專利名稱：一個與精神分裂癥密切相關(guān)聯(lián)的易感基因位點的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一個與精神分裂癥有顯著關(guān)聯(lián)的易感基因位點。
背景技術(shù)：
精神分裂癥是最嚴(yán)重的精神疾病之一。在我國，精神分裂癥的終身患病率高達(dá)0.7％。這樣大的患病群體，不僅給家庭和社會帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，而且還嚴(yán)重威脅社會的安全與穩(wěn)定。因此，確定精神分裂癥的病因，建立有效地防治方法，已成為醫(yī)學(xué)界乃至整個社會需迫切解決的問題。精神分裂癥與遺傳因素有密切關(guān)系，且歸類于多基因遺傳病。人類基因組系統(tǒng)掃描發(fā)現(xiàn)，除19號、21號和Y染色體外，其余染色體上都可能含有精神分裂癥易感基因。利用連鎖和關(guān)聯(lián)方法定位精神分裂癥的易感基因已成為分子遺傳學(xué)研究的熱點。Pulver等最早報道22q區(qū)域可能存在精神分裂癥易感基因(Pulver AE，et al.Am J MedGenet，1994，5436-43)。腭-心-面綜合征(velo-cardio-facial syndrome，VCFS)也使研究者們注意到第22號染色體與精神疾病的聯(lián)系(Pulver AE，et al.J Nerv MentDis，1994，182476-478)。但至今在該染色體區(qū)域內(nèi)未發(fā)現(xiàn)確定特異的與精神分裂癥有關(guān)的易感基因。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是在第22號染色體區(qū)域內(nèi)揭示與精神分裂癥密切相關(guān)聯(lián)的易感基因位點；目的之二是通過該易感基因位點遺傳特性提出一種判定精神分裂癥的易感人群的方法，以利于指導(dǎo)精神分裂癥的預(yù)防和治療。
本研究結(jié)果表明UFD1L/CDC45L是精神分裂癥的易感基因位點。是含有三個單核苷酸多態(tài)性的序列長度為69987bp的UFD1L/CDC45L位點，由于該位點的單核苷酸多態(tài)性rs1547931堿基C突變?yōu)镚，從而與精神分裂癥的易感性相關(guān)聯(lián)。UFD1L/CDC45L位點位于22q11.2染色體區(qū)域，編碼泛有素融合降解1型蛋白和細(xì)胞周期啟動蛋白。泛有素融合降解1型蛋白在胎兒期及產(chǎn)后期大量表達(dá)，原位雜交表明其在鼠腦內(nèi)表達(dá)，并與能形成海馬的內(nèi)側(cè)終腦有顯著親和性，泛有素融合降解1型蛋白通常在神經(jīng)嵴細(xì)胞中表達(dá)，這些神經(jīng)嵴細(xì)胞可形成心臟、支氣管弓、咽囊、腭面骨、胸腺和甲狀旁腺。細(xì)胞周期啟動蛋白在真核細(xì)胞中啟動DNA的復(fù)制。
本發(fā)明在22q11區(qū)通過連鎖不平衡分析方法進(jìn)行單個核苷酸多態(tài)性(SNPs)連鎖不平衡制圖分析，通過NCBI(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/mapviewer)數(shù)據(jù)庫，獲得22q11內(nèi)所有侯選基因，并獲得UFD1L/CDC45L位點序列。通過http//www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP及http//snp.cshl.org/數(shù)據(jù)庫，在UFD1L/CDC45L位點上選擇含有限制性酶切位點的單核苷酸多態(tài)性rs1547931、rs2238769和rs2073732。下列所示為這三個單核苷酸多態(tài)性的核苷酸序列。三個加黑部分分別為引物序列，三個方框內(nèi)是發(fā)生互換的堿基，劃線處則分別是PstI和RsaI限制性內(nèi)切酶識別的酶切位點，箭頭所示內(nèi)切酶的切割部位。具體信息如下。
SNP1rs2238769，Gene bank accession numberAC000087，Base changeC/G8161 acttgagggt gaaagggtga ggctatctag gttcacctcg cttggtcaaa cagctttcca8221 gaaccagagc aactttgtga aaagcgcctt atgtggtgga tgctttcttt gctcccaaat 8341 tcttctctga cttccactgc agcagctgga ggagcagagc cagagccctc aggctgagaa8401 cacgaggcct ctgcaggcag ggcgggctcc ccatatggcc tctgcgtact ctggcacctgSNP2rs1547931，Gene bank accession