專利名稱：五種石斛種質(zhì)鑒定特異性gDNA探針的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中中藥鑒定。
背景技術(shù)：
石斛鑒定作為石斛質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的主要內(nèi)容，不僅是在國內(nèi)市場，更重要的是進(jìn)入國際市場迫切需要解決的關(guān)鍵問題之一。目前使用的商品石斛藥材來源、種類復(fù)雜，加之各地藥材種使用習(xí)慣不盡相同，同名異藥、同藥異名，互混、互代以假充真混亂現(xiàn)象嚴(yán)重，石斛藥材偽、混品種充斥市場，且數(shù)量有增無減，長期困擾石斛藥材市場，嚴(yán)重影響我國石斛中藥材的進(jìn)出口和制藥企業(yè)的產(chǎn)品質(zhì)量。為確保使用安全有效，控制質(zhì)量，對各種石斛藥材進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定成為當(dāng)務(wù)之急，同時準(zhǔn)確鑒定石斛品種是保證其用藥安全有效的前提。
中藥傳統(tǒng)上是用經(jīng)典的形態(tài)分類學(xué)和解剖學(xué)特征，從基原、性狀、顯微、理化及DNA分子遺傳標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行藥材品種的鑒別。性狀鑒別是利用感官對完整藥材進(jìn)行鑒別；顯微鑒別是利用顯微鏡來觀察藥材的組織構(gòu)造、細(xì)胞性狀以及內(nèi)含物的特性。理化鑒別是利用物理或化學(xué)的方法，對藥材及其制劑所含的主要化學(xué)成分進(jìn)鑒定，目前有薄層層析法、熒光法、紫外、紅外光譜法等。這些方法對于動、植物藥材以整體入藥而保持其分類學(xué)性狀特征的藥材的鑒定確實(shí)是行之有效的。但是，這些方法要真正應(yīng)用石斛的鑒別還存在一些問題，一是因中藥材的性狀、組織結(jié)構(gòu)、化學(xué)成分除了受中藥材本身的遺傳物質(zhì)控制外，還受生長環(huán)境、氣候、緯度等因素的影響而不同；二是因石斛經(jīng)過多道工序加工成楓斗后難辨別其原貌，導(dǎo)致上述鑒別方法結(jié)果的不穩(wěn)定，不能滿足鑒別的需要。DNA分子遺傳標(biāo)記技術(shù)是根據(jù)不同生物個體遺傳物質(zhì)DNA的差異來鑒別生物物種的方法。DNA作為遺傳信息的直接載體，不受生長環(huán)境生理狀態(tài)等因素的影響，因此，DNA分子遺傳標(biāo)記技術(shù)鑒別藥材的方法雖然比上述方法都具有較高的準(zhǔn)確性和可靠性，但都存在一定的局限性，已報道的方法可歸納為三類(1)AP-PCR標(biāo)記鑒別該方法在擴(kuò)增反應(yīng)時要求的復(fù)性溫度低(通常為36℃)，特異性不高，結(jié)果容易受到多種因素的影響，在不同的實(shí)驗(yàn)室之間難以重復(fù)，即使在同一實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，每次檢測樣品時，都必須用已知的正品藥材作為對照，同時進(jìn)行DNA提取、RAPD擴(kuò)增和電泳檢測，比較正品藥材與待檢樣品擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜的異同才能進(jìn)行鑒定，檢驗(yàn)成本高，因此很難推廣。(2)RFLD標(biāo)記鑒別該方法要求DNA無顯著的降解，只適于新鮮動、植物材料的研究，它對于模板的純度和完整性要求高，操作較煩瑣，所需DNA模板的量大。(3)DNA測序法它利用某段已知的相對保守的基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再進(jìn)行序列測定加以鑒別。這種方法雖然準(zhǔn)確性高，但所含信息量較少，測序成本高。
由于上述各種用于中藥鑒定技術(shù)存在的種種缺陷與不足，迄今尚未成為任何一種中藥材鑒定的常規(guī)檢測手段，而生物芯片技術(shù)為中藥的鑒定展現(xiàn)了良好的發(fā)展前景。但是應(yīng)用生物芯片進(jìn)行中藥鑒定就必須獲得大量的種質(zhì)特異性探針。大量的種質(zhì)特異性探針是該技術(shù)的關(guān)鍵。
這些石斛種質(zhì)特異性探針是在我們創(chuàng)立的“中藥材gDN序列特異性微陣列芯片制備方法”(專利申請?zhí)?31322050)下獲取的，能有效地固定在固相支持物如玻片、尼龍膜上建立一種低成本、準(zhǔn)確性高、重現(xiàn)性好的石斛鑒定DNA芯片。

發(fā)明內(nèi)容
