專利名稱：畢氏酵母發(fā)酵批過程的補(bǔ)料優(yōu)化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種優(yōu)化方法，特別是一種畢氏酵母發(fā)酵生產(chǎn)重組人血清白蛋白批過程的補(bǔ)料優(yōu)化方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
人血清白蛋白是由585個氨基酸組成的多肽鏈，分子量為66.5kDa。人體血漿中血清白蛋白的濃度高達(dá)42gl-1，臨床上人血清白蛋白主要用作血漿容量擴(kuò)充劑，搶救休克、燒傷和失血病人以及癌癥的輔助治療。目前，人血清白蛋白制品主要從人血漿或胎盤中分離生產(chǎn)，產(chǎn)品被血液病原病毒(如乙肝病毒和愛滋病毒)污染的幾率較大。近年來，隨著重組DNA技術(shù)的發(fā)展，利用生物技術(shù)生產(chǎn)人血清白蛋白逐漸成為一條替代途徑。
從產(chǎn)量看，畢氏酵母是迄今為止最為優(yōu)良的重組人血清白蛋白的表達(dá)分泌系統(tǒng)。經(jīng)文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，Invitrogen(美國)公司建立了畢氏酵母分批發(fā)酵生產(chǎn)人血清白蛋白的工藝規(guī)范(http//invitrogen.com/content/sfs/manuals/pichiaferm prot.pdf)，該工藝把整個發(fā)酵周期定為180小時，分成三個階段甘油間歇發(fā)酵期、甘油流加發(fā)酵期和甲醇流加發(fā)酵期。規(guī)范中明確給出了每個階段的發(fā)酵時間、培養(yǎng)基成分和發(fā)酵環(huán)境參數(shù)(溫度、pH值和溶氧濃度)，同時給出了甘油流加發(fā)酵期和甲醇流加發(fā)酵期的補(bǔ)料方法，其中，甘油流加發(fā)酵期的補(bǔ)料方法是，以18.15(毫升每小時每升初始發(fā)酵液)的恒定速率流加甘油；甲醇流加發(fā)酵期的補(bǔ)料方法是，首先以1(毫升每小時每升初始發(fā)酵液)的速率流加甲醇2個小時；然后，每30分鐘把甲醇的流速提高10％直到流速達(dá)到3(毫升每小時每升初始發(fā)酵液)；最后，保持3(毫升每小時每升初始發(fā)酵液)-的流速至發(fā)酵結(jié)束。該方法對應(yīng)的甲醇流加發(fā)酵期的細(xì)胞比生長速率呈遞減型，對利用畢氏酵母GS115表達(dá)重組人血清白蛋白的系統(tǒng)而言，這種補(bǔ)料控制方法所得蛋白表達(dá)量較低。檢索中還發(fā)現(xiàn)，Ren et al.，Macrokinetic model formethylotrophic Pichia pastoris based on stoichiometric balance，Journal ofBiotechnology，10653-68，2003(任海濤等，基于化學(xué)計量平衡的畢氏酵母宏觀動力學(xué)模型，生物技術(shù)雜志，10653-68，2003)建立了畢氏酵母的宏觀動力學(xué)模型，但是文章中沒有涉及產(chǎn)量優(yōu)化問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)存在的不足和缺陷，在保持Invitrogen工藝中其它工藝條件不變的前提下，基于畢氏酵母的宏觀動力學(xué)模型，提供一種畢氏酵母發(fā)酵批過程的補(bǔ)料優(yōu)化方法，使其適用于畢氏酵母發(fā)酵生產(chǎn)重組人血清白蛋白批過程的甲醇補(bǔ)料方法，該補(bǔ)料方法實現(xiàn)了甲醇誘導(dǎo)期-即甲醇流加發(fā)酵初期-的線性遞增型補(bǔ)料控制和隨后的恒定比生長速率的控制，彌補(bǔ)了Invitrogen工藝中甲醇流加發(fā)酵階段遞減型比生長速率補(bǔ)料方法的不足，提高了蛋白產(chǎn)率。