專利名稱：一種雙歧桿菌發(fā)酵用復(fù)合培養(yǎng)基及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種雙歧桿菌發(fā)酵用復(fù)合培養(yǎng)基，屬于食品及食品添加劑生產(chǎn)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
雙歧桿菌(Bifidobacterium)是一種人體腸道中重要的生理性細(xì)菌。關(guān)于雙歧桿菌的生理調(diào)節(jié)作用已被大量研究所證實(shí)。從20世紀(jì)70年代起，雙歧桿菌制品開始蓬勃發(fā)展，至今勢頭強(qiáng)勁。由于各種雙歧桿菌制品的生產(chǎn)離不開雙歧桿菌的培養(yǎng)，因此，研究雙歧桿菌的高效、廉價發(fā)酵培養(yǎng)基是生產(chǎn)雙歧桿菌制劑的關(guān)鍵問題。在現(xiàn)有技術(shù)中，雙歧桿菌培養(yǎng)基是以MRS培養(yǎng)基或改良MRS培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)雙歧桿菌效果較好，菌體生長繁殖快，菌體濃度可達(dá)到109/ml，但存在的問題是MRS培養(yǎng)基價格高，不適宜規(guī)模生產(chǎn)引用，這也是制約雙歧桿菌功能性制劑生產(chǎn)的主要因素。尋找一種價格低、培養(yǎng)時間短的雙歧桿菌的培養(yǎng)基成為業(yè)內(nèi)迫切需要解決的課題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種雙歧桿菌發(fā)酵用復(fù)合培養(yǎng)基，雙歧桿菌在其中生長良好，發(fā)酵液可直接用于生產(chǎn)功能性食品，從而實(shí)現(xiàn)了雙歧桿菌廉價、高效培養(yǎng)。
本發(fā)明的目的是基于以下構(gòu)思實(shí)現(xiàn)的。大量科學(xué)實(shí)驗(yàn)和生產(chǎn)實(shí)踐證明雙歧桿菌的培養(yǎng)需要較高的營養(yǎng)環(huán)境，這是在尋找適合雙歧桿菌生長的培養(yǎng)基時首先要考慮的因素，即培養(yǎng)基中應(yīng)含有較高的營養(yǎng)成分，此外，它應(yīng)該適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，特別是成本要低。本發(fā)明人經(jīng)過多年研究發(fā)現(xiàn)菊芋是比較合適的原料。菊芋(Jerusalem artichoke)，俗名洋姜，它分布廣，適應(yīng)性強(qiáng)，種植簡易，產(chǎn)量極高。菊芋淀粉是β2，1連接的多聚果糖淀粉對雙歧桿菌的生長具有選擇性生長優(yōu)勢。分析據(jù)測定表明，鮮菊芋莖中含79.8％，碳水化合物(菊粉)16.6％，蛋白質(zhì)1.0％，粗纖維0.6％，灰分2.8％及一定量的維生素，其中碳水化合物的78％為菊糖。研究表明，菊糖有許多生理功能，特別是能選擇性促進(jìn)雙歧桿菌的生長。迄今為止，我國對菊芋的開發(fā)還不能令人滿意，菊芋基本上還只是用于腌制咸菜。由此可見，菊芋是一種極具開發(fā)潛力的半野生資源。本發(fā)明是在大量有關(guān)基礎(chǔ)研究的基礎(chǔ)上，以菊芋得以綜合利用和雙歧桿菌制劑開發(fā)為目標(biāo)的系統(tǒng)研究，取得了突破性研究成果，為雙歧桿菌活菌制劑的生產(chǎn)研制出了一種高效、廉價的菊芋汁復(fù)合培養(yǎng)基，同時該培養(yǎng)基的使用也能進(jìn)一步推動菊芋資源的開發(fā)利用。
為了確定菊芋汁復(fù)合培養(yǎng)基的組成，發(fā)明人做了以下工作第一考察了雙歧桿菌在菊芋汁中的生長狀況。
