專利名稱：一種堿性α－淀粉酶及其編碼基因與生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及酶基因工程和酶工程領(lǐng)域中一種α-淀粉酶及其編碼基因與生產(chǎn)方法，特別涉及一種堿性α-淀粉酶及其編碼基因與生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
α-淀粉酶，也稱液化型淀粉酶，能使淀粉不規(guī)則地水解。它存在于動物的唾液、胰臟及植物的麥芽中。此外，霉菌和細(xì)菌也產(chǎn)生此酶。
長期以來α-淀粉酶一直被用于多個領(lǐng)域。例如，在發(fā)酵業(yè)中它一直被用于谷物和馬鈴薯的糖化，在紡織業(yè)中用作淀粉糊去除劑，在制藥業(yè)中用作助消化藥，而在食品業(yè)中用于制造粘稠的麥芽糖漿。α-淀粉酶是一種作用于淀粉相關(guān)多糖如直鏈淀粉和支鏈淀粉，單一地水解多糖分子中α-1，4-糖苷鍵的內(nèi)切酶。自從1833年P(guān)ayen和Persoz首次發(fā)現(xiàn)這種酶開始，已經(jīng)從包括細(xì)菌、真菌、植物種子和動物消化腺等多種不同來源中獲得了α-淀粉酶的晶體樣品或電泳純的樣品。
研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)將α-淀粉酶和支鏈淀粉酶都滲入洗碗劑和衣物洗滌劑中時，洗碗劑和衣物洗滌劑的效能可被改善，特別是對淀粉污漬的去除能力會得到大大提高(日本專利申請公開(kokai)2-132192號)。然而目前在自然界中發(fā)現(xiàn)的大部分α-淀粉酶在中性到酸性pH范圍內(nèi)表現(xiàn)出最大且穩(wěn)定的酶切活性，但在pH 9-10的堿性溶液中卻很少發(fā)揮作用。已知只有少數(shù)的堿性α淀粉酶在堿性的pH范圍內(nèi)表現(xiàn)最大的活性。堿性α-淀粉酶是指酶最適工作pH高于8的α-淀粉酶，這些堿性α-淀粉酶包括由芽孢桿菌A-40-2產(chǎn)生的一種酶[Horikoshi，K.等，(Agric.Biol.Chem.)，35，1783(1971)]，由芽孢桿菌NRRL B-3881產(chǎn)生的一種酶[Boyer，E.等，(J.Bacteriol.)，110，992(1972)]，由鏈霉菌KSM-9產(chǎn)生的一種酶(日本專利申請公開(kokai)61-209528號)，由芽孢桿菌H-167產(chǎn)生的一種酶(日本專利申請公開(kokai)62-208278號)，由嗜熱堿性芽孢桿菌A3-8產(chǎn)生的一種酶(日本專利申請公開(kokai)2-49584號)以及由嗜鹽堿球菌AH-36產(chǎn)生的一種酶(日本專利申請公開(kokai)4-211369)。
上述堿性α-淀粉酶大部分是將淀粉或淀粉相關(guān)糖分解為葡萄糖、麥芽糖或麥芽三糖的所謂的糖化α-淀粉酶。雖它們能被有效地用于制糖業(yè)中，但如果將它們用作洗滌劑的酶卻會產(chǎn)生問題。因此，仍然需要尋找對用于洗滌劑中的表面活化劑具有抗性并以一種高度隨機的方式分解淀粉或淀粉相關(guān)多糖的所謂的液化型堿性α-淀粉酶。
發(fā)明創(chuàng)造內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種堿性α-淀粉酶及其編碼基因。
一種堿性α-淀粉酶，來源于芽孢桿菌(Bacillus sp.)BG-CS10，它是與SEQID №2的氨基酸序列具有至少80％的同源性，優(yōu)選為具有至少90％的同源性，且具有與SEQ ID №2相同活性的由SEQ ID №2衍生的蛋白質(zhì)；較優(yōu)選為序列表中SEQ ID №2的氨基酸殘基序列或?qū)EQ ID №2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID №2相同活性的由SEQ ID№2衍生的蛋白質(zhì)；最優(yōu)選為序列表中SEQ ID №2的氨基酸殘基序列。
芽孢桿菌(Bacillus sp.)BG-CS10，已于2003年12月19日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，保藏號為CGMCC №1081。
芽孢桿菌(Bacillus sp.)BG-CS10 CGMCC №1081自鹽湖土壤中分離得到。其菌落粗糙，不透明、不閃光，為污白色；細(xì)胞為橢圓至桿狀，有芽孢，革蘭氏陽性菌；生長pH值范圍是8.0-11.0，最適10.0；溫度范圍20-40℃，最適30℃；好氧，水解淀粉。