numberAC000087，Base changeC/G15121 tgagagtagc atggaggtac agtaagggtg ggcactccct cctatcacca agggtgactc 15241 atggagctga catacagctg gtccacagta aactggactg ggctcagcca agggtctgag15301 attgttgcaa gtgaaagaga ctccaatgtc cctcagtcca ctgactctca aactgcattt15361 tgtgacttag aggctcccag tgccctgggg ctcccagtcc ctctgtaccc cctcactttcSNP3rs2073732，Gene bank accession numberAC000088，Base changeC/T21061 catgtcttgt gtgtcagcag cttttttggg agggcgtttg agaaggcagc ggaaagcacc21121 agctcccgga tgctgcacaa ccattttgac ctctcaggtg agagtctcct gccactctgc 21241 tggctggagg agcctggcca gcagccctct tgaccttcca gatctggccc tgggacaggc21301 tactcctggt ggctcaggga gctctggtga acctcaggcc cctgagaggg aaaaagtgtt以中國東北地區(qū)226個漢族精神分裂癥患者和他們健康父母雙親組成的核心家系(Trios)為研究對象?；颊呔?000-2002年間入院，按國際疾病分類標(biāo)準(zhǔn)第10版(ICD-10)被診斷為精神分裂癥。這種基于家系的研究，系以父母雙親傳遞給患病子女的等位基因為“病例”，以未傳遞的等位基因為“對照”。因病例與對照等位基因均來自同樣的基因池，可避免人群層化問題。
家系成員均由外周靜脈抽取抗凝血5ml，用星普液體微量DNA提取試劑盒(寧波)提取基因組DNA。步驟如下①取血樣100μl，加入到1.5ml離心管中，然后加入100ul的1×TE緩沖液，搖勻；②一邊振蕩，一邊加入200μl的B1試劑，充分混勻；③在振蕩中加入200μl的B2試劑，充分混勻；④將混合溶液移入旋轉(zhuǎn)離心柱中離心(14000rpm，分鐘)；⑤向旋轉(zhuǎn)離心柱中加入400μl的B3試劑后離心(14000rpm，1分鐘)；⑥重復(fù)上述步驟；⑦空柱離心(14000rpm，2分鐘)，將旋轉(zhuǎn)離心柱移入干凈的1.5ml離心管中，加入100μl的B4試劑離心(14000rpm，1分鐘)；此時離心管中的溶液體積為100μl，含有已經(jīng)提取的基因組DNA。使用美國BECKMAN公司生產(chǎn)的型號為Du640紫外分光光度儀，分別取波長260nm、280nm兩個波段，測得其相應(yīng)DNA的OD260nm及OD280nm值，然后再通過公式，計算出DNA含量，公式為DNA含量＝50mg/ml×OD260nm×稀釋倍數(shù)，另外通過公式計算出DNA純度，公式為DNA純度＝OD260nm/OD280nm。
依據(jù)相應(yīng)的堿基序列合成三對引物。rs2238769為TATCTAGGTTCACCTCGCTTGG和TCGTGTTCTCAGCCTGAGGG。rs1547931為GAGGTACAGTAAGGGTGGGC和GCACTGGGAGCCTCTAAGTC。rs2073732為AAGGCAGCGGAAAGCACCAG和GTTCACCAGAGCTCCCTGAG。PCR反應(yīng)體系為20μl，其中含10mM Tris-HCl(pH8.3)，50mM KCl，1.5mM MgCl2，0.001％(w/v)gelatin，200μM of each dNTP，上下游引物各0.4μM，Taq DNA聚合酶(Promega)1.0U，DNA模板30-50ng。PCR擴(kuò)增條件為①94℃ 5min②96℃ 30s，62℃ 60s，72℃ 35s 2個循環(huán)；③95℃ 30s，60℃ 60s，72℃ 35s 6個循環(huán)；④94℃ 55s，56℃～58℃ 60s，72℃ 35s 28個循環(huán)；⑤72℃ 10min。取PCR產(chǎn)物5μl用1.5％瓊脂糖凝膠電泳，以DNA marker DL2000為分子量標(biāo)準(zhǔn)品。所擴(kuò)增的片段長度分別為222bp(8184～8405)、250bp(15134～15381)和230bp(21103～21332)。
在PCR擴(kuò)增后的反應(yīng)體系中，加入適量相對應(yīng)的限制性內(nèi)切酶及其酶切緩沖液，置37℃溫箱5小時。經(jīng)2.5％瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)酶切圖譜判斷基因型。存在3種基因型，其中有完全切開的純合基因型，未切開的純合基因型，既有切開又有未切開的雜合基因型。