(1)發(fā)明目的本發(fā)明目的是提供一種便于在普通設(shè)備條件下用于制備石斛鑒定微陣列的種質(zhì)特異性探針，即這些種質(zhì)特異性探針精確、高效、經(jīng)濟(jì)地用基因芯片點(diǎn)樣儀在固相支持物如玻片上制備成含大量不同種質(zhì)特異性探針的微陣列芯片進(jìn)行中藥才的鑒定，對確保石斛的安全用藥，質(zhì)量控制，實(shí)現(xiàn)中藥現(xiàn)代化具有重要的價值。
(2)技術(shù)方案本發(fā)明是用這些種質(zhì)特異性gDNA探針制備成微陣列進(jìn)行石斛鑒定，其特征在于(1)這些種質(zhì)特異性gDNA探針點(diǎn)樣于固體支持物表面(包括玻片、尼龍膜、硝酸纖維膜等)制作成微陣列。(2)待檢測樣本gDNA擴(kuò)增子的制備與標(biāo)記提取待檢測樣本的gDNA，gDNA用RsaI酶切后，連接接頭adaptor(圖1(1))，用引物primer(圖1(2))擴(kuò)增時摻入dCTP-Cy3或dCTP-Cy5進(jìn)行標(biāo)記，或用DIG-primer進(jìn)行標(biāo)記，得到標(biāo)記的gDNA擴(kuò)增子。(3)標(biāo)記的gDNA擴(kuò)增子與特異性探針微陣列雜交，在一定的嚴(yán)謹(jǐn)條件下掃描、檢測。(4)雜交結(jié)果分析。
(3)技術(shù)效果本發(fā)明石斛種質(zhì)特異性gDNA探針是以石斛的gDNA作為鑒別的信息載體，它不受外界因素和生物發(fā)育階段及器官組織差異的影響，每一個體的任一體細(xì)胞均含相同的遺傳信息，為種質(zhì)特異性探針鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性提供保證。這些種質(zhì)特異性探針制備成一種低成本、準(zhǔn)確性高、可平行鑒別五種石斛品種微陣列技術(shù)平臺，對石斛的安全用藥和質(zhì)量控制、走向國際市場具有非常重要的價值。在微陣列制備技術(shù)上不僅其制備基礎(chǔ)與國內(nèi)外基因芯片制備技術(shù)完全兼容，且在應(yīng)用中與通用基因表達(dá)芯片的反應(yīng)、檢測設(shè)備完全兼容，提高了使用的特異性探針簡便性，四

圖1是種質(zhì)特異性探針與用五種石斛gDNA制備的微陣列雜交結(jié)果。
(A)迭鞘1探針與五種石斛gDNA制備的微陣列雜交結(jié)果。
(B)迭鞘2探針與五種石斛gDNA制備的微陣列雜交結(jié)果。
(C)鐵皮1探針與五種石斛gDNA制備的微陣列雜交結(jié)果。
(D)鐵皮2探針與五種石斛gDNA制備的微陣列雜交結(jié)果。
(E)金釵1探針與五種石斛gDNA制備的微陣列雜交結(jié)果。
(F)金釵2探針與五種石斛gDNA制備的微陣列雜交結(jié)果。
(G)鼓槌1探針與五種石斛gDNA制備的微陣列雜交結(jié)果。
(H)鼓槌2探針與五種石斛gDNA制備的微陣列雜交結(jié)果。
(I)流蘇1探針與五種石斛gDNA制備的微陣列雜交結(jié)果。
(J)流蘇2探針與五種石斛gDNA制備的微陣列雜交結(jié)果。
圖2是(1)連接接頭adaptor，(2)引物primer。
圖3是種質(zhì)特異性探針點(diǎn)樣固定在固相支持物表面形成微陣列。
圖4是種屬的鑒定圖示。
五具體實(shí)施例方式
1、CTAB法提取待鑒石斛基因組(gDNA)DNA在液氮中研磨后，加入適量的60℃預(yù)熱的2×CTAB提取液(0.1M Tris-HCl，PH8.0，20mM EDTA，PH8.0，1.4M NaCl，2％CTAB，0.2％β-巰基乙醇。60℃水浴2小時。經(jīng)離心，酚/氯仿/異戊醇抽提后，再用RNAase A酶37℃進(jìn)行處理，乙醇沉淀，溶解于適量的TE中。
2、gDNA的酶切反應(yīng)提取的gDNA用識別4個堿基的平頭末端內(nèi)切酶(如RsaI)在37℃酶切1.5小時，產(chǎn)生平頭端雙鏈gDNA片段，其大小在150-550之間。加入適量20×EDTA/Glycogen終止反應(yīng)，酶切產(chǎn)物經(jīng)酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)抽提，乙醇沉淀后，溶解于適量的水中。
3、gDNA連接接頭將適量的gDNA，用T4連接酶連接接頭adaptor(圖1(1))。
4、擴(kuò)增子的PCR標(biāo)記在3中經(jīng)酶切的gDNA混合物，連接接頭Adaptor(圖1(1))后，PCR混合液中摻入dCTP-Cy3或dCTP-Cy5，用引物Primer(圖1(2))進(jìn)行PCR熒光標(biāo)記?；蛴肈IG-Primer進(jìn)行標(biāo)記。
