專利名稱：編碼棉花半胱氨酸蛋白酶的基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及棉花半胱氨酸蛋白酶基因(Ghcysp)的克隆、重組及功能分析和應(yīng)用，屬于分子生物學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
在棉花生產(chǎn)中，棉花葉片早衰普遍存在，棉田葉片早衰一般導(dǎo)致產(chǎn)量損失10％左右，嚴(yán)重早衰的棉田產(chǎn)量損失達(dá)20％以上。棉花葉片的早衰不僅影響棉花的產(chǎn)量，而且導(dǎo)致棉花纖維強(qiáng)度降低、長度變短、整齊度下降，從而降低棉纖維的成紗質(zhì)量，因此，棉花生產(chǎn)迫切需要延緩棉花早衰的技術(shù)和方法。
細(xì)胞程序性死亡是遺傳控制、高度有序的細(xì)胞自殺過程，可使生物清除衰老的細(xì)胞，是多細(xì)胞真核生物在生長發(fā)育過程中保持體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定所必須的，大量實驗證明動物的一些疾病是由于細(xì)胞程序性死亡發(fā)生異常造成的(Polverini，P.J.，and Nr，J.E.Apoptosis andpredisposition to oral cancer.Crit.Rev.Oral Biol.Med.1999，10139-152.。Wang，T.H.，and Wang，H.S.Apoptosis(2)Characteristics ofapoptosis.J.Formos.Med.Assoc.1999，98531-542.)。植物的早衰(pre-mature)是否也與植物細(xì)胞程序性死亡發(fā)生異常有關(guān)？目前還沒有實驗驗證。在動物的細(xì)胞程序性死亡中，Caspases(cysteineaspartases)蛋白酶起著重要的作用(Vaux and Korsme，The molecularbiology of leaf senesence.Journal of Experiment Botany，1997，48(307)181-199。Hengartner，The biochemistry of apoptosis.Nature，2000，407770-776。)，Caspase蛋白酶的命名是根據(jù)它的酶活性位點是Cys，水解蛋白質(zhì)酶切位點在天冬氨基酸后，它是一類半胱氨基酸蛋白酶，它在動物細(xì)胞程序性死亡中既是水解蛋白質(zhì)的參與者，也是細(xì)胞程序性死亡的啟動因素。在植物衰老過程中，細(xì)胞程序性死亡廣泛存在(Bleecker，A.B.，and Patterson，S.E.Last exitSenescence，abscission，andmeristem arrest in Arabidopsis.Plant Cell，1997，91169-1179。Schmid，M.，Simpson，D.，Sarioglu，H.，Lottspeich，F(xiàn).，and Gietl，C.Thericinosomes of senescing plant tissue bud from the endoplasmic reticulum.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2001，985353-5358)，目前，已經(jīng)從擬南芥(Eason，J.R.，Ryan，D.J.，Pinkney，T.T.，and O′Donoghue，E.M.Programmed cell death during flower senescenceIsolation andcharacterization of cysteine proteinases from Sandersonia aurantiaca.Funct.Plant Biol，2002，291055-1064.)、番茄(Draham R，John I，F(xiàn)arrellA，Cooper W，Schunch W，Grierson D，Isolation and analysis of cDNAsencoding tomato cysteine proteases expressed during leaf senescence，Plant Molecular Biology，1996，30755-767.)、胡蘿卜和玉米(Smart etal.The timing of maize leaf senesence and characterisation ofsenesence-related cDNAs.Phsiology Plantrum，1995，93(1)673-682)中分離得到了類似動物Caspases蛋白酶的半胱氨酸蛋白酶基因，在植物發(fā)育早期半胱氨酸蛋白酶基因的表達(dá)量比較低，在衰老的植物器官表達(dá)量增加。但是，在棉花中目前還沒有克隆到該基因。
