗膜用洗滌緩沖液洗硝酸纖維素膜3次，每次3-5min；c.與兔抗人蛋白C多抗反應(yīng)抗體稀釋液按1∶300稀釋多抗，浸沒硝酸纖維素膜，搖床輕輕振搖，室溫2-4h；d.洗膜棄去多抗，洗滌液漂洗膜3次，每次3-5min；e.與酶標(biāo)二抗反應(yīng)抗體稀釋液按1∶300稀釋酶標(biāo)二抗，浸沒硝酸纖維素膜，搖床輕輕振搖，室溫2-4h；f.洗膜棄去酶標(biāo)二抗，洗滌液漂洗膜3次，每次3-5min；g.顯色按1∶1∶50稀釋NBT/BCIP，將膜浸于其中，室溫下輕搖，細(xì)心觀察，待蛋白帶達(dá)到要求(約3-5min)后，用蒸餾水沖洗硝酸纖維素膜，終止反應(yīng)，拍照留作永久實(shí)驗(yàn)記錄。結(jié)果如圖6所示，表明檢測到人蛋白C，圖中a為陰性對照，b.c.d.e.f.g為不同的克隆，h為人蛋白C純品。
4.APTT法測定樣品的抗凝活性參照American Diagnostic Inc出品的人蛋白C活性測定試劑盒的方法。
以蛋白C缺陷血漿為基質(zhì)血漿，白陶土為表面接觸活化劑，在Ca2+參與下，受檢樣品血漿凝固時(shí)間與蛋白C的抗凝活性相關(guān)。測定不同稀釋度的蛋白C對照血漿的凝固時(shí)間，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時(shí)測定樣品的凝固時(shí)間。具體步驟如下a.將蛋白C對照血漿按1/2、1/4、1/8、1/16倍比稀釋后，分別取0.1ml，與0.1ml蛋白C缺陷血漿及ProtacTM0.05ml加入體積為4ml透明塑料小試管中，混合均勻后37℃溫育3min；b.迅速加入APTT懸液0.1ml，于37℃溫育2min；c.加入0.025mol/L CaCl2溶液0.1ml，立即啟動秒表，在水浴中以1-2次/秒的頻率混勻；d.觀察血漿凝固情況。當(dāng)血漿出現(xiàn)凝固時(shí)，立即記錄血漿凝固時(shí)間。
以參照標(biāo)準(zhǔn)的蛋白C的百分比活性為X軸，平均血漿凝固時(shí)間為Y，由這些點(diǎn)得出最佳擬合直線為標(biāo)準(zhǔn)曲線。將查找標(biāo)準(zhǔn)曲線的結(jié)果乘以2以校正稀釋度，即得到樣品的百分比活性。
以參比血漿為陽性對照，而TE緩沖液pH8.0為陰性對照，每次取待檢樣品0.05ml。每個(gè)樣品重復(fù)測量三次。結(jié)果如表1所示，表明步驟3中制備的酵母表達(dá)上清具有抗凝活性。
表1.步驟3中制備的酵母表達(dá)上清的抗凝活性樣品凝血時(shí)間(sec)平均值±標(biāo) 血漿hPC活性％1 23準(zhǔn)差參比血漿 146 140 143 143±3 100酵母表達(dá)上清 110 105 108 107.7±2.5 50陰性對照 40 42 40 40.1±1.2 0
序列表<160>2<210>1<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>1gcactcgaga aaagagccaa ctccttcctg gagg 34<210>2<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>2cggaattcag ggagggtcgc taaggtgc 28
權(quán)利要求
1.一種擴(kuò)增人蛋白C基因的專用引物，為序列表中的SEQ ID №1和SEQ ID №2。
2.一種人蛋白C的表達(dá)載體，是含有人蛋白C基因的重組畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9-hPC。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9-hPC，其特征在于所述重組畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9-hPC是通過下述步驟得到的(1)應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)RT-PCR，從人胎肝總RNA中釣取人蛋白C cDNA；(2)將步驟(1)中的得到的人蛋白C cDNA連接到酵母表達(dá)載體pPIC9上，得到重組畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9-hPC。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9-hPC，其特征在于所述RT的引物為Oligo(dT)15。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的重組畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9-hPC，其特征在于所述PCR擴(kuò)增引物為序列表中的SEQ ID №1和SEQ ID №2。
6.一種表達(dá)人蛋白C的方法，是將重組畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9-hPC轉(zhuǎn)化到畢赤酵母中，得到陽性克隆，誘導(dǎo)培養(yǎng)所述陽性克隆，表達(dá)人蛋白C。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述畢赤酵母為GS115菌株。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于用終濃度為0.25-1％的甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)所述陽性克隆。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述甲醇的終濃度為0.5％。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種人蛋白C的表達(dá)方法及其專用引物與表達(dá)載體。本發(fā)明所提供的擴(kuò)增人蛋白C基因的專用引物為序列表中的SEQ ID №1和SEQ ID №2。人蛋白C的表達(dá)載體是含有人蛋白C基因的重組畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9－h(huán)PC。表達(dá)人蛋白C的方法，是將重組畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9－h(huán)PC轉(zhuǎn)化到畢赤酵母中，得到陽性克隆，誘導(dǎo)培養(yǎng)所述陽性克隆，表達(dá)人蛋白C。本發(fā)明采用基因克隆技術(shù)，成功構(gòu)建了酵母表達(dá)載體pPIC9－h(huán)PC；利用電穿孔轉(zhuǎn)化方法，得到具有外源基因的酵母轉(zhuǎn)化子，表達(dá)的人蛋白C經(jīng)APTT法測定表明可延長血液凝固時(shí)間，起到了抗凝血的作用。本發(fā)明的方法在人蛋白C的生產(chǎn)中具有廣闊的工業(yè)前景。
文檔編號C12P19/00GK1648259SQ20041000079
公開日2005年8月3日 申請日期2004年1月19日 優(yōu)先權(quán)日2004年1月19日
發(fā)明者章金剛, 賈莉瑋, 呂茂民 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院野戰(zhàn)輸血研究所