專利名稱：魚類基因原位修飾育種的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基因工程育種的方法，尤其是涉及一種魚類基因原位修飾育種的方法。
背景技術(shù)：
遺傳育種過程是一個基因組操作的過程，基因工程育種基于對基因功能和調(diào)控機(jī)制的認(rèn)識，在分子水平上對基因組實(shí)施修飾和改造，從而獲得定向遺傳改良的遺傳品種，擺脫了物種間遺傳堡壘的桎梏，從遺傳資源的被動利用轉(zhuǎn)向積極的改造創(chuàng)新。1982年，Palmiter等將大鼠生長激素基因轉(zhuǎn)移到小鼠受精卵中，培育出了快速生長的“超級小鼠”，這一突破性成果開創(chuàng)了轉(zhuǎn)基因動物研究的新紀(jì)元。1985年，中國科學(xué)院水生生物研究所在世界上率先開展了魚類基因工程定向育種研究，建立了完整的轉(zhuǎn)基因魚理論模型和完善的實(shí)驗(yàn)技術(shù)體系，揭示了外源基因整合的動力學(xué)過程，提出了轉(zhuǎn)基因魚形成的模型理論和培育純合轉(zhuǎn)基因魚品系對策，為轉(zhuǎn)基因魚育種奠定了理論基礎(chǔ)。目前，全世界有數(shù)十個實(shí)驗(yàn)室開展了魚類基因轉(zhuǎn)移研究，建立了顯微注射、電融合及精子攜帶法等多種基因轉(zhuǎn)移方法，獲得了快速生長的轉(zhuǎn)基因鯉、大馬哈魚、虹鱒、大西洋鮭和羅非魚等，規(guī)?；B(yǎng)殖試驗(yàn)在進(jìn)行中。雖然基因工程定向育種技術(shù)已取得突破，但是，基因工程育種的目的還未能達(dá)到，外源基因的隨機(jī)整合、外源基因非可控表達(dá)、轉(zhuǎn)基因魚生物安全性等問題嚴(yán)重影響了這一基因工程育種技術(shù)在魚類育種上的有效應(yīng)用，成為制約轉(zhuǎn)基因魚研究進(jìn)一步發(fā)展和推廣應(yīng)用的瓶頸。因此，現(xiàn)有技術(shù)的缺陷是它是采用外源基因隨機(jī)整合來完成基因工程育種的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種利用同源重組來進(jìn)行魚類基因原位修飾育種的方法。
本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是，本發(fā)明包括下述步驟1)分離魚的β-肌動蛋白基因啟動調(diào)控序列、生長激素基因啟動調(diào)控序列及其側(cè)翼序列；2)以魚的基因中的所述生長激素基因啟動調(diào)控序列作為同源重組的靶DNA片段；3)通過同源重組將所述β-肌動蛋白基因啟動調(diào)控序列替代所述生長激素基因啟動調(diào)控序列；4)構(gòu)建同源重組載體A)所述同源重組載體包括生長激素啟動調(diào)控序列5′側(cè)翼序列、生長激素啟動調(diào)控序列3′側(cè)翼序列、β-肌動蛋白基因啟動調(diào)控序列、綠色熒光蛋白正向標(biāo)記基因及兩個同向的Cre/loxP序列、紅色熒光蛋白負(fù)向標(biāo)記基因；B)所述生長激素啟動調(diào)控序列5′側(cè)翼序列作為同源長臂，所述生長激素啟動調(diào)控序列3′側(cè)翼序列作為同源短臂；C)將所述兩個同向的Cre/loxP序列分別置于所述綠色熒光蛋白正向標(biāo)記基因的兩側(cè)，然后將所述綠色熒光蛋白正向標(biāo)記基因置于所述同源長臂與所述同源短臂的內(nèi)側(cè)；D)將所述紅色熒光蛋白負(fù)向標(biāo)記基因置于所述同源長臂與所述同源短臂的外側(cè)；E)經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化，得到線性重組DNA片段；5)魚進(jìn)行人工授精后，在第一次卵裂前，采用顯微注射方法，將所述同源重組載體導(dǎo)入受精卵，隨后受精卵在實(shí)驗(yàn)室26℃～30℃的無菌環(huán)境中孵化；6)在熒光解剖鏡下篩選僅出現(xiàn)綠色熒光的胚胎，獲得同源重組的嵌合體；
7)PCR法和Southern雜交法檢測確認(rèn)發(fā)生同源重組的細(xì)胞或胚胎。