序列表中SEQ ID №2的氨基酸殘基序列是由520個氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)。
一種堿性α-淀粉酶的編碼基因，它是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)編碼序列表中SEQ ID №2蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有80％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列，其中，優(yōu)選為與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
序列表中的SEQ ID №1的DNA序列由1563個堿基組成，該基因的開放閱讀框架(ORF)為自5’端第1到第1563位堿基。
含有堿性α-淀粉酶的編碼基因的表達(dá)載體和細(xì)胞系均屬于本發(fā)明的保護范圍。
所述細(xì)胞系可為芽孢桿菌(Bacillus sp.)BG-CS10 CGMCC №1081或含有上述堿性α-淀粉酶的編碼基因的工程菌。
所述工程菌的出發(fā)菌株可為大腸桿菌或芽孢桿菌，所述大腸桿菌優(yōu)選為大腸桿菌K-12的EK系統(tǒng)成員，如DH5α、HB101、BL21和JM109，最優(yōu)選為大腸桿菌DH5α；所述芽孢桿菌優(yōu)選為枯草芽孢桿菌的BS系統(tǒng)成員，如BD170、MI112和ISW1214。
可將上述堿性α-淀粉酶的編碼基因?qū)氚ㄟm用于EK系統(tǒng)的pET3a、pBR322、pBv220、pUC18和pUC19，以及適用于BS系統(tǒng)的pUB110和pHY300PLK等載體內(nèi)，得到堿性α-淀粉酶的編碼基因的表達(dá)載體，如將上述堿性α-淀粉酶的編碼基因?qū)雙ET3a得到的表達(dá)載體pAML10(物理圖譜如圖3所示)。
擴增本發(fā)明的堿性α-淀粉酶編碼基因的任一片段的引物屬于本發(fā)明的保護范圍。
本發(fā)明的堿性α-淀粉酶基因可用作從其它微生物中分離與其同源的核苷酸序列的探針。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種制備堿性α-淀粉酶的方法。
本發(fā)明所提供的制備堿性α-淀粉酶的方法，是通過培養(yǎng)芽孢桿菌(Bacillussp.)BG-CS10 CGMCC №1081或含有上述的堿性α-淀粉酶的編碼基因的工程菌獲得堿性α-淀粉酶。
所述工程菌可為含有本發(fā)明的堿性α-淀粉酶的編碼基因的大腸桿菌或芽孢桿菌，所述大腸桿菌優(yōu)選為大腸桿菌K-12的EK系統(tǒng)成員，如DH5α、HB101、BL21和JM109，最優(yōu)選為大腸桿菌BL21；所述芽孢桿菌優(yōu)選為枯草芽孢桿菌的BS系統(tǒng)成員，如BD170、MI112和ISW1214。將堿性α-淀粉酶的編碼基因?qū)肷鲜龃竽c桿菌和芽孢桿菌的載體可為包括適用于EK系統(tǒng)pET3a、pBR322、pBV220、pUC18和pUC19，以及適用于BS系統(tǒng)的pUB110和pHY300PLK等載體。
可利用常規(guī)方法將含有本發(fā)明的堿性α-淀粉酶編碼基因的重組DNA分子轉(zhuǎn)化宿主，例如可用氯化鈣法(Mandel，M.和Higa，A.，《分子生物學(xué)雜志》，53，159(1970))轉(zhuǎn)化EK系統(tǒng)宿主，可用原生質(zhì)體法(Chang，C.和Cohen，S.N.，Mol.Gen.Genet.)，168，111(1978))轉(zhuǎn)化BS系統(tǒng)宿主?？赏ㄟ^載體本身的篩選標(biāo)記進(jìn)行重組子微生物(工程菌)的初步篩選，再利用水解淀粉的性質(zhì)最終確定工程菌，例如，在利用EK系統(tǒng)的pBR322作載體并利用HindIII酶切本發(fā)明的堿性α-淀粉酶編碼基因?qū)⑵洳迦雙BR322的HindIII酶切位點時，四環(huán)素抗性基因失活，可以通過AmprTets來初步篩選轉(zhuǎn)化子。然后將所篩選的轉(zhuǎn)化子利用影印等方法轉(zhuǎn)移至含有淀粉的瓊脂平板上，然后進(jìn)行培養(yǎng)形成菌落，靶重組子微生物在集落周圍分解淀粉，所以可利用含碘溶液對含有淀粉的瓊脂平板進(jìn)行淀粉染色以確定工程菌。