本發(fā)明的目的是克隆棉花的半胱氨酸蛋白酶基因，通過構(gòu)建反義表達(dá)載體，抑制該基因的表達(dá)，以延緩棉花及其它植物的早衰。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明以遼棉9號衰老葉片的cDNA為模板，利用cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)，克隆了棉花半胱氨酸蛋白酶基因，通過構(gòu)建反義表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌侵染轉(zhuǎn)化擬南芥，轉(zhuǎn)基因植株的衰老比野生型延遲9-10天。
遼棉9號吐絮后，葉片變黃進(jìn)入衰老時期時，提取衰老葉片的總RNA，取2微克RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。利用Blast軟件，對Genebank中已經(jīng)克隆的不同植物半胱氨酸蛋白酶的進(jìn)行同源性比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)半胱氨酸蛋白酶的羧基端有兩段比較保守的氨基酸序列，根據(jù)這兩段保守序列的氨基酸順序，設(shè)計了1對兼并引物，分別為C-A[5’TG(C/T)TGGGC(G/A/T)TT(T/C)TC(A/C)GC(A/G)GT(T/G)GC3’]和C-B{5’TG(A/G)AA(G/C)AC(T/A)CC(C/A/T)GA(A/T)GA(G/A)TA(A/G)AA(C/T)TG 3’}。以衰老葉片的cDNA為模板，利用這一對兼并引物進(jìn)行RT-PCR進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增反應(yīng)條件為PCR反應(yīng)體積為50μl，包括以下成分10×反應(yīng)緩沖液5μl2.5mMdNTP 4μl5′端引物(5μM) 4μl
3′端引物(5μM) 4μl反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物4μlTap酶(2.5u) 0.5μl反應(yīng)條件為 取2μl PCR產(chǎn)物，與pGEM-T載體(Promega公司產(chǎn)品)進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Promega公司產(chǎn)品)，篩選重組子，然后進(jìn)行序列分析。
根據(jù)已經(jīng)克隆的DNA序列設(shè)計特異引物，以衰老葉片的cDNA為模板，進(jìn)行3′RACE分離其3′序列，進(jìn)行5′RACE擴(kuò)增，以分離5′序列，然后，將它們與保守片段進(jìn)行拼接成一個完整的cDNA序列。根據(jù)該cDNA的5’和3′的核苷酸序列，設(shè)計一對特異引物Ghc-1 5’AAAACC CCA CTT CAAAAC CC 3’Ghc-2 5’GCA CAC GAT TCA TTC ATAAC 3’利用這一對特異引物，以衰老葉片的cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，按照同上擴(kuò)增條件，結(jié)果分離的得到一段1300bp左右的片段，對該片段進(jìn)行序列分析表明其基因序列的長度為1368bp，將該cDNA命名為Ghcysp，它包含一個1034bp的開放閱讀框，起始于序列的99位，終止于1133位，編碼344個氨基酸，5′端非編碼區(qū)的長度為98bp，3’端非編碼區(qū)的長度為235bp。在Poly A上游75bp處有典型的真核生物基因Poly A的信號序列-AATAAA，起始密碼子ATG附近具有5’-CACAATGG序列結(jié)構(gòu)，與其他真核生物中普遍存在的高效轉(zhuǎn)錄起始序列5’-CA/GNNATGG一致。Ghcysp基因與其它動、植物編碼半胱氨酸蛋白酶的核苷酸序列的同源性為46％-66％，Ghcysp基因與其它動、植物半胱氨酸蛋白酶的氨基酸同源性為67％--82％。這表明通過以上操作得到了編碼棉花半胱氨酸蛋白酶的基因。
序列表(1)SEQ.ID.NO 1的信息序列特征長度1368堿基對類型核酸鏈型雙鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性分子類型cDNA假設(shè)否反義否最初來源棉花序列描述SEQ.ID.NO 11 ATTACCAATA CACATCAAAC TTTTTCACTA TAAAACCCCA CTTCAAAACC CTTTTGGAGT61 AATCAAATTA GGATCTAATC CTTCAACTTT CTAAACCAAT GGCTTTGCTG CAAATTTTTC121 TCTTCGTTGC TCTGGTTCTA TCATTCTGTT TTTCCATCCA ACTTGCTGGA CTGTCTCGTC