為了設(shè)計(jì)以菊芋汁為主要原料的雙歧桿菌培養(yǎng)基，首先對雙歧桿菌在純菊芋汁中的生長進(jìn)行了系統(tǒng)研究。將Blr(長雙歧桿菌)、Bbm(兩歧雙歧桿菌)活化后，以0.1％接種量接種到菊芋汁中，37℃恒溫培養(yǎng)，定時取樣，進(jìn)行活菌數(shù)測定。結(jié)果為Blm(長雙歧桿菌)和Bbm(兩歧雙歧桿菌)在菊芋汁中能夠良好生長，在12h達(dá)到生長高峰。Blm(長雙歧桿菌)的最大生長量為2.360×108cfu/mL，Bbm(兩歧雙歧桿菌)的最大生長量為1.000×108cfu/mL。由于雙歧桿菌的生長對營養(yǎng)要求很高，上述結(jié)果表明菊芋汁中的營養(yǎng)成分比較適合雙歧桿菌生長，可以作為篩選優(yōu)化的初始培養(yǎng)基。Blm(長雙歧桿菌)和Bbm(兩歧雙歧桿菌)在菊芋汁中的生長曲線見附圖1。
第二考察了在菊芋汁中添加不同物質(zhì)對雙歧桿菌生長的影響。參考經(jīng)典雙歧桿菌培養(yǎng)基的配方，在菊芋汁中分別加入各種物質(zhì)成分，研究它們對菊芋汁的營養(yǎng)補(bǔ)充效果，為篩選優(yōu)化培養(yǎng)基做進(jìn)一步的準(zhǔn)備。將Blm(長雙歧桿菌)、Bbm(兩歧雙歧桿菌)活化后，以0.1％接種量分別接種到不同處理的菊芋汁中，37℃恒溫培養(yǎng)12h，取樣進(jìn)行活菌數(shù)測定。結(jié)果為在菊芋汁中添加胰蛋白胨、牛肉膏、玉米漿、半胱氨酸鹽酸鹽、大豆蛋白胨對Blm(長雙歧桿菌)、Bbm(兩歧雙歧桿菌)促進(jìn)生長作用極顯著。在菊芋汁中添加吐溫80、磷酸氫二鉀對Blm(長雙歧桿菌)、Bbm(兩歧雙歧桿菌)促進(jìn)生長作用顯著。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1和表2。
表1.Blm(長雙歧桿菌)在添加不同成分的菊芋汁中的生長狀況培養(yǎng)基 活菌數(shù)(cfu/mL) 方差分析(p)促進(jìn)作用JAJ 1.560×108JAJ+胰蛋白胨(1％) 4.039×108＜0.01 +JAJ+牛肉膏(1％) 5.559×108＜0.01 +JAJ+酵母膏(0.5％) 1.037×108＜0.05 -JAJ+葡萄糖(2％) 1.981×107＜0.01 -JAJ+吐溫80(0.1％) 2.482×108＜0.05 +JAJ+磷酸氫二鉀(0.2％) 2.641×108＜0.05 +JAJ+乙酸鈉(0.5％) 1.800×103＞0.05 +JAJ+檸檬酸銨(0.2％) 2.318×108＞0.05 +JAJ+硫酸鎂(0.02％) 1.512×108＞0.05 -JAJ+硫酸錳(0.02％) 2.182×108＞0.05 +JAJ+玉米漿(0.3％) 5.824×108＜0.01 +JAJ+Cys-HCl(0.05％) 5.249×108＜0.01 +JAJ+乳糖(1％) 1.181×107＜0.01 -JAJ+氯化鈉(0.2％) 1.794×108＞0.05 +JAJ+磷酸二氫鉀(0.1％) 1.206×108＞0.05 -JAJ+大豆蛋白胨(0.05％) 5.249×108＜0.01 +JAJ+可溶性淀粉(0.05％) 1.824×108＞0.05 +
