專利名稱：調(diào)控蛋白tsrf1在植物抗病中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及含調(diào)控蛋白TSRF1的植物基因表達載體，以及用該載體轉(zhuǎn)化植物使之產(chǎn)生抗病性的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
病菌侵染嚴(yán)重制約農(nóng)作物、蔬菜和林草的生產(chǎn)發(fā)展。如番茄青枯病(Ralstoniasolanacearum)是危害多種重要農(nóng)作物的土傳性細菌性病害，目前生產(chǎn)中還沒有有效的防治方法。植物的抗病反應(yīng)是一個多基因參與的協(xié)同防御反應(yīng)，調(diào)節(jié)基因的使用已成為國際上植物抗病轉(zhuǎn)基因研究的有效新策略，如近年在水稻、番茄等農(nóng)作物抗病轉(zhuǎn)基因研究中卓有成效的Xa21、Pto等R基因就都是位于信號傳遞鏈上游的調(diào)節(jié)基因。
ERF轉(zhuǎn)錄因子包含高度保守的ERF DNA結(jié)合域，是一類植物特有、抗性相關(guān)的重要調(diào)節(jié)蛋白，它整合了下游部分抗性功能基因的表達。因此以抗病相關(guān)ERF轉(zhuǎn)錄因子基因轉(zhuǎn)化植物，便可能同時改變多個下游抗病功能基因的表達調(diào)控，從而獲得抗病綜合性狀得以改良的轉(zhuǎn)基因植株。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是篩選出一種新的ERF轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，用其基因序列構(gòu)建植物表達載體，用該表達載體轉(zhuǎn)化植物，以提高植物抗病性。
蛋白-DNA相互作用是調(diào)控植物基因表達的重要途徑，GCC-盒(box)是眾多抗病功能基因共有的順式作用元件。本發(fā)明利用調(diào)控蛋白與GCC-盒的相互作用，以番茄NP24啟動子上的GCC-box為誘餌，采用酵母單雜交的方法從番茄表達文庫中篩選到一種新的ERF蛋白-TSRF1(基因庫登陸號為AF494201)，發(fā)現(xiàn)其在番茄中的表達受乙烯、茉莉素和水楊酸的誘導(dǎo)，能夠與順式作用元件GCC-盒，DRE和CE1結(jié)合，具有核定位和轉(zhuǎn)錄激活等特性。過表達TSRF1的植物能組成型表達一些受水楊酸或乙烯/茉莉素調(diào)控的PR蛋白，如煙草PR1(prb-1b)，PR2(β-1，3-glucanase)，PR3(chitinase)，and PR5(Osmotin)和番茄PR2(GluB)，PR3(chi9)，and PR5(NP24)。
本發(fā)明用新型轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子TSRF1的基因序列構(gòu)建植物表達載體，并用該載體進行了提高或抑制植物抗病性研究。
本發(fā)明進行了下列TSRF1轉(zhuǎn)基因植株的抗病相關(guān)功能試驗1.抗細菌性病害A番茄青枯菌侵染的轉(zhuǎn)TSRF1煙草試驗由于番茄青枯菌為土傳性病害，首先，我們用轉(zhuǎn)TSRF1煙草根部接種108cfu/ml的番茄青枯菌，15天后，野生型煙草有57.1％的植株葉片萎蔫整株枯死，而超表達轉(zhuǎn)基因只有16.1％的植株枯死(圖3)。以106cfu/ml的番茄青枯菌注射6周煙草植株的葉脈，侵染4天后，野生型植株的侵染細菌總數(shù)比TSRF1超表達的轉(zhuǎn)基因植株多出約70-280倍(圖4)。
B番茄青枯菌侵染轉(zhuǎn)TSRF1番茄試驗于葉片的兩葉脈之間注射104cfu/ml的番茄青枯病菌，侵染4天后，與野生型植株相比，TSRF1超表達的轉(zhuǎn)基因植株出現(xiàn)的水漬狀病斑明顯減小，而TSRF1的雙鏈RNA干擾突變轉(zhuǎn)基因植株的水漬狀病斑明顯增大；同期的野生型植株的侵染細菌總數(shù)比TSRF1超表達的轉(zhuǎn)基因植株多出約60-200倍，但少于TSRF1的雙鏈RNA干擾突變轉(zhuǎn)基因植株2-5倍(圖5)。
2.抗真菌性病害A灰霉菌侵染的番茄試驗以106cfu/ml的番茄灰霉菌侵染生長6周的番茄植株，4-5天后野生型番茄植株葉片發(fā)病，而同期的TSRF1超表達的轉(zhuǎn)基因植株不發(fā)病，而TSRF1的雙鏈RNA干擾突變轉(zhuǎn)基因番茄植株病斑明顯(圖6)。
B灰霉菌侵染的煙草試驗以106cfu/ml的番茄灰霉菌侵染生長5周的煙草植株，4-5天后野生型植株葉片發(fā)病，而同期的TSRF1超表達的轉(zhuǎn)基因植株只有少數(shù)輕微發(fā)病或者不發(fā)病(圖7)。
上述抗病實驗證明本發(fā)明提供的TSRF1是一種植物抗病性相關(guān)的ERF轉(zhuǎn)錄因子家族的新成員，TSRF1超表達的轉(zhuǎn)基因植物能夠顯著提高對細菌病原和真菌病原侵染的抗性。