生產(chǎn)本發(fā)明的堿性α-淀粉酶的培養(yǎng)基，可采用包括碳源、氮源和無機鹽在內(nèi)的通常用于培養(yǎng)細(xì)菌的培養(yǎng)基；培養(yǎng)條件也應(yīng)該是培養(yǎng)工程菌的出發(fā)菌的條件，即只要是適合于產(chǎn)生本發(fā)明的堿性α-淀粉酶即可，通常情況下，培養(yǎng)溫度為20-40℃，pH為5-8，培養(yǎng)時間為3-24小時，其中優(yōu)選的條件是培養(yǎng)溫度為30-37℃，pH為6-7.5，培養(yǎng)時間5-10小時。
可通過改善芽孢桿菌(Bacillus sp.)BG-CS10 CGMCC №1081或工程菌的培養(yǎng)方法或通過基因工程方法改造本發(fā)明的堿性α-淀粉酶基因來提高堿性α-淀粉酶的產(chǎn)量，以適應(yīng)工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)的需要。
本發(fā)明的堿性α-淀粉酶在堿性條件下具有良好的活性和穩(wěn)定性，最適作用pH為9.0-10.5，可廣泛用于制備洗碗和廚房用具的洗滌劑組合物以及洗衣的洗滌劑組合物中的添加劑，具有廣闊的工業(yè)應(yīng)用前景。


圖1為芽孢桿菌(Bacillus sp.)BG-CS10 CGMCC №1081產(chǎn)生的堿性α-淀粉酶的最適反應(yīng)pH曲線圖2為芽孢桿菌(Bacillus sp.)BG-CS10 CGMCC №1081產(chǎn)生的堿性α-淀粉酶的pH穩(wěn)定性曲線圖3為pAML10的物理構(gòu)建圖譜具體實施方式
實施例中的濃度都是以(W/V)的％為基礎(chǔ)。
實施例1、堿性α-淀粉酶編碼基因的獲得1)將產(chǎn)生堿性液化α-淀粉酶的芽孢桿菌(Bacillus sp.)BG-CS10 CGMCC №1081接種在5ml培養(yǎng)基A(表1)中并在30℃進(jìn)行振蕩培養(yǎng)24小時。將1ml培養(yǎng)物接種于100ml同樣的培養(yǎng)基中，然后在30℃再次振蕩培養(yǎng)48小時。隨后通過離心收集細(xì)胞并按照Saito和Miura推薦的方法(Saito，H.和Miura，K.，Biochem.Biophys.Acta，1963，72，619)獲得大約1mg的染色體DNA。用Sau3AI部分酶切后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電洗脫回收10kb以下DNA片段，和BamHI酶切的并脫磷的pUC18質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α，在含Amp的LB瓊脂平板上進(jìn)行克隆質(zhì)粒的初步挑選和分離，獲得陽性克隆250株。
表1培養(yǎng)基A的組成可溶性淀粉 1.0％胰蛋白胨 1.5％大豆蛋白胨 0.5％酵母提取物 0.5％NaCl 0.5％Na2CO31.0％(單獨滅菌)2)已知淀粉酶家族的許多成員具有氨基酸序列高度保守的I-IV區(qū)(Nakajima，R.等，(Appl.Microbiol.Biotechnol.)，23，355(1986))。因而，根據(jù)在已知的堿性液化α-淀粉酶的I到IV區(qū)中非常保守的II區(qū)和IV區(qū)的氨基酸序列合成與II區(qū)和IV區(qū)相應(yīng)的引物1(5-GACCT CGTTGTGAAT-3)和引物2(5-CCTTCAG GTGTTTGA-3)。利用所合成的引物和芽孢桿菌(Bacillus sp.)BG-CS10 CGMCC №1081的染色體DNA(用作模板)按照如下條件進(jìn)行PCR擴增1個循環(huán)＝94℃×1min+50℃×1min+72℃×1min，然后按同樣條件再進(jìn)行30個循環(huán)。獲得了一個大約0.3kb的基因片段A，并測定了該片段的核苷酸序列。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)該片段編碼一種與已知淀粉酶的從II區(qū)延伸到IV區(qū)的氨基酸序列同源性為91％的氨基酸序列。
