專利名稱：腺苷脫氨酶活性測定方法及腺苷脫氨酶診斷試劑的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種腺苷脫氨酶活性測定方法，同時本發(fā)明還涉及用以實現(xiàn)該方法的腺苷脫氨酶診斷試劑，屬于醫(yī)學檢驗測定技術領域。
背景技術：
醫(yī)學研究表明，腺苷脫氨酶是一種與機體細胞免疫活性有重要關系的核酸代謝酶。因此，腺苷脫氨酶活性的測定被作為良惡性胸腹水、腦脊液鑒別診斷、重癥聯(lián)合免疫缺陷病(SCID)、急、慢性肝炎、肝硬化、肝癌等疾病鑒別的重要診斷標志。
腺苷脫氨酶的活性測定方法較多，主要有放射核素法、物理方法和生化法。據(jù)申請人了解，目前國際上普遍采用紫外光法，其測定原理是腺苷(Adenosine)+水(H2O)腺苷脫氨酶肌苷(Inosine)+氨離子(NH4+)，此反映過程生成的肌苷會在波長為265nm處顯現(xiàn)，因此可以通過測定此波長處吸光度的大小直接反映腺苷脫氨酶活性的大小。然而，此方法無法用一般醫(yī)院的可見光分析儀測定，而需要使用專門的紫外光分析儀，因此難以切實推廣應用。
檢索發(fā)現(xiàn)，申請?zhí)枮?3128092.7、申請日為2003.05.29、名稱為《一種測定腺苷脫氨酶的試劑及其制法》的中國專利申請公開了應用酶反應產(chǎn)物氧化型煙酰胺輔酶配制的測定試劑。該發(fā)明所指的酶法測定試劑并不加入測定反應所需的還原型煙酰胺輔酶或其類似物，而加入其反應產(chǎn)物氧化型煙酰胺輔酶或其類似物及其相應的生成還原型輔酶所需的酶和底物系統(tǒng)，通過在試劑內形成酶-底物-NAD或酶-底物-NADP等慢反應系統(tǒng)，將這類氧化型輔酶或其類似物緩慢循環(huán)還原為還原型煙酰胺輔酶或其類似物，當被還原的還原型煙酰胺輔酶或其類似物達到一定的濃度時，該發(fā)明所指的酶法試劑就可達到測定樣本中腺苷脫氨酶及其同工酶活力的目的。該發(fā)明的特點在于為腺苷脫氨酶的測試提供一個內源合成腺苷脫氨酶反應所需要的底物—還原型煙酰胺輔酶—的腺苷脫氨酶試劑。其缺點為這個系統(tǒng)在生成反應所需要的還原型煙酰胺輔酶的同時，也抵消了部分腺苷脫氨酶試劑(腺苷脫氨酶偶聯(lián)谷氨酸脫氫酶反應必定將還原型煙酰胺輔酶氧化成氧化型煙酰胺輔酶)的活性。

發(fā)明內容
本發(fā)明要解決的技術問題是提出一種不需要還原型煙酰胺輔酶，并且借助可見光分析儀即可測定腺苷脫氨酶活性的方法，同時，本發(fā)明還將給出用以實現(xiàn)該方法的腺苷脫氨酶診斷試劑，從而大大方便通過測定腺苷脫氨酶活性的進行良惡性胸腹水、腦脊液鑒別診斷、重癥聯(lián)合免疫缺陷病(SCID)、急、慢性肝炎、肝硬化、肝癌等等各種疾病的診斷，使之可以在中、小醫(yī)院得到推廣應用。
本發(fā)明腺苷脫氨酶活性測定方法步驟如下1、腺苷+水腺苷脫氨酶肌苷+氨離子2、肌苷+單價磷酸鹽核苷磷酸酶次黃嘌呤+1-磷酸核糖3、次黃嘌呤+水+氧黃嘌呤氧化酶尿酸鹽+過氧化氫4、過氧化氫+還原型色原體組合過氧化物酶吲嗒胺色原或醌亞胺色原+水5、將最終反應物置于可見光分析儀下，檢測400——600nm(根據(jù)還原型色原體組合的不同而定)處直接反映吲嗒胺色原(Indamine dye)或醌亞胺色原(Quioneimine dye)含量高低的光吸收大小，得出腺苷脫氨酶測定結果。
用于實現(xiàn)以上方法的腺苷脫氨酶診斷試劑主劑為腺苷、單價磷酸鹽、核苷磷酸酶、黃嘌呤氧化酶、過氧化物酶、還原型色原體組合。
以上主劑按如下比例組合，測定結果較好腺苷1——50mmol/l單價磷酸鹽 0.2——10mmol/l核苷磷酸酶 500——50000U/l黃嘌呤氧化酶500——50000U/l過氧化物酶 500——50000U/l還原型色原體組合0.1——20mmol/l其余是緩沖液、穩(wěn)定劑。