本發(fā)明的有益效果是由于本發(fā)明利用同源重組進(jìn)行魚類基因原位修飾來進(jìn)行育種，避免了外源基因的轉(zhuǎn)移，將極大地消除人們對轉(zhuǎn)基因生物安全性的疑慮；又由于本發(fā)明通過構(gòu)建同源重組載體，建立高效的基因同源重組技術(shù)，使人類按設(shè)計對魚類的基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行定點(diǎn)、定量地改變，從而定向改變細(xì)胞或整體本身的遺傳結(jié)構(gòu)和特征。本發(fā)明實(shí)施內(nèi)源基因原位修飾及內(nèi)源基因的可控表達(dá)，建立了一種魚類基因工程育種技術(shù)平臺，對魚類基因工程育種、生物反應(yīng)器研制以及基因功能、表達(dá)調(diào)控和發(fā)育生物學(xué)研究都具有重大理論指導(dǎo)意義和潛在應(yīng)用價值。


圖1是本魚類基因組的結(jié)構(gòu)示意圖；圖2是本發(fā)明同源重組載體的結(jié)構(gòu)示意圖；圖3是本發(fā)明同源重組篩選后的重組體的結(jié)構(gòu)示意圖；圖4是本發(fā)明同源重組載體的構(gòu)建過程示意圖。
具體實(shí)施例方式
以斑馬魚為例，在圖1、圖2、圖3中，1代表斑馬魚生長激素基因(GH)啟動調(diào)控序列5′側(cè)翼序列(作為同源長臂)片段，2代表GH啟動調(diào)控序列(GH-promoter)片段，3代表生長激素基因(GH)啟動調(diào)控序列3′側(cè)翼序列(作為同源短臂)片段，4代表β-肌動蛋白基因(β-actin)啟動調(diào)控序列片段，5代表兩個同向的Cre/loxP序列片段，6代表綠色熒光蛋白(GFP)正向標(biāo)記基因片段，7代表紅色熒光蛋白(RFP)負(fù)向標(biāo)記基因片段，8代表正向PCR檢測引物，9代表反向PCR檢測引物，10代表同源短臂3′側(cè)翼序列非靶位DNA序列片段。
下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的實(shí)施方式作具體說明
1.獲取目的基因用PCR法擴(kuò)增斑馬魚的β-肌動蛋白基因(β-actin)啟動調(diào)控序列、生長激素基因啟動調(diào)控序列及其側(cè)翼序列。
2.同源重組載體構(gòu)建(A)同源重組技術(shù)說明本發(fā)明采用一種基因同源重組的雙重?zé)晒夂Y選方法，在胚胎中利用雙重?zé)晒夂Y選發(fā)生同源重組的細(xì)胞，不需要胚胎干細(xì)胞和胚胎嵌合體操作。本發(fā)明采取以下技術(shù)措施基于正向選擇和負(fù)向選擇原理，構(gòu)建雙重?zé)晒夂Y選同源重組載體，其步驟是(1)以斑馬魚基因中生長激素啟動調(diào)控序列(GH-promoter)作為同源重組的靶DNA片段；(2)綠色熒光蛋白(GFP)基因?yàn)檎蜻x擇基因，置于同源DNA片斷內(nèi)側(cè)；(3)紅色熒光蛋白(RFP)基因?yàn)樨?fù)向選擇基因，置于同源DNA片斷外側(cè)。(4)同源重組載體中將β-肌動蛋白的啟動調(diào)控序列(β-actin promoter)與綠色熒光蛋白(GFP)連接，再通過同源臂與紅色熒光蛋白(RFP)連接。經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化，得到線性重組DNA片斷，采用顯微注射方法將同源重組載體導(dǎo)入斑馬魚受精卵中。在非同源重組的細(xì)胞中，將可同時觀察到綠色熒光和紅色熒光；在發(fā)生同源重組的細(xì)胞中，由于置于同源DNA片斷外側(cè)的紅色熒光蛋白(RFP)基因在DNA分子同源重組過程中被切除，只能觀察到綠色熒光(GFP)。在熒光解剖鏡下篩選僅出現(xiàn)綠色熒光的胚胎，即可獲得同源重組的嵌合體。
(B)如圖2所示，本發(fā)明同源重組載體的構(gòu)建過程是同源重組載體所用的正負(fù)標(biāo)記基因分別為綠色熒光蛋白基因(GFP)和紅色熒光蛋白基因(RFP)。為了方便把GFP和RFP連接到質(zhì)粒pBluescript IISK(-)(pBSK)多克隆酶切位點(diǎn)(MCS)中，首先用分別從pEGFP和pDSRFP中PCR出強(qiáng)啟動子CMV、GFP/RFP、SV40加尾信號及其polyA，再用融合引物PCR出剔除MCS的完整GFP/RFP基因片斷(PCMV-GFP/RFP-SV40-polyA)。