181 CACTCTTGGA TGAAGACTCC ATGAGGCATG AGGAGTGGAT GAGTCAACAT GGCCGTGTTT241 ACGCGGATGA GCAGGAGGAC CATAAGAACA AGCGCTTCAA TGTGTTTAAA GAGAACGTCG301 AACGAATTGA AGAGTTTAAT GACGGAAAAA CTTTCAAACT TGCGATAAAT CAGTTTGCTG361 ACTTAACCAA TGAGGAATTT CGTGCCAGTT ACAATGGTTT CAAAGGTCCC ATGGTATTAT421 CTAGTCAAAT AACTAAACCG ACGCCGTTTA GGTACGAAAA CGTTTCTTCT GCTTTGCCTG481 TTTCAGTTGA TTGGAGGAAG AAAGGAGCTG TTACTCCTGT TAAAAATCAA GGCCAATGCG541 GATGTTGTTG GGCGTTTTCA GCGGTTGCGG CTATTGAAGG TATTACTCAA ATTAGTACTG601 GGAAACTTAT ATCTTTGTCA GAACAAGAGC TTGTTGATTG CGACACAAAG GGTATTGACC661 ATGGCTGCGA AGGCGGTTTA ATGGATACTG CGTTTGAGTT TATTATTAAC AATGGCGGCT721 TGACAACTGA GTCAAATTAT CCTTACAAAG GCGAAGATGG AACTTGCAAC TTTAACAAGA781 CCAATCCAAT TGCTGTGTCT ATTACAGGTT ATGAGGATGT CCCGGCTAAT GATGAGCAAG841 CACTGATGAA GGCAGTGGCA CACCAACCGG TTAGCGTTGC TATTGAAGCG GGTGGTAGTG901 ATTTCCAATT CTATTCGTCT GGTGTGTTCA CTGGAGAGTG CGGAACGGAA CTTGATCATG961 CAGTTACTGC TGTCGGATAC GGCGAATCTG AAGACGGATC AAAGTATTGG ATCGTTAAGA1021 ATTCATGGGG AACAAAATGG GGAGAAAGTG GATATATTGA AATGCAAAAA GATATCAAGG1081 TTAAACAAGG ACTATGTGGT ATTGCCATGC AAGCTTCTTA CCCAACTGCT TAACGGTTCA1141 GTAATATGCG ATGTAATGCA AAAGATTTCA AAACCGTGTT AATGTATTTA GTAAGCTTAT1201 GAGGATTGAT TGTAATGTAA TGCTTCATGG TGTGTATTAT CCTATGTATG CATCTCCTAA1261 ATCACAAAGA AATAATATAG ACCGACCCGC AATAGGTGCA TGTCGGTTGG CGCTGTATGC1321 TACTGTTATG AATGAATCGT GTGCTTTTAC AAAAAAAAAA AAAAAAAA(2)SEQ.ID.NO 2的信息(a)序列特征長度344氨基酸類型氨基酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(b)分子類型蛋白質(zhì)(c)序列描述SEQ.ID.NO 21 MALLQIFLFV ALVLSFCFSI QLAGLSRPLL DEDSMRHEEW MSQHGRVYAD EQEDHKNKRF61 NVFKENVERI EEFNDGKTFK LAINQFADLT NEEFRASYNG FKGPMVLSSQ ITKPTPFRYE121 NVSSALPVSV DWRKKGAVTP VKNQGQCGCC WAFSAVAAIE GITQISTGKL ISLSEQELVD181 CDTKGIDQGC EGGLMDTAFE FIINNGGLTT ESNYPYKGED GTCNFNKTNP IAVSITGYED241 VPANDEQALM KAVANQPVSV AIEAGGSDFQ FYSSGVFTGE CGTELDHGVT AVGYGESEDG301 SKYWIVKNSW GTKWGESGYI EMQKDIKAKE GLCGIAMQAS YPTA根據(jù)以上序列，設(shè)計構(gòu)建表達(dá)載體引物
正向引物5’AAAACC CCA CTT CAAAAC CC 3’反向引物5’GCA CAC GAT TCA TTC ATAAC 3’以衰老葉片的cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物，先與pGEM-T載體(Promega公司產(chǎn)品)進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌(購自上海生工生物工程公司)，篩選重組子，進(jìn)行序列分析。然后，利用限制性內(nèi)切酶將該片段切下，反向插入植物表達(dá)載體pBI121中35S啟動子下游，將構(gòu)建的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105(promeag公司)中。
