專利名稱：水產(chǎn)動(dòng)物及人類病原菌－嗜水氣單胞菌基因診斷試劑盒及檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及水生經(jīng)濟(jì)動(dòng)物和人類病原菌的診斷試劑盒及檢測方法，主要是針對嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)基因診斷的試劑盒及檢測方法。
背景技術(shù)：
嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)是一種廣布于近岸海水、河流湖泊、下水道廢水及飲用水中，是一種條件致病菌，可以引起人和多種動(dòng)物的敗血病、腹瀉等疾病，在一定的條件會(huì)引起暴發(fā)流行。近年來，我國常有因嗜水氣單胞菌引起許多動(dòng)物(特別是水產(chǎn)動(dòng)物)發(fā)病或大量死亡以及使人類致病的報(bào)道。目前已知脊椎動(dòng)物中除圓口綱動(dòng)物未報(bào)導(dǎo)有嗜水氣單胞菌引起疾病外，其它各綱動(dòng)物均發(fā)現(xiàn)有嗜水氣單胞菌引起的疾病。尤其是引起養(yǎng)殖動(dòng)物的暴發(fā)性疾病，給養(yǎng)殖戶造成巨大的損失，如鰱、鳙、錦鯉、鴨、羅非魚、鱉、蟹、翹嘴鲌、草魚等。一些珍貴動(dòng)物如大熊貓、白暨豚等也受到嗜水氣單胞菌的感染而發(fā)病。可見嗜水氣單胞菌的感染范圍之廣，造成的損失之大。
嗜水氣單胞菌能使人患上很多疾病，常見的有腹瀉病、敗血癥、食物中毒、傷口感染等。嗜水氣單胞菌主要是當(dāng)人免疫力低下時(shí)而發(fā)病，如燒傷病人，用不潔水沖洗傷口，受到嗜水氣單胞菌感染而引起敗血癥、炎癥等。人們主要通過吃生食，或用不潔物品和水接觸傷口，從而感染嗜水氣單胞菌而發(fā)病，而出現(xiàn)腹瀉、發(fā)熱、嘔吐等癥狀。
因此，可以說嗜水氣單胞菌是水生經(jīng)濟(jì)動(dòng)物細(xì)菌病的主要病原菌，也是對人類健康安全危害較大的一種病原菌。嗜水氣單胞菌病具有暴發(fā)快、流行廣、死亡率高等特點(diǎn)，由于細(xì)菌極易對抗生素產(chǎn)生抗藥性，因此目前對嗜水氣單胞菌病還未有特效的治療方法，推行水產(chǎn)品的健康養(yǎng)殖是最有效的預(yù)防措施，而這主要依賴于早期的快速檢測。目前對細(xì)菌的檢測技術(shù)主要包括傳統(tǒng)的形態(tài)及生理生化鑒定法、免疫學(xué)方法(主要有單克隆抗體技術(shù)、酶聯(lián)免疫檢測法(ELISA))、免疫電鏡技術(shù)、分子生物學(xué)方法(主要有分子雜交技術(shù)、限制性內(nèi)切酶長度多態(tài)(RELP))等。這些檢測方法有些對技術(shù)條件要求高，檢測時(shí)間長。有些所需的材料制備麻煩，費(fèi)用高，有些方法靈敏度不高，特異性不強(qiáng)，因此廣大水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)主和醫(yī)生掌握的技術(shù)難度很大，很難推廣，限制了這些技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展。
早期快速診斷水產(chǎn)動(dòng)物和人類病原菌—嗜水氣單胞菌是目前水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物養(yǎng)殖的主要措施和減少損失的有效途徑，因此，簡便快速、特異性好又靈敏度高的診斷試劑盒及其檢測方法是廣大水產(chǎn)養(yǎng)殖者急切盼望的。
多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，簡稱PCR技術(shù))，是上世紀(jì)80年代發(fā)展起來的一種體外擴(kuò)增特異DNA片斷的技術(shù)，由于具有快速、敏感、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，所以這種方法建立后，很快就被應(yīng)用于實(shí)踐中。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是利用嗜水氣單胞菌基因保守序列設(shè)計(jì)的一對引物，建立嗜水氣單胞菌PCR反應(yīng)體系，在此基礎(chǔ)上優(yōu)化和設(shè)計(jì)，提供水產(chǎn)動(dòng)物和人類病原菌—嗜水氣單胞菌的基因診斷試劑盒及檢測方法。該試劑盒可批量生產(chǎn)，操作簡單，簡便快速，特異性好，靈敏度高；可用于水產(chǎn)動(dòng)物各時(shí)期養(yǎng)殖過程中的細(xì)菌跟蹤檢測，也可用于人類急性敗血癥的臨床檢測，還可以用于環(huán)境監(jiān)測，避免病菌傳播流行，具有很高的實(shí)用價(jià)值。
