專利名稱：：植物型黑色素酶法合成的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬生物化學(xué)制品領(lǐng)域技術(shù)背景黑色素是生物的保護(hù)性色素，廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物中，黑色素有吸收紫外線、抗氧化、消除自由基的作用，對(duì)生物有機(jī)體起著保護(hù)作用。按黑色素的結(jié)構(gòu)組成，可分為三種型式，即真黑色素(eumelanin)、棕黑色素(phaeomelanin)和異黑色素(allpmelanin)。真黑色素顏色為深棕色或黑色，由酪氨酸經(jīng)由多巴(Dopa)途徑轉(zhuǎn)化而生成，這種黑色素主要分布于動(dòng)物表皮和毛發(fā)細(xì)胞中，以及內(nèi)臟膜或組織中，可稱為動(dòng)物型黑色素。棕黑色素是真黑色素的胱氨酸衍生物，含硫原子，顏色為略帶紅色的棕色或黃色，常見(jiàn)于動(dòng)物的毛發(fā)中。異黑色素主要分布于植物中，屬植物型黑色素，類似于真黑色素為棕色或黑色，它主要是由兒茶酚等二元酚、三元酚經(jīng)由多聚羥基萘途徑生成的。Nicolausetal提出，動(dòng)物源黑色素多屬吲哚型，而植物源黑色素多屬鄰苯二酚型。Porta經(jīng)過(guò)進(jìn)一步研究，根據(jù)其結(jié)構(gòu)單元是以吲哚還是苯并噻嗪為骨架，將動(dòng)物源黑色素分為真黑色素(eumelanin)和棕黑色素(pheomelanin)。王巖等研究了幾種天然黑色素分子結(jié)構(gòu)的紅外光譜表征，提出頭發(fā)黑色素屬于真黑色素和棕黑色素混合型黑色素，香蕉皮黑色素、葵花籽黑色素都屬于鄰苯二酚型黑色素，是多酚物質(zhì)在多酚氧化酶和酚羥基酶的作用下轉(zhuǎn)化為羥基醌，進(jìn)而聚合形成的。同時(shí)他們還認(rèn)為黑芝麻黑色素是吲哚型和鄰苯二酚型的混合型黑色素。尹佩玉等確認(rèn)，黑芝麻黑色素中含有酚類共軛結(jié)構(gòu)，初步證明黑芝麻黑色素具有兒茶酚型黑色素的結(jié)構(gòu)特征，由兒茶酚、對(duì)苯二酚和微量?jī)翰杷針?gòu)成，不含吲哚型組分。根據(jù)這些研究，表明植物型黑色素主要是由一元酚、二元酚等酚類組分在多酚氧化酶和酚羥基酶的作用下合成的。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明根據(jù)植物型黑色素結(jié)構(gòu)組成，用酶化學(xué)方法合成植物型黑色素，本發(fā)明的基本要點(diǎn)如下1.多酚氧化酶系統(tǒng)的酶制劑制備從多種多酚氧化酶類活性高的植物材料和菌類材料，其中包括梨、蘋果、馬鈴薯、山芋、竹筍、榿木、杉木、松、馬褂木、蘑菇、馬勃等植物性材料分離、制取多酚氧化酶類，包括酚羥基酶。將植物性材料在磷酸緩沖液PH7.0中粉碎勻漿，5000rpm離心15～20分鐘，去渣獲上清液，加入使達(dá)40～50％飽和度的硫酸銨，于4℃冰箱中進(jìn)行鹽析，離心收集酶蛋白沉淀。酶蛋白溶于小體積磷酸緩沖液(PH7.0)，上SephadexG-25柱脫鹽，磷酸緩沖液洗脫，收集酶液。酶液中加入冷凍丙酮或乙醇沉淀出酶蛋白，離心收集酶蛋白，冷凍干燥得粉末酶制劑，酶活力11000～15000單位/g。2.酶促合成1000ml磷酸緩沖液(PH8.0)中單獨(dú)溶解0.1～2.0g對(duì)苯二酚、鄰苯二酚、連苯三酚、沒(méi)食子酸、酪氨酸，或其不同的組合，用2MNaOH調(diào)PH到8.0，35～42℃保溫，加入上述酶制劑0.5～1.0g，繼續(xù)保溫3～5小時(shí)，并不停的攪拌或通氣。反應(yīng)液顏色逐漸變黑，直到濃黑色。3.