3)利用片段A作為一個探針，對步驟1)中用含Amp的LB瓊脂平板分離獲得的陽性克隆菌株進(jìn)行原位雜交的粗步篩選，獲得1個淀粉酶弱陽性菌株，劃平板進(jìn)一步確定后，進(jìn)行單獨培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，用BamHI進(jìn)行酶切鑒定，確定含有一個4.0kb插入基因片斷。對該4.0kb插入基因片斷進(jìn)行核苷酸序列測定，結(jié)果表明有一個表達(dá)含有26個氨基酸組成的信號肽序列(序列表中序列2的第1到第26位)的520個氨基酸的1563bp(ORF)的淀粉酶結(jié)構(gòu)基因(序列表中序列1)的存在。4)利用定位于信號肽序列上游的引物A(5-GCGCCATATGAAAGGGAAAAAATGGAC-3)，定位于終止密碼下游處的引物B(5-GCGCGCGGATCCTTATTTTATCAAAACCGATG-3)并以芽孢桿菌(Bacillus sp.)BG-CS10 CGMCC №1081的染色體DNA作為模板，按照常規(guī)方法進(jìn)行PCR擴增得到引物間的大約1.6kb的片段。將所獲的擴增片段插入pET3a的NdeI和BamHI位點，然后導(dǎo)入大腸桿菌BL21。轉(zhuǎn)化子可以在含有0.4％淀粉天青，50ug/ml氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上生長。分離在周圍形成透明暈環(huán)菌落作為生產(chǎn)堿性α-淀粉酶的大腸桿菌菌株。利用制備質(zhì)粒DNA的標(biāo)準(zhǔn)程序(Maniatis T.等，(Molecular Cloning)，冷泉港實驗室，紐約(1982))，從該轉(zhuǎn)化子中提取重組質(zhì)粒，并制備質(zhì)粒的限制性酶切圖譜。在圖譜中，證實含有一個大約1.6kb的DNA片段，該重組質(zhì)粒被定名為質(zhì)粒pAML10(物理圖譜如圖3所示)，其大小為6.2kb。
實施例2、堿性α-淀粉酶的生產(chǎn)1、培養(yǎng)工程菌生產(chǎn)堿性α-淀粉酶將在實施例1的步驟(4)中獲得的重組大腸桿菌菌株BL21(pAML10)于2ml含有50ug/ml氨芐青霉素LB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)12小時后，將該2ml培養(yǎng)物接種于50ml LB培養(yǎng)基(含有50ug/ml氨芐青霉素)中，然后在37℃振蕩培養(yǎng)24小時。離心分離收集細(xì)胞，懸于Tris-HCl緩沖液(pH8.0)中，并通過超聲處理破碎細(xì)胞。細(xì)胞被超聲處理后，通過離心分離清除細(xì)胞碎片，收集上清液得到無細(xì)胞提取物。以相同方法制備的BL21(含有pET3a空載體)菌株的無細(xì)胞提取物作為對照。首先通過在一含有50mM甘氨酸-NaOH緩沖液(pH10)和可溶性淀粉的反應(yīng)混合物中于30℃反應(yīng)15分鐘，然后通過利用3，5-二硝基水楊酸方法定量測定所產(chǎn)生的還原糖來檢測這些提取物中的α-淀粉酶活性。將1個單位的酶活性定義為每分鐘產(chǎn)生等價于1μmol葡萄糖的還原糖的蛋白質(zhì)的量。
①最適酶活溫度標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件下，在給定的溫度條件下測定酶活性，表明該酶最適溫度為50℃。
②最適pH在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件下(25℃)，在表2中的50mmoL/L不同緩沖液的條件下測定酶活性，結(jié)果表明菌株DH5α(pAML10)的無細(xì)胞提取物中α-淀粉酶的的最適工作pH在10.5左右，與芽孢桿菌CS-10產(chǎn)生的α-淀粉酶的最適pH非常一致。
③pH穩(wěn)定性將酶液與pH4.0-12.0的緩沖液混合，25℃放置30min，測定酶活力，結(jié)果表明酶活在pH5-11.5的范圍內(nèi)比較穩(wěn)定。
用SDS-PAGE測得的該堿性α-淀粉酶的分子量為60000道爾頓，與理論上推算的分子量59000道爾頓相似。