本發(fā)明的水產(chǎn)動(dòng)物和人類病原菌—嗜水氣單胞菌的基因診斷試劑盒包括下列部件1).樣品稀釋液A液，1管，內(nèi)裝1×PBS，pH7.4；2).PCR反應(yīng)液B液，1管，內(nèi)裝PCR擴(kuò)增反應(yīng)液，包括ddH2O、含Mg2+的10×Buffer、dNTP、引物AhF、引物AhR和TaqE；3).陽性對照液C液，1管，內(nèi)裝嗜水氣單胞菌的總DNA，作為陽性模板；4).盒子；5).一塊泡沫板，其大小與盒子的底面相同，裝于盒子中；泡沫板上有不少于上述小管數(shù)量的小孔，上述各小管分別對應(yīng)放置于這些小孔中。
上述水產(chǎn)動(dòng)物和人類病原菌—嗜水氣單胞菌的基因診斷試劑盒中所述的一對引物AhF和AhR是根據(jù)嗜水氣單胞菌基因保守區(qū)序列設(shè)計(jì)的，其DNA序列分別如下AhF5’-CCA AAC GAG AGA AGC CCT TAhR5’-AAA ACT TAG ATG TTT CAG TTC用本發(fā)明上述試劑盒檢測水產(chǎn)動(dòng)物和人類病原菌—嗜水氣單胞菌的方法，按下列步驟進(jìn)行1).取新鮮待檢樣品，加入樣品稀釋液A液稀釋10～20倍，于無菌勻漿器中冰浴勻漿；待檢樣品可以是直接取自待檢動(dòng)物的任何部位組織，最好是消化道或肌肉組織；對于人，可取糞便或傷口膿液作為待檢樣品。
2).6000～8000r/min離心5～10min；3).取上清200μl，煮沸15min，立刻放于冰上5～10min；4).6000～8000r/min離心10min，上清作PCR模板；5).分別取模板和C液，加入到PCR反應(yīng)液B液中，混勻后離心數(shù)秒(通常為500～1000r/min離心5～10sec)，置于PCR儀上；6).按下列條件擴(kuò)增95℃3min預(yù)變性→94℃1min 34個(gè)循環(huán)→72℃10min→4℃保存49℃45sec72℃1min
7).反應(yīng)結(jié)束后取5～10μl加2μl溴酚藍(lán)混勻，經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳20～30分鐘后于紫外儀上觀察，若在615bp處出現(xiàn)明亮的反應(yīng)條帶，則為嗜水氣單胞菌陽性；若無反應(yīng)條帶顯示，則為陰性。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明的水產(chǎn)動(dòng)物和人類病原菌—嗜水氣單胞菌的基因診斷試劑盒及檢測方法，是以根據(jù)嗜水氣單胞菌基因保守區(qū)序列設(shè)計(jì)的一對引物為主體而設(shè)計(jì)的。利用該對引物，可以特異性地?cái)U(kuò)增攜帶嗜水氣單胞菌的待測樣品的有關(guān)基因片斷，所建立的優(yōu)化的PCR體系保證檢測結(jié)果的快速性、準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。因此，使用本發(fā)明的試劑盒及檢測方法，可以簡便、快速、靈敏而特異的地檢測感染嗜水氣單胞菌的水產(chǎn)動(dòng)物，大大高于傳統(tǒng)和常規(guī)的生物學(xué)方法，可運(yùn)用于水產(chǎn)動(dòng)物各時(shí)期養(yǎng)殖過程細(xì)菌中的細(xì)菌跟蹤檢測，也可用于人類急性敗血癥的臨床檢測，還可以用于環(huán)境監(jiān)測，避免病菌傳播流行，具有很高的實(shí)用價(jià)值。


圖1是感染嗜水氣單胞菌的羅非魚肝臟組織樣品的PCR擴(kuò)增結(jié)果。其中MDNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1嗜水氣單胞菌陽性對照；2嗜水氣單胞菌陰性對照；3檢測樣品；具體實(shí)施方式
以下通過具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
實(shí)施例1嗜水氣單胞菌的基因診斷試劑盒該試劑盒由下列部分構(gòu)成(10樣份)1).樣品稀釋液(A液)，1管，5ml/管，內(nèi)裝1×PBS，pH7.4。
2).PCR反應(yīng)液(B液)，1管，250μl/管，內(nèi)裝PCR擴(kuò)增反應(yīng)液(25μl體系)，包括ddH2O、含Mg2+的10×Buffer、dNTP、引物AhF、引物AhR和TaqE。
3).陽性對照液(C液)，1管，20μl/管，內(nèi)裝嗜水氣單胞菌總DNA，作為陽性模板；4).長方體盒子，8.5×5.8×6.2cm3。
5).一塊泡沫板，其大小與盒子的底面相同，高2.2cm，有四排孔，第一排四個(gè)孔，孔徑1.3cm，第二排五個(gè)孔，孔徑1.0cm，第三、四排分別六個(gè)孔，孔徑0.6cm。上述各小管分別對應(yīng)放置于這些小孔中，裝于長方體盒子中。
該試劑盒中的一對引物的DNA序列如下AhF5’-CCA AAC GAG AGA AGC CCT TAhR5’-AAA ACT TAG ATG TTT CAG TTCPCR擴(kuò)增反應(yīng)液體系(25μl體系)如下ddH2O21μl