盡管本發(fā)明只舉出有限的植物和植物病害病原，但本發(fā)明并不限于此。在不脫離本發(fā)明精神實質(zhì)的范圍內(nèi)可完成多種其它轉(zhuǎn)化。TSRF1超表達的轉(zhuǎn)基因植物可以包括雙子葉植物和單子葉植物，如棉花、大豆、油菜、玉米、水稻、苗木和花草；所說的抗病性包括抗細菌、真菌和抗病毒的特性；用含調(diào)控基因TSRF1的植物基因表達載體轉(zhuǎn)化植物的轉(zhuǎn)化方法，可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的各種方法，如農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、共轉(zhuǎn)化法和基因槍法等。


圖1表示超表達TSRF1基因植物表達載體的構(gòu)建。把TSRF1全長cDNA序列插入到pROK2植物表達載體BamH1和Sma1位點和CaM35S啟動子的下游。
圖2表示TSRF1的雙鏈RNA干擾載體pGSA-dsRNA-TSRF1的構(gòu)建。127BP片段(位于TSRF1的127-254之間)的正義、反義片段克隆到pGSA1285。
圖3是煙草根部接種106cfu/ml的番茄青枯病菌，侵染后15天的植物發(fā)病情況。
圖4是煙草葉片的兩葉脈間注射104cfu/ml的番茄青枯病菌，侵染后4天的植物發(fā)病情況。
圖5是番茄葉片的兩葉脈間注射104cfu/ml的番茄青枯病菌，侵染后4天的植物發(fā)病情況。
圖6是真菌病害灰霉菌侵染的轉(zhuǎn)基因番茄試驗結(jié)果。
圖7是真菌病害灰霉菌侵染的轉(zhuǎn)基因煙草試驗結(jié)果。
具體實施例方式實施例1載體構(gòu)建TSRF1超表達載體pROK-TSRF1的構(gòu)建將TSRF1的編碼序列(基因庫登陸號AF494201)用引物5’-CCTGATCTAGATGGATTCTTCTTCTTC-3’和5’-CCTGTGTCGACAAAATCATTCGCTTAG-3’擴增后，通過XbaI和SmaI酶切位點克隆到植物雙元表達載體pROK2[由pBI121(Clontech)改造]的35S CaMV啟動子的下游。
TSRF1的雙鏈RNA干擾載體pGSA-dsRNA-TSRF1的構(gòu)建PCR擴增獲得127BP片段(127-254)的TSRF1片段，其中在5’引物中引入SpeI-NcoI位點，在3’引物中引入BamH I-AscI位點。首先，在NcoI和AscI位點引入127BP正向TSRF1片段，然后，在BamI和SpeI位點引入127BP反向TSRF1片段，正反片段由一段800bp的GUS片段連接。
上述載體通過電轉(zhuǎn)化方法分別導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404。
實施例2根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)pROK2-JERFs轉(zhuǎn)化煙草1.轉(zhuǎn)化(1)培養(yǎng)無菌煙草小苗，至長出5片真葉時用于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化；(2)將無菌苗的葉片切去邊緣和主脈，切成0.4×0.6cm2大小的外植體；(3)將農(nóng)桿菌菌液(OD600＝0.8)用新鮮YEB培養(yǎng)基重懸后浸泡切好的外植體5分鐘；(4)用無菌濾紙吸干外植體表面的菌液，轉(zhuǎn)入MS固體基本培養(yǎng)基，28℃暗培養(yǎng)；
(5)三天后，將材料轉(zhuǎn)到含有抗生素(Kan＝100mg/L，羧芐＝500mg/L)和6-BA的分化培養(yǎng)基中于25℃，16小時光照/8小時黑暗光照周期條件下進行培養(yǎng)，兩周繼代一次；(6)待分化出的小苗長至2-3cm高時，切下轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根。
2.鑒定將獲得的T0代轉(zhuǎn)基因植物采用RT-PCR、Northern blot鑒定。T0轉(zhuǎn)基因種子使用卡那霉素選擇平板萌發(fā)，確認其具有3∶1的分離比，然后將T1轉(zhuǎn)基因植株轉(zhuǎn)至土壤培養(yǎng)直至成熟，收獲T1種子于T2進行抗病性功能分析。
實施例3 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化番茄1.轉(zhuǎn)化(1)取生長一周左右的無菌番茄子葉，剪成小段，在MS預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)兩天；(2)將農(nóng)桿菌菌液(OD600＝0.8)用新鮮YEB培養(yǎng)基重懸后浸泡預(yù)培養(yǎng)的葉片15到20分鐘；(3)在共培養(yǎng)培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)兩天；(4)轉(zhuǎn)入含有抗生素(卡拉＝50mg/L，羧芐＝500mg/L)和6-BA的分化選擇培養(yǎng)基上于25℃，16小時光照/8小時黑暗光照周期條件下進行培養(yǎng)，兩周繼代一次；(5)將分化出的小苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基誘導(dǎo)生根.