以上測定的溫度控制在20℃到50℃，各反應步驟的反應時間控制在2-30分鐘，各試劑以基本相同的劑量按步驟加入，被測腺苷脫氨酶樣品與試劑的比例、即樣品試劑比控制在1/10到1/250，可以獲得較好的測定結果。
以上還原型色原體組合(Chromogen)可以是0.5-20mmol/l的3-甲基-2-苯噻唑酮腙(3-methyl-2-benzothiazolinone-hydrszone簡稱MBTH)或0.5-20mmol/l的4-氨基抗砒(4-aminoantipyrine)與0.1——20mmol/l以下十四種成分之一組合而成石碳酸(phenol)N-乙基-N-(3-硫丙基)-m-噻啶胺(N-ethyl-N-(3-sulfopropyl)-m-anisidine簡稱ESPAS)N，N-雙乙基-m-甲苯胺(N，N-Diethyl-m-toluidine)2，4-雙氯石碳酸(2，4-Dichloriphenol)2，4，6-仨溴-3-羥基-苯磺酸(2，4，6-Tribromo-3-hydroxy-benzenesulfonic acid簡稱TBHB)3，5-雙氯石碳酸磺酸(3，5-Dichlorophenolsulfonic acid)3，5-雙氯-2-羥基-苯磺酸(3，5-Dichloro-2-hydroxy-benzenesulfonicacid簡稱DHBS)
N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺鈉鹽(N-ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-m-toluidine-sodium簡稱TOOS)仨溴羥基苯甲酸(Tribromohydroxybenzoic acid)雙甲基苯胺(Dimethylaniline簡稱DMA)N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺(N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-m-toluidine簡稱EHSPT)2，2′-AZINO-雙(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)(2，2′-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)簡稱ABTS4-羥基-3-甲氧基苯甲酸(Vanillic acid(4-hydroxy-3-methoxybenzoicacid)簡稱HMB)3-甲基-乙基-羥基苯胺(3-methyl-ethyl-hydroxyaniline簡稱MEHA)本發(fā)明的測定方法通過腺苷脫氨酶、核苷磷酸酶、黃嘌呤氧化酶、過氧化物酶等一系列的酶偶聯(lián)反應，最終將無色的還原型色原體組合氧化成有色的吲嗒胺色原或醌亞胺色原，從而可以通過可見光分析儀器，在400——600nm波長處，測定吲嗒胺色原或醌亞胺色原含量的高低，進而直接反映出腺苷脫氨酶活性的大小，為多種疾病的診斷提供方便，整個測定過程只需按步驟加入試劑即可，一氣呵成，便于操作。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明不僅便于推廣應用，而且由于所生成的吲嗒胺色原或醌亞胺色原均有較高的摩爾消光系數(shù)，因此靈敏度高、精確度好。此外，反應過程中的成分都是外加的，所以不受內外源物質的污染。
具體實施例方式
下面結合實施例子對本發(fā)明作進一步的說明。