同時通過PCR，在RFP的5′端引入Apa I和Sph I酶切位點(diǎn)，在其3′端引入ApaI酶切位點(diǎn)。Apa I單酶切插入pBSK中并通過測序調(diào)出方向正確(逆時針)的克隆(pBSK-RFP)，Sph I的引入是為了下一步定點(diǎn)生長激素(GH)同源短臂的亞克隆。為了實(shí)現(xiàn)“全魚基因”，從定點(diǎn)同源重組整合的陽性魚中剔除外源的GFP基因序列，PCR時在GFP片斷的兩末端引入同方向的Cre/loxp序列。在GFP擴(kuò)增引物的5′端加上BamH I酶切位點(diǎn)，在其3′端加上EcoR I酶切位點(diǎn)以便通過BamH I和EcoR I雙酶切定向克隆到pBSK-RFP中(pBSK-GFP-RFP)。
從斑馬魚基因組中PCR出β-actin的啟動調(diào)控序列(2251bp)，利用PCR上下游引物中攜帶的EcoR I和Sal I酶切位點(diǎn)用雙酶切定向克隆到pBSK-RFP-GFP中(pBSK-GRP)。通過基因組步行的方法PCR出GH啟動調(diào)控序列3′側(cè)翼序列(1.7kb、2.8kb)和其啟動調(diào)控序列上游序列即5′側(cè)翼序列(2.5kb)并分別直接連接到pGEM-T vector中(pGEM-T-GH和pGEM-T-Pgh)，GH同源短臂通過Sal I和Sph I其同源長臂即啟動調(diào)控序列上游序列(5′側(cè)翼序列)通過用Sac II和BamH I分別從pGEM-T-GH和pGEM-T-Pgh中切出并依次通過雙酶切定向連接到pBSK-GRP上，最后利用pBSK上MCS兩側(cè)的BssHII酶切位點(diǎn)，用BssH II單酶切消化釋放出所需的線性DNA片段。
3.同源重組載體顯微注射至斑馬魚受精卵斑馬魚人工授精后，在第一次卵裂前，采用顯微注射方法，將同源重組載體導(dǎo)入受精卵，隨后受精卵在實(shí)驗(yàn)室26℃～30℃無菌環(huán)境中孵化。受精卵的最佳孵化溫度為28℃4.熒光觀察和同源重組陽性胚胎篩選在非同源重組的細(xì)胞中，將可同時觀察到綠色熒光和紅色熒光；在發(fā)生同源重組的細(xì)胞中，由于置于同源DNA片斷外側(cè)的紅色熒光蛋白(RFP)基因在DNA分子同源重組過程中被切除，只能觀察到綠色熒光(GFP)。在熒光解剖鏡下篩選僅出現(xiàn)綠色熒光的胚胎，即可獲得同源重組的嵌合體。
5.陽性同源重組細(xì)胞的PCR檢測正向檢測引物設(shè)在載體的正向選擇基因綠色熒光蛋白(GFP)基因上，反向檢測引物設(shè)在基因組同源短臂非靶位DNA順序上，發(fā)生同源重組的細(xì)胞或胚胎經(jīng)PCR和Southern雜交法來進(jìn)行檢測確認(rèn)。
本發(fā)明的同源重組效率為4/1600，將同源重組載體顯微注射5000個受精卵，正常發(fā)育到魚苗期1600尾，其中有4尾為陽性同源重組魚。經(jīng)過基因原位修飾的斑馬魚，其生長發(fā)育速度比對照組快一倍，即對照組魚生長至性成熟需3個月左右，而本發(fā)明獲得的基因修飾魚只需1個半月左右。
斑馬魚β-actin的啟動調(diào)控序列1 tgtgcgcaca gattctgtgt gggcctagtc attacctata ctcaacgttt51 actctgagaa acttccatat tttagaggta aaatgctcag aattgtaaaa101 agtcttgtca aaatacttgg aatttgccaa aaacaaaata aaagtcacat151 cacctcattg tccttggtat cagcaagcac ttttaacaca atcagctgtt201 tttgtttata actcccactg aaggccatgt gcattactcc caagttacac251 agtaaaaagt cacatgtagt ttatcatgat cactgctgct caagcacagc301 tttatctgtt attcagtgtg gcaatatctg aaatgtgtgc aaaatattat351 ttattgtagc tgatcaccaa cactttcagt gttttttttt tctactttta401 atgagaatta tgttcttagg atttatcctt ataaacctct ttaaaaagaa451 atgttatgtc tgcatagaca cgacatgaaa ttatgaacag aaaatttaac501 