利用滲透法轉(zhuǎn)化擬南芥，收獲轉(zhuǎn)化擬南芥的種子，在含有卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，將篩選到的抗性苗進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗證，選擇純合的T3代植株，與野生型擬南芥相比較，轉(zhuǎn)基因擬南芥的衰老延遲9-10天。
通過上述技術(shù)，從棉花衰老葉片中克隆了編碼棉花半胱氨酸蛋白酶的基因，抑制該基因的表達(dá)，能夠延緩植物的早衰。如果將該基因的反義鏈與特異的啟動子連接，轉(zhuǎn)化棉花抑制該基因的表達(dá)，可以延緩棉花的早衰。
具體實施方式實施例1編碼棉花半胱氨酸蛋白酶基因的克隆方法1總RNA的提取提取RNA的溶液要經(jīng)過DEPC處理，配制母液用的雙蒸餾水加入0.1％的DEPC，攪拌混合過夜，高壓滅菌待用，乙醇和異丙醇開后立即用。全部玻璃器皿在2000C烘烤6小時，塑料制品用0.1％的DEPC溶液浸泡30分鐘，高壓滅菌，抑制核酸酶的活性后，方可使用。
(1)將12毫升提取液(200mmol L-1 Tis-HCL，Ph 8.5，300mmol L-1，10mmol L-1EDTA，1.5％脫氧膽酸鈉，1.5％Nonidep-40)與120微升巰基乙醇和1％的PVP(W/V)混和均勻，加入離心管中，利用冰水浴中冷卻。
(2)取大約1克材料，利用液氮研磨至粉末狀，移入離心管中，混和均勻，在冰水浴中放置片刻。
(3)加2M醋酸鈉溶液(PH4.0)1.2ml，上下顛倒離心管5次。加入苯酚/氯仿/異戊醇12ml，旋渦混合器上震蕩10秒鐘，然后水浴中放置15分鐘。
(4)離心，10000×g(9200rpm)，20分鐘，4℃。將上清夜轉(zhuǎn)移到另一離心管中，注意不要吸到水相和有機(jī)相之間的分界層，防止DNA和蛋白質(zhì)污染。然后加入等體積的異丙醇?；靹蚝笥?20℃放置0.5-3小時。
(5)離心，10000×g(9200rpm)，20分鐘，4℃，丟棄上清夜。將離心管倒置于濾紙上片刻。用適量的焦碳酸二乙酯(DEPC)處理的重蒸水(ddH2O)溶解沉淀，并轉(zhuǎn)移到1.5ml eppendorf管中(300μl/管)，然后加入0.4倍體積的5M醋酸銨120μl，2.5倍體積的無水乙醇，-20℃放置0.5-3小時。
(6)離心，13500rpm，4℃，20分鐘，棄上清夜。加入1ml70％乙醇，4℃，離心5分鐘。37℃干燥15分鐘。
(7)用100μl DEPC處理的ddH2O溶解沉淀。
(8)測定OD值。取2-4μg的總RNA進(jìn)行甲醛變性膠電泳，鑒定RNA是否降解。
2反轉(zhuǎn)錄(1)電泳檢測RNA是否降解，并用RNA/DNA calculator測定OD值，計算RNA濃度。
(2)取10μl RNase-free DNase I(promega)在37℃消化15分鐘，苯酚氯仿提取，然后用乙醇沉淀。
(3)取2μg總RNA，加DEPC處理的ddH2O至10.5μl。
(4)70℃變性5分鐘，冰浴中放置5分鐘，然后稍微離心。
(5)依次加入下列試劑5×反應(yīng)緩沖液 4μl10mMdNTPmix2μl核糖核酸酶抑制劑(40-200u/μl) 0.5μl引物B26或oligodT(1μg/μl) 1μl反轉(zhuǎn)錄酶(10μ/μl) 2μl混均勻后在離心機(jī)上稍微離心一下。
(6)42℃水浴60分鐘。
(7)85℃加熱10分鐘，滅活反轉(zhuǎn)錄酶(promeag公司)。
(8)加入180μlDEPC處理的ddH2O，稀釋至200μl，-20℃保存。
3PCR擴(kuò)增條件PCR反應(yīng)體積為50μl，包括以下成分10×反應(yīng)緩沖液 5μl2.5mMdNTP4μl5′端引物(5μM) 4μl3′端引物(5μM) 4μl反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 4μlTap酶(2.5u) 0.5μl反應(yīng)條件為 4基因克隆取2μlPCR產(chǎn)物與pGEM-T Vector進(jìn)行連接，方法按照Promega產(chǎn)品的說明進(jìn)行，連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化DH5α細(xì)菌(購自上海生工生物工程公司)，轉(zhuǎn)化菌在LB/ampicillin/IPTG/-Gal固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，37℃倒置培養(yǎng)12-20小時，有的菌落為白色，有的變?yōu)樗{(lán)色。選取白色菌落，提取質(zhì)粒DNA，進(jìn)行酶切和PCR鑒定。