分離純化酶促合成反應(yīng)結(jié)束后，加入6NHCL調(diào)PH≤4，黑色素呈絮狀沉淀析出，靜置3～4小時(shí)，傾去上清液，離心或過(guò)濾收集沉淀，無(wú)離子水充分洗滌，冷凍干燥，獲得黑色素粗產(chǎn)物。黑色素產(chǎn)物往往和蛋白質(zhì)或其他成分發(fā)生結(jié)合而隨沉淀析出，需要進(jìn)行純化處理。將黑色素干燥粉末加入到6NHCL中洄流16～24小時(shí)，洄流結(jié)束后靜置過(guò)夜，傾去上清液，離心收集沉淀，無(wú)離子水充分洗滌，冷凍干燥，獲黑色素純凈品?；蛘?，將黑色素粉末懸浮于胰蛋白酶溶液中(0.5g/升)，調(diào)PH7～8，40℃保溫2～3小時(shí)，酶消化反應(yīng)結(jié)束后，調(diào)PH≤4，靜置后黑色素沉淀下來(lái)，傾去上清液，離心收集沉淀，無(wú)離子水充分洗滌，經(jīng)冷凍干燥獲黑色素純品。4.理化性質(zhì)檢測(cè)黑色素雖然來(lái)源不同(動(dòng)物、植物、微生物)、結(jié)構(gòu)不同(吲哚型、酚醌型)，但所表現(xiàn)出的理化性質(zhì)卻是一樣的(NicolausR.A.etal，1964)，即有共同的紫外吸收特征，不溶于水，不溶于酸，不溶于一般有機(jī)溶劑，可溶于堿性水，可被KMnO4或H2O2氧化而褪色等，根據(jù)這些理化性質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果表明，所獲產(chǎn)物都具有這些黑色素的理化性質(zhì)，成功地酶促合成了植物型黑色素。具體實(shí)施例方式實(shí)例1.將100g所收獲的雜交種馬鈴薯在4℃預(yù)冷2小時(shí)，隨后去皮、切碎，在冰浴中加入適量的0.1mol/L磷酸緩沖液(PH7.0)勻漿，5000rpm離心15～20分鐘，上清液中加入硫酸銨達(dá)50％飽和度，于4℃冰箱中鹽析，離心收集酶蛋白沉淀。將酶蛋白溶于小體積0.1mol/L磷酸緩沖液(PH7.0)，上SephadexG-25柱脫鹽，磷酸緩沖液洗脫，收集酶液。酶液中加入2.5倍(V/V)-18℃冷凍丙酮，8000rpm離心收集酶蛋白，經(jīng)冷凍干燥獲酶制劑1.8g。以MansonH.S.法測(cè)定L-Dopa生成1mmoldopachrome所需的酶量定義為一個(gè)酶活力單位，Dopachrome在475nm的消光系數(shù)為3600mol/L-1.cm-1，本發(fā)明制得的酶制劑活力測(cè)定結(jié)果為6744單位/g。實(shí)例2.將100g新鮮蘑菇在4℃預(yù)冷2小時(shí)，在冰浴中加入適量的0.1mol/L磷酸緩沖液(PH7.0)勻漿，5000rpm離心15～20分鐘，上清液中硫酸銨達(dá)50％飽和度，于4℃冰箱中鹽析，離心收集沉淀。將所獲沉淀溶于小體積磷酸緩沖液(PH7.0)，上SephadexG-25柱脫鹽，收集洗脫液，加入2.5倍(V/V)-18℃冷凍丙酮，析出酶蛋白沉淀，8000rpm離心收集酶蛋白，經(jīng)冷凍干燥獲酶制劑4.26g。按實(shí)例1法測(cè)得的酶活性為7546單位/g。實(shí)例3.將鄰苯二酚1g和碳酸鈉0.2g用少許熱水溶解后，加入1000ml0.2mol/L磷酸緩沖液(PH8.0)中，加溫至40～42℃，加入實(shí)例1酶制劑1.0～1.5g，加入CuSO4.7H2O50mg，在水浴中40～42℃保溫3～5小時(shí)，并不停攪拌。反應(yīng)結(jié)束后，加入6NHCL調(diào)PH≤4，黑色素絮狀沉淀析出，靜置5小時(shí)，傾去上清液，離心收集絮狀沉淀，冷凍干燥，獲黑色素相產(chǎn)物1.24g。實(shí)例4.