表2.Bbm(兩歧雙歧桿菌)在添加不同成分的菊芋汁中的生長狀況培養(yǎng)基 活菌數(shù)(cfu/mL) 方差分析(p) 促進(jìn)作用JAJ 1.000×108JAJ+蛋白胨(1％) 3.539×108＜0.01 +JAJ+牛肉膏(1％) 4.580×108＜0.01 +JAJ+酵母膏(0.5％)6.590×107＜0.05 -JAJ+葡萄糖(2％) 2.680×107＜0.01 -JAJ+吐溫80(0.1％)2.620×108＜0.05 +JAJ+磷酸氫二鉀(0.2％)2.045×108＜0.05 +JAJ+乙酸鈉(0.5％)3.390×107＜0.05 -JAJ+檸檬酸銨(0.2％) 4.680×107＜0.05 -JAJ+硫酸鎂(0.02％) 2.110×108＞0.05 +JAJ+硫酸錳(0.02％) 2.900×107＜0.05 -JAJ+玉米漿(0.3％)5.003×108＜0.01 +JAJ+Cys-HCl(0.05％) 4.489×108＜0.01 +JAJ+乳糖(1％)1.270×107＜0.01 -JAJ+氯化鈉(0.2％)2.200×108＞0.05 +JAJ+磷酸二氫鉀(0.1％)9.520×107＞0.05 -JAJ+大豆蛋白胨(0.05％) 4.975×108＜0.01 +JAJ+可溶性淀粉(0.05％) 9.790×107＞0.05 -注“+”表示有促進(jìn)作用“-”表示有抑制作用。
第三篩選優(yōu)化菊芋汁復(fù)合培養(yǎng)基，采用正交試驗(yàn)法確定菊芋汁復(fù)合培養(yǎng)基的最佳配方組成。
綜合上述結(jié)果，并考慮到成本因素，確定將玉米漿、半胱氨酸鹽酸鹽和大豆蛋白胨這三種成分補(bǔ)充到菊芋汁中；在對三因素多水平的單因子試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)對菊芋汁復(fù)合培養(yǎng)基進(jìn)行篩選優(yōu)化。本試驗(yàn)采用L9(33)正交表.
首先選擇Blm(長雙歧桿菌)一個菌株作正交試驗(yàn)菌株。將Blm(長雙歧桿菌)活化后，以0.1％的接種量接種到各個培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)12h，進(jìn)行活菌數(shù)測定。結(jié)果為在參加試驗(yàn)的9個組合處理中，第5號組合是最優(yōu)組合，即A2B2C3。為了尋找理論上的最優(yōu)處理組合，根據(jù)數(shù)據(jù)分析結(jié)果作三個因素不同水平與試驗(yàn)指標(biāo)的關(guān)系圖，結(jié)果為A2、B2、C1分別是三個因素的最佳水平。三因素不同水平與試驗(yàn)指標(biāo)的關(guān)系見圖2所示。
在得到比較理想的培養(yǎng)基組成后，再用其它雙歧桿菌菌株進(jìn)行檢驗(yàn)。將Blm(長雙歧桿菌)、Bbm(兩歧雙歧桿菌)、Blr(長雙歧桿菌)和Bbb(兩歧雙歧桿菌)活化后，以0.1％接種量接入A2B2C1和A2B2C3兩個組合的培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)12h，取樣測定活菌數(shù)。結(jié)果為4個菌株在兩個培養(yǎng)基中的活菌數(shù)都可以達(dá)到109以上，A2B2C1稍優(yōu)于A2B3C1，即在菊芋汁中補(bǔ)充0.05％玉米漿、0.05％大豆蛋白胨和0.025％半胱氨酸鹽酸鹽可以使雙歧桿菌生長最好。
經(jīng)以上試驗(yàn)得出雙歧桿菌發(fā)酵用復(fù)合培養(yǎng)基的組成可以表示為菊芋汁 1000ml玉米漿 1-5ml大豆蛋白陳 0.25-0.75g半胱氨酸鹽酸鹽 0.25-0.75g更合適的配方組成為菊芋汁 1000ml玉米漿 3ml大豆蛋白陳 0.5g半胱氨酸鹽酸鹽 0.25g試驗(yàn)結(jié)果列表如下表3.正交試驗(yàn)的因素和水平表