5質(zhì)粒DNA的提取煮沸法小量提取質(zhì)粒DNA，堿裂解法提取大量DNA。
6序列分析序列測定用測序儀ABIPRISM T M--377DNA Sequencer進(jìn)行，反應(yīng)試劑為BigDyeTM Terminator Cycle Sequencing Ready ReactionKit(PERKIN ELMER)。序列測定在大連寶生物公司進(jìn)行。
7末端序列的克隆cDNA的3′和5′末端的分離，是根據(jù)RACE PCR進(jìn)行的。具體方法參照GIBCO BRL公司的Race System for Rapid Amplicationof cDNA Ends說明書進(jìn)行。
8同源序列的比較DNA和氨基酸的序列比較利用NCBI的BLASTP 2.2.8軟件進(jìn)行，比較數(shù)據(jù)庫為NCBI的GENBANK和EMBL數(shù)據(jù)庫。
實施例2棉花半胱氨酸蛋白酶基因Ghcysp序列克隆基因序列分析結(jié)果如下(1)SEQ.IN.NO 1的信息(a)序列特征長度1368堿基對類型核酸鏈型雙鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(b)分子類型cDNA
(c)假設(shè)否(d)反義否(e)最初來源棉花(f)序列描述SEQ.IN.NO 11ATTACCAATA CACATCAAAC TTTTTCACTA TAAAACCCCA CTTCAAAACC CTTTTGGAGT61 AATCAAATTA GGATCTAATC CTTCAACTTT CTAAACCAAT GGCTTTGCTG CAAATTTTTC121 TCTTCGTTGC TCTGGTTCTA TCATTCTGTT TTTCCATCCA ACTTGCTGGA CTGTCTCGTC181 CACTCTTGGA TGAAGACTCC ATGAGGCATG AGGAGTGGAT GAGTCAACAT GGCCGTGTTT241 ACGCGGATGA GCAGGAGGAC CATAAGAACA AGCGCTTCAA TGTGTTTAAA GAGAACGTCG301 AACGAATTGA AGAGTTTAAT GACGGAAAAA CTTTCAAACT TGCGATAAAT CAGTTTGCTG361 ACTTAACCAA TGAGGAATTT CGTGCCAGTT ACAATGGTTT CAAAGGTCCC ATGGTATTAT421 CTAGTCAAAT AACTAAACCG ACGCCGTTTA GGTACGAAAA CGTTTCTTCT GCTTTGCCTG481 TTTCAGTTGA TTGGAGGAAG AAAGGAGCTG TTACTCCTGT TAAAAATCAA GGCCAATGCG541 GATGTTGTTG GGCGTTTTCA GCGGTTGCGG CTATTGAAGG TATTACTCAA ATTAGTACTG601 GGAAACTTAT ATCTTTGTCA GAACAAGAGC TTGTTGATTG CGACACAAAG GGTATTGACC661 ATGGCTGCGA AGGCGGTTTA ATGGATACTG CGTTTGAGTT TATTATTAAC AATGGCGGCT721 TGACAACTGA GTCAAATTAT CCTTACAAAG GCGAAGATGG AACTTGCAAC TTTAACAAGA781 CCAATCCAAT TGCTGTGTCT ATTACAGGTT ATGAGGATGT CCCGGCTAAT GATGAGCAAG841 CACTGATGAA GGCAGTGGCA CACCAACCGG TTAGCGTTGC TATTGAAGCG GGTGGTAGTG901 ATTTCCAATT CTATTCGTCT GGTGTGTTCA CTGGAGAGTG CGGAACGGAA CTTGATCATG961 CAGTTACTGC TGTCGGATAC GGCGAATCTG AAGACGGATC AAAGTATTGG ATCGTTAAGA1021 ATTCATGGGG AACAAAATGG GGAGAAAGTG GATATATTGA AATGCAAAAA GATATCAAGG1081 TTAAACAAGG ACTATGTGGT ATTGCCATGC AAGCTTCTTA CCCAACTGCT TAACGGTTCA1141 GTAATATGCG ATGTAATGCA AAAGATTTCA AAACCGTGTT AATGTATTTA GTAAGCTTAT1201 GAGGATTGAT TGTAATGTAA TGCTTCATGG TGTGTATTAT CCTATGTATG CATCTCCTAA1261 ATCACAAAGA AATAATATAG ACCGACCCGC AATAGGTGCA TGTCGGTTGG CGCTGTATGC1321 TACTGTTATG AATGAATCGT GTGCTTTTAC AAAAAAAAAA AAAAAAAA(2)SEQ.IN.NO 2的信息(d)序列特征長度344氨基酸類型氨基酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(e)分子類型蛋白質(zhì)