實施例一本實施例的腺苷脫氨酶診斷試劑有緩沖液100mmol/l
腺苷 10mmol/l單價磷酸鹽5mmol/l核苷磷酸酶6000U/l黃嘌呤氧化酶 8000U/l過氧化物酶20000U/l4-氨基抗砒2mmol/l石碳酸10mmol/l測定腺苷脫氨酶活性時，溫度控制在36.5——37.5℃，被測腺苷脫氨酶樣品與試劑的比例約為1/25，具體測定步驟為1、腺苷+水腺苷脫氨酶肌苷+氨離子2、肌苷+單價磷酸鹽核苷磷酸酶次黃嘌呤+1-磷酸核糖3、次黃嘌呤+水+氧黃嘌呤氧化酶尿酸鹽+過氧化氫4、過氧化氫+4-氨基抗砒+石碳酸過氧化物酶醌亞胺色原+水5、將最終反應物置于可見光分析儀下，檢測500nm處的醌亞胺色原含量的高低，得出腺苷脫氨酶測定結果。
各反應步驟的反應時間控制在8-12分鐘。
實施例二本實施例的腺苷脫氨酶診斷試劑有緩沖液 100mmol/l腺苷5mmol/l單價磷酸鹽 1mmol/l核苷磷酸酶 800U/l黃嘌呤氧化酶800U/l過氧化物酶 800U/l4-氨基抗砒 0.6mmol/l2，4，6-仨溴-3-羥基-苯磺酸 0.2mmol/l
測定腺苷脫氨酶活性時，溫度控制在29——31℃，被測腺苷脫氨酶樣品與試劑的比例約為1/15，具體測定步驟為1、腺苷+水腺苷脫氨酶肌苷+氨離子2、肌苷+單價磷酸鹽核苷磷酸酶次黃嘌呤+1-磷酸核糖3、次黃嘌呤+水+氧黃嘌呤氧化酶尿酸鹽+過氧化氫4、過氧化氫+4-氨基抗砒+2，4，6-仨溴-3-羥基-苯磺酸過氧化物酶醌亞胺色原+水5、將最終反應物置于可見光分析儀下，檢測546nm處的醌亞胺色原含量的高低，得出腺苷脫氨酶測定結果。
各反應步驟的反應時間控制在4-6分鐘。
實施例三本實施例的腺苷脫氨酶診斷試劑有緩沖液 100mmol/l腺苷45mmol/l單價磷酸鹽 8mmol/l核苷磷酸酶 40000U/l黃嘌呤氧化酶42000U/l過氧化物酶 50000U/l3-甲基-2-苯噻唑酮腙 15mmol/l雙甲基苯胺 18mmol/l測定腺苷脫氨酶活性時，溫度控制在24——26℃，被測腺苷脫氨酶樣品與試劑的比例約為1/200，具體測定步驟為1、腺苷+水腺苷脫氨酶肌苷+氨離子2、肌苷+單價磷酸鹽核苷磷酸酶次黃嘌呤+1-磷酸核糖3、次黃嘌呤+水+氧黃嘌呤氧化酶尿酸鹽+過氧化氫4、過氧化氫+3-甲基-2-苯噻唑酮腙+雙甲基苯胺過氫化物酶吲嗒胺色原+水5、將最終反應物置于可見光分析儀下，檢測578nm處的吲嗒胺色原含量的高低，得出腺苷脫氨酶測定結果。
各反應步驟的反應時間控制在14-16分鐘。
申請人經(jīng)過實驗驗證，采用以上發(fā)明內容中記載的其他各種還原型色原體組合均能達到本發(fā)明的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實施例類同，不另一一例舉。
總之，實驗證明，采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過可見光分析儀器得出所需的測定結果，并且靈敏度高、精確度好，不受內外源物質的污染。
權利要求
1.一種腺苷脫氨酶活性測定方法，步驟如下1)、腺苷+ 水腺苷脫氨酶肌苷+氨離子2)、肌苷+單價磷酸鹽核苷磷酸酶次黃嘌呤+1-磷酸核糖3)、次黃嘌呤+水+氧黃嘌呤氧化酶尿酸鹽+過氧化氫4)、過氧化氫+還原型色原體組合過氧化物酶吲嗒胺色原或醌亞胺色原+水5)、將最終反應物置于可見光分析儀下，檢測400——600nm處直接反映吲嗒胺色原或醌亞胺色原含量高低的光吸收大小，得出腺苷脫氨酶測定結果。
2.根據(jù)權利要求1所述腺苷脫氨酶活性測定方法，其特征在于測定溫度控制在20℃到50℃。
3.根據(jù)權利要求2所述腺苷脫氨酶活性測定方法，其特征在于被測腺苷脫氨酶樣品與試劑的比例控制在1/10到1/250。
