專利名稱：一種細(xì)胞－材料單元的三維受控堆積成形方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種細(xì)胞-材料單元的三維受控堆積成形制造組織器官雛形的工藝方法，屬于組織工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
人體病損組織與器官的修復(fù)與替代是二十一世紀(jì)令人矚目的科學(xué)前沿。為了解決這一科學(xué)難題，組織工程技術(shù)在二十世紀(jì)八十年代中期誕生了，它的本質(zhì)在于將活的細(xì)胞通過(guò)某種方式與基質(zhì)材料或支架結(jié)合起來(lái)制造新的組織。經(jīng)過(guò)二十年左右的發(fā)展，組織工程在支架、細(xì)胞、生長(zhǎng)因子、構(gòu)建技術(shù)、生物學(xué)評(píng)價(jià)、檢測(cè)技術(shù)與標(biāo)準(zhǔn)、臨床實(shí)驗(yàn)和產(chǎn)業(yè)化等方面取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步。但是，在構(gòu)建技術(shù)方面，細(xì)胞與基質(zhì)材料或支架的復(fù)合方法通常是采用細(xì)胞懸液浸泡或者注射裝置灌注等方法。這些方法在構(gòu)建具有復(fù)雜的功能梯度結(jié)構(gòu)的組織和器官時(shí)，存在以下缺陷一是對(duì)于比較厚的組織工程支架，細(xì)胞的遷入和繁殖不是特別的理想，血管的長(zhǎng)入受到限制；二是不能將不同的細(xì)胞在空間準(zhǔn)確定位與定點(diǎn)放置，滿足構(gòu)建組織器官的功能梯度結(jié)構(gòu)的需求，然而在復(fù)雜組織器官的人工制造過(guò)程中，必須將不同細(xì)胞和材料堆積到空間指定位置并為它們之間相互作用創(chuàng)造條件。對(duì)于細(xì)胞-材料的堆積成形，必須滿足如下條件①細(xì)胞-材料混合物在成形之前呈現(xiàn)一定的流動(dòng)性，便于擠壓和噴射；②噴射到指定位置后，細(xì)胞-材料的混合物能夠迅速的改變狀態(tài)，使其保持一定的形狀，具有一定的強(qiáng)度；③材料在擠壓、噴射之前和堆積成形之后都必須保持適合細(xì)胞生存的含大量水分、便于營(yíng)養(yǎng)和代謝產(chǎn)物交換過(guò)程的環(huán)境。
中國(guó)發(fā)明專利(申請(qǐng)?zhí)?0124985.1)公開(kāi)了一種“無(wú)加熱液化過(guò)程的擠壓、噴射成形工藝方法”，該方法無(wú)法在細(xì)胞-材料的堆積成形中應(yīng)用。該方法是將材料經(jīng)過(guò)擠壓、噴射后，通過(guò)溶劑揮發(fā)、水分蒸發(fā)、同點(diǎn)或不同點(diǎn)噴射固化劑、粘接劑固化和氫鍵結(jié)合等五種方法使液態(tài)的材料固化。所謂固化，材料中就不能包含大量游離的水分，因此這種固化后的環(huán)境不適合細(xì)胞的生存。
楊洪義，陳立峰和劉海霞等發(fā)表于《電加工與模具》2004年第1期的文章“RP技術(shù)新進(jìn)展細(xì)胞打印的初步研究”，雖然提出了一種細(xì)胞-材料單元的堆積成形工藝方法，但是該方法在材料制備的過(guò)程中，將細(xì)胞與凝膠混合后，進(jìn)行擠壓和堆積，擠出后的細(xì)胞-凝膠材料通過(guò)固化成形。這種方法同樣基于材料固化的成形機(jī)理，固化后的環(huán)境同樣不適合細(xì)胞的生存發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服傳統(tǒng)的組織工程中的組織器官構(gòu)建方式，提供一種細(xì)胞-材料單元的三維受控堆積成形工藝方法，該方法在現(xiàn)有的計(jì)算機(jī)控制下的三維快速成形技術(shù)的基礎(chǔ)上，基于材料在擠壓、噴射之后的溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞-材料的受控堆積成形。使成形前的細(xì)胞生存在材料溶液環(huán)境中，成形后的細(xì)胞生活在含有大量水分的水凝膠環(huán)境中，保證在堆積成形之前和堆積成形之后細(xì)胞生存的適合環(huán)境，便于細(xì)胞的增殖與分化，同時(shí)成形后的結(jié)構(gòu)體又具有一定的結(jié)構(gòu)和強(qiáng)度，實(shí)現(xiàn)一種或多種細(xì)胞在三維空間的準(zhǔn)確定位與裝配堆積，構(gòu)建組織器官雛形。