(f)序列描述SEQ.IN.NO 21 MALLQIFLFV ALVLSFCFSI QLAGLSRPLL DEDSMRHEEW MSQHGRVYAD EQEDHKNKRF61 NVFKENVERI EEFNDGKTFK LAINQFADLT NEEFRASYNG FKGPMVLSSQ ITKPTPFRYE121 NVSSALPVSV DWRKKGAVTP VKNQGQCGCC WAFSAVAAIE GITQISTGKL ISLSEQELVD181 CDTKGIDQGC EGGLMDTAFE FIINNGGLTT ESNYPYKGED GTCNFNKTNP IAVSITGYED241 VPANDEQALM KAVANQPVSV AIEAGGSDFQ FYSSGVFTGE CGTELDHGVT AVGYGESEDG301 SKYWIVKNSW GTKWGESGYI EMQKDIKAKE GLCGIAMQAS YPTA實施例3表達(dá)載體的構(gòu)建1根據(jù)編碼棉花半胱氨酸蛋白酶基因Ghcysp序列，設(shè)計以下PCR引物正向引物5’AAAACC CCA CTT CAA AAC CC 3’反向引物5’GCA CAC GAT TCA TTC ATAAC 3’以衰老葉片的cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物。2取2μl PCR產(chǎn)物與pGEM-T Vector進(jìn)行連接，方法按照Promega產(chǎn)品的說明進(jìn)行，連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化DH5α細(xì)菌(購自上海生工生物工程公司)，轉(zhuǎn)化菌在LB/ampicillin/IPTG/-Gal固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，37℃倒置培養(yǎng)12-20小時，有的菌落為白色，有的變?yōu)樗{(lán)色。選取白色菌落，提取質(zhì)粒DNA，進(jìn)行酶切和PCR鑒定。
3利用限制性內(nèi)切酶將該片段切下，反向插入植物表達(dá)載體pBI121中35S啟動子下游，將構(gòu)建的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404(promeag公司)中。
實施例4轉(zhuǎn)基因擬南芥的獲得1將擬南芥種子用70％乙醇浸泡5分鐘，無菌水飄洗兩遍，再用2.6％次氯酸鈉浸泡10分鐘，用無菌水飄洗四遍后，最后將種子灑在GM培養(yǎng)基上(1/2MS，1×B5Vitamins，1％蔗糖，0.8％瓊脂，PH5.8，4℃下春化處理48小時。
2將含有已春化處理種子的平板轉(zhuǎn)移到光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。條件為24℃，15hr光照/9hr黑暗，70-100microeinsteins/m2/sec light intensity。種子在三天后發(fā)芽，開花后進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
3利用滲透法轉(zhuǎn)化擬南芥，收獲轉(zhuǎn)化擬南芥的種子，在含有卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，將篩選到的抗性苗進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗證，選擇純合的T3代植株，與野生型擬南芥相比較，轉(zhuǎn)基因擬南芥的衰老延遲9-10天。
棉花半胱氨酸蛋白酶基因Ghcysp序列表<110>中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所<120>編碼棉花半胱氨酸蛋白酶基因及其應(yīng)用<130>1<160>2<170>Patent In Version 3.1<210>1<211>1368<212>DNA<213>棉花<Gossypium hirsutum>
<220>1<221>CDS<222>(99)..(1133)<223>
<220>
<221>5’UTR<222>(1)..(98)<223>
<221>3’UTR<235>(1133)..(1368)<235>