建立Pedigree和SPSS SNP基因分型數(shù)據(jù)庫(參見表1和表2)，應(yīng)用擬合優(yōu)度卡方檢驗和傳遞不平衡檢驗，應(yīng)用UNPHASED分析軟件進(jìn)行單倍體傳遞卡方檢驗，利用SPSS軟件管理數(shù)據(jù)。
表1 Pedigree數(shù)據(jù)庫格式Number 病人 父親 母親 性別 狀態(tài) PstI RsaIABC41 2 312 1/12/2ABC42 0 011 1/22/2ABC43 0 021 1/11/2ABC91 2 322 1/11/2ABC92 0 011 1/21/2ABC93 0 021 1/11/2ABC11 1 2 322 1/22/2ABC11 2 0 011 2/22/2ABC11 3 0 021 1/12/2
表2 SPSS數(shù)據(jù)庫格式 傳遞不平衡檢驗(Transmitted disequilibrium test，TDT)顯示在所有被檢測的SNPs當(dāng)中，只有rs1547931與精神分裂癥顯著關(guān)聯(lián)(x2＝11.072，P＝0.001)。在226個家系452個父母中，167個為雜合子，而這些雜合父母分別將62個C等位基因和105個G等位基因傳遞給患病子女(見表3)。由于G等位基因傳遞過多，說明含G等位基因的單倍體或染色體可能攜帶決定精神分裂癥易感性的突變位點。
表3 UFD1L/CDC45L位點與精神分裂癥的關(guān)系等位基因 傳遞等位基因限制性SNPs主等位 次等位主等位次等位P內(nèi)切酶基因基因 基因 基因Rs2238769 RsaIC G 108 870.133Rs1547931 PstIG C 105 620.001Rs2073732 PstIC T 107 850.112單倍體傳遞卡方檢驗(Haplotype transmission chi-square test)顯示有兩種單倍體系統(tǒng)與精神分裂癥密切相關(guān)聯(lián)，它們分別是rs2238769-rs1547931和rs1547931-rs2073732單倍體系統(tǒng)(見表4)。單倍體可以是一條染色體或一段染色體。故此結(jié)果進(jìn)一步說明UFD1L/CDC45L位點rs2238769和rs2073732之間的染色體區(qū)域存在決定精神分裂癥易感性的突變位點。
表4 單倍體傳遞卡方檢驗結(jié)果單倍體 x2dfPRs2238769-rs1547931 19.8 30.00018Rs1547931-rs2073732 23.0 30.00004
根據(jù)本發(fā)明由UFD1L/CDC45L基因位點堿基突變特性判定精神分裂癥的易感人群的方法，可對未表現(xiàn)精神分裂癥臨床癥狀的人群進(jìn)行如下所示方法的篩查，rs1547931堿基為G的個體為精神分裂癥的易感人群。rs1547931堿基為C的個體不易發(fā)生精神分裂癥。對精神分裂癥易感人群在日常生活中應(yīng)盡量減少誘發(fā)因素，如環(huán)境因素的刺激，可降低精神分裂癥的發(fā)病率。這是本發(fā)明的一個重要用途。
根據(jù)本發(fā)明，對精神分裂癥的患者可采用如基因敲除等基因工程方法針對性進(jìn)行基因治療。另外，疾病基因的存在有可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)與功能的缺損或改變，阻礙或干擾特定生化通路中生物大分子的相互作用。正因為UFD1L/CDC45L位點的堿基突變，可能造成蛋白質(zhì)表達(dá)及功能異常。本發(fā)明為進(jìn)一步檢測蛋白功能，開發(fā)新型治療藥物，開展基于遺傳學(xué)背景的個體化藥物治療奠定了十分重要的基礎(chǔ)，并將帶來十分可觀的社會與經(jīng)濟(jì)效益。
具體實施例方式
通過提取受試者基因組DNA進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性rs1547931的基因型分析，其rs1547931堿基為G的個體為精神分裂癥的易感人群。
1.基因組DNA提取受試者均由外周靜脈抽取抗凝血5ml，用星普液體微量DNA提取試劑盒(寧波)提取基因組DNA。步驟如下①取血樣100μl，加入到1.5ml離心管中，然后加入100ul的1×TE緩沖液，搖勻；②一邊振蕩，一邊加入200μl的B1試劑，充分混勻；③在振蕩中加入200μl的B2試劑，充分混勻；④將混合溶液移入旋轉(zhuǎn)離心柱中離心(14000rpm，分鐘)；⑤向旋轉(zhuǎn)離心柱中加入400μl的B3試劑后離心(14000rpm，1分鐘)；⑥重復(fù)上述步驟；⑦空柱離心(14000rpm，2分鐘)，將旋轉(zhuǎn)離心柱移入干凈的1.5ml離心管中，加入100μl的B4試劑離心(14000rpm，1分鐘)；此時離心管中的溶液體積為100μl，含有已經(jīng)提取的基因組DNA。使用美國BECKMAN公司生產(chǎn)的型號為Du640紫外分光光度儀，分別取波長260nm、280nm兩個波段，測得其相應(yīng)DNA的OD260nm及OD280nm值，然后再通過公式，計算出DNA含量，公式為DNA含量＝50mg/ml×OD260nm×稀釋倍數(shù)，另外通過公式計算出DNA純度，公式為DNA純度＝OD260nm/OD280nm。