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的，首先通過線性遞增型補(bǔ)料方法使細(xì)胞比生長速率在誘導(dǎo)期末達(dá)到設(shè)定值，誘導(dǎo)期的時間由用戶指定，記為tin然后通過拋物線型的補(bǔ)料方法使細(xì)胞比生長速率恒定地保持在設(shè)定值，線性遞增型補(bǔ)料方法和拋物線型補(bǔ)料方法進(jìn)行轉(zhuǎn)換時，保持甲醇的流加速率連續(xù)。
以下對本發(fā)明方法作具體描述(一)通過線性遞增型補(bǔ)料方法使細(xì)胞比生長速率經(jīng)過tin小時達(dá)到設(shè)定值。
通過線性遞增型補(bǔ)料控制方法適用于誘導(dǎo)期全程，期間甲醇補(bǔ)料速率是時間的一次函數(shù)，該函數(shù)的常數(shù)項和比例系數(shù)由如下方法確定(1)確定一次函數(shù)的常數(shù)項。本發(fā)明甲醇初始補(bǔ)料速率與Invitrogen公司的工藝規(guī)范相同，因此，一次函數(shù)的常數(shù)項等于1(毫升每小時每升初始發(fā)酵液)乘以初始發(fā)酵液體積(升)，其中，初始發(fā)酵液體積是指甲醇流加發(fā)酵階段開始時的發(fā)酵液體積。
(2)確定一次函數(shù)的比例系數(shù)。首先設(shè)定一個比例系數(shù)的初值，然后利用黃金分割法進(jìn)行一維搜索，目標(biāo)函數(shù)是使誘導(dǎo)期末細(xì)胞比生長速率的模型仿真值和設(shè)定值的誤差平方最小，其中，模型仿真值通過畢氏酵母宏觀動力學(xué)模型獲得。
(二)通過拋物線型的補(bǔ)料方法使細(xì)胞比生長速率恒定地保持在設(shè)定值。
拋物線型補(bǔ)料方法適用于誘導(dǎo)期結(jié)束后的剩余發(fā)酵時間，期間補(bǔ)料速率是時間的二次函數(shù)，該函數(shù)的常數(shù)項、一次項系數(shù)和二次項系數(shù)由如下方法確定(1)確定二次函數(shù)的常數(shù)項。二次函數(shù)的常數(shù)項取誘導(dǎo)期結(jié)束處的補(bǔ)料速率值，它保持了流加速率的連續(xù)性。
(2)確定二次函數(shù)的一次項系數(shù)和二次項系數(shù)。首先設(shè)定一次項系數(shù)和二次項系數(shù)的初值，然后利用單純形法尋優(yōu)，目標(biāo)函數(shù)是在誘導(dǎo)期以后的發(fā)酵時段，使細(xì)胞比生長速率的模型仿真值和設(shè)定值的誤差平方和最小。其中，模型仿真值通過畢氏酵母宏觀動力學(xué)模型求得，誤差平方和在時間整點計算。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明在任海濤等的畢氏酵母宏觀動力學(xué)模型基礎(chǔ)上，將線性補(bǔ)料方法和拋物線型的補(bǔ)料方法相結(jié)合，并且在兩段補(bǔ)料方法轉(zhuǎn)換時保持流加速率連續(xù)，使比生長速率在誘導(dǎo)期幾近勻速地到達(dá)設(shè)定值并使隨后發(fā)酵時段的細(xì)胞比生長速率恒定地保持在該設(shè)定值。這種恒定比生長速率補(bǔ)料方法可以較高地提高蛋白產(chǎn)率，發(fā)酵時間180小時處的蛋白濃度和總產(chǎn)量較Invitrogen公司提供的補(bǔ)料方法提高40％。