<400>11 ATTACCAATACACATCAAACTTTTTCACTATAAAACCCCACTTCAAAACCCTTTTGGAGT61 AATCAAATTAGGATCTAATCCTTCAACTTTCTAAACCAATGGCTTTGCTGCAAATTTTTCM A L L Q I F L121 TCTTCGTTGCTCTGGTTCTATCATTCTGTTTTTCCATCCAACTTGCTGGACTGTCTCGTCF V A L V L S F C F S I Q L A G L S R P181 CACTCTTGGATGAAGACTCCATGAGGCATGAGGAGTGGATGAGTCAACATGGCCGTGTTTL L D E D S M R H E E W M S Q H G R V Y241 ACGCGGATGAGCAGGAGGACCATAAGAACAAGCGCTTCAATGTGTTTAAAGAGAACGTCGA D E Q E D H K N K R F N V F K E N V E301 AACGAATTGAAGAGTTTAATGACGGAAAAACTTTCAAACTTGCGATAAATCAGTTTGCTGR I E E F N D G K T F K L A I N Q F A D361 ACTTAACCAATGAGGAATTTCGTGCCAGTTACAATGGTTTCAAAGGTCCCATGGTATTATL T N E E F R A S Y N G F K G P M V L S421 CTAGTCAAATAACTAAACCGACGCCGTTTAGGTACGAAAACGTTTCTTCTGCTTTGCCTGS Q I T K P T P F R Y E N V S S A L P V481 TTTCAGTTGATTGGAGGAAGAAAGGAGCTGTTACTCCTGTTAAAAATCAAGGCCAATGCGS V D W R K K G A V T P V K N Q G Q C G541 GATGTTGTTGGGCGTTTTCAGCGGTTGCGGCTATTGAAGGTATTACTCAAATTAGTACTG
C C W A F S A V A A I E G I T Q I S T G601 GGAAACTTATATCTTTGTCAGAACAAGAGCTTGTTGATTGCGACACAAAGGGTATTGACCK L I S L S E Q E L V D C D T K G I D H661 ATGGCTGCGAAGGCGGTTTAATGGATACTGCGTTTGAGTTTATTATTAACAATGGCGGCTG C E G G L M D T A F E F I I N N G G L721 TGACAACTGAGTCAAATTATCCTTACAAAGGCGAAGATGGAACTTGCAACTTTAACAAGAT T E S N Y P Y K G E D G T C N F N K T781 CCAATCCAATTGCTGTGTCTATTACAGGTTATGAGGATGTCCCGGCTAATGATGAGCAAGN P I A V S I T G Y E D V P A N D E Q A841 CACTGATGAAGGCAGTGGCACACCAACCGGTTAGCGTTGCTATTGAAGCGGGTGGTAGTGL M K A V A H Q P V S V A I E A G G S D901 ATTTCCAATTCTATTCGTCTGGTGTGTTCACTGGAGAGTGCGGAACGGAACTTGATCATGF Q F Y S S G V F T G E C G T E L D H A961 CAGTTACTGCTGTCGGATACGGCGAATCTGAAGACGGATCAAAGTATTGGATCGTTAAGAV T A V G Y G E S E D G S K Y W I V K N1021 ATTCATGGGGAACAAAATGGGGAGAAAGTGGATATATTGAAATGCAAAAAGATATCAAGGS W G T K W G E S G Y I E M Q K D I K V1081 TTAAACAAGGACTATGTGGTATTGCCATGCAAGCTTCTTACCCAACTGCTTAACGGTTCAK Q G L C G I A M Q A S Y P T A *1141 GTAATATGCGATGTAATGCAAAAGATTTCAAAACCGTGTTAATGTATTTAGTAAGCTTAT1201 GAGGATTGATTGTAATGTAATGCTTCATGGTGTGTATTATCCTATGTATGCATCTCCTAA1261 ATCACAAAGAAATAATATAGACCGACCCGCAATAGGTGCATGTCGGTTGGCGCTGTATGC1321 TACTGTTATGAATGAATCGTGTGCTTTTACAAAAAAAAAAAAAAAAAA<210>2<211>344<212>PRT<213>棉花<Gossypium hirsutuum>