10×Buffer 1.8μldNTP 0.4μl引物AhF 0.3μl引物AhR 0.3μlTaqE 0.2μl實(shí)施例2水產(chǎn)動(dòng)物和人類病原菌—嗜水氣單胞菌的檢測方法使用實(shí)施例1的試劑盒，按下列步驟進(jìn)行1).用無菌操作方法，取新鮮羅非魚肝臟組織0.05g，加入樣品稀釋液(A液)500μl稀釋10倍，于無菌勻漿器中冰浴勻漿；2).6000r/min離心5min；3).取上清100μl，煮沸15min，立刻放于冰上5min；4).6000r/min離心10min，上清作為PCR模板；5).分別取模板和C液1μl，加入到PCR反應(yīng)液(B液)中，混勻后，1000r/min離心10sec，置于PCR儀上；6).按下列條件擴(kuò)增95℃3min預(yù)變性→94℃1min 34個(gè)循環(huán)→72℃10min→4℃保存49℃45sec72℃1min7).反應(yīng)結(jié)束后取5～10μl加2μl溴酚藍(lán)混勻，經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳20～30分鐘(5V/cm)后于紫外儀上觀察，若在615bp處出現(xiàn)一明亮的反應(yīng)條帶(與陽性對照在同一位置)，則為嗜水氣單胞菌陽性，說明檢測樣品中攜帶嗜水氣單胞菌；若無反應(yīng)條帶顯示，則為陰性，表明檢測樣品中不含嗜水氣單胞菌(見圖1)。
權(quán)利要求
1.水產(chǎn)動(dòng)物及人類病原菌-嗜水氣單胞菌的基因診斷試劑盒，其特征是該試劑盒包括下列部件1).樣品稀釋液A液，1管，內(nèi)裝1×PBS，pH7.4；2).PCR反應(yīng)液B液，1管，內(nèi)裝PCR擴(kuò)增反應(yīng)液，包括ddH2O、含Mg2+的10×Buffer、dNTP、引物AhF、引物AhR和TaqE；AhF為5’-CCA AAC GAG AGA AGC CCT T-3’，AhR為5’-AAA ACT TAG ATG TTT CAG TTC-3’；3).陽性對照液C液，1管，內(nèi)裝嗜水氣單胞菌的總DNA；4).盒子；5).一塊泡沫板，其大小與盒子的底面相同，裝于盒子中；泡沫板上有不少于上述小管數(shù)量的小孔，上述各小管分別對應(yīng)放置于這些小孔中。
2.一種檢測水產(chǎn)動(dòng)物及人類病原菌-嗜水氣單胞菌的方法，其特征是使用權(quán)利要求1所述試劑盒，按下列步驟進(jìn)行1).取新鮮待檢樣品，加入樣品稀釋液A液稀釋10～20倍，于無菌勻漿器中冰浴勻漿；2).6000～8000r/min離心5～10min；3).取上清200μl，煮沸15min，立刻放于冰上5～10min；4).6000～8000r/min離心10min，上清作PCR模板；5).分別取模板和C液，加入到PCR反應(yīng)液B液中，混勻后離心數(shù)秒，置于PCR儀上；6).按下列條件擴(kuò)增95℃ 3min預(yù)變性→94℃ 1min 34個(gè)循環(huán)→72℃ 10min→4℃保存49℃ 45sec72℃ 1min7).反應(yīng)結(jié)束后取5～10μl加2μl溴酚藍(lán)混勻，經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳20～30分鐘后于紫外儀上觀察，若在615bp處出現(xiàn)明亮的反應(yīng)條帶，則為嗜水氣單胞菌陽性；若無反應(yīng)條帶顯示則為陰性。
全文摘要
本發(fā)明提供一種水產(chǎn)動(dòng)物(如中華鱉、羅非魚，鰻鱺和三角帆蚌等)及人類病原菌—嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)的基因診斷試劑盒及檢測方法。該試劑盒及檢測方法是以嗜水氣單胞菌基因保守區(qū)序列設(shè)計(jì)的一對引物為主體而設(shè)計(jì)的。本發(fā)明采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)，對水產(chǎn)動(dòng)物(如中華鱉、羅非魚，鰻鱺和三角帆蚌等)及人類的病原菌—嗜水氣單胞菌的特異性DNA片斷進(jìn)行定性檢測，簡便快速，特異性好，靈敏度高；可用于水產(chǎn)動(dòng)物各時(shí)期養(yǎng)殖過程中的細(xì)菌跟蹤檢測，也可用于人類腹瀉病、敗血癥、食物中毒等的臨床檢測，還可以用于環(huán)境監(jiān)測，避免病菌傳播流行，具有很高的實(shí)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1560275SQ20041001546
公開日2005年1月5日 申請日期2004年2月26日 優(yōu)先權(quán)日2004年2月26日
發(fā)明者鄧先余, 何建國, 王智學(xué), 黃志堅(jiān), 翁少萍 申請人:中山大學(xué), 珠海福德隆生物技術(shù)有限公司