tatttaagat caagacttga catataacat ttctaatgaa cattaaacct551 gaggtaggcc cacttgcaaa aatgtaactg ctatcactca ctttatacat601 cattgtgtaa cttgtacaca caaaaatagt gaagcaatgt ggcatggaat651 gcaggtccca ttcattcaaa gttattaaag cactttctta aagtgcatta701 ctactgagct aagaccagct agttgctcat acaacatact acaagtagtg751 tcatcctaat ttggataaaa aaaatgtcca ttttatacat ggaaaagtac801 tcattagatc ccccattgtt tgtattacgg tatttcgtga acacaagagg851 taaatgacct acagagctgc tgttgtgtta gattgaaaac acaacacagg901 atcatggagg catccatcat tatgacgcat tctgccactt gtaactctgc951 acagactttt tgaaaagttt aattgagtct tggcgttgtc gcagaaaaat1001 acgaaaaatt ctgtgttaaa atttgcaaat aaaaattcca gttttatagg1051 aaatcgccat ggccttgttc tttaaccagt taagcttccc cttctttcac1101 tctcaagttg caagaagcaa gtgtagcaat gtgcacgcga cagccgggtg1151 tgtgacgctg gaccaatcag agcacagagc tccgaaagtt taccttttat1201 ggctagagcc gggtatgtgc cgtcatataa aagagcgcgc ccagcttttc
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斑馬魚生長激素基因序列、啟動調(diào)控序列及其5′側(cè)翼序列1 ccagggggag ctctcgagac cttcctttac atagttattg accaggcggg agccctgggc61 tctgttatct ccgagctcag ggttcttccc aggacagcat gtcaaacctg ctattagcgt121 caagcatatt taagtgtcaa ctcttgaagc taaactgtaa aaacagtgta acatccataa181 ttttacagtt tatttccggc agctagggtg ctgtaaattt accataaaat aacagacatt241 aaattacaga aatttcctta aattgtaatt tcccccaaaa ttcaacctgt gttatttcac301 agtaaatttc tgtattttgt ggccgttctt tcttttatgc cgtagctttc ttttacggca361 tcccagctgg cagaaataag ctgtaaaatt actaattgtt ttttttacag tgtacggtta421 gtgttgcaaa tcatggttga tttgtggttg ttcagttgtc tgtgaaaatg taaagctttt481 cgtataggga cttcacagat gaagaccttt accctctaca gtggaatgag cgaacacaga541 aacatatttc ttcaaagaaa actgtaagtt gtattttgtt acgttttcat ttattctgat601 ttctttataa gttgtgtgct tttcctgact gagtacttgc atcattccct caccttcgtt661 tagacaaatg tgctgcaaat aaaaaaaaaa acactaacaa attaaacaca tcatcagtat721 taaactctca caacacatgc aaacacagaa atgcattgca aatagcgcag aacccagaca781 tccagaacat tcaggagaac ttgggaaatc cataatggct cctgtaaatt ggacaaaatg841 tcccggaaat