表2.堿性α-淀粉酶的酶活性測定中所用的緩沖液pH3.5-5.5醋酸鹽緩沖液pH5.5-8.5Tris-HCl緩液pH8.5-10.5Gly-NaOH緩沖液pH10.5-12.0Na2CO3-NaHCO3緩沖液2、培養(yǎng)芽孢桿菌(Bacillus sp.)BG-CS10 CGMCC №1081生產(chǎn)堿性α-淀粉酶將產(chǎn)生堿性液化α-淀粉酶的芽孢桿菌(Bacillus sp.)BG-CS10 CGMCC №1081接種在5ml培養(yǎng)基A(表1)中并在30℃進(jìn)行振蕩培養(yǎng)24小時。將1ml培養(yǎng)物接種于100ml同樣的培養(yǎng)基中，然后在30℃再次振蕩培養(yǎng)48小時，收集發(fā)酵液，發(fā)酵液6000r/m離心10min去菌體，所得上清液為含有α-淀粉酶的酶液。采用步驟1中(2)相同的方法測定芽孢桿菌(Bacillus sp.)BG-CS10 CGMCC №1081產(chǎn)生的堿性α-淀粉酶的特性，結(jié)果表明所產(chǎn)生的堿性α-淀粉酶最適酶活溫度為50℃；最適工作pH為10.5(圖1)，其酶活在pH5-11.5范圍內(nèi)穩(wěn)定。用SDS-PAGE測得的該堿性α-淀粉酶的分子量為60000道爾頓。對從芽孢桿菌(Bacillus sp.)BG-CS10 CGMCC №1081培養(yǎng)物中純化的堿性α-淀粉酶進(jìn)行氨基酸測序表明，其氨基末端側(cè)的10個氨基酸殘基序列與由堿性α-淀粉酶編碼基因的核苷酸序列所推導(dǎo)的第27個氨基酸延伸的序列(序列2中的自氨基端的27-36氨基酸)一致。
序列表<160>2<210>1<211>1563<212>DNA<213>芽孢桿菌(Bacillus sp.)<400>1atgaaaggga aaaaatggac agctttagct ctaacactgc cgctggctgc tagcttatca 60acaggcgttc acgcggaaac cgtacataaa ggtaaatctc cagctgcaga taaaaacggt 120gtattttatg aggtgtatgt aaactctttt tacgatgcaa ataaagatgg acatggtgat 180ttaaaaggtc ttacacaaaa gctggactat ttaaatgatg gcaattctca tacaaagaat 240gatcttcaag taaacgggat ttggatgatg ccggtcaacc cttctcctag ctatcataaa 300tatgatgtaa cggactatta taacattgat cctcagtatg gaaatctgca agattttcgc 360aaactaatga aagaagcaga taaacgagat gtaaaagtta ttatggacct cgttgtgaat 420catacgagca gtgaacaccc ttggtttcaa gctgcgttaa aagataaaaa cagcaagtac 480agagattact atatttgggc tgataaagat accgacttga atgaaaaagg atcttggggg 540cagcaagtat ggcataaagc tccaaacgga gagtattttt atggaacgtt ctgggaagga 600atgcctgact taaattacga taaccctgaa gtaagaaaag aaatgattaa cgtcggaaag 660ttttggctaa agcaaggcgt tgacggcttc cgcttagatg ctgccctcca tatctttaaa 720ggtcaaacac ctgaaggcgc taagaaaaat ctcctgtggt ggaatgagtt tagagatgca 780atgaaaaaag aaaaccctaa cgtatatcta acgggtgaag tatgggatca gccggaagta 840gtagctcctt attatcagtc gcttgattcc ctatttaact ttgatttagc aggaaaaatt 900gtcagctctg taaaagcagg aaatgatcaa ggaatcgcta ctgcagctgc ggcaacagat 960gaactgttca aatcatacaa tccaaataaa attgacggca ttttcttaac caatcatgac 1020caaaatcgcg tcatgagtga gttaagcgga gatgtcaata aagcaaagtc agctgcctct 1080atcttactta cgcttcctgg aaatccgtat atttattacg gtgaagaaat cggcatgacc 1140ggtgaaaagc ctgatgaatt aatccgtgaa ccgttccgct ggtacgaagg aaacggactt 1200ggacaaacta gttgggaaac acctgtatac aataaaggcg gcaacggcgt gtctgtagaa 1260gcacaaacca aacaaaagga ctctttgtta aatcattatc gtgaaatgat tcgcgtgcgt 1320