表4.正交試驗(yàn)方案和結(jié)果分析表因素試驗(yàn)號活菌數(shù)(lgcfu/mL)A B C1 A1 B1 C19.0762 A1 B2 C29.0453 A1 B3 C39.0094 A2 B1 C29.0395 A2 B2 C39.1016 A2 B3 C19.0877 A3 B1 C38.8758 A3 B2 C18.9969 A3 B3 C28.986M127.13 26.99 27.159M227.227 27.142 27.07M326.857 27.082 26.985m19.043 8.997 9.053
m29.0769.0479.023m38.9529.0278.995R 0.1240.05 0.058表5.雙歧桿菌在兩種培養(yǎng)基中的生長狀況比較菌株 A2B2C1(cfu/mL) A2B3C1(cfu/mL) 方差分析(p)Blm1.400×1091.125×109＞0.05Bbm1.250×1091.020×109＞0.05Bbb1.300×1091.000×109＞0.05Blr1.350×1091.150×109＞0.05表中Blm、Blr為長雙歧桿菌，Bbm、Bbb為兩歧雙歧桿菌。
本發(fā)明所述的雙歧桿菌發(fā)酵用復(fù)合培養(yǎng)基的制備方法包括以下步驟(1)制備標(biāo)準(zhǔn)菊芋汁a.使用當(dāng)年采集或低溫-20℃保存的菊芋，用水清洗干凈；b.菊芋稱重后放在水浴鍋內(nèi)，加水升溫至100℃，滅酶，時間5-10分鐘；c.將菊芋粉碎成菊芋粉，加適量70-85℃水，用100目雙層濾布過濾，取濾汁，濾渣加70-85℃水適量，重復(fù)壓榨，合并濾液；d.取上述的合并濾液，加水定容，控制量為100g菊芋制得100ml標(biāo)準(zhǔn)菊芋汁；(2)制備復(fù)合培養(yǎng)基在制得的標(biāo)準(zhǔn)菊芋汁中添加配合量的玉米漿、大豆蛋白陳和半胱氨酸鹽酸鹽即得成品雙歧桿菌發(fā)酵用復(fù)合培養(yǎng)基。
本發(fā)明取得的技術(shù)進(jìn)步在于雙歧桿菌在該培養(yǎng)基中生長良好，最大生長量達(dá)到109cfu/mL以上，和實(shí)驗(yàn)室中所使用的經(jīng)典的雙歧桿菌培養(yǎng)基(如MRS)相當(dāng)；該培養(yǎng)基的主要原料菊芋價廉易得，其他補(bǔ)充成分種類少、用量小，因此生產(chǎn)工藝流程簡單，成本低廉，適宜雙歧桿菌的工業(yè)化大規(guī)模培養(yǎng)。


圖1是Blm(長雙歧桿菌)和Bbm(兩歧雙歧桿菌)在菊芋汁中的生長曲線圖。
圖2是三因素不同水平與試驗(yàn)指標(biāo)的關(guān)系圖。
具體實(shí)施例方式
以下實(shí)施例用以說明本發(fā)明。
實(shí)施例1雙歧桿菌發(fā)酵用復(fù)合培養(yǎng)基的組成為菊芋汁 1000ml玉米漿 1ml大豆蛋白陳 0.75g半胱氨酸鹽酸鹽 0.25g雙歧桿菌發(fā)酵用復(fù)合培養(yǎng)基的制備(1)制備標(biāo)準(zhǔn)菊芋汁a.使用11月下旬采收的菊芋，用水清洗干凈；b.稱取菊芋1000g放在水浴鍋內(nèi)，升溫到100℃，滅酶，5分鐘后結(jié)束；c.將菊芋粉碎成菊芋粉，加80℃水500ml，用100目雙層濾布過濾，取濾汁，濾渣加80℃水200ml，重復(fù)壓榨、浸提三次，合并濾液約950ml；d.取上述的合并濾液，加水50ml制得1000ml標(biāo)準(zhǔn)菊芋汁；(2)制備復(fù)合培養(yǎng)基在制得的標(biāo)準(zhǔn)菊芋汁中添加配合量的玉米漿、大豆蛋白陳和半胱氨酸鹽酸鹽即得成品雙歧桿菌發(fā)酵用復(fù)合培養(yǎng)基。
實(shí)施例2雙歧桿菌發(fā)酵用復(fù)合培養(yǎng)基的組成為菊芋汁 1000ml玉米漿 3ml大豆蛋白陳 0.5g