4.根據(jù)權利要求2或3所述腺苷脫氨酶活性測定方法，其特征在于各反應步驟的反應時間控制在2-30分鐘。
5.一種腺苷脫氨酶診斷試劑，主劑為腺苷、單價磷酸鹽、核苷磷酸酶、黃嘌呤氧化酶、過氧化物酶、還原型色原體組合。
6.根據(jù)權利要求5所述腺苷脫氨酶診斷試劑，其特征在于所述主劑的比例為腺苷 1——50mmol/l單價磷酸鹽 0.2——10mmol/l核苷磷酸酶 500——50000U/l黃嘌呤氧化酶 500——50000U/l過氧化物酶 500——50000U/l還原型色原體組合0.1——20mmol/l其余是緩沖液、穩(wěn)定劑。
7.根據(jù)權利要求6所述腺苷脫氨酶診斷試劑，其特征在于所述還原型色原體為0.5-20mmol/l的3-甲基-2-苯噻唑酮腙與0.1-20mmol/l以下十四種成分之一組合而成石碳酸N-乙基-N-(3-硫丙基)-m-噻啶胺N，N-雙乙基-m-甲苯胺2，4-雙氯石碳酸2，4，6-仨溴-3-羥基-苯磺酸3，5-雙氯石碳酸磺酸3，5-雙氯-2-羥基-苯磺酸N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺鈉鹽仨溴羥基苯甲酸雙甲基苯胺N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺2，2′-AZINO-雙(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)4-羥基-3-甲氧基苯甲酸3-甲基-乙基-羥基苯胺。
8.根據(jù)權利要求6所述腺苷脫氨酶診斷試劑，其特征在于所述還原型色原體組合為由0.5-20mmol/l的4-氨基抗砒與0.1-20mmol/l以下十四種成分之一組合而成石碳酸N-乙基-N-(3-硫丙基)-m-噻啶胺N，N-雙乙基-m-甲苯胺2，4-雙氯石碳酸2，4，6-仨溴-3-羥基-苯磺酸3，5-雙氯石碳酸磺酸3，5-雙氯-2-羥基-苯磺酸N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺鈉鹽仨溴羥基苯甲酸雙甲基苯胺N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺2，2′-AZINO-雙(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)4-羥基-3-甲氧基苯甲酸3-甲基-乙基-羥基苯胺。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種腺苷脫氨酶活性測定方法，同時本發(fā)明還涉及用以實現(xiàn)該方法的腺苷脫氨酶診斷試劑，屬于醫(yī)學檢驗測定技術領域。本發(fā)明以腺苷、單價磷酸鹽、核苷磷酸酶、黃嘌呤氧化酶、過氧化物酶、還原型色原體組合為診斷試劑主成分，通過一系列的酶偶聯(lián)反應，將最終將無色的還原型色原體組合氧化成有色的染料，從而可以通過可見光分析儀器，在400－600nm波長處，測定染料含量的高低，進而直接反映出腺苷脫氨酶活性的大小，為多種疾病的診斷提供方便。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明不僅便于推廣應用，而且由于所生成的染料均有較高的摩爾消光系數(shù)，因此靈敏度高、精確度好。此外，反應過程中的成分都是外加的，所以不受內外源物質的污染。
文檔編號C12Q1/25GK1641043SQ20041001409
公開日2005年7月20日 申請日期2004年2月18日 優(yōu)先權日2004年2月18日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司