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下一種細(xì)胞-材料單元的三維受控堆積成形方法，其特征在于該方法按如下步驟進(jìn)行1)將離子濃度敏感材料和一種或多種促進(jìn)細(xì)胞黏附生長(zhǎng)的生物可降解材料制備成水溶液，濃度為10～100g/L，其中的離子濃度敏感材料與促進(jìn)細(xì)胞黏附生長(zhǎng)的生物可降解材料的質(zhì)量比為1∶0.5～10，將所述溶液滅菌備用；2)選定一種或多種細(xì)胞，分別與滅菌后的溶液混合均勻，制備成細(xì)胞-材料溶液的混合物；根據(jù)預(yù)先設(shè)計(jì)的結(jié)構(gòu)和定義規(guī)劃的路徑，在計(jì)算機(jī)的控制下，將所述的各種細(xì)胞-材料溶液的混合物分別通過(guò)不同的噴頭擠壓或噴射出來(lái)，形成離散的微滴、微片、微段或連續(xù)的微流狀細(xì)胞-材料單元，堆積到空間指定位置；3)在堆積過(guò)程中，細(xì)胞-材料單元在有觸發(fā)離子存在的條件下，迅速發(fā)生溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變，形成具有一定的形態(tài)和強(qiáng)度的細(xì)胞-材料凝膠；4).通過(guò)逐點(diǎn)逐層的堆積，得到由細(xì)胞-材料凝膠構(gòu)成的且與預(yù)先設(shè)計(jì)結(jié)構(gòu)一致的組織器官雛形。
本發(fā)明所述的離子濃度敏感材料為海藻酸鈉，觸發(fā)離子為Ca離子。所述的促進(jìn)細(xì)胞黏附生長(zhǎng)的生物可降解材料采用蛋白質(zhì)、多糖、糖蛋白、蛋白多糖、氨基酸或生長(zhǎng)因子。。
本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)及突出性效果1)本發(fā)明將離散/堆積成形原理應(yīng)用于細(xì)胞操作。離散堆積成形是一種在計(jì)算機(jī)驅(qū)動(dòng)控制下的高度柔性的先進(jìn)成形技術(shù)。將它與材料擠壓/噴射技術(shù)結(jié)合，能夠解決組織工程研究中具有復(fù)雜梯度結(jié)構(gòu)的組織器官構(gòu)建的難題。
2)將細(xì)胞等生物活體納入了工程技術(shù)可加工成形的材料范疇。本發(fā)明所采用的工藝方法可以對(duì)細(xì)胞等生物活體進(jìn)行裝配堆積成形而不損傷其活性。使成形前的細(xì)胞生存在材料溶液環(huán)境中，成形后的細(xì)胞生活在含有大量水分的水凝膠環(huán)境中，保證在堆積成形之前和堆積成形之后細(xì)胞生存的適合環(huán)境，便于細(xì)胞的增殖與分化，同時(shí)成形后的結(jié)構(gòu)體又具有一定的結(jié)構(gòu)和強(qiáng)度，實(shí)現(xiàn)一種或多種細(xì)胞在三維空間的準(zhǔn)確定位與裝配堆積，構(gòu)建組織器官雛形。通過(guò)這些生物活體的裝配成形，將工程制造的對(duì)象擴(kuò)大到生命體的范圍，是對(duì)傳統(tǒng)的工程制造概念的重要突破。


圖1為細(xì)胞-材料溶膠的擠壓/噴射堆積成形工藝流程示意圖。
圖2為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的工藝方法的設(shè)備結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實(shí)施例方式
圖1為本發(fā)明的工藝路線。將離子濃度敏感材料和一種或多種促進(jìn)細(xì)胞黏附生長(zhǎng)的生物可降解材料，在室溫下制備成濃度為10～100g/L的生物材料水溶液，其中的離子濃度敏感材料與促進(jìn)細(xì)胞黏附生長(zhǎng)的生物可降解材料的質(zhì)量比為1∶0.5～10，將所述溶液滅菌備用；所選擇的材料能夠溶解于水形成溶膠，具有特殊的離子濃度敏感特征，能夠在特定的離子的觸發(fā)下發(fā)生溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變，觸發(fā)條件要在細(xì)胞的生理?xiàng)l件之內(nèi)，在擠壓/噴射之前保持流動(dòng)態(tài)，在擠壓/噴射到目標(biāo)部位后迅速轉(zhuǎn)變?yōu)槟z態(tài)。