ggagtcgctt tcccaagcag gttgtgtttt tccatattta ttcttgcagt901 gctcttgcgc tctctcagtc atcatataca agttattctt cttggaccac taaagagaat961 tatagataat tccaaataat ggcagactct tttaacaatt acttaaaagt ataataggat1021 tgttccatac atgtgcagaa tacttccact gtaattcatg tgttgtaaaa taaagttcag1081 cgatgaacca accaagacat tatttattat tcaaaaaaaa atctgacatt gatggttcat1141 gagactttta gcatggcatt atcagttttg agtgaataga ctctttaata cgtagactat1201 tttaggctat atctaagtat atttttgtta aatatagctt ggctatttgt tttacacagt1261 aaatatctgt attataattt ctaacctgca gtttgtcact ttctatttta tgtcctgtcc1321 acatagaaaa cacacgccac cctgtggtca aaatagatta gattcatagc ggtgttctgg
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權(quán)利要求
1.一種魚類基因原位修飾育種的方法，其特征在于，它包括下述步驟1)分離魚的β-肌動蛋白基因啟動調(diào)控序列、生長激素基因啟動調(diào)控序列及其側(cè)翼序列；2)以魚的基因中的所述生長激素基因啟動調(diào)控序列作為同源重組的靶DNA片段；3)通過同源重組將所述β-肌動蛋白基因啟動調(diào)控序列替代所述生長激素基因啟動調(diào)控序列；4)構(gòu)建同源重組載體A)所述同源重組載體包括生長激素啟動調(diào)控序列5′側(cè)翼序列、生長激素啟動調(diào)控序列3′側(cè)翼序列、β-肌動蛋白基因啟動調(diào)控序列、綠色熒光蛋白正向標(biāo)記基因及兩個同向的Cre/loxP序列、紅色熒光蛋白負(fù)向標(biāo)記基因；B)所述生長激素啟動調(diào)控序列5′側(cè)翼序列作為同源長臂，所述生長激素啟動調(diào)控序列3′側(cè)翼序列作為同源短臂；C)將所述兩個同向的Cre/loxP序列分別置于所述綠色熒光蛋白正向標(biāo)記基因的兩側(cè)，然后將所述綠色熒光蛋白正向標(biāo)記基因置于所述同源長臂與所述同源短臂的內(nèi)側(cè)；D)將所述紅色熒光蛋白負(fù)向標(biāo)記基因置于所述同源長臂與所述同源短臂的外側(cè)；E)經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化，得到線性重組DNA片段；5)魚進(jìn)行人工授精后，在第一次卵裂前，采用顯微注射方法，將所述同源重組載體導(dǎo)入受精卵，隨后受精卵在實(shí)驗(yàn)室26℃～30℃的無菌環(huán)境中孵化；6)在熒光解剖鏡下篩選僅出現(xiàn)綠色熒光的胚胎，獲得同源重組的嵌合體；7)PCR法和Southern雜交法檢測確認(rèn)發(fā)生同源重組的細(xì)胞或胚胎。
全文摘要
本發(fā)明提供一種魚類基因育種的方法，旨在提供一種利用同源重組來進(jìn)行魚類基因原位修飾育種的方法。該魚類基因原位修飾育種的方法是按下述步驟進(jìn)行的(1)分離魚的特定基因(如生長激素基因/肌動蛋白基因等)側(cè)翼序列/啟動調(diào)控序列DNA片段，構(gòu)建以肌動蛋白基因啟動調(diào)控序列置換生長激素基因啟動調(diào)控序列的同源重組載體；(2)將上述同源重組載體顯微注射到斑馬魚胚胎，篩選陽性同源重組置換魚苗；(3)分析內(nèi)源基因修飾魚類的相關(guān)基因表達(dá)水平和遺傳表型。本發(fā)明可用于魚類育種。
文檔編號C12N15/85GK1647624SQ20041001524
公開日2005年8月3日 申請日期2004年1月21日 優(yōu)先權(quán)日2004年1月21日
發(fā)明者吳玉萍, 朱作言, 胡煒, 徐安龍 申請人:中山大學(xué), 中國科學(xué)院水生生物研究所