2.鑒定方法同實施例2。
實施例4 轉(zhuǎn)基因植株的抗病性鑒定1.TSRF1轉(zhuǎn)基因煙草對番茄青枯菌的抗性檢測將得到的超表達轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草(6周大小的小苗)通過葉片滲透(104-108cfu/ml)方法接種青枯病菌，接種后用保鮮膜覆蓋保濕四天后觀察葉片癥狀并對以106cfu/ml接菌的葉片進行細菌記數(shù)；實驗發(fā)現(xiàn)野生型煙草以106-108cfu/ml濃度接菌后呈現(xiàn)水浸狀，并且邊緣發(fā)黃褪色有擴散跡象，以104和105cfu/ml接種后出現(xiàn)黃化，而超表達轉(zhuǎn)基因煙草在以106-108cfu/ml濃度接菌后呈保護性的超敏反應(yīng)，以104和105cfu/ml接種后呈免疫反應(yīng)無發(fā)病癥狀；細菌記數(shù)結(jié)果證明野生型煙草接種106cfu/ml的青枯菌4天后葉片中菌數(shù)生長量是超表達轉(zhuǎn)基因型煙草的70-280倍。以浸根(108cfu/ml)的方法接種青枯病菌15天后，野生型煙草有57.1％的植株萎蔫枯死，而超表達轉(zhuǎn)基因只有16.1％的植株枯死。
2.TSRF1轉(zhuǎn)基因番茄對番茄青枯菌的抗性檢測
將得到的轉(zhuǎn)基因番茄和野生型番茄(4周大小的小苗)通過葉片滲透(103cfu/ml)方法接種青枯病菌，接種后用保鮮膜覆蓋保濕。四天后野生型番茄葉片中的青枯菌數(shù)比TSRF1基因被dsRNA沉默的轉(zhuǎn)基因植株中的低2-5倍，而比超表達TSRF1基因的轉(zhuǎn)基因植株中的高60-200倍。
3.TSRF1轉(zhuǎn)基因煙草對灰霉的抗性檢測將野生型和用轉(zhuǎn)基因技術(shù)得到的轉(zhuǎn)基因煙草和番茄植株噴霧接菌106cfu/ml的灰霉孢子。4天后，超過80％的超表達轉(zhuǎn)基因煙草無明顯發(fā)病癥狀，而野生型煙草約80％出現(xiàn)明顯的褐色水浸斑。
4.TSRF1轉(zhuǎn)基因番茄對灰霉的抗性檢測實驗方法與在煙草中的方法相同，實驗結(jié)果一致。
權(quán)利要求
1.一種植物基因表達載體，其特征是含有基因庫登陸號AF494201的基因序列。
2.權(quán)利要求1所述的表達載體的用途，是用于轉(zhuǎn)化植物，使之產(chǎn)生抗病性。
3.權(quán)利要求2所述的表達載體的用途，所述植物包括雙子葉植物和單子葉植物。
4.權(quán)利要求2所述的表達載體，所述植物是蔬菜、棉花、豆類、糧食作物、煙草、苗木和花卉。
5.權(quán)利要求4所述的表達載體的用途，所述蔬菜是番茄。
6.權(quán)利要求2所述的表達載體的用途，所述抗病性包括抗細菌、真菌和抗病毒的特性。
7.權(quán)利要求6所述的表達載體的用途，所述細菌是番茄青枯菌；所述真菌是灰霉菌。
8.權(quán)利要求2所述的表達載體的用途，所述轉(zhuǎn)化包括利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、共轉(zhuǎn)化法和基因槍法進行的轉(zhuǎn)化。
9.基因庫登陸號AF494201的基因序列及其編碼的蛋白質(zhì)用于植物抗病的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及調(diào)控蛋白TSRF1在植物抗病中的應(yīng)用。本發(fā)明篩選出一種新的ERF轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子——基因庫登陸號AF494201的基因序列，用該基因序列構(gòu)建植物表達載體，并轉(zhuǎn)化植物，以提高植物抗病性。實驗證明本發(fā)明提供的TSRF1是一種植物抗病性相關(guān)的ERF轉(zhuǎn)錄因子家族的新成員，TSRF1超表達的轉(zhuǎn)基因植物能夠顯著提高對植物病原侵染的抗性。
文檔編號C12N15/63GK1563389SQ20041000345
公開日2005年1月12日 申請日期2004年3月22日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月22日
發(fā)明者黃榮峰, 張洪博, 陳琪, 陳珈, 王學(xué)臣, 黃大昉 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所, 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)