圖2為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的工藝方法的設(shè)備結(jié)構(gòu)示意圖。選定一種或多種細(xì)胞，分別與滅菌后的溶液混合均勻，制備成細(xì)胞-材料溶液的混合物；將這種混合物輸入擠壓/噴射堆積成形設(shè)備中，其結(jié)構(gòu)示意圖如圖2所示。整個(gè)裝置包括若干個(gè)擠壓噴射噴頭1、2、3，三維運(yùn)動(dòng)平臺(tái)4，噴射驅(qū)動(dòng)裝置5，成形空間和消毒裝置6；在計(jì)算機(jī)CAD模型直接驅(qū)動(dòng)下，通過(guò)控制各噴頭的掃描運(yùn)動(dòng)與擠壓噴射運(yùn)動(dòng)。根據(jù)預(yù)先設(shè)計(jì)的結(jié)構(gòu)和定義規(guī)劃的路徑，將上述細(xì)胞-材料溶膠的混合物通過(guò)不同的噴頭擠壓或噴射出來(lái)，形成細(xì)胞-材料單元(如微滴、微片、微段和微流等)，堆積到空間指定位置；在相應(yīng)的觸發(fā)條件下(在空間中充滿霧化的觸發(fā)劑或者噴射觸發(fā)劑)，堆積后的細(xì)胞-材料單元迅速發(fā)生溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變等，形成具有一定的形態(tài)和強(qiáng)度的細(xì)胞-材料凝膠。通過(guò)逐點(diǎn)逐層的堆積，得到具有一定的結(jié)構(gòu)的組織器官雛形。
3)在堆積過(guò)程中，細(xì)胞-材料單元在有觸發(fā)離子存在的條件下，迅速發(fā)生溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變，形成具有一定的形態(tài)和強(qiáng)度的細(xì)胞-材料凝膠；4).通過(guò)逐點(diǎn)逐層的堆積，得到由細(xì)胞-材料凝膠構(gòu)成的且與預(yù)先設(shè)計(jì)結(jié)構(gòu)一致的組織器官雛形。
實(shí)施例1通過(guò)該工藝方法制造的軟骨細(xì)胞-明膠-海藻酸鈣三維結(jié)構(gòu)。將海藻酸鈉和促進(jìn)細(xì)胞粘附生長(zhǎng)的明膠的混合物制備成水溶液，濃度為100g/L，其中海藻酸鈉和明膠的質(zhì)量比為1∶10，滅菌備用；將軟骨細(xì)胞與材料溶液混合均勻，得到軟骨細(xì)胞-明膠-海藻酸鈉溶液的混合物；制備10％的氯化鈣溶液的作為觸發(fā)劑并使之在成形空間內(nèi)霧化；根據(jù)預(yù)先設(shè)計(jì)的結(jié)構(gòu)和定義規(guī)劃的路徑，將上述混合物通過(guò)微滴噴射的方法噴射到充滿霧化觸發(fā)劑的常溫?zé)o菌成形室中；溶液在噴射到指定位置后，迅速發(fā)生溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變，形成軟骨細(xì)胞-明膠-海藻酸鈣凝膠；逐層堆積得到含軟骨細(xì)胞的三維結(jié)構(gòu)。
實(shí)施例2通過(guò)該工藝方法制造的肝細(xì)胞-明膠-肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子-海藻酸鈣三維結(jié)構(gòu)。將海藻酸鈉、促進(jìn)細(xì)胞粘附生長(zhǎng)的明膠和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子的混合物制備成水溶液，濃度為30g/L，其中海藻酸鈉∶(明膠+肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子)為1∶0.67(質(zhì)量比)，滅菌備用；將肝細(xì)胞與材料溶液混合均勻，得到肝細(xì)胞-明膠-肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子-海藻酸鈉溶液的混合物；制備5％的氯化鈣溶液作為觸發(fā)劑并輸入觸發(fā)劑噴頭；根據(jù)預(yù)先設(shè)計(jì)的結(jié)構(gòu)和定義規(guī)劃的路徑，將上述混合物通過(guò)微滴噴射的方法噴射到成形室中的指定位置，觸發(fā)劑噴頭在相同位置噴射氯化鈣溶液，使細(xì)胞-材料單元迅速發(fā)生溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變，形成肝細(xì)胞-明膠-肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子-海藻酸鈣凝膠；逐層堆積得到含肝細(xì)胞的三維結(jié)構(gòu)。