5、固相支持物的準(zhǔn)備用于種質(zhì)特異性探針組成的微陣列的固相支持物可以是LB膜，(聚)四氟乙烯膜，(聚)偏二氟乙烯膜，聚苯乙烯膜，聚碳酸酯等化學(xué)膜，凝膠體、表面化學(xué)修飾的玻璃、硅、金等固相化學(xué)所用材料。固相支持物表面含有活性基團(tuán)的羧基、醛基、氨基、羥基、硫醇基等類似基團(tuán)。本述以尼龍膜為例。
6、種質(zhì)特異性探針在固相支持物表面的固定將種質(zhì)特異性探針在變性液(0.25N NaOH，0.75M NaCl)中變性30分鐘，通過機(jī)器、手工等適當(dāng)方式點(diǎn)樣到固相支持物表面(如尼龍膜)，在適當(dāng)條件下(100℃，烘烤30分鐘)固定到支持物表面。圖2。
7、標(biāo)記的待鑒樣本的擴(kuò)增子與種質(zhì)特異性探針的雜交檢測4中標(biāo)記的變性的擴(kuò)增子與種質(zhì)特異性探針，在適宜溫度和濃度條件下雜交一定時間后，用化學(xué)發(fā)光檢測法進(jìn)行檢測確定待鑒樣本的屬性。圖4。
權(quán)利要求
1.五種石斛特異性gDNA探針序列，其特征如下
以上特異性探針與用五種石斛gDNA制備的微陣列雜交，雜交結(jié)果如圖1。尼龍膜上點(diǎn)樣的gDNA從左到右各列依次為迭鞘(D.aurantiacum Kerr)，鐵皮(D.officinale Kimura et Migo)，金釵(D.nobile Lindl.)，鼓槌(D.chrysotoxum Lindl.)，流蘇(D.fimbriatum Hook.)；
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述，其特征在于這些特異性探針之間序列差異非常大，序列之間沒有同源性，允許較高的雜交溫度。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述，其特征在于每個特異性探針對于它所代表的品種是特異性的。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述，其功能在于每個特異性探針來自于它所代表的基因組(gDNA)。每個特異性探針與它所代表的品種樣本進(jìn)行特異性的雜交。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述，其功能在于這些特異性探針固定在固相支持物包括剛性和半剛性的材料上制作成微陣列，用化學(xué)標(biāo)記的不同樣本擴(kuò)增子雜交、檢測，每個特異性探針和它所代表的品種樣本特異性雜交，
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述，其特征在于固定或承載特異性探針分子的固相支持物包括剛性和半剛性的材料，如硝酸纖維素膜、尼龍膜、LB膜、(聚)四氟乙烯膜、(聚)偏二氟乙烯膜，聚苯乙烯膜，聚碳酸酯、瓊脂糖及聚丙烯酰胺等凝膠、玻璃珠、玻璃管、硅顆粒、玻片、硅片等；固相支持物具有光學(xué)平整的表面或孔狀表面，dsDNA探針分子可以固定在固相支持物光學(xué)平整的表面上，如玻片、硅片等，也可以固定在固相支持物孔狀表面的孔內(nèi)，如瓊脂糖及聚丙烯酰胺等凝膠。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述，其特征在于以這些特異性序列設(shè)計特異性引物，以PCR擴(kuò)增出特異性片段。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述，其功能在于以特異性引物擴(kuò)增得到不同品種的特異性PCR產(chǎn)物片段條帶，這些特異性條帶可作為品種鑒別條帶。
全文摘要
本發(fā)明是以五種名貴石斛即迭鞘、鼓槌、流蘇、鐵皮、金釵為材料，以我們創(chuàng)立的“中藥材gDNA序列特異性微陣列芯片制備方法”(專利申請?zhí)?3132205.0)篩選獲得的特異性探針，用這些特異性探針制備成微陣列進(jìn)行名貴中藥材石斛不同品種的鑒別。這些探針的高特異性序列使其在進(jìn)行雜交檢測時，只與它所代表的品種的gDNA雜交，而不與其它四個品種雜交以達(dá)到鑒別不同品種的目的。這些特異性探針是在基因組(gDNA)水平上尋找獲得的，不受生長發(fā)育和環(huán)境的影響，具有很高的遺傳穩(wěn)定性，能快速、準(zhǔn)確鑒別不同品種的名貴石斛，對石斛的用藥安全，質(zhì)量控制，實(shí)現(xiàn)中藥現(xiàn)代化具有重要的應(yīng)用價值。
文檔編號C12Q1/68GK1667128SQ200410014259
公開日2005年9月14日 申請日期2004年3月10日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月10日
發(fā)明者李同祥, 王進(jìn)科, 陸祖宏 申請人:李同祥, 王進(jìn)科, 陸祖宏, 南京新益華集團(tuán)公司