2.PCR擴(kuò)增目的片段應(yīng)用以下引物序列GAGGTACAGTAAGGGTGGGC和GCACTGGGAGCCTCTAAGTC進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為20μl，其中含10mM Tris-HCl(pH8.3)，50mM KCl，1.5mM MgCl2，0.001％(w/v)gelatin，200μM of dNTP，上下游引物各0.4μM，Taq DNA聚合酶(Promega)1.0U，DNA模板30-50ng。PCR擴(kuò)增條件為①94℃ 5min②96℃ 30s，62℃ 60s，72℃ 35s 2個循環(huán)；③95℃ 30s，60℃ 60s，72℃ 35s 6個循環(huán)；④94℃ 55s，56℃～58℃ 60s，72℃ 35s 28個循環(huán)；⑤72℃ 10min。取PCR產(chǎn)物5μl用1.5％瓊脂糖凝膠電泳，以DNA marker DL2000為分子量標(biāo)準(zhǔn)品。所擴(kuò)增的片段長度為250bp(15134～15381)
3.限制性內(nèi)切酶酶切鑒定基因型酶切的反應(yīng)體系為20μl，其中，10μl PCR產(chǎn)物，限制性內(nèi)切酶PstI 0.8μl，酶切緩沖液2μl，BSA 0.2μl。置37℃溫箱5小時。經(jīng)2.5％瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)酶切圖譜判斷基因型。存在3種基因型，其中有完全切開的純合基因型(G/G)，未切開的純合基因型(C/C)，既有切開又有未切開的雜合基因型(C/G)。
4.結(jié)果判定rs1547931堿基為G的個體為精神分裂癥的易感人群。rs1547931堿基為C的個體不易發(fā)生精神分裂癥。
權(quán)利要求
1.一個與精神分裂癥密切相關(guān)聯(lián)的易感基因位點，是含有三個單核苷酸多態(tài)性的序列長度為69987bp的UFD1L/CDC45L位點，由于該位點的單核苷酸多態(tài)性rs1547931堿基C突變?yōu)镚，從而與精神分裂癥的易感性相關(guān)聯(lián)。
2.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的UFD1L/CDC45L基因位點堿基突變特性判定精神分裂癥的易感人群的方法，其特征是通過提取受試者基因組DNA進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性rs1547931的基因型分析，其rs1547931堿基為G的個體為精神分裂癥的易感人群，具體作法是(1)基因組DNA提取，用微量DNA提取試劑盒提取基因組DNA，(2)PCR擴(kuò)增目的片段，引物序列為GAGGTACAGTAAGGGTGGGC和GCACTGGGAGCCTCTAAGTC，(3)限制性內(nèi)切酶酶切鑒定基因型，酶切的反應(yīng)體系為20μl，其中，10μl PCR產(chǎn)物，限制性內(nèi)切酶PstI 0.8μl，酶切緩沖液2μl，BSA 0.2μl，置37℃溫箱5小時，經(jīng)2.5％瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)酶切圖譜判斷基因型，(4)結(jié)果判定，rs1547931堿基為G的個體為精神分裂癥的易感人群，rs1547931堿基為C的個體不易發(fā)生精神分裂癥。
全文摘要
本發(fā)明提供一個與精神分裂癥的發(fā)生密切相關(guān)的易感基因位點，即含有三個單核苷酸多態(tài)性的序列長度為69987bp的UFD1L/CDC45L位點。由于該位點的單核苷酸多態(tài)性rs1547931堿基C突變?yōu)镚，從而與精神分裂癥的易感性相關(guān)聯(lián)。rs1547931堿基為G的個體為精神分裂癥的易感人群。UFD1L/CDC45L位點及其編碼蛋白對闡明精神分裂癥遺傳學(xué)機(jī)制及建立基因診斷方法，指導(dǎo)精神分裂癥預(yù)防、開發(fā)新型治療藥物具有重要作用。
文檔編號C12Q1/68GK1603421SQ200410010790
公開日2005年4月6日 申請日期2004年4月5日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月5日
發(fā)明者尉軍, 鞠桂芝, 謝林, 劉樹錚, 于雅琴, 史杰萍, 沈巖, 許琪 申請人:吉林大學(xué)