<400>21 MALLQIFLFV ALVLSFCFSI QLAGLSRPLL DEDSMRHEEW MSQHGRVYAD EQEDHKNKRF61 NVFKENVERI EEFNDGKTFK LAINQFADLT NEEFRASYNG FKGPMVLSSQ ITKPTPFRYE121 NVSSALPVSV DWRKKGAVTP VKNQGQCGCC WAFSAVAAIE GITQISTGKL ISLSEQELVD181 CDTKGIDQGC EGGLMDTAFE FIINNGGLTT ESNYPYKGED GTCNFNKTNP IAVSITGYED241 VPANDEQALM KAVANQPVSV AIEAGGSDFQ FYSSGVFTGE CGTELDHGVT AVGYGESEDG301 SKYWIVKNSW GTKWGESGYI EMQKDIKAKE GLCGIAMQAS YP
權(quán)利要求
1.一種編碼半胱氨酸蛋白酶的核酸，其具有(a)序列SEQ ID No.1；(b)基于密碼子的兼并性與(a)編碼相同蛋白酶的序列；或(c)與(a)的同源性大于65.4％的核酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的核酸，其特征在于來自棉花。
3.一種由權(quán)利要求1核酸編碼的半胱氨酸蛋白酶，其特征在于具有如下序列a)氨基酸序列SEQ ID No.2；或b)與SEQ ID No.2具有至少82％同源性的氨基酸序列。
4.一種克隆棉花半胱氨酸蛋白酶基因的方法，包括步驟(a)根據(jù)編碼棉花半胱氨酸蛋白酶的基因，設(shè)計引物；正向引物5’AAA ACC CCA CTT CAA AAC CC 3’反向引物5’GCA CAC GAT TCA TTC ATA AC 3’(b)以棉花衰老葉片的cDNA為模板，利用(a)中的引物對進(jìn)行RT-PCR；(c)將PCR產(chǎn)物與載體連接并轉(zhuǎn)化DH5α細(xì)菌，倒置培養(yǎng)，選取白色菌落，提取質(zhì)粒DNA；(d)酶切和PCR鑒定，獲得棉花半胱氨酸蛋白酶基因。
5.一種延緩植物早衰的方法，包括步驟(a)利用半胱氨酸蛋白酶基因，構(gòu)建反義表達(dá)載體；(b)將表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌；(c)利用(b)中獲得的轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)化植物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5延緩植物早衰的方法，其中的半胱氨酸蛋白酶基因具有序列(a)序列SEQ ID No.1；(b)基于密碼子的兼并性與(a)編碼相同蛋白酶的序列；或(c)與(a)的同源性大于65.4％的核酸序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6的延緩植物早衰的方法，其特征在于其中的植物為棉花、小麥或玉米。
8.權(quán)利要求1或2的編碼半胱氨酸蛋白酶的核酸在延緩植物早衰中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的核酸在延緩植物早衰中的應(yīng)用，其特征在所述的植物為棉花、小麥或玉米。
全文摘要
本發(fā)明涉及棉花半胱氨酸蛋白酶基因的克隆、重組及功能分析，屬于分子生物學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域。以棉花衰老葉片的cDNA為模板，根據(jù)其它植物中已經(jīng)克隆半胱氨酸蛋白酶基因中氨基酸的保守序列，設(shè)計兼并引物，進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)，將擴(kuò)增的DNA片段回收后，與pGEM－T載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，篩選重組子，進(jìn)行序列分析。然后進(jìn)行3′和5′末端快速擴(kuò)增獲得全長cDNA，進(jìn)一步，構(gòu)建反義表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化擬南芥。與野生型相比較，轉(zhuǎn)基因擬南芥的衰老延緩。因此，該基因可以轉(zhuǎn)入棉花、小麥和玉米等農(nóng)作物中，以克服這些農(nóng)作物早衰的現(xiàn)象，提高農(nóng)作物的產(chǎn)量和品質(zhì)，具有重要的應(yīng)用前景。
文檔編號C12N15/29GK1760364SQ20041000965
公開日2006年4月19日 申請日期2004年10月12日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月12日
發(fā)明者喻樹迅, 沈法富 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所