具體實施例方式
結(jié)合本發(fā)明方法的內(nèi)容進(jìn)一步提供以下實施例對象畢氏酵母GS115重組人血清白蛋白發(fā)酵批過程。發(fā)酵罐體積為10(升)，甘油間歇發(fā)酵期和甘油流加發(fā)酵期按Invitrogen公司提供的操作規(guī)范進(jìn)行，甲醇流加發(fā)酵期的初始發(fā)酵液體積為4(升)，甲醇誘導(dǎo)期為20(小時)。
控制目標(biāo)使甲醇流加發(fā)酵期細(xì)胞比生長速率恒定地保持在0.006(每小時)。
具體步驟如下(一)在甲醇誘導(dǎo)期-位于甲醇流加發(fā)酵初期-首先實施線性補(bǔ)料方法，它的方程是F＝ω1+ω2*(t-tf)(tf≤t≤tf+20)①式①中，F(xiàn)表示甲醇的流加流率(毫升每小時)，t是以接種時刻為計時起點的發(fā)酵時間(小時)，tf是甲醇流加發(fā)酵期開始處的時間(小時)，ω1是初始流加速率(毫升每小時)，其值設(shè)為4(毫升每小時)，這是由甲醇流加發(fā)酵期開始時的發(fā)酵液體積乘以1(毫升每小時每升發(fā)酵液)得出的，ω2是比例系數(shù)，其初始值設(shè)為0.3，再由黃金分割法尋優(yōu)得出準(zhǔn)確值，尋優(yōu)目標(biāo)函數(shù)見式②。
JFmin≤F≤Fmax=min(μ(tf+20)-0.006)2]]>②式②中，J為目標(biāo)函數(shù)值，F(xiàn)的含義與式①中相同，F(xiàn)min和Fmax是甲醇流加速率的下限和上限，它們由發(fā)酵罐的物理條件決定，μ(tf+20)是甲醇流加發(fā)酵20小時后細(xì)胞比生長速率的模型仿真值(每小時)。
(二)線性補(bǔ)料方法實施20小時后，實施拋物線型的補(bǔ)料方法至發(fā)酵結(jié)束，它的方程是F＝ω3+ω4*(t-tf-20)+ω5*(t-tf-20)2(tf+20＜t≤180) ③式③中的F、t和tf的含義與式①中相同，ω3是拋物線型補(bǔ)料方法甲醇流加速率的初始值，它和線性補(bǔ)料方法結(jié)束時的甲醇流加速率相等，即ω3＝ω1+20ω2，這就保證了兩段補(bǔ)料方法轉(zhuǎn)換時，甲醇流加速率的連續(xù)，ω4和ω5是方程系數(shù)，其初始值分別設(shè)為0.0001和0.05，再由單純形法尋優(yōu)得出其準(zhǔn)確值，尋優(yōu)目標(biāo)函數(shù)見式④。
JFmin≤F≤Fmax=minΣt=tf+20180(μ(t)-0.006)2]]>④式④中的誤差平方和在時間整點計算，其中，J、Fmin、Fmax、t和tf的含義與式①和②中相同，μ(t)是整點時刻細(xì)胞比生長速率的模型仿真值。
按上述方法得到的甲醇流加發(fā)酵階段的補(bǔ)料方法可以使細(xì)胞比生長速率恒定地保持在0.006(每小時)，最終的蛋白濃度和總產(chǎn)量較Invitrogen公司提供的補(bǔ)料方法提高40％。
權(quán)利要求