將鄰苯二酚1g和碳酸鈉0.2g用少許熱水溶解后，加入1000ml0.2mol/L磷酸緩沖液(PH8.0)中，加溫至40～42℃，加入實(shí)例2酶制劑1.0～1.2g，加入CuSO4.7H2O50mg，在水浴中40～42℃保溫3～5小時(shí)，并不停攪拌。反應(yīng)結(jié)束后，加入6NHCL調(diào)PH≤4，黑色素絮狀沉淀析出，靜置5小時(shí)，傾去上清液，離心收集沉淀，冷凍干燥，獲黑色素粗產(chǎn)物0.98g。實(shí)例5.將對(duì)苯二酚1g和碳酸鈉0.2g用少許熱水溶解后，加入到1000ml0.2mol/L磷酸緩沖液(PH8.0)中，加溫至40～42℃，加入實(shí)例1酶制劑1.0～1.5g，加入CuSO4.7H2O50mg，在水浴中保溫3～5小時(shí)，并不停攪拌。反應(yīng)結(jié)束后，加入6NHCL調(diào)PH≤4，黑色素絮狀沉淀析出，靜置5小時(shí)，傾去上清液，離心收集沉淀，冷凍干燥，獲黑色素粗產(chǎn)物1.2g。實(shí)例6.將連苯三酚1g和0.2g碳酸鈉用少許熱水溶解后，加入到1000ml0.2mol/L磷酸緩沖液(PH8.0)中，加溫至40～42℃，加入實(shí)例1酶制劑1.0～1.5g，加入CuSO4.7H2O50mg，在水浴中40～42℃保溫3～5小時(shí)，并不停攪拌。反應(yīng)結(jié)束后，加入6NHCL調(diào)PH≤4，黑色素絮狀沉淀析出，靜置5小時(shí)，傾去上清液，離心收集沉淀，冷凍干燥，獲黑色素粗產(chǎn)物1.05g。實(shí)例7.將沒(méi)食子酸1g和0.2g碳酸鈉用少許熱水溶解后，加入到1000ml0.2mol/L磷酸緩沖液(PH8.0)中，加溫至40～42℃，加入實(shí)例1酶制劑1.0～1.5g，加入CuSO4.7H2O50mg，在水浴中40～42℃保溫3～5小時(shí)，并不停攪拌。反應(yīng)結(jié)束后，加入6NHCL調(diào)PH≤4，黑色素絮狀沉淀析出，靜置5小時(shí)，傾去上清液，離心收集沉淀，冷凍干燥，獲黑色素粗產(chǎn)物0.92g。實(shí)例8.將實(shí)例3，4，5，6，7所制取的黑色素粗產(chǎn)物各稱取1g，分別在50ml6NHCL中加熱洄流18～24小時(shí)，冷卻后過(guò)濾，無(wú)離子水充分洗滌，105℃干燥，所獲純化黑色素分別為0.53g、0.62g、0.46g、0.48g、0.37g。實(shí)例9.將實(shí)例3，4，5，6，7所制取的黑色素粗產(chǎn)物各稱取1g，分別加入到100ml磷酸緩沖液(PH6.8)中，加熱到40～42℃，再分別加入胰蛋白酶500mg，40～42℃保溫2～3小時(shí)，加入6NHCL調(diào)PH≤4，離心收集沉淀，并用無(wú)離子水充分洗滌，105℃干燥，所獲純化黑色素分別為0.43g、0.63g、0.41g、0.46g、0.40g。實(shí)例10.將按實(shí)例3，4，5，6，7酶法合成制取的植物型黑色素的理化性質(zhì)進(jìn)行測(cè)定，并與Sigma公司生產(chǎn)的Dopa-melanine(Dopa黑色素)和按Kereateaetal法從植物材料七葉樹(shù)(Aesculushippocastanicum)、向日葵(Heliantusannus)制取的黑色素進(jìn)行比較(1)紫外和可見(jiàn)光吸收在短波段吸收最強(qiáng)，隨波長(zhǎng)增加吸收減弱；(2)同Dopa黑色素、七葉樹(shù)和向日葵黑色素一樣，不溶于水，不溶于一般常見(jiàn)的有機(jī)溶劑；(3)在0.5mol/LNaOH或KOH溶液中完全溶解；(4)不溶于酸，在PH＜5時(shí)沉淀；(5)FeCl3存在時(shí)發(fā)生沉淀；(6)KMnO4和H2O2能氧化并使褪色(7)能使AgNO3再生NH4溶液這些性質(zhì)都表明實(shí)例3，4，5，6，7酶促合成的產(chǎn)物是植物型黑色素。