專利名稱：組織型纖溶酶原激活劑缺失突變體基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于細(xì)胞生物學(xué)與分子生物學(xué)領(lǐng)域，其技術(shù)涉及細(xì)胞生物學(xué)與分子生物學(xué)的相關(guān)實驗方法與技術(shù)，特別是一種組織型纖溶酶原激活劑缺失突變體基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
背景技術(shù)：
心血管疾病引發(fā)的血栓并發(fā)癥嚴(yán)重威脅人類的生命與健康，是導(dǎo)致死亡和病殘的主要疾病之一。全世界每年心血管病患者多達(dá)幾千萬；我國血栓性疾病的發(fā)生人數(shù)近年來也明顯上升，每年高達(dá)300萬，且治療后復(fù)發(fā)率較高，而由血栓造成的急性心肌梗塞(Acutemyocardial infarction，AMI)的死亡率可高達(dá)30％，對于許多AMI患者來說，溶栓治療是提高存活率及保持左心室功能的首選方法，故疾病發(fā)作時，進(jìn)行及時有效的特效藥物治療以保證血液循環(huán)的正常暢通，對提高患者的生存率十分重要。
目前臨床上已正式批準(zhǔn)使用和試用的溶栓劑可劃分為三代，其中，作為第二代溶栓劑之一的組織型纖溶酶原激活劑(tissue-typeplasminogen activator，t-PA)是血中纖溶系統(tǒng)中天然存在的生理性激活劑，其能特異地激活纖溶酶原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w溶酶，而后者能在血栓局部有效地溶解血栓中的纖維蛋白，使血管再通，與其它溶栓劑相比，t-PA具有引起全身出血傾向小，溶栓后再凝趨勢弱的優(yōu)點；因此能夠發(fā)揮高效、特異的溶栓作用。但是，盡管t-PA在臨床上存在有很多的益處，其溶栓治療卻也常常受到限制，這主要是因為t-PA在血中的半衰期甚短(3～5分鐘)，使得在臨床治療中為維持其有效濃度而必須大劑量靜脈滴注，從而增加了引起系統(tǒng)性出血的危險。除此之外，溶栓治療時，大量t-PA的使用也使其價格令人難以接受。因此設(shè)計并研制延長半衰期，降低系統(tǒng)出血傾向，提高特異活性，簡化給藥途徑，價格便宜的新型t-PA愈發(fā)重要；基于此，人們努力開發(fā)研制新型第三代溶栓試劑。
作為第三代溶栓制劑之一的rPA(Reteplase，t-PA的V4～E175缺失突變體)，早在1996年就已通過FDA的認(rèn)證，與野生型t-PA相比，其有許多的優(yōu)點，如半衰期相對延長；對患者用藥時，可以采用推注而非滴注的方式等等，但由于rPA為大腸桿菌的表達(dá)產(chǎn)物，需要進(jìn)行大量的純化與復(fù)性方面的工作，從而增加了生產(chǎn)成本，使其在國內(nèi)臨床上難以得到廣泛的應(yīng)用。
而對于真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)來說，由于其不僅能夠正確剪接加工成熟的mRNA，提高產(chǎn)品正確構(gòu)型的幾率，且表達(dá)產(chǎn)物具有遺傳穩(wěn)定性和可重復(fù)性，可分泌到培養(yǎng)基中，提純工藝簡單，成本也較低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種以真核細(xì)胞表達(dá)方法得到的組織型纖溶酶原激活劑缺失突變體基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株CHO-dhfr-pCSRA(保藏號CGMCC No.1093)。
本發(fā)明的目的按下述方案實現(xiàn)
一種組織型纖溶酶原激活劑缺失突變體基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，它是將t-PA V4～E175缺失突變體cDNA的真核表達(dá)載體pCSRA轉(zhuǎn)染CHO-dhfr-細(xì)胞，經(jīng)G418及DMEM的雙重選擇后，首次獲得其穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株CHO-dhfr-pCSRA(保藏號CGMCC No.1093)。
本發(fā)明對上述細(xì)胞株生物學(xué)特性進(jìn)行了鑒定。其中，F(xiàn)APA檢測結(jié)果表明，表達(dá)產(chǎn)物具有良好的溶纖活性；80℃平板滅活實驗表明，產(chǎn)物具有特異活性；Western blotting結(jié)果表明，產(chǎn)物具有特異抗原性；穩(wěn)定性試驗表明，細(xì)胞株具有良好的穩(wěn)定性。實驗中，還對無血清培養(yǎng)基CHO-S-SFMII與常規(guī)培養(yǎng)基DMEM培養(yǎng)條件下的細(xì)胞株特性進(jìn)行了比較，其中24h，48h，72h時，目的產(chǎn)物的表達(dá)量，前者均約為后者的2倍；SDS-PAGE顯示，前者僅有少量的蛋白質(zhì)條帶，而后者則存在有大量的蛋白質(zhì)條帶。
具體實施例方式本發(fā)明是以脂質(zhì)體介導(dǎo)法將自行構(gòu)建的t-PA V4～E175缺失突變體cDNA的真核表達(dá)載體pCSRA轉(zhuǎn)染CHO-dhfr-細(xì)胞，經(jīng)G418及DMEM的雙重選擇后，獲得其穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株CHO-dhfr-pCSRA(保藏號CGMCC No.1093)。并對細(xì)胞株進(jìn)行了一系列生物學(xué)特性鑒定。
實驗中還首次對無血清培養(yǎng)基(serum free medium，SFM)在rPA生產(chǎn)應(yīng)用方面進(jìn)行了探索，從而進(jìn)一步證明了SFM對于生產(chǎn)藥用性蛋白質(zhì)的廣闊前景。本發(fā)明為臨床上開發(fā)和應(yīng)用延長半衰期，降低系統(tǒng)出血傾向，提高特異活性，簡化給藥途徑和價格便宜的新型長效的t-PA奠定了良好基礎(chǔ)。
權(quán)利要求
1.一種組織型纖溶酶原激活劑缺失突變體基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，其特征在于它是t-PA V4～E175缺失突變體cDNA的真核表達(dá)載體pCSRA轉(zhuǎn)染CHO-dhfr-細(xì)胞，經(jīng)G418及DMEM的雙重選擇后，首次獲得其穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株CHO-dhfr-pCSRA(保藏號CGMCC No.1093)。
全文摘要
本發(fā)明是一種組織型纖溶酶原激活劑缺失突變體基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，它是以脂質(zhì)體介導(dǎo)法將含有t－PA經(jīng)G418及DMEM的雙重選擇后，獲得其穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株CHO－dhfr
文檔編號C12N15/85GK1560240SQ20041000473
公開日2005年1月5日 申請日期2004年3月1日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月1日
發(fā)明者王玉炯, 李敏, 扈榮良, 羅惠霞 申請人:寧夏大學(xué)