1.一種畢氏酵母發(fā)酵批過程的補(bǔ)料優(yōu)化方法，其特征在于，將線性補(bǔ)料方法和拋物線型的補(bǔ)料方法相結(jié)合，首先通過線性遞增型補(bǔ)料方法使細(xì)胞比生長速率在誘導(dǎo)期末達(dá)到設(shè)定值，其中，誘導(dǎo)期的時間長短由用戶指定，然后通過拋物線型的補(bǔ)料方法使細(xì)胞比生長速率恒定地保持在設(shè)定值，線性補(bǔ)料方法和拋物線型補(bǔ)料方法進(jìn)行轉(zhuǎn)換時，保持甲醇的流加速率連續(xù)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的畢氏酵母發(fā)酵批過程的補(bǔ)料優(yōu)化方法，其特征是，所述的通過線性遞增型補(bǔ)料方法，具體為線性補(bǔ)料方法適用于誘導(dǎo)期全程，期間甲醇補(bǔ)料速率是時間的一次函數(shù)，該函數(shù)的常數(shù)項和比例系數(shù)由如下方法確定(1)確定一次函數(shù)的常數(shù)項一次函數(shù)的常數(shù)項等于1毫升每小時每升初始發(fā)酵液乘以初始發(fā)酵液體積，其中，初始發(fā)酵液體積是指甲醇流加發(fā)酵階段開始時刻的發(fā)酵液體積，單位是升；(2)確定一次函數(shù)的比例系數(shù)首先設(shè)定比例系數(shù)初值，然后利用黃金分割法進(jìn)行一維尋優(yōu)，尋優(yōu)目標(biāo)函數(shù)是使誘導(dǎo)期末細(xì)胞比生長速率的模型仿真值和設(shè)定值的誤差平方最小，其中，模型仿真值通過畢氏酵母宏觀動力學(xué)模型獲得。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的畢氏酵母發(fā)酵批過程的補(bǔ)料優(yōu)化方法，其特征是，所述的拋物線型補(bǔ)料方法，具體為拋物線型補(bǔ)料方法適用于誘導(dǎo)期結(jié)束后的剩余發(fā)酵時間，期間補(bǔ)料速率是時間的二次函數(shù)，該函數(shù)的常數(shù)項、一次項系數(shù)和二次項系數(shù)由如下方法確定(1)確定二次函數(shù)的常數(shù)項二次函數(shù)的常數(shù)項取誘導(dǎo)期結(jié)束處的補(bǔ)料速率值，它保持了流加速率的連續(xù)性；(2)確定二次函數(shù)的一次項系數(shù)和二次項系數(shù)首先設(shè)定一次項系數(shù)和二次項系數(shù)的初值，然后利用單純形法尋優(yōu)，尋優(yōu)目標(biāo)函數(shù)是在除誘導(dǎo)期外的發(fā)酵時段，使細(xì)胞比生長速率的模型仿真值和設(shè)定值的誤差平方和最小，其中，模型仿真值通過畢氏酵母宏觀動力學(xué)模型求得，誤差平方和在時間整點計算。
全文摘要
一種畢氏酵母發(fā)酵批過程的補(bǔ)料優(yōu)化方法，屬生物技術(shù)領(lǐng)域。在甲醇流加發(fā)酵期，首先利用基于宏觀動力學(xué)模型的線性遞增型補(bǔ)料方法使細(xì)胞比生長速率幾近勻速地達(dá)到設(shè)定值，然后利用基于宏觀動力學(xué)模型的拋物線型補(bǔ)料方法使細(xì)胞比生長速率恒定地保持在該設(shè)定值，兩段補(bǔ)料方法轉(zhuǎn)換時，甲醇的流加速率保持連續(xù)。對于畢氏酵母GS115重組人血清白蛋白的表達(dá)系統(tǒng)，本發(fā)明可以明顯提高蛋白的產(chǎn)率，180小時處重組人血清白蛋白濃度和總產(chǎn)量較Invitrogen公司提供的補(bǔ)料方法提高40％。
文檔編號C12P21/02GK1556215SQ200410015660
公開日2004年12月22日 申請日期2004年1月8日 優(yōu)先權(quán)日2004年1月8日
發(fā)明者袁景淇, 任海濤 申請人:上海交通大學(xué)