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Arg Asp Tyr Tyr Ile Trp Ala Asp Lys Asp Thr Asp Leu Asn Glu Lys165 170 175Gly Ser Trp Gly Gln Gln Val Trp His Lys Ala Pro Asn Gly Glu Tyr180 185 190Phe Tyr Gly Thr Phe Trp Glu Gly Met Pro Asp Leu Asn Tyr Asp Asn195 200 205Pro Glu Val Arg Lys Glu Met Ile Asn Val Gly Lys Phe Trp Leu Lys210 215 220Gln Gly Val Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Ala Leu His Ile Phe Lys225 230 235 240Gly Gln Thr Pro Glu Gly Ala Lys Lys Asn Leu Leu Trp Trp Asn Glu245 250 255Phe Arg Asp Ala Met Lys Lys Glu Asn Pro Asn Val Tyr Leu Thr Gly260 265 270Glu Val Trp Asp Gln Pro Glu Val Val Ala Pro Tyr Tyr Gln Ser Leu275 280 285Asp Ser Leu Phe Asn Phe Asp Leu Ala Gly Lys Ile Val Ser Ser Val290 295 300Lys Ala Gly Asn Asp Gln Gly Ile Ala Thr Ala Ala Ala Ala Thr Asp305 310 315 320Glu Leu Phe Lys Ser Tyr Asn Pro Asn Lys Ile Asp Gly Ile Phe Leu325 330 335Thr Asn His Asp Gln Asn Arg Val Met Ser Glu Leu Ser Gly Asp Val340 345 350Asn Lys Ala Lys Ser Ala Ala Ser Ile Leu Leu Thr Leu Pro Gly Asn355 360 365Pro Tyr Ile Tyr Tyr Gly Glu Glu Ile Gly Met Thr Gly Glu Lys Pro370 375 380Asp Glu Leu Ile Arg Glu Pro Phe Arg Trp Tyr Glu Gly Asn Gly Leu385 390 395 400Gly Gln Thr Ser Trp Glu Thr Pro Val Tyr Asn Lys Gly Gly Asn Gly405 410 415
Val Ser Val Glu Ala Gln Thr Lys Gln Lys Asp Ser Leu Leu Asn His420 425 430Tyr Arg Glu Met Ile Arg Val Arg Gln Gln His Glu Glu Leu Val Lys435 440 445Gly Thr Leu Gln Ser Ile Ser Val Asp Ser Lys Glu Val Val Ala Tyr450 455 460Ser Arg Thr Tyr Lys Gly Asn Ser Ile Ser Val Tyr His Asn Ile Ser465 470 475480Asn Gln Pro Val Lys Val Ser Val Ala Ala Lys Gly Lys Leu Ile Phe485 490 495Ala Ser Glu Lys Gly Ala Lys Lys Val Lys Asn Gln Leu Val Ile Pro500 505 510Ala Asn Thr Ser Val Leu Ile Lys515 520