實(shí)施例3通過(guò)該工藝方法制造的肝細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞-明膠-海藻酸鈣三維結(jié)構(gòu)。將海藻酸鈉和促進(jìn)細(xì)胞粘附生長(zhǎng)的明膠的混合物制備成水溶液，濃度為10g/L，其中海藻酸鈉和明膠的質(zhì)量比為1∶0.5，滅菌備用；將肝細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞分別與與材料溶液混合均勻，得到兩種細(xì)胞-明膠-海藻酸鈉溶液的混合物；將兩種混合物分別輸入不同的噴頭；制備20％的氯化鈣溶液作為觸發(fā)劑輸入專用的觸發(fā)劑噴頭；根據(jù)預(yù)先設(shè)計(jì)的結(jié)構(gòu)和定義規(guī)劃的路徑，將上述混合物通過(guò)微滴噴射的方法噴射到制定位置后，觸發(fā)劑噴頭在相同的位置噴射氯化鈣溶液，細(xì)胞-材料溶液的混合物迅速發(fā)生溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變，形成細(xì)胞-明膠-海藻酸鈣凝膠；逐層堆積得到含有準(zhǔn)確定位的肝細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的三維結(jié)構(gòu)。
權(quán)利要求
1.一種細(xì)胞-材料單元的三維受控堆積成形方法，其特征在于該方法按如下步驟進(jìn)行1)將離子濃度敏感材料和一種或多種促進(jìn)細(xì)胞黏附生長(zhǎng)的生物可降解材料，制備成水溶液，濃度為10～100g/L，其中的離子濃度敏感材料與促進(jìn)細(xì)胞黏附生長(zhǎng)的生物可降解材料的質(zhì)量比為1∶0.5～10，將所述溶液滅菌備用；2)選定一種或多種細(xì)胞，分別與滅菌后的溶液混合均勻，制備成細(xì)胞-材料溶液的混合物；根據(jù)預(yù)先設(shè)計(jì)的結(jié)構(gòu)和定義規(guī)劃的路徑，在計(jì)算機(jī)的控制下，將所述各種細(xì)胞-材料溶液的混合物分別通過(guò)不同的噴頭擠壓或噴射出來(lái)，形成離散的微滴、微片、微段或連續(xù)的微流狀細(xì)胞-材料單元，堆積到空間指定位置；3)在堆積過(guò)程中，細(xì)胞-材料單元在有觸發(fā)離子存在的條件下，迅速發(fā)生溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變，形成具有一定的形態(tài)和強(qiáng)度的細(xì)胞-材料凝膠；4)通過(guò)逐點(diǎn)逐層的堆積，得到由細(xì)胞-材料凝膠構(gòu)成的且與預(yù)先設(shè)計(jì)結(jié)構(gòu)一致的組織器官雛形。
2.按照權(quán)利要求1所述的三維受控堆積成形方法，其特征在于所述的離子濃度敏感材料為海藻酸鈉，觸發(fā)離子為Ca離子。
3.按照權(quán)利要求1或2所述的三維受控堆積成形方法，其特征在于所述的促進(jìn)細(xì)胞黏附生長(zhǎng)的生物可降解材料采用蛋白質(zhì)、多糖、糖蛋白、蛋白多糖、氨基酸或生長(zhǎng)因子。
全文摘要
一種細(xì)胞—材料單元的三維受控堆積成形方法，該方法將離子濃度敏感材料和一種或多種促進(jìn)細(xì)胞黏附生長(zhǎng)的生物可降解材料制成水溶液，滅菌；然后選定一種或多種細(xì)胞，分別與滅菌的溶液混合，制成細(xì)胞—材料溶液的混合物；根據(jù)預(yù)先設(shè)計(jì)的結(jié)構(gòu)和路徑，將各種細(xì)胞—材料溶液的混合物分別通過(guò)不同的噴頭擠壓或噴射出來(lái)，形成細(xì)胞—材料單元，堆積到空間指定位置；在相應(yīng)的觸發(fā)條件下，形成一定形態(tài)和強(qiáng)度的細(xì)胞—材料凝膠；通過(guò)逐點(diǎn)逐層的堆積，得到具有一定的結(jié)構(gòu)的組織器官雛形。本發(fā)明基于快速成形制造的離散/堆積的基本原理，實(shí)現(xiàn)一種或多種細(xì)胞在三維空間的準(zhǔn)確定位與成形，對(duì)細(xì)胞等生物活體進(jìn)行裝配堆積成形而不損傷其活性，便于細(xì)胞的增殖與分化。
文檔編號(hào)C12N11/04GK1609210SQ20041000978
公開(kāi)日2005年4月27日 申請(qǐng)日期2004年11月12日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月12日
發(fā)明者顏永年, 熊卓, 王小紅, 林峰, 吳任東, 張人佶, 盧清萍 申請(qǐng)人:清華大學(xué)