半胱氨酸鹽酸 0.25g雙歧桿菌發(fā)酵用復(fù)合培養(yǎng)基的制備(1)制備標(biāo)準(zhǔn)菊芋汁a.使用低溫-20℃保存的菊芋，用水清洗干凈；b.稱取菊芋1000g放在水浴鍋內(nèi)，加水升溫到100℃，滅酶8分鐘；c.取出菊芋，將其粉碎成菊芋粉，加入85℃水500ml，用100目雙層濾布過濾，取濾汁，濾渣加85℃水250ml，重復(fù)壓榨、浸提三次，合并濾液960ml；d.取上述的合并濾液，加入40ml清水制得1000ml標(biāo)準(zhǔn)菊芋汁；(2)制備復(fù)合培養(yǎng)基在制得的標(biāo)準(zhǔn)菊芋汁中添加配合量的玉米漿、大豆蛋白陳和半胱氨酸鹽酸鹽即得成品雙歧桿菌發(fā)酵用復(fù)合培養(yǎng)基。
實(shí)施例3雙歧桿菌發(fā)酵用復(fù)合培養(yǎng)基的組成為菊芋汁 1000ml玉米漿 5ml大豆蛋白陳 0.25g半胱氨酸鹽酸鹽 0.75g雙歧桿菌發(fā)酵用復(fù)合培養(yǎng)基的制備(1)制備標(biāo)準(zhǔn)菊芋汁a.使用當(dāng)年采集的菊芋，用水清洗干凈；b.稱取菊芋1000g放在水浴鍋內(nèi)，加水升溫到100℃滅酶，時間10分鐘；c.取出菊芋，將其粉碎成菊芋粉，加入75℃水600ml，用100目雙層濾布過濾，取濾汁，濾渣加75℃水200ml，重復(fù)壓榨、浸提三次，得到合并濾液970ml；d.取上述的合并濾液，加入清水30ml制得1000ml標(biāo)準(zhǔn)菊芋汁；(2)制備復(fù)合培養(yǎng)基在制得的標(biāo)準(zhǔn)菊芋汁中添加配合量的玉米漿、大豆蛋白陳和半胱氨酸鹽酸鹽即得成品雙歧桿菌發(fā)酵用復(fù)合培養(yǎng)基。
權(quán)利要求
1.一種雙歧桿菌發(fā)酵用復(fù)合培養(yǎng)基，其特征在于培養(yǎng)基的組成為菊芋汁 1000ml玉米漿 1-5ml大豆蛋白陳 0.25-0.75g半胱氨酸鹽酸鹽 0.25-0.75g
2.按權(quán)利要求1所述的雙歧桿菌發(fā)酵用復(fù)合培養(yǎng)基，其特征在于培養(yǎng)基的組成為菊芋汁 1000ml玉米漿 3ml大豆蛋白陳 0.5g半胱氨酸鹽酸鹽 0.25g。
3.如權(quán)利要求1和2所述的雙歧桿菌發(fā)酵用復(fù)合培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于包括以下步驟(1)制備標(biāo)準(zhǔn)菊芋汁a.使用當(dāng)年采集或低溫保存的菊芋，用水清洗干凈；b.菊芋稱重后放在水浴鍋內(nèi)，加水升溫到100℃，滅酶，時間5-10分鐘；c.將菊芋粉碎成菊芋粉，加適量70-85℃水，用100目雙層濾布過濾，取濾汁，濾渣加70-85℃水適量，重復(fù)壓榨、浸提，合并濾液；d.取上述的合并濾液，加水定容，控制量為100g菊芋制得100ml標(biāo)準(zhǔn)菊芋汁；(2)制備復(fù)合培養(yǎng)基在制得的標(biāo)準(zhǔn)菊芋汁中添加配合量的玉米漿、大豆蛋白陳和半胱氨酸鹽酸鹽即得成品雙歧桿菌發(fā)酵用復(fù)合培養(yǎng)基。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種雙歧桿菌發(fā)酵用復(fù)合培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基的配方為菊芋汁+玉米漿+大豆蛋白胨+半胱氨酸鹽酸鹽。雙歧桿菌在其中生長良好，最高生長量可以達(dá)到10
文檔編號C12N1/20GK1584013SQ200410012308
公開日2005年2月23日 申請日期2004年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月31日
發(fā)明者賈英民, 孫紀(jì)錄 申請人:河北農(nóng)業(yè)大學(xué)