權(quán)利要求
1.一種堿性α-淀粉酶，是與序列表中SEQ ID №2的氨基酸殘基序列具有至少80％的同源性且具有與SEQ ID №2相同活性的由SEQ ID №2衍生的蛋白質(zhì)，或?qū)EQ ID №2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID №2相同活性的由SEQ ID №2衍生的蛋白質(zhì)。
2.一種堿性α-淀粉酶的編碼基因，它是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)編碼序列表中SEQ ID №2蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有80％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
3.含有權(quán)利要求2所述的基因的表達(dá)載體和細(xì)胞系。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體和細(xì)胞系，其特征在于所述表達(dá)載體為重組質(zhì)粒pAML10。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的表達(dá)載體和細(xì)胞系，其特征在于所述細(xì)胞系為芽孢桿菌(Bacillus sp.)BG-CS10 CGMCC №1081或含有堿性α-淀粉酶的編碼基因的工程菌。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的表達(dá)載體和細(xì)胞系，其特征在于所述工程菌的出發(fā)菌為大腸桿菌或芽孢桿菌。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的表達(dá)載體和細(xì)胞系，其特征在于所述大腸桿菌為大腸桿菌K-12的EK系統(tǒng)成員，其中優(yōu)選的為大腸桿菌DH5α、HB101、BL21和JM109。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的表達(dá)載體和細(xì)胞系，其特征在于所述芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌的BS系統(tǒng)成員，其中優(yōu)選的為枯草芽孢桿菌BD170、MI112和ISW1214。
9.一種制備堿性α-淀粉酶的編碼基因的方法，是通過培養(yǎng)(Bacillus sp.)BG-CS10 CGMCC №1081或含有堿性α-淀粉酶的編碼基因的編碼基因的工程菌獲得堿性α-淀粉酶。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述工程菌為含有堿性α-淀粉酶的編碼基因的的大腸桿菌或芽孢桿菌。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種堿性α－淀粉酶及其編碼基因與生產(chǎn)方法。本發(fā)明所提供的堿性α－淀粉酶，是與序列表中SEQ ID №2的氨基酸殘基序列具有至少80％的同源性且具有與SEQ ID №2相同活性的由SEQ ID№2衍生的蛋白質(zhì)。該堿性α－淀粉酶的編碼基因是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)編碼序列表中SEQ ID №2蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有80％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。本發(fā)明可廣泛用于制備洗碗和廚房用具的洗滌劑組合物以及洗衣的洗滌劑組合物中的添加劑，具有廣闊的工業(yè)應(yīng)用前景。
文檔編號C12N15/74GK1641020SQ20041000106
公開日2005年7月20日 申請日期2004年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2004年1月18日
發(fā)明者馬延和, 吳襟, 薛燕芬 申請人:中國科學(xué)院微生物研究所