本發(fā)明為生產(chǎn)制取植物型黑色素提供了新途徑，工藝簡(jiǎn)單，制取方便，成本低廉。NicolausR.A.，Piattellim.，F(xiàn)attorussoE.Tetrahedron，1964，201163PortaG.J.Invest.Dermatol，1980，75122王巖等，分析試驗(yàn)室，1996，第15卷，第6期，63-35。尹佩玉等，氣相色譜/質(zhì)譜法鑒定黑芝麻中黑色素的結(jié)構(gòu)類型，色譜，2001年第19卷，第3期，208-209。MansonH.S.Oxidase.Aun.Rev.Biochem.1965，34，595-634.KerestesJ.J.etal.Biologicalactivefractionofvegetablemelanin，processforitsproductionanditsuse，UnitedStatesPatentApplication，20020041905.April11，2002.權(quán)利要求1.本發(fā)明提出了用酶促合成法生產(chǎn)制取植物型黑色素的新途徑新方法。2.按權(quán)利要求1，酶促合成法生產(chǎn)制取植物型黑色素的新途徑、新方法，包括酶制劑的分離制備、酶反應(yīng)底物、酶促反應(yīng)系統(tǒng)組成、酶促反應(yīng)條件和酶促反應(yīng)產(chǎn)物的分離和純化。3.按權(quán)利要求2，所涉及的酶包括多酚氧化酶系統(tǒng)中的所有的參于合成黑色素的酶種類及其相應(yīng)的輔酶、輔基和活化因子等，這種包括多酚氧化酶系統(tǒng)的酶制劑，既包括酶粗提物，也包括經(jīng)部分純化的酶制劑粉末和溶液。4.按權(quán)利要求3，所涉及的多酚氧化酶系統(tǒng)的所有酶種類是從各種植物材料和微生物材料(包括真菌)按廣為人知的方法制取的。5.按權(quán)利要求2，酶反應(yīng)底物包括一元酚及其衍生物(酪氨酸、酪胺、多巴、多巴胺等及其衍生物)、二元酚及其衍生物(對(duì)苯二酚、鄰苯二酚、間本二酚、兒茶酸、異兒茶酸等及其衍生物)、三元酚及其衍生物(連苯三酚、沒(méi)食子酸等及其衍生物)。6.按權(quán)利要求2，酶促合成植物型黑色素反應(yīng)系統(tǒng)組成包括磷酸緩沖液(PH6-9)、權(quán)利要求5中的底物0.1-3.0g/升、權(quán)利要求3中的酶系統(tǒng)5000-100000單位/升。7.按權(quán)利要求2，用酸調(diào)PH≤4沉淀析出黑色素，使黑色素從酶反應(yīng)液中分離出來(lái)。8.按權(quán)利要求2，用3-9NHCL洄流10-30小時(shí)或用胰酶水解消化法處理酶法合成制取的黑色素粗產(chǎn)物，使黑色素產(chǎn)品得以純化。全文摘要本發(fā)明屬于生物化學(xué)制品領(lǐng)域從植物材料分離制取多元酚氧化酶系作為酶制劑，以植物中普通存在的酚類成分為底物，在磷酸緩沖液介質(zhì)中建立酶促反應(yīng)系統(tǒng)，進(jìn)行酶促合成植物型黑色素，并進(jìn)行分離和純化，檢測(cè)所獲產(chǎn)物理化性質(zhì)，所獲產(chǎn)物和標(biāo)準(zhǔn)黑色素以及從其他植物分離提取的黑色素完全相同。本發(fā)明為生產(chǎn)制取植物型黑色素提供了新途徑。文檔編號(hào)C12N9/00GK1651574SQ200410004108公開(kāi)日2005年8月10日申請(qǐng)日期2004年2月6日優(yōu)先權(quán)日2004年2月6日發(fā)明者王敬文